JP2000312583A - キトサン分解酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】アルカリ性条件下でもキトサン分解活性を有す
る酵素を提供する。 【解決手段】以下の性質を有するキトサン分解酵素： β１−４結合しているキトサンをｐＨ４乃至 １０に
おいて加水分解する、 ドデシル硫酸ナトリウム存在下ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法にて分子量３５，０００を示す、 等電点電気泳動法にて等電点３．５を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酸性からアルカリ
性までのｐＨ条件下においてβ１−４結合しているキト
サンを加水分解するキトサン分解酵素、及び、該酵素を
生産する微生物、に関する。

【０００２】

【従来の技術】キトサンは抗菌作用、保湿性等を有する
アミノ糖鎖で、食品工業用、医療用、化粧品素材用とし
て幅広く使用されている（キチン・キトサン研究会編
「キチン・キトサン・ハンドブック、技報堂刊（１９９
５年）」３０２乃至３７６頁参照）。

【０００３】高分子キトサンは、細菌の細胞壁と特異的
に反応することにより抗菌活性を発揮することが知られ
ている（キチン・キトサン研究会編「キチン・キトサン
・ハンドブック、技報堂刊（１９９５年）」３０２乃至
３２０頁参照）。高分子キトサンを部分的に加水分解し
た低分子キトサンは、高分子キトサンよりも強い抗菌及
び抗カビ活性を有し、中でも、４乃至６糖を主成分とす
るキトサンオリゴ糖は一般細菌に対して抗菌性を示すと
共に、数種の乳酸菌に対して増殖促進効果を示すことが
報告されており（キチン・キトサン研究会編「キチン・
キトサン・ハンドブック、技報堂刊（１９９５年）」３
０２乃至３２０頁参照）、工業原料として様々な用途が
期待されている。

【０００４】低分子キトサン及びキトサンオリゴ糖は、
従来、甲殻類等に由来するキチンを熱濃アルカリ中で脱
アセチル化することにより得られる高分子キトサンを、
化学的手法又は酵素的手法を用いて加水分解することに
より、製造されてきた。

【０００５】高分子キトサンの加水分解法のうち、化学
的手法を用いた場合の反応生成物には、抗菌活性のない
グルコサミン及びグルコサミン２乃至３量体が多く含ま
れ、抗菌活性を有する低分子キトサン及びキトサンオリ
ゴ糖は少ししか含まれない。また、その反応液から低分
子キトサン及びキトサンオリゴ糖を回収するためには、
何らかの分離精製手段を要する。すなわち、化学的手法
は、収率が低い上、操作が煩雑になりがちであり、あま
り経済的ではない。よって、化学的手法が好ましい加水
分解法であるとは必ずしも言い難い。

【０００６】一方、酵素的手法は特異性が高く、主な反
応生成物は抗菌活性を有する低分子キトサン又はキトサ
ンオリゴ糖であり、反応生成物を分離精製する必要がな
い。すなわち、酵素的手法は、収率が高い上、操作も比
較的簡便であり、より経済的である。よって、酵素的手
法はより好ましい加水分解法と言うことができる。

【０００７】キトサンを加水分解する酵素として従来知
られているものは、バシラス（Bacillus）属（例えば、
バシラス・サーキュランス（Bacillus circulans）：Ts
ujisaka,Y.et, al.,Biochim.Biophys. Acta 410, 145
(1975)参照）、シュードモナス（Pseudomonas属（例え
ば、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）：F
ujii,T.et. al., J. Gen.Appl. Microbiol., 34, 255
(1988)参照）、ノカルディア（Nocardia）属（例えば、
ノカルディア・オリエンタリス(Nocardia orientali
s)：Sakai,K. et al.,Biochim. Biophys. Acta. 1079,
65 (1991)参照）、ストレプトミセス（Streptomyces）
属（例えば、ストレプトミセス・グリセウス（Storepto
myces griseus）：Ohtakara,A.et. al.,Chitin, Chitos
an and RelatedEnzymes, ed.Zikalis,J.P., pp147, Aca
demic Press, Oplando (1984)参照）、フザリウム（Fus
arium）属（例えば、フザリウム・ソラニフ・エスピー
（Fusarium solanif sp.）、フザリウム・ファセオリ
（Fusarium phaseoli）：Shimosaka,M. et al.,Biosci.
Biotech. Biochem., 57, 231, (1993)参照）、ペニシ
リウム（Penicillium）属（例えば、ペニシリウム・イ
スランディクム（Penicilliumisulandicum）：Eveleig
h,D.E.et. al.,J. Gen.Microbial., 126, 151 (1981)参
照）等、いずれも中性菌に由来する。これらの微生物に
由来し、キトサンを加水分解する酵素は、中性条件下で
は優れた活性を示す。

【０００８】上述の通り、低分子キトサン及びキトサン
オリゴ糖の原料となる高分子キトサンは、甲殻類等に由
来するキチンを熱濃アルカリ処理することにより得られ
る。このアルカリ処理時のｐＨは非常に高いので、斯く
得られた高分子キトサンを中性条件下で上述の酵素を用
いた加水分解反応に供するためには、水難溶性である高
分子キトサンを水による洗浄等の操作に供さなければな
らない。このような操作は概して煩雑且つ非経済的であ
り、環境上有害な排液を多量に生じる場合もある。そこ
で、アルカリ性領域でも高分子キトサンを加水分解し得
る酵素は、これらの問題点を解決又は軽減するものと期
待されていた。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】発明者は、アルカリ性
条件下で優れた活性を有するキトサン分解酵素を生産す
る微生物について鋭意探索を行った結果、静岡県富士市
で採集した土壌から分離したノカルディオプシス（Noca
rdiopsis）属に属する放線菌ノカルディオプシス・エス
ピー（Nocardiopsis sp.） ＳＡＮＫ ６０５９９株、
神奈川県大和市で採集した土壌から分離したバシラス属
に属する細菌バシラス・エスピー（Bacillus sp.） Ｓ
ＡＮＫ ７０７９９株、及び東京都八王子市で採集した
土壌から分離したバシラス属に属する細菌バシラス・エ
スピー ＳＡＮＫ ７０６９９株が、アルカリ性条件下
で優れた活性を発揮するキトサン分解酵素（以下、単に
「キトサン分解酵素」という。）を生産することを見出
し、本発明を完成した。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、 （１）以下の性質を有するキトサン分解酵素： β１−４結合しているキトサンをｐＨ４乃至ｐＨ１０
において加水分解する、 ドデシル硫酸ナトリウム存在下ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法にて分子量３５，０００を示す、 等電点電気泳動にて等電点ｐＩ３．５を示す、 （２）以下の性質を有するキトサン分解酵素： β１−４結合しているキトサンをｐＨ４乃至ｐＨ１０
において加水分解する、 ドデシル硫酸ナトリウム存在下ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法にて分子量５０，０００を示す、 等電点電気泳動にて等電点ｐＩ４．５を示す、 （３）以下の性質を有するキトサン分解酵素： β１−４結合しているキトサンをｐＨ４乃至ｐＨ１０
において加水分解する、 ドデシル硫酸ナトリウム存在下ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法にて分子量５０，０００を示す、 等電点電気泳動にて等電点ｐＩ３．５を示す、 （４）以下の性質を有するキトサン分解酵素： β１−４結合しているキトサンをｐＨ４乃至ｐＨ１０
において加水分解する、 ドデシル硫酸ナトリウム存在下ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法にて分子量６０，０００を示す、 等電点電気泳動にて等電点ｐＩ３．５を示す、 （５）以下の性質を有するキトサン分解酵素： β１−４結合しているキトサンをｐＨ４乃至ｐＨ１０
において加水分解する、 ドデシル硫酸ナトリウム存在下ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法にて分子量７０，０００を示す、 等電点電気泳動にて等電点ｐＩ３．５を示す、 （６）バシラス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ．） ＳＡＮＫ ７０６９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６
６６６）、 （７）バシラス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ．） ＳＡＮＫ ７０７９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６
６６７）、及び、 （８）ノカルディオプシス・エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉ
ｏｐｓｉｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０５９９株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６６６５）、に関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のキトサン分解酵素は、酸
性又は中性乃至アルカリ性のｐＨ条件下において、β１
−４結合している高分子キトサン（以下、単に「高分子
キトサン」という。）、β１−４結合しているキチン
（以下、単に「キチン」という。）、及びβ１−４結合
している部分脱アセチル化キチン（以下、単に「部分脱
アセチル化キチン」という。）を加水分解し、低分子キ
トサン、キトサンオリゴ糖、キチンオリゴ糖等を生じ
る。

【００１２】本発明のキトサン分解酵素は微生物の培養
物より採取することができる。該酵素を生産する微生物
は、キトサンをアルカリ性条件下で加水分解する活性を
指標とし、広く自然界から分離することができる。

【００１３】キトサンを加水分解する活性は、キトサン
等を基質として水性媒体中で該分解反応を行い、反応終
了後に基質又は生成物を定量することにより、測定する
ことができる。

【００１４】基質としては、例えば、高分子キトサン、
キチン、部分脱アセチル化キチン等を挙げることがで
き、好適には高分子キトサン及び部分脱アセチル化キチ
ンである。部分脱アセチル化キチンとして、具体的に
は、キトサン７Ｂ（７０％脱アセチル化キチ：加ト吉
（株）製ン）、キトサン８Ｂ（８０％脱アセチル化キチ
ン：加ト吉（株）製）、キトサン９Ｂ（９０％脱アセチ
ル化キチン：加ト吉（株）製）、キトサン１０Ｂ（９９
％％脱アセチル化キチン：加ト吉（株）製）等が挙げら
れる。高分子キトサンは、甲殻類等に由来するキチンを
熱濃アルカリ処理又は熱濃酸処理することにより得るこ
とができる。基質濃度は０．０１乃至５０重量％、好適
には０．５乃至５０重量％である。

【００１５】水性媒体としては、井戸水、水道水、蒸留
水、脱イオン水、これら２つ以上の混合水等が挙げられ
るが、好適には緩衝液を添加して水性媒体のｐＨを調製
する。緩衝液により調製された後の水性媒体のｐＨは、
ｐＨ４乃至ｐＨ１０．５、好適にはｐＨ４乃至１０、よ
り好適にはｐＨ７乃至ｐＨ１０である。緩衝液として
は、ｐＨ４乃至１０．５の範囲で緩衝作用を有するもの
であれば特に限定されないが、例えば、炭酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液等を挙げることができる。

【００１６】反応温度は８０℃以下であり、好適には３
０乃至６５℃である。反応時間は、基質、反応温度、ｐ
Ｈ等の諸条件に依存するが、１０分間乃至１０日間、好
適には１時間乃至２日間である。生成物の定量は、ラン
ドル・モーガン（Randle-Morgan）法（Blix,G.,Acta Ch
em.Scand.,2,467(1948)参照）又はシェールズ（Shale
s）法（Imoto,T.and Yagishita,K.,Agric.Biol.Chem.,3
5,1154(1971)参照）による遊離還元糖の定量等により行
うことができる。

【００１７】本発明のキトサン分解酵素を生産する微生
物としては、キトサン分解酵素を生産する微生物であれ
ば特に限定されないが、例えば、放線菌類、細菌類、真
菌類等を挙げることができる。放線菌としてはストレプ
トマイセス属、ノカルディア（Nocardia）属、ノカルデ
ィオプシス（Nocardiopsis）属等が、細菌類としてはバ
シラス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomona
s）属等が、真菌類としてはフザリウム（Fusarium）
属、ペニシリウム（Penicillium）属等が、それぞれ挙
げられ、好適にはノカルディオプシス属に属する放線菌
又はバシルス属に属する細菌、より好適には、ノカルデ
ィオプシス・エスピー（Nocardiopsis sp.）ＳＡＮＫ
６０５９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６５）、バシルス・
エスピー（Bacillus sp.） ＳＡＮＫ ７０６９９（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６６６６）及びバシルス・エスピー Ｓ
ＡＮＫ ７０７９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６７）であ
る。

【００１８】以下のＩ乃至ＩＩＩにおいて、本発明のキ
トサン分解酵素生産微生物の土壌からの分離及び菌学的
同定について述べる。 Ｉ．ＳＡＮＫ ７０６９９株 本発明のキトサン分解酵素を生産するＳＡＮＫ ７０６
９９は東京都八王子市陣馬高原で採取した土壌から分離
した細菌で、次のような菌学的性質を有する。

【００１９】１）形態学的性状 普通寒天培地（栄研化学（株）製）上で３７℃、３日培
養後の観察では、細胞は０．６μｍ×（４．０乃至１
２．０）μｍの桿菌で、運動する。グラム染色は陽性
で、卵円形の芽胞をわずかに形成し、細胞は膨張しな
い。

【００２０】２）培養学的性状 普通寒天培地で３７℃、３日間培養した場合、中程度の
生育を示し、コロニーは円形で全縁、黄味灰色で湿潤
し、水溶性色素は生産しない。アルカリ性培地（ｐＨ１
０）においても良好に生育し、好アルカリ性の性質を示
す。

【００２１】３）生理的性状 カタラーゼ ：陽性 生育温度範囲 ：１６℃乃至４５℃ 嫌気条件下での発育 ：陰性 ｐＨ５．７における発育 ：陰性 ７％ＮａＣｌにおける発育：陽性 ４）酸の産生 グルコース ：陽性 アラビノース：陰性 マンニット ：陰性 キシロース ：陰性 ５）代謝に関する諸性質 ＭＲテスト ：陰性 ＶＰテスト ：陰性 硝酸塩の還元 ：陽性 クエン酸鉄の利用 ：陽性 ウレアーゼ ：陰性 ゼラチンの液化 ：陰性 デンプンの加水分解：陽性 カゼインの加水分解：陽性 チロシンの分解 ：陰性 ６）ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量（ＨＰＬＣ法による）：４５．
０ｍｏｌ％ 以上の菌学的性状を有するＳＡＮＫ ７０６９９株はア
ルカリ性培地で良好に生育し、芽胞を形成するグラム陽
性の好気性桿菌で、ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量が４５．０ｍｏ
ｌ％であり、ブキャナン（Buchanan,R.E.）及びギボン
ズ（Gibbons,N.E.）編「バージーズ・マニュアル・オブ
・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Man
ual of Systematic Bacteriology）第４巻、ウィリアム
・アンド・ウィルキンス社（The Williams and Wilkins
Company）刊（１９８９年）」等の文献によって検索し
た結果、好アルカリ性のバシラス属に属する細菌と同定
された。次に好アルカリ性のバシラス属に属する既知菌
種と本菌株の性状を上記文献等によって比較したが、生
理的性質とＤＮＡのＧ＋Ｃ含量などの点で一致する菌種
はみあたらなかった。そこでこの菌株をバシラス・エス
ピー ＳＡＮＫ ７０６９９（以下、単に「ＳＡＮＫ
７０６９９」という。）と命名した。なお該菌株は平成
１１年２月２６日付けで日本国茨城県つくば市東１−１
−３の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に
国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６６を付
された。 ＩＩ．ＳＡＮＫ ７０７９９株 本発明のキトサン分解酵素を生産するＳＡＮＫ ７０７
９９株は、神奈川県大和市で採取した土壌から分離した
細菌で、次のような菌学的性質を有する。

【００２２】１）形態学的性状 普通寒天培地（栄研）上で３７℃、３日後の観察では、
細胞は０．６μｍ×（３．０乃至４．０）μｍの桿菌
で、運動する。グラム染色は陽性で卵円形の芽胞を形成
するが、細胞は膨張しない。

【００２３】２）培養学的性状 肉汁寒天培地で３７℃、３日培養した場合、良好な生育
を示し、培養とともに茶褐色になる。コロニー表面は皺
状に増殖し波状の縁である。アルカリ性培地（ｐＨ１
０）で生育微弱だが、中性（ｐＨ７）の培地で良好な生
育をする。

【００２４】３）生理的性状 カタラーゼ ：陽性 生育温度 ：１４乃至５０℃ 嫌気条件下での発育 ：陽性 ｐＨ５．７における発育：陽性 ７％ＮａＣｌにおけ発育：陽性 ４）酸の産生 グルコース ：陽性 アラビノース：陰性 マンニット ：陽性 キシロース ：陽性 ５）代謝に関する諸性質 ＭＲテスト ：陰性 ＶＰテスト ：陰性 硝酸塩の還元 ：陽性 クエン酸鉄の利用 ：陽性 ウレアーゼ ：陽性 ゼラチンの液化 ：陽性 デンプンの加水分解：陽性 カゼインの加水分解：陰性 チロシンの分解性 ：陽性 ６）ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量（ＨＰＬＣ法による）：４６．
５ｍｏｌ％ 以上の菌学的性状を有するＳＡＮＫ ７０７９９株はア
ルカリ性（ｐＨ１０）培地より、中性（ｐＨ７）培地で
良好に生育し、芽胞を形成するグラム陽性の通性嫌気性
桿菌で、ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量が４６．５ｍｏｌ％であ
り、ブキャナン及びギボンズ編「バージーズ・マニュア
ル・オブ・デヴィターミネイティブ・バクテリオロジー
第８版、ウィリアムス・アンド・ウィルキンス社刊（１
９８４年）」、ブキャナン及びギボンズ編「バージーズ
・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロ
ジー第４巻、ウィリアム・アンド・ウィルキンス社刊
（１９８９年）」等の文献によって検索した結果、バシ
ラス属に属する細菌と同定した。次にバシラス属に属す
る既知菌種と本菌株の性状を上記文献等によって比較し
たが、生理的性質とアルカリ性（ｐＨ１０）で生育する
などの点で、一致する菌種はみあたらなかった。そこで
この菌株をバシラス・エスピー ＳＡＮＫ ７０７９９
（以下、単に「ＳＡＮＫ ７０７９９株」という。）と
命名した。なお該菌株は平成１１年２月２６日付けで日
本国茨城県つくば市東１−１−３の通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６６６７を付された。 ＩＩＩ．ＳＡＮＫ ６０５９９株 本発明のキトサン分解酵素を生産するＳＡＮＫ ６０５
９９株は、静岡県富士市で採集した土壌から分離された
放線菌で、その形態学的特徴、生理学的性質及び化学分
類学的性質は以下に示すとおりである。

【００２５】１）形態学的特徴 ＳＡＮＫ ６０５９９株は、インターナショナル・スト
レプトマイセス・プロジェクト（International Strept
omyces Project：以下、「ＩＰＳ」という。）規定の寒
天培地に１％の炭酸ナトリウム溶液を添加し、ｐＨ１０
に調整した培地上で、２８℃、１４日間培養後、顕微鏡
下観察では、ＳＡＮＫ ６０５９９株の基生菌糸は良好
に伸長し単純分岐するが分断は観察されない。基生菌糸
は直ないし曲状の伸長を示すが、寒天培地によってはル
ープ状にも伸張し、さらにノカルディア属様のジグザグ
様伸張が僅かに認められる。気菌糸を比較的良好に形成
し、これらは良く伸張し単純分岐する。気菌糸は成熟に
従い長い胞子連鎖を形成する。胞子の表面構造は平滑
で、その大きさは（０．４乃至０．７）μｍ×（０．７
乃至１．９）μｍである。胞子嚢、菌核や車軸分岐等の
特殊器官は認められない。

【００２６】２）各種培養基上の培養性状 ＳＡＮＫ ６０５９９株の２８℃、１４日培養後の各種
培養基上での性状を表１に記載した。各種培養基は１％
炭酸ナトリウムでｐＨ１０に調整後に供試した。色調の
表示は、日本規格協会ＪＩＳ色票委員会監修「標準色票
第８版、財団法人日本規格協会刊（１９９３年）」の１
乃至４０頁に記載されたマンセル方式による。

