KR100862397B1 - 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 이용한 자일란 분해용 조성물 - Google Patents

자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 이용한 자일란 분해용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR100862397B1
KR100862397B1 KR1020070020157A KR20070020157A KR100862397B1 KR 100862397 B1 KR100862397 B1 KR 100862397B1 KR 1020070020157 A KR1020070020157 A KR 1020070020157A KR 20070020157 A KR20070020157 A KR 20070020157A KR 100862397 B1 KR100862397 B1 KR 100862397B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
xylan
bacillus
composition
strain
enzyme
Prior art date
Application number
KR1020070020157A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080079768A (ko
Inventor
이윤식
이존화
라타나카노챠이 카녹
레이 규 킨
Original Assignee
전북대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전북대학교산학협력단 filed Critical 전북대학교산학협력단
Priority to KR1020070020157A priority Critical patent/KR100862397B1/ko
Publication of KR20080079768A publication Critical patent/KR20080079768A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100862397B1 publication Critical patent/KR100862397B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01072—Acetylxylan esterase (3.1.1.72)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01037—Xylan 1,4-beta-xylosidase (3.2.1.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01055—Alpha-N-arabinofuranosidase (3.2.1.55)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 이용한 자일란 분해용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 할로두란스 BK, 이를 포함하는 농업 잔존물 및 크라프트 펄프 분해용 조성물 및 상기 균주를 이용하여 자일란 분해효소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바실러스 할로두란스 BK는 자일란 분해효소를 생산하므로 이를 이용하여 농업 잔존물 및 크라프트 펄프를 가수분해함으로써 농업 잔존물의 재활용 산업 및 펄프 산업에 사용될 수 있다.
자일란 분해효소, 바실러스 할로두란스 BK

Description

자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 이용한 자일란 분해용 조성물{A composition for discompositing xylane by use of Bacillus sp producing xylanolytic enzyme}
도 1은 본 발명의 바실러스 할로두란스 BK(Bacillus halodurