KR100477456B1 - 만난아제를 생산하는 신규한 바실러스 속 ｗｌ-7 균주 - Google Patents

만난아제를 생산하는 신규한 바실러스 속 ｗｌ-7 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 바실러스 속(Bacillus sp.WL-7) 균주 및 상기 균주로부터 만난아제를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 전통식품인 된장으로부터 분리한 만난 분해능이 있는 신규한 바실러스 속 WL-7 균주(Bacillus sp. WL-7) (KCTC 10279BP)는 발효에 관여하는 바실러스 서브틸리스와 유사하고 안전성이 우수한 균주이며, 곤냑과 LBG를 함유한 배지에서 만난아제를 대량 생산하는데 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명의 바실러스 속 WL-7 균주(Bacillus sp. WL-7)(KCTC 10279BP)로부터 생산되는 만난아제는 중성 pH와 중성온도에서 반응성이 높고 곡류에 존재하는 헤미셀룰로즈 분해에 뛰어난 효과가 있어 사료첨가제로서 제조될 수 있다.

Description

만난아제를 생산하는 신규한 바실러스 속 ＷＬ-7 균주{Novel Bacillus sp. WL-7 strain producing mannanase}
본 발명은 신규한 바실러스 속(Bacillus sp. WL-7) 균주와 상기 균주로부터 만난아제를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 전통식품인 된장으로부터 신규한 바실러스 속 균주를 분리하고 상기 바실러스 속 균주로부터 중성과 산성범위의 pH에서 활성이 높아 단위동물의 사료 첨가제로 유용한 만난아제를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
만난아제는 헤미셀룰로즈를 구성하는 주요성분인 만난 함유물질을 분해하는 효소로서 그 용도가 증대되는 효소 중 하나이다. 헤미셀룰로즈는 식물 세포벽의 구성성분이며 셀룰로즈 및 리그닌과 결합하여 존재하며 자연계에서는 셀룰로즈 다음으로 풍부한 다당류이다. 헤미셀룰로즈에는 콩과식물의 씨에 존재하는 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 침엽수의 글루코만난, 갈락토글로코만난 등의 만난물질이 포함된다. 자일라나제 및 글루카나제와 함께 헤미셀룰라제에 속하는 만난아제의 이용 가능성 중 가장 중요한 것은 지구상의 재생가능한 식물자원인 헤미셀룰로즈를 당화하여 생물체가 이용가능한 탄소원으로 전환시키는 것이나 아직까지 현실화되지는 않은 상태이다. 현재 헤미셀룰라제를 산업적으로 실용화한 것들로 커피, 초코렛, 코코아, 차, 시리얼등의 식품과 펄프제조 등이 있다.
식품과 사료에 사용되는 헤미셀룰로즈를 함유한 곡물을 헤미셀룰라제로 가공하면, 식·사료용에 알맞은 형태로 전환되어 에너지 수율이 증진되고 점질도가 저하된다. 이와같이 식품과 가축사료의 이용 가능한 에너지 함량이 높아진다면, 특히 사료에 있어서 가축의 생산가를 낮출 수 있을 것이다.
한편, 대두 단백질은 개, 고양이, 돼지, 물고기, 닭 등의 가축 사료로 사용되고 있다. 주된 에너지원 성분은 아니지만 대두박은 필수아미노산을 갖는 우수한 단백질원이며, 대두박 성분 중 에너지원 성분인 탄수화물의 약 10% 정도는 갈락탄과 펜토산으로 되어 있다. 이러한 탄수화물은 단위 동물에서 상당량이 소화되지 않고 배설되는데 만난아제는 대두박의 에너지원이 되는 탄수화물 중 갈락탄을 저분자의 올리고당이나 단당으로 분해하여 단위동물이 쉽게 대사할 수 있도록 한다.
헤미셀룰로즈의 주요성분인 만난을 완전히 분해하여 당화하기 위해서는 일반적으로 세가지 종류의 효소, 즉 엔도만난아제(endo-β-mannanase), 엑소만난아제 (exo-β-mannanase) 및 만노시다제 (β-mannosidase)가 함께 작용해야 한다고 알려져 있다. 이들 중 엔도만난아제는 만노즈 중합도가 4개인 만노테트라오즈 이상의 중합도를 갖는 만난 다당류의 β-D-1,4-만노피라노실(β-D-1,4-mannopyranosyl) 결합을 무작위로 가수분해하는 반응을 촉매하며 만난을 가수분해하는데 있어 주된 역할을 한다. 한편, 본 발명에서는 이들 효소중 "엔도만난아제"에 중점을 두었으며 이후 이 효소를 편의상 "만난아제"로 칭하였다.
만난아제는 고초균을 비롯하여 애로모나스(Aeromonas), 엔테로코커스 (Enterococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 세균을 비롯하여 곰팡이, 효모 등의 미생물로부터 생산된다. 또한, 고등식물과 동물 중에도 만난아제를 생산하는 것이 있다. 실제로 만난아제의 생산에 사용되는 미생물로는 주로 트리코더마(Trichoderma), 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 곰팡이 균주들이 있으며 곰팡이 유래의 만난아제는 산성 조건에서 최대 활성을 나타낸다. 그러나, 돼지나 닭의 소화기관의 생리적 조건은 부위별로 차이가 있지만 만난아제가 작용할 소장 이후의 pH 조건은 6.5 부근이다. 따라서, pH 3.6 ∼ 5.5 부근에서 활성이 높은 곰팡이 유래의 만난아제보다는 pH가 중성 부근의 조건에서 활성이 높은 만난아제가 사료첨가용 효소로 필요한 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 전통식품인 된장으로부터 만난아제를 생산하는 신규한 바실러스 속 균주를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 된장으로부터 분리, 동정한 신규한 바실러스 속 균주를 배양하여 중성의 pH와 중온에서 활성이 큰 만난아제를 대량 생산하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 생산방법으로부터 생산되는 만난아제의 가축사료용 첨가제로서의 용도를 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적들은 전통식품인 된장으로부터 다수의 세균을 분리한 후 아카시아 열매수지 유래의 갈락토만난 (Locust Bean Gum; LBG)을 첨가한 평판배지에서 배양하여 LBG의 분해환이 큰 균주를 선발한 후 선발 균주의 균학적 성질을 조사하고 상기에서 선발된 균주가 생산하는 만난아제의 특성을 조사하고 배양배지 조성에 따른 선발균주의 만난아제 생산성을 조사한 다음 상기에서 생산된 만난아제가 가축사료로 이용되는 대두분과 옥수수분의 탄수화물을 분해하는 능력을 분석하여 사료첨가제로서의 유용성을 조사함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성을 설명한다.
본 발명은 전통식품인 된장을 LBG를 첨가한 LB 한천배지에서 배양하여 콜로니 주위에 열매수지 분해환이 생성된 균들을 선별하여 만난아제를 생산하는 미생물을 선발하고 상기로부터 선발된 균주를 바실러스 속 WL-7(Bacillus sp. WL-7) 균주로 명명하는 단계; 상기 선발된 바실러스 속 WL-7 균주의 형태학적, 생화학적 특성을 조사하여 동정하는 단계; 상기 바실러스 속 WL-7 균주가 생산하는 만난아제의 최적 활성온도와 최적 pH를 조사하는 단계; 상기 바실러스 속 WL-7으로부터 만난아제를 대량생산하기 위한 최적 조건 확립 단계; 바실러스 속 WL-7 균주로부터 생산된 만난아제를 동물사료의 주 성분인 대두분과 옥수수분에 처리하여 만난의 분해정도를 조사하여 동물사료 첨가제로서의 용도를 조사하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 사용한 LB 한천배지는 1L 당 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g 및 박토아가 18g을 함유한다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 된장으로부터 만난아제 생산균주의 분리
만난아제를 생산하는 미생물을 분리하기 위해, 전통식품인 된장시료 1g을 생리식염수 10mL에 현탁하고, 상기 현탁액 중 적당량을 취하여 0.5% 아카시아 열매수지 유래의 갈락토만난 (Locust Bean Gum; LBG)을 첨가한 LB 한천배지에 도말한 후 37℃에서 배양하였다. 콜로니가 형성된 상기 고체 한천배지를 0.2% 콩고레드 용액으로 염색하고 그 콜로니 주위에 만난 분해환이 생성된 균들을 선별하여 된장으로부터 만난아제를 생산하는 미생물을 다수 탐색하였다. 이들 균주중에서 중성 pH와 중온에서 만난아제 활성이 우수한 균주를 선발하고 이를 바실러스 속 WL-7 (Bacillus sp. WL-7) 균주로 명명하였다.
실시예 2: 바실러스속 WL-7 균주의 동정 및 특성조사
상기 실시예 1에서 분리된 만난아제를 생산하는 균주를 다양한 온도에서 배양하면서 생육가능한 최고온도를 조사한 결과 60℃ 이상에서는 자라지 못하였으나 55℃ 까지는 정상적인 성장을 보였다. 분리 균주의 동정은 형태학적, 생화학적 특성 및 지방산 조성을 조사함으로써 실시하였다. 분리 균주의 형태적, 생화학적 특성은 표 1에서 나타난 바와 같으며, 버기의 매뉴얼(Bergy's manuals of determinative bacteriology)에 따라 바실러스 속 (Bacillus) 균주로 동정하였다. 분리 균주의 당 발효에 관한 생화학적 특성에 있어서, 바실러스 서브틸리스와 비교하여 95.2%로 유사하여 바실러스 속 균주 중 유사도가 가장 높았고, 젠티오비오스 (gentiobiose)에 관한 항목만을 제외하고는 바실러스 서브틸리스와 동일한 당 발효 성질을 보였다. 또한 분리균주의 지방산 조성은 표 2에 나타난 바와 같으며, 바실러스 아트로배우스와 바실러스 서브틸리스의 지방산 조성과 각각 0.729와 0.630의 유사도를 보여 분리균주를 바실러스 속 WL-7 (Bacillus sp. WL-7) 균주로 명명하였다. 본 발명에서 동정한 신규한 바실러스 속 WL-7 균주는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2002년 6월 17일자로 기탁번호 KCTC 10279BP로 기탁하였다.
바실러스 속 WL-7 균주의 형태 및 생화학적 특징
구 분 반 응
세포 형태 (Shape) 간 균
포자형성능 (Endospore) +
포자 형태 (Spore shape) 타원형
포자위치 (Spore position) 중앙
운동성 (Motility) +
그람염색 (Gram staining) +
생육 최고온도 (Maximum growth temperature) 55℃
카탈라아제 활성 (Catalase) +
베타-갈락토시다아데 (beta-Galactosidase) +
인돌생성 (Indole production) -
메틸레드 (Metyl-Red) -
보거스-프로스카우어 (Voges-Prokauer) +
유레아 가수분해 (Urease) -
젤라틴 가수분해 (Gelatin hydrolysis) +
전분 가수분해 (Starch hydrolysis) +
당발효에 의한 산 생성글루코스(D-glucose), 프록토스(D-Fructose), 만노스(D-Mannose),글리세롤(Glycerol), 아라비노스(L-Arabinose), 이노시톨(Inositol),만니톨(Mannitol), 소비톨(Sorbitol), 말토스(Maltose), 리보스(Ribose),이큐린(Esculin), 살리신(Salicin), 이눌린(Inulin), 수크로오스(Sucrose),라피노오스(Raffinose) 자일로스(D-Xylose), 갈락토스(Galactose), 람노스(Rhamnose),락토스(Lactose), 에리쓰리톨(Erythritol), 글루코네이트(Gluconate),아라비톨(D-Arabitol), 리소스(D-Lyxose), 타가토스(D-Tagatose),2-케토-글루코네이트(2-keto-Gluconate), 자일로스(D-Xylose) +++++ ----
+: 양성 -: 음성
바실러스 속 WL-7의 지방산 조성
지방산 조성 (%)
Iso-C14:0 1.31
Iso-C15:0 19.27
Anteiso-C15:0 45.11
Iso-C16:0 3.56
n-C16:1 ω11c 2.18
n-C16:0 4.01
Iso-C17:1ω10c 1.57
Iso-C17:0 8.59
Anteiso-C17:0 13.28
실시예 3: 바실러스 속 WL-7 균주로부터 생산되는 만난아제의 반응특성
본 발명 바실러스 속 WL-7 균주로부터 생산되는 만난아제를 이용하여 LBG를 가수분해함에 있어 반응온도와 pH에 따른 활성을 조사하기위해, 우선 배양상등액을 농축하고 황산 암모늄염(ammonium sulfate)으로 분획하여 침전물을 얻은 다음 50 mM 소듐포스페이트 완충액 (pH 6.5)에 현탁한 후 동일한 완충액으로 투석하였다. 분획된 단백질 중 만난아제 활성을 갖는 부분을 모아 조효소액으로 사용하여 반응온도와 pH를 달리하여 만난아제의 활성을 측정하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주로부터 생산되는 만난아제는 55℃와 pH 6.0 부근에서 최고의 효소 활성을 나타냈으며, pH 5.0 ~ 7.5 의 범위에서 90% 이상의 활성을 나타냈다. 또한 동물의 장내 온도인 37℃에서 최고 효소활성의 60% 이상의 반응성을 나타내므로, 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주로부터 생산되는 만난아제는 중성부근의 pH와 중성온도에서 우수한 반응성을 지님을 확인하였다.
실시예 4: 탄소원의 첨가에 따른 만난아제 생산성의 변화
일반적으로 미생물의 다당류 분해효소의 생산은 배양액 중의 탄소원에 의해 영향을 받는 경우가 많다. 본 실시예에서는 탄소원인 탄수화물의 종류를 달리하여 배지에 첨가한 후 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주의 만난아제 생산성을 조사하였다. 그 결과, 곤냑과 LBG을 배지에 첨가하였을 때 만난아제 생산성이 증가한다는 사실을 확인하였다. 따라서, 배지내 곤냑과 LBG의 첨가량에 따른 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주의 만난아제 생산성을 조사하기위해, 먼저 LB 배지를 대조구로 하여 LB 배지에 곤냑과 LBG의 농도를 각각 달리하여 첨가한 액체배지에 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주를 접종하여 37℃에서 15시간 각각 액체배양한 후 배양상등액의 만난아제 활성을 조사하였다.
표 3에 나타난 바와 같이, 배지내 탄소원으로 곤냑을 첨가한 경우 첨가량이 많을수록 만난아제의 생산성이 증가하며 0.5% 곤냑을 첨가한 배지에서 만난아제의 생산성이 가장 높았다. LBG를 첨가한 경우에도 만난아제의 생산성은 증가하였으며 0.5%를 첨가하였을 때 만난아제의 생산이 가장 많이 증가되었다. 상기와 같이 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주의 만난아제 생산은 곤냑과 LBG에 의해 크게 증가됨을 알 수 있었다. 상기의 사실로부터 두 탄소원을 복합으로 첨가하였을 때 만난아제의 생산성이 보다 증가되는지 알아보기위해, LB 배지에 0.5%의 LBG를 첨가한 배지를 기본배지로하여 곤냑을 농도별로 첨가하고 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주를 배양하여 만난아제 활성을 조사하였다.
표 4에 나타난 바와 같이, 곤냑과 LBG를 각각 0.5% 씩 첨가한 배지에서 효소 생산이 최대로 증가하여 대조구에 비해 262배에 달하였다. 최종적으로 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주로부터의 만난아제 생산은 곤냑과 LBG를 0.5% 씩 동시에 첨가한 LB 배지에서 최대의 생산성을 나타내었다.
LBG과 곤냑의 첨가량에 따른 만난아제 생산성에 대한 영향
배지첨가성분 첨가량(%) 만난아제 활성(unit/mL) 비교활성(fold)
무첨가 0.8 1
LBG 0.1% 45.4 57
0.3% 51.2 64
0.5% 74.4 93
0.7% 71.5 89
곤냑 0.05% 29.1 36
0.1% 35.6 45
0.2% 72.4 91
0.3% 100.1 125
0.4% 111.3 139
0.5% 119.8 150
LBG와 곤냑을 복합첨가함에 따른 만난아제 생산성에 대한 영향
배지첨가성분 곤냑첨가량(%) 만난아제 활성(unit/mL) 비교활성(fold)
무첨가(LB 배지) 0.8 1
(LBG 0.5% 함유 LB 배지) 0% 94.0 118
0.05% 107.3 134
0.1% 117.1 146
0.2% 147.4 184
0.3% 170.4 213
0.4% 190.8 238
0.5% 209.8 262
1.0% 201.8 252
실시예 5: 배양시간에 따른 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주의 만난아제 생산성의 변화와 균체량과의 관계
배양시간에 따른 곤냑과 LBG에 의한 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주로부터 만난아제의 생산성 증가와 균체량의 관계를 알아보기 위해, 탄소원을 첨가하지 않은 LB 배지와 부가 탄소원으로 곤냑과 LBG를 각각 0.5% 씩 동시에 첨가한 LB 배지에 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주를 각각 접종하여 37℃에서 배플 플라스크(baffle flask) 로 진탕배양하면서 일정시간 마다 생균수와 만난아제의 활성을 측정하였다. 균수는 채취한 배양액으로 희석한 후 LB 한천 배지에 도말하여 배양한 후 각 콜로니의 수를 측정하였고 배양액내에 존재하는 만난아제의 활성은 배양액을 원심분리한 후 상등액을 시료로 하여 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명 바실러스속 WL-7 균주는 두 배지에서 모두 빠른 성장을 보였고 접종후 6∼7 시간만에 정지기에 이르러 계속 유지되었으나 18 시간 이후에는 LB배지에서 균수가 약간 감소하였다. 만난아제의 생산은 두 배지에서 현격한 차이를 보였다. 즉, 곤냑과 LBG를 첨가한 경우 배양시간이 13∼14시간에 이르렀을 때 224 unit/mL의 최대 생산성을 나타냈으나, 부가 탄소원이 없는 LB 배지에서는 배양시간에 따른 활성증가도 미약하였고 최대 생산성이 2.0 unit/mL로 나타났다. 따라서 곤냑과 LBG가 각각 0.5%씩 동시에 첨가된 배지에서는 이들을 첨가하지 않은 배지에 비해 본 발명 바실러스 속 WL-7의 만난아제 생산성이 약 280 배의 증가하는 것으로 확인하였다.
실시예 6: 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주로부터 생산되는 만난아제의 사료첨가제로서의 용도
본 발명 바실러스 속 WL-7 균주로부터 생산되는 만난아제가 사료첨가제로 사용될 수 있는지를 조사하기 위해, 대두의 부산물로서 가축사료의 재료로 많이 사용되는 대두분과 옥수수분을 대상으로 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주 유래의 만난아제를 처리한 후 효소활성에 의해 생성된 환원당의 양을 분석하였다. 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주를 곤냑과 LBG를 각각 0.5%씩 동시에 첨가한 LB 배지에서 배양한 후 배양상등액을 황산 암모늄염으로 침전시켜 조효소액을 제조하였다. 대두분과 옥수수분을 각각 1 g씩 취해 만난아제 40 unit/mL이 되도록 첨가하고 반응조건은 단위동물의 소장의 생리적 조건인 pH 6.5, 반응온도 37℃로 하여 6시간동안 처리하였다.
표 5에 나타난 바와 같이, 반응시간에 따라 대두분과 옥수수분이 분해되어 반응액에 환원당 값이 증가하는 것으로 나타났으며 특히 반응시간이 1시간내에서 환원당 발생량이 많은 것으로 관찰되었다. 상기의 결과로부터 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주 유래의 만난아제는 사료첨가제로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명 바실러스 속 WL-7로부터 생산되는 만난아제의 대두분과 옥수수분 분해능
반응 시간 (시간) 반응후 생성된 환원당의 양 (μmole)
대두분 옥수수분
0 0 0
1 34 42
2 37 58
3 38 62
4 40 64
5 39 71
6 39 70
본 발명을 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 전통식품인 된장으로부터 분리한 만난 분해능이 있는 신규한 바실러스 속 WL-7 균주(Bacillus sp. WL-7) (KCTC 10279BP)는 발효에 관여하는 바실러스 서브틸리스와 유사하고 안전성이 우수한 균주이며, 곤냑과 LBG를 함유한 배지에서 만난아제를 대량 생산하는데 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명의 바실러스 속 WL-7 균주(Bacillus sp. WL-7)(KCTC 10279BP)로부터 생산되는 만난아제는 중성 pH와 중성온도에서 반응성이 높고 곡류에 존재하는 헤미셀룰로즈 분해에 뛰어난 효과가 있어 사료첨가제로서 제조될 수 있어사료산업과 식품산업에 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1은 바실러스 속 WL-7(Bacillus sp. WL-7) 균주로부터 생산된 만난아제의 온도와 pH에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 탄소원으로 0.5%곤냑과 0.5% 아카시아 열매수지 유래의 갈락토만난을 첨가한 LB 배지에서 본 발명 바실러스 속 WL-7 균주를 배양시, 배양시간에 따른 생균수와 배양액 내에서의 만난아제의 생산성을 나타낸 그래프이다.

Claims (4)

  1. pH 5.0∼7.5와 37℃에서 최적의 활성을 가지며 곡류에 존재하는 헤미셀룰로즈를 분해하는 만난아제를 생산하는 전통식품인 된장으로부터 분리한 바실러스 속 WL-7 균주(Bacillus sp. WL-7)(기탁번호 KCTC 10279BP).
  2. 트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L 및 NaCl 5 g/L를 포함하는 LB배지에 곤냑과 아카시아 열매수지(LBG)를 각각 0.5% 씩을 넣어 제조한 후 상기 배지에 바실러스 속 WL-7(Bacillus sp. WL-7)(기탁번호 KCTC 10279BP) 균주를 접종하고 37℃에서 6 ~ 15시간동안 액체배양한 다음 배양상등액을 농축하고 황산 암모늄염으로 분획하여 침전물을 얻고 상기 침전물을 50 mM 소듐포스페이트 완충액 (pH 6.5)에 현탁한 후 동일한 완충액으로 투석하는 단계를 포함하것을 특징으로 하는 만난아제의 대량생산방법.
  3. 삭제
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