【表１】 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 培地の種類 項目＊１：ＳＡＮＫ６０５９９株の性状 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― イーストエキス Ｇ ：良好、平坦、黄味灰(7.5Y 9/4) 麦芽エキス寒天 ＡＭ ：良好、綿毛状、薄黄味橙(2.5Y 9/2) （ＩＳＰ ２） Ｒ ：黄味灰(7.5Y 9/4) ＳＰ ：産生せず オートミール寒天 Ｇ ：余り良くない、平坦、黄味灰(7.5Y 9/2) （ＩＳＰ ３） ＡＭ ：余り良くない、ビロード状、薄黄味茶(2.5Y 7/2) Ｒ ：黄味灰(7.5Y 9/2) ＳＰ ：産生せず 澱粉・無機塩寒天 Ｇ ：余り良くない、平坦、薄黄(5Y 9/6) （ＩＳＰ ４） ＡＭ ：良好、ビロード状、茶味白(2.5Y 9/1) Ｒ ：薄黄(5Y 9/6) ＳＰ ：産生せず グリセリン Ｇ ：余り良くない、平坦、薄オリーブ(5Y 8/3) アスパラギン寒天 ＡＭ ：良くない、ビロード状、白 （ＩＳＰ ５） Ｒ ：薄オリーブ(5Y 8/3) ＳＰ ：産生せず ペプトン・イーストＧ ：非常に良好、平坦、黄味灰(5Y 9/4) エキス・鉄寒天 ＡＭ ：豊富に形成、ビロード状、薄黄味橙(2.5Y 9/2) （ＩＳＰ ６） Ｒ ：黄味灰(5Y 9/4) ＳＰ ：産生せず チロシン寒天 Ｇ ：余り良くない、平坦、黄味灰(5Y 9/2) （ＩＳＰ ７） ＡＭ ：余り良くない、ビロード状、白 Ｒ ：黄味灰(5Y 9/2) ＳＰ ：産生せず シュークロース Ｇ ：余り良くない、平坦、黄味灰(7.5Y 9/2) 硝酸塩寒天 ＡＭ ：良くない、ビロード状、白 Ｒ ：黄味灰(7.5Y 9/2) ＳＰ ：産生せず グルコース Ｇ ：余り良くない、平坦、黄味灰(7.5Y 9/2) アスパラギン寒天 ＡＭ ：形成せず Ｒ ：黄味灰(7.5Y 9/2) ＳＰ ：産生せず 栄養寒天 Ｇ ：良好、平坦、黄味灰(7.5Y 9/2) （Ｄｉｆｃｏ） ＡＭ ：良好、ビロード状、薄茶(5YR 8/3) Ｒ ：黄味灰(7.5Y 9/2) ＳＰ ：産生せず ポテトエキス Ｇ ：余り良くない、平坦、無色 人参エキス寒天 ＡＭ ：余り良くない、ビロード状、薄黄味茶(2.5Y 8/3) Ｒ ：無色 ＳＰ ：産生せず 水寒天 Ｇ ：良くない、平坦、無色 ＡＭ ：良くない、白 Ｒ ：無色 ＳＰ ：産生せず ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― ＊１ Ｇは生育、ＡＭは気菌糸、Ｒは裏面、ＳＰは可溶性色素をそれぞれ示す。 ２）生理学的性質 １％の炭酸ナトリウムでｐＨ１０に調整した培養基上、
２８℃にて培養した後、２乃至２１日間に観察したＳＡ
ＮＫ ６０５９９株の生理学的性質を表２に記載した。

【表２】 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 澱粉の水解 ：陽性 ゼラチンの液化 ：生育しない 硝酸塩の還元 ：陰性 ミルクのペプトン化 ：陽性 ミルクの凝固 ：陰性 メラニン様色素の生産性：培地１（＊１）では陰性 培地２（＊２）では陰性 培地３（＊３）では陰性 基質分解性 ：カゼインに対しては陽性 チロシンに対しては陽性 キサンチンに対しては陽性 生育温度範囲 ：培地４（＊４）では１３℃乃至４１℃ 生育適正温度 ：培地４（＊４）では２７℃乃至３６℃ 食塩耐性 ：１４％まで生育 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― ＊１ 培地１はトリプトン・イーストエキス・ブロス(ISP 1) ＊２ 培地２はペプトン・イーストエキス・鉄寒天(ISP 6) ＊３ 培地３はチロシン寒天(ISP 7) ＊４ 培地４はイーストエキス・麦芽エキス寒天(ISP 2) また、１％炭酸ナトリウムを添加してｐＨ１０に調整し
たプリドハム・ゴトリーブ寒天培地(ISP 9)を基礎培地
として使用して、２８℃、１４日間培養後に観察したＳ
ＡＮＫ６２６９５株の炭素源の資化性を表３に記載し
た。

【表３】 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― Ｄ−グルコース ：利用する Ｄ−フルクトース：利用しない Ｄ−アラビノース：利用しない Ｌ−ラムノース ：利用しない Ｄ−キシロース ：利用しない シュクロース ：利用する イノシトール ：利用しない ラフィノース ：利用しない Ｄ−マンニトール：若干利用する 対照 ：利用しない ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― ３）菌体成分について 長谷川らの方法（Hasegawa,T.,et al., J.Gen.Appl.Mic
robiol.,29,319(1983)参照）に従い細胞壁について検討
した結果、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸が検出され
た。また、ＳＡＮＫ ６０５９９株の全細胞中の糖成分
を上述の長谷川らの方法に従い検討した結果、リボー
ス、キシロースおよびマンノースを検出したが、特徴的
な糖パターンは認められなかった。これらのことからＳ
ＡＮＫ ６０５９９株の細胞壁型はＩＩＩＣ型であるこ
とが明らかになった。

【００２７】内田らの方法（Uchida,K.,et al.,J.Gen.A
ppl.Microbiol.,25,169(1979)参照）に従って細胞壁ム
ラミン酸のアシル基を検討した結果、アセチル型を示し
た。

【００２８】メナキノン分子種について「放線菌の同定
実験法、日本放線菌学会編、中越印刷刊（昭和６３
年）」に従い検討した結果、主要メナキノン種はＭＫ−
１０（Ｈ４）であるがＭＫ−１０（Ｈ６）ＭＫ−９（Ｈ
４）およびＭＫ−９（Ｈ６）も多量に検出した。

【００２９】細胞壁のリン脂質について「放線菌の同定
実験法、日本放線菌学会編、中越印刷刊（昭和６３
年）」に従い検討した結果、ＳＡＮＫ ６０５９９株の
リン脂質型はＰＩＩＩ型を示した。

【００３０】ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量について「放線菌の同
定実験法、日本放線菌学会編、中越印刷刊（昭和６３
年）」に従い検討した結果、ＳＡＮＫ ６０５９９株の
Ｇ＋Ｃ含量は６９ｍｏｌ％であった。

【００３１】以上、１）乃至３）の結果に基づき、イン
ターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト基
準（International Streptomyces Project Standard：
ワクスマン（Waksman,S.A.）著「ジ・アクチノミセテス
第二巻（The Actinomycetes）第２巻、ウィリアムス
・アンド・ウィルキンス社刊（１９６１年）」参照）、
ブキャナン及びギボンズ編「バージーズ・マニュアル・
オブ・デヴィターミネイティブ・バクテリオロジー（Be
rgey's Manual of Determinative Bacteriology）第８
版、ウィリアムス・アンド・ウィルキンス社刊（１９８
４年）」、ブキャナン及びギボンズ編「バージーズ・マ
ニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
第４巻、ウィリアム・アンド・ウィルキンス社刊（１９
８９年）」、及びノカルディオプシス属放線菌に関する
最近の文献（Yassin,F.,et al.,Int.J.Syst.Bacterio
l.,47,983(1997)：Rainey,F.A.,et al.,Int.J.Syst.Bac
teriol.,46,1088(1996)）によって同定を行い、本菌株
が放線菌の中でもノカルディオプシス属に属すると同定
し、本菌株をノカルディオプシス・エス・ピーＳＡＮＫ
６０５９９株（以下、単に「ＳＡＮＫ ６０５９９
株」という。）と命名した。なお、該菌株は１９９９年
２月２６日付けで、日本国茨城県つくば市東１−１−３
の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に国際
寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６５を付与さ
れた。

【００３２】放線菌は、自然界において、又は人工的な
操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理
等）により、変異を起こし易く、本発明のＳＡＮＫ ６
０５９９株も放線菌としてこの性質を有する。本発明に
おいて、ＳＡＮＫ ６０５９９株はその全ての変異株を
包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝学的方
法、例えば、遺伝子組換え、形質導入、形質転換等によ
り得られたものも包含される。即ち、キトサン分解酵素
を生産する、ＳＡＮＫ ６０５９９株並びにその変異
株、及びそれらと明確に区別されない菌株は、全てＳＡ
ＮＫ ６０５９９株に包含されるものである。本発明の
キトサン分解酵素は、前述のＩ乃至ＩＩＩ記載の菌株に
例示されるようなキトサン酵素生産微生物の培養物より
採取することができる。そのような微生物の培養に使用
される培地としては、炭素源、窒素源、無機物及び有機
物を適宜含有する培地であれば、合成培地及び天然培地
の何れも使用することができる栄養源としては、放線菌
類、細菌類又は真菌類の培養に使用されているものであ
れば特に限定されないが、例えば、炭素源としてはグル
コース、グリセロール、コハク酸ソーダ、糖蜜等が、窒
素源としてはバクトペプトン等のペプトン類、コーンス
ティープリカー、生イースト、硫酸アンモニウム、硝酸
ナトリウム、アスパラギン等が、無機物としては、リン
酸水素二カリウム、炭酸カルシウム等が、それぞれ挙げ
られる。有機物としては、菌株の生育を又はキトサン分
解酵素の生産を促進するようもの等が挙げられ、好適に
はキトサンである。培養法としては液体培養法が好適に
使用できる。培養温度は１０℃乃至６０℃、好適には２
０℃乃至４５℃である。反応時間は、培地組成、培養温
度等により依存するが、１分日間乃至２０日間、好適に
は３０分間乃至５日間、より好適には１日間乃至５日間
である。キトサン分解酵素生産微生物が好気性微生物で
ある場合、通気することが好ましい。培養終了後、培養
液や菌体又は不溶物を遠心除去することにより、粗酵素
液を得ることができる。

【００３３】このようにして得られる粗酵素液は、直接
キトサン分解反応に供することが可能であるが、種々の
精製手段によって精製して使用することも可能である。
キトサン分解酵素の精製手段としては、タンパク質の精
製に通常使用されるものであれば特に限定されないが、
例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎
水クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフ
ィー、塩溶、塩析、脱塩、濃縮、等電点電気泳動、調製
用電気泳動等を挙げることができ、好適にはイオン交換
クロマトグラフィーである。イオン交換クロマトグラフ
ィーの担体としては、陽イオン交換担体又は陰イオン交
換担体を使用することができ、好適には陰イオン交換担
体である。陰イオン交換担体としては、キトサン分解酵
素が安定なｐＨ条件で操作できるものであれば特に限定
されないが、例えば、ＤＥＡＥトヨパール（東ソー
（株）製）、ＭｏｎｏＱ（ファルマシア製）等を挙げる
ことができる。これらの担体（固相）に粗酵素画分を接
触させ、移動相（液相）のｐＨ条件及び／又はイオン強
度条件を調節することにより、精製度の改善されたキト
サン分解酵素を回収することができる。以上のような精
製手段を適宜組み合わせることにより、ドデシル硫酸ナ
トリウム（sodium dodecylsulphate：以下、「ＳＤＳ」
という。）存在下のポリアクリルアミド電気泳動（poly
acrylamide gel electrophoresis：以下、「ＰＡＧＥ」
という）法（以下、ＳＤＳ存在下のＰＡＧＥを「ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ」という。）にて単一となるまでキトサン分
解酵素を精製することができる。

【００３４】キトサン分解酵素の分子量及び等電点は、
精製の各段階において測定することができる。分子量は
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（Laemmli,U.K.,Nature,227,680(19
70)参照）、ゲルろ過（日本生化学会編「生化学実験講
座１ タンパク質の化学Ｉ分離精製、東京化学同人刊
（１９７６年）」４４３乃至４９２頁参照）、密度勾配
超遠心分離法（日本生化学会編「生化学実験講座１ タ
ンパク質の化学Ｉ 分離精製、東京化学同人刊（１９７
６年）」３５９乃至４３０頁参照）等により測定するこ
とができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によってＳＤＳ変成下
の分子量を測定することができ、ゲルろ過法、及び密度
勾配超遠心分離法によって未変成条件下での分子量を測
定することができる。等電点は常法により測定すること
ができる（日本生化学会編「生化学実験講座１ タンパ
ク質の化学Ｉ 分離精製、東京化学同人刊（１９７６
年）」２６２乃至３１２頁参照）。

【００３５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量の測定及
び等電点電気泳動による等電点の測定は、各電気泳動終
了後にゲルを染色して目的タンパク質の位置（移動度）
を決定することにより行うことができる。キトサン分解
酵素の染色には酵素活性を指標とする染色法（以下、
「活性染色」という。）が好適に使用できる。標準タン
パク質の染色にはコマジーブリリアントブルー染色、銀
染色が好適に使用できる。

【００３６】本発明のキトサン分解酵素の諸性質につい
て述べる。

【００３７】本発明のキトサン分解酵素は以下の性質を
有する： １）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分子量３５，０００乃至７
０，０００を示す、 ２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩ３．５乃至ｐＩ
４．５を示す、 ３）キトサン７Ｂ（加ト吉（株）製）を、ｐＨ４乃至ｐ
Ｈ１０．５において加水分解する。

【００３８】また、ノカルディオプシス属に属する放線
菌により生産される本発明のキトサン分解酵素は、以下
の性質を有する： １）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分子量３５，０００を示
す、 ２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩ３．５を示す、 ３）キトサン７Ｂ（加ト吉（株）製）を、少なくともｐ
Ｈ７乃至ｐＨ１０のｐＨ条件下で加水分解する。該加水
分解活性は、ｐＨ７より低いｐＨ条件下及び／又はｐＨ
１０を超えるｐＨ条件下においても発揮され得る。

【００３９】さらに、キトサン分解酵素のうち、バシラ
ス属に属する細菌により生産される本発明のキトサン分
解酵素は、以下の性質を有する： １）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分子量５０，０００乃至７
０，０００を示す、 ２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩ３．５乃至ｐＩ
４．５を示す、 ３）キトサン７Ｂ（加ト吉（株）製）を、ｐＨ４乃至ｐ
Ｈ１０．５にて加水分解する、 ４）８０℃以下で３）記載の加水分解活性を発揮する、 ５）３）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ７．５及
びｐＨ１０である、 ６）３）記載の加水分解活性の最適温度はｐＨ７．５で
は６５℃、ｐＨ１０では５０℃である、 ７）７０℃以下の温度で安定である、 ８）ｐＨ５乃至ｐＨ１０．５のｐＨ条件下で安定であ
る。

【００４０】また、バシラス属に属する細菌のうち、Ｓ
ＡＮＫ ７０７９９株により生産される本発明のキトサ
ン分解酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分子量５０，００
０を、等電点電気泳動法にて等電点ｐＩ４．５をそれぞ
れ示し、ＳＡＮＫ ７０６９９株により生産される本発
明のキトサン分解酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分子量
５０，０００、６０，０００及び７０，０００を、等電
点電気泳動法にて等電点ｐＩ３．５をそれぞれ示す。

【００４１】以上の様な性質を有する本発明のキトサン
分解酵素を用いることにより、キチンを熱濃アルカリ処
理等により得られる高分子キトサン及び部分脱アセチル
化キチン、キチン等より、低分子キトサン、キトサンオ
リゴ糖、キチンオリゴ糖等を直接得ることができる。こ
の目的で本発明のキトサン分解酵素を使用する際の反応
条件としては、本明細書に記載されたキトサンを加水分
解する活性の測定条件が使用できる。

【００４２】本発明のキトサン分解酵素が高分子キトサ
ン、部分脱アセチル化キチン、キチン等を加水分解する
ことによって得られる低分子キトサン、キトサンオリゴ
糖、キチンオリゴ糖等は、本技術分野においてよく知ら
れた方法で、抗菌剤、創傷治癒剤、食品材、化粧品素材
に供することができる。低分子キトサンは常法により濾
別することにより精製できる。キトサンオリゴ糖及びキ
チンオリゴ糖は常法により不要物を濾別し、直接使用す
るか、濃縮により適当なキトサンオリゴ糖液を得ること
もできる。更に必要に応じて水を加えて水混和性有機溶
剤で抽出し、抽出溶剤を留去することにより得ることも
できる。また、必要に応じて常法、例えばカラムクロマ
トグラフィー、再結晶法等により更に精製することもで
きる（キチン・キトサン研究会編「キチン・キトサン・
ハンドブッック、技報堂刊（１９９５年）」２０９頁乃
至２１８頁参照）。

【００４３】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実施例１．キトサン分解酵素の加水分解活性の測定 １）キトサンの加水分解反応 キトサン７Ｂ（加ト吉（株）製）１２５ｍｇに水１２．
５ｍｌを加え、濃塩酸にてｐＨ２．５に調製し、粉末キ
トサンを完全に溶解させた。ここに炭酸水素ナトリウム
１６８ｍｇを加えた後、１６０ｍＭ炭酸水素ナトリウム
水溶液及び１６０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液にてｐＨ１
０に調製し、総量を５０ｍｌのキトサン水溶液とした。
酵素活性を中性条件下（ｐＨ７）で測定する場合、上記
１６０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液の代わりに１６０ｍＭリ
ン酸二水素カリウム溶液を用いてｐＨ７に調整し、総量
を５０ｍｌのキトサン水溶液とした。このキトサン水溶
液１００μｌと水６０μｌに酵素液４０μｌを加え撹拌
して均一にし反応を開始し、３７℃で保温して１０分間
酵素反応を行った。 ２）ランドル・モーガン法による遊離還元糖の定量 アセチルアセトン１０μｌを０．５Ｍ炭酸ナトリウム水
溶液５００μｌに溶かした溶液２００μｌを酵素反応液
に加えて反応を停止させた後、１００℃で２０分間保温
した。氷冷後、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンズアルデビ
ド０．８ｇをエタノール３０ｍｌ及び濃塩酸３０ｍｌに
溶解した混合溶液２００μｌ、並びに、エタノール６０
０μｌ中を反応溶液に加え、６５℃で１０分間発色反応
させた。氷冷後、沈殿物を遠心分離し上清の５３０ｎｍ
における吸光度を測定した。酵素反応１分間当たり１μ
ｍｏｌのグルコサミンを生成する酵素活性を１単位とし
た。 実施例２．キトサン分解酵素の分子量の決定 キトサン分解酵素を、０．０１％キトサン７Ｂ（加ト吉
（株）製）溶液を含む１２．５％ポリアクリルアミドゲ
ルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemmli,U.K.,Nature,22
7,680(1970)参照）に供した。

【００４４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、ゲルを活性染色
に供した：ゲルを１００ｍＭリン酸二水素カリウム−炭
酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）７５ｍｌ及びイ
ソプロパノール２５ｍｌで３０分間振とうして界面活性
剤を除去する操作を２回行い、１００ｍＭリン酸二水素
カリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）５０ｍ
ｌで３０分間振とうして有機溶媒を除去する操作を２回
行った後、１００ｍＭリン酸二水素カリウム−炭酸水素
ナトリウム緩衝液５０ｍｌ（ｐＨ７）と、３７℃にて一
晩反応させ、反応終了後コマジーブリリアントブルーＲ
２５０で染色した後脱色した。上述の処理によりゲル中
のキトサン７Ｂは染色されたが、酵素反応によってキト
サン７Ｂが分解された部分は染色されなかった。分子量
マーカーの移動度及び染色されなかったバンドの移動度
を比較することにより、キトサン分解酵素の分子量を決
定した（Mitsutomi,L.,et al.,Biosci. Biotechnol. Bi
ochem.,62,2107( 1998)参照）。 実施例３．キトサン分解酵素の等電点の決定 キトサン分解酵素を等電点電気泳動（日本生化学会編
「生化学実験講座１ タンパク質の化学Ｉ 分離精製、
東京化学同人刊（１９７６年）」２６２乃至３１２頁参
照）に供した。。

【００４５】等電点電気泳動終了後、ゲルを活性染色に
供した：０．０１％キトサン７Ｂ（加ト吉（株）製）を
含有するアガロースゲルに重ね合わせ、３７℃で５時間
反応させ、反応終了後コマジーブリリアントブルーＲ２
５０で染色した。染色されなかった部分を酵素の等電点
として決定した。 実施例４．ＳＡＮＫ ６０５９９株の培養及び該培養物
中にキトサン分解酵素が存在することの確認 滅菌した以下の組成の培地１００ｍｌを含む５００ｍｌ
容の三角フラスコ（種フラスコ）に種菌を接種し、３７
℃にて３日間、１７０ｒｐｍの振とう機培養を行った。 培地；下記Ａ液及びＢ液を別々に滅菌し、使用直前に混
合した（ｐＨ１０．２） ［Ａ液］ ポリペプトン １０ｇ イースト・エクストラクト ５ｇ リン酸水素ニカリウム １ｇ 硫酸マグネシウム ０．２ｇ コロイダルキトサン ２．５ｇ 純水で９００ｍｌとした。

【００４６】［Ｂ液］ 炭酸ナトリウム １０ｇ 純水で１００ｍｌとした。 培養終了後、４℃条件下、１０，０００×Ｇにて３０分
間の遠心分離を行った。得られた上清について、実施例
２記載方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分
子量３５，０００のバンドが確認された。また、実施例
３記載の方法により等電点電気泳動を行ったところ、等
電点はｐＩ３．５であった。 実施例５．ＳＡＮＫ ７０７９９株の培養及び該培養物
中にキトサン分解酵素が存在することの確認 滅菌した以下の組成の培地１００ｍｌを含む５００ｍｌ
容の坂口フラスコに種菌を接種し、３７℃にて３日間、
１９０ｒｐｍの振とう培養を行った。 培地組成 ポリペプトン １０ｇ イースト・エクストラクト ５ｇ リン酸水素ニカリウム １ｇ 硫酸マグネシウム ０．２ｇ フレークキトサン ２．５ｇ 純水で１００ｍｌとした（滅菌後のｐＨはｐＨ７．
５）。 培養終了後、４℃条件下、１０，０００×Ｇにて３０分
間の遠心分離を行った。得られた上清について、実施例
２記載の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、
分子量５０，０００のバンドが確認された。また、実施
例３記載の方法により等電点電気泳動を行ったところ、
等電点はｐＩ４．５であった。 実施例６．ＳＡＮＫ ７０６９９株の培養及び該培養物
中にキトサン分解酵素が存在することの確認 滅菌した以下の組成の培地１００ｍｌを含む５００ｍｌ
容の三角フラスコに種菌を接種し、３７℃にて３日間、
１７０ｒｐｍの振とう培養を行った。 培地：下記Ｃ液及びＤ液を別々に滅菌し、使用直前に混
合した（混合後のｐＨはｐＨ１０．２）。

【００４７】［Ｃ液］ ポリペプトン １０ｇ イースト・エクストラクト ５ｇ リン酸水素ニカリウム １ｇ 硫酸マグネシウム ０．２ｇ コロイダルキトサン ２．５ｇ 純水で９００ｍｌとした。 ［Ｄ液］ 炭酸ナトリウム １０ｇ 純水で１００ｍｌとした。 培養終了後、４℃条件下、１０，０００×Ｇにて３０分
間の遠心分離を行った。得られた上清について、実施例
２記載の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、
分子量５０，０００、６０，０００及び７０，０００の
バンドが確認された。また、実施例３記載の方法により
等電点電気泳動を行ったところ、等電点はｐＩ３．５で
あった。 実施例７．ｐＨ７及びｐＨ１０におけるキトサン分解酵
素の活性 ＳＡＮＫ ６０５９９株の培養上清及びＳＡＮＫ ７０
７９９株の培養上清を各１ｍｌずつ別々に採取し、中性
条件下（ｐＨ７）及びアルカリ性条件下（ｐＨ１０）に
てキトサン分解活性を測定した。活性は１分間当たりの
低分子キトサンの生産量で算定した。結果を表４に記載
した。

【表４】 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 株 低分子キトサンの生産（μｍｏｌ／分） ―――――――――――――――――― ｐＨ７ ｐＨ１０ ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― ＳＡＮＫ ７０７９９株 ０．２５ ０．１８５ ＳＡＮＫ ６０５９９株 ０．０９５ ０．０８ ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 表４に示す通り、両菌株の生産するキトサン分解酵素
は、アルカリ性条件下（ｐＨ１０）においても、中性条
件下（ｐＨ７）とほぼ同等の活性を示した。 実施例８．ＳＡＮＫ ７０６９９株の生産するキトサン
分解酵素の精製 実施例５で得られた培養上清５００ｍｌを１０ｍＭトリ
ス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３０００ｍｌに対して６
時間ずつ１０回透析し、これを粗酵素画分（１０００ｍ
ｌ）とした。これを、予め１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥトヨパール（東ソ
ー（株）製）カラム（直径２．２ｃｍ×長さ２０ｃｍ）
に添加し、吸着させた。１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で該カラム十分洗浄した後、１０ｍＭト
リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）９００ｍｌ中に０乃至
０．９Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して
該カラムに吸着した成分を溶出させた。キトサン分解活
性は塩化ナトリウム濃度が０．７５Ｍ乃至０．８５Ｍの
画分（１００ｍｌ）に溶出された。

【００４８】活性画分１００ｍｌを２０ｍＭトリス・塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）３０００ｍｌに対して６時間ず
つ３回透析した後、、予め２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で平衡化したＭｏｎｏＱ（ファルマシア
社製）カラム（直径７ｍｍ×長さ５ｃｍ）に添加し、吸
着させた。該カラムを２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で十分洗浄した後、１０ｍＭトリス・塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）５００ｍｌ中に０乃至０．５Ｍの塩
化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸
着した成分を溶出させた。キトサン分解活性は塩化ナト
リウム濃度が０．３５Ｍ乃至０．４Ｍの画分（１８ｍ
ｌ）に溶出された。

【００４９】キトサン分解酵素の活性測定は、実施例１
記載の方法に従った。但し、基質溶液は、キトサン７Ｂ
（加ト吉（株）製）１２５ｍｇを蒸留水５０ｍｌに懸濁
し、酢酸３０μｌを添加して溶解させることにより、
０．２５％溶液として調製した。また、反応用緩衝液に
は、終濃度１００ｍＭの４−モルフォリンプロパンスル
ホン酸（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅｐｒｏｐａｎｅｓｕ
ｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ：以下、「ＭＯＰＳ」とい
う。）−炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用い
た。

【００５０】以上のキトサン分解酵素の精製結果を表５
にまとめた。表中、ＤＥＡＥとはＤＥＡＥトヨパールカ
ラムクロマトグラフィーを、ＭｏｎｏＱとはＭｏｎｏＱ
カラムクロマトグラフィーを、それぞれ意味する。

【表５】 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 精製段階 全活性（Ｕ） 比活性（Ｕ／ｍｇ） 精製度 活性回収率（％） ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 粗酵素 ５４．６ ０．３３ １ １００ ＤＥＡＥ ７．４ ０．７６ ２．３ １３．６ ＭｏｎｏＱ ３．４ ２．４ ７．３ ６．２ ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 実施例９．精製されたキトサン分解酵素の諸性質 実施例８において精製されたキトサン分解酵素（以下、
単に「精製酵素」という。）の諸性質を調べた。精製酵
素の加水分解活性の測定は、実施例１記載の方法により
行った。但し、基質溶液は、キトサン７Ｂ（加ト吉
（株）製）１２５ｍｇを蒸留水５０ｍｌに懸濁し、酢酸
３０μｌを添加して溶解させることにより、０．２５％
溶液として調製した。また、反応用緩衝液には、終濃度
１００ｍＭのＭＯＰＳ−炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．５）を用いた。 １）精製酵素の基質特異性 精製酵素の、種々の基質に対する加水分解活性を測定し
た。各基質は実施例９記載の方法に準じて調製し、酵素
反応後の遊離還元糖の定量はシェールズ法（Imoto,T.an
d Yagashita,K.,Agric.Biol.Chem.,35,1154(1971)参
照）により行った。

【００５１】キトサン７Ｂに対する精製酵素の加水分解
活性を１００％としたときの、他の各基質に対する精製
酵素の加水分解活性を相対値として表６に記載した。表
中、キトサン１０Ｂは９９％脱アセチル化キチン、キト
サン９Ｂは９０％脱アセチル化キチン、キトサン８Ｂは
８０％脱アセチル化キチン、キトサン７Ｂは７０％脱ア
セチル化キチンである（いずれも加ト吉（株）製）。

【表６】 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 基質 相対活性 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― キトサン１０Ｂ １２．９ キトサン９Ｂ ３０．９ キトサン８Ｂ ６５．２ キトサン７Ｂ １００ グリコールキトサン ７．２ グリコールキチン ２．６ コロイダルキチン １．９ ＣＭ−セルロース ０ リケナン ６．０ ―――――――――――――――――――――――――――――――――――― 表６に示す通り、精製酵素はキトサン７Ｂに対して最も
加水分解活性が高く、脱アセチル化度が大きくなるにつ
れて加水分解活性は低下した。また、精製酵素はキチン
加水分解活性を有し、セルラーゼ加水分解活性は見られ
なかった。

【００５２】２）精製酵素の温度安定性 精製酵素を種々の温度で３０分間処理した後、その加水
分解活性を測定した。

【００５３】無処理（０℃保温）群の精製酵素の加水分
解活性を１００％とし、各温度で処理したときの精製酵
素の加水分解活性を相対値として図１に記載した。

【００５４】図１に示す通り、精製酵素の加水分解活性
は、５０℃以下の処理ではほぼ１００％残存し、７０℃
の処理では約５０％残存し、８０℃の処理では約４０％
残存し、９０℃の処理では約２０％残存していた。 ３）精製酵素が有する加水分解活性の温度依存性 ｐＨ７．５又はｐＨ１０の条件下において、種々の温度
で精製酵素の加水分解活性を測定した。但し、ｐＨ１０
の場合の緩衝液には、終濃度１００ｍＭの炭酸水素ナト
リウム―炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）を用いた。

【００５５】最も高い活性を示した温度条件で測定され
た精製酵素の加水分解活性を１００％とし、各温度にお
ける精製酵素の加水分解活性を相対値として図２にまと
めた。

【００５６】図２に示す通り、精製酵素の加水分解活性
の最適温度は、ｐＨ７．５にて６５℃、ｐＨ１０にて５
０℃であった。 （４）精製酵素のｐＨ安定性 精製酵素１０５μｌに、以下に述べる各ｐＨの４００ｍ
Ｍ緩衝液１５μｌを添加し、３７℃にて３時間保温した
後、加水分解活性を測定した。

【００５７】緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ３．６乃
至ｐＨ６．５の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐ
Ｈ５．８乃至ｐＨ８の場合、ＭＯＰＳ−炭酸ナトリウム
緩衝液：ｐＨ７．６乃至ｐＨ８．３の場合、Ｎ−トリス
（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスル
ホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropane
sulfonic Acid）−炭酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ８．３
乃至ｐＨ１０の場合、炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリ
ウム緩衝液：ｐＨ１０乃至ｐＨ１１．２の場合、リン酸
水素二ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液。

【００５８】精製酵素の加水分解活性が最も安定に保た
れたｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨ
における精製酵素の加水分解活性を相対値として図３に
記載した。

【００５９】図３に示す通り、精製酵素の加水分解活性
はｐＨ５乃至ｐＨ１０．５の範囲で５０％以上保持さ
れ、ｐＨ６乃至１０の範囲で８０％以上保持された。 （５）精製酵素が有する加水分解活性のｐＨ依存性 （４）に記載した各緩衝液を用い、各ｐＨにおける精製
酵素の加水分解活性を測定した。

【００６０】最も高い活性を示したｐＨ条件で測定され
た精製酵素の加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにお
ける精製酵素の加水分解活性を相対値として図４に記載
した。

【００６１】図４に示す通り、精製酵素の活性の最適ｐ
Ｈは、ｐＨ７．５及びｐＨ１０であった。 （６）精製酵素の分子量 １２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いた実施例２記
載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により、精製酵素の分子量を求
めた。標準タンパクとして次のものを用いた： ａ．ホスホリラーゼ（phosphorylase）、分子量９４，
０００：ｂ．アルブミン（albumin）、分子量６７，０
００：ｃ．オバルブミン（ovalbumin）、分子量４３，
０００：ｄ．カルボニック・アンヒドラーゼ（carbonic
anhydrase）、分子量３０，０００：ｅ．トリプシン・
インヒビター（trypsin inhibitor）、分子量２０，１
００：ｆ．α−ラクタルブミン（α-lactalbumin）、分
子量１４，４００。

【００６２】これら標準タンパクの移動度から求められ
た検量線を図５に記載した。

【００６３】図５に示す通り、精製酵素は分子量７０，
０００の単一バンドを示した。 （７）等電点 実施例３に記載の方法により精製酵素の等電点を求めた
ところ、精製酵素の等電点はｐＩ３．５であった。

【００６４】

【発明の効果】本発明のキトサン分解酵素は、中性条件
下及びアルカリ性条件下で優れた酵素活性を有し、低分
子キトサン、キトサンオリゴ糖及びキチンオリゴ糖の工
業的生産に好適に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】精製酵素の温度安定性。

【図２】精製酵素が有する加水分解活性の温度依存性。

【図３】精製酵素のｐＨ安定性。

【図４】精製酵素が有する加水分解活性のｐＨ依存性。

【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの検量線及び精製酵素の分子
量。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 石井 晃 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 FF05E FF11E LL05 4B065 AA01X AA15X BA22 CA21 CA31 CA41 CA44

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の性質を有するキトサン分解酵素： β１−４結合しているキトサンをｐＨ４乃至ｐＨ１０
   において加水分解する、 ドデシル硫酸ナトリウム存在下ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法にて分子量３５，０００を示す、 等電点電気泳動にて等電点ｐＩ３．５を示す。
2. 【請求項２】以下の性質を有するキトサン分解酵素： β１−４結合しているキトサンをｐＨ４乃至ｐＨ１０
   において加水分解する、 ドデシル硫酸ナトリウム存在下ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法にて分子量５０，０００を示す、 等電点電気泳動にて等電点ｐＩ４．５を示す。
3. 【請求項３】以下の性質を有するキトサン分解酵素： β１−４結合しているキトサンをｐＨ４乃至ｐＨ１０
   において加水分解する、 ドデシル硫酸ナトリウム存在下ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法にて分子量５０，０００を示す、 等電点電気泳動にて等電点ｐＩ３．５を示す。
4. 【請求項４】以下の性質を有するキトサン分解酵素： β１−４結合しているキトサンをｐＨ４乃至ｐＨ１０
   において加水分解する、 ドデシル硫酸ナトリウム存在下ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法にて分子量６０，０００を示す、 等電点電気泳動にて等電点ｐＩ３．５を示す。
5. 【請求項５】以下の性質を有するキトサン分解酵素： β１−４結合しているキトサンをｐＨ４乃至ｐＨ１０
   において加水分解する、 ドデシル硫酸ナトリウム存在下ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法にて分子量７０，０００を示す、 等電点電気泳動にて等電点ｐＩ３．５を示す。
6. 【請求項６】バシラス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ｓｐ．） ＳＡＮＫ ７０６９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
   ６６６６）。
7. 【請求項７】バシラス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ｓｐ．） ＳＡＮＫ ７０７９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
   ６６６７）。
8. 【請求項８】ノカルディオプシス・エスピー（Ｎｏｃａ
   ｒｄｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．） ＳＡＮＫ ６０５９９株
   （ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６５）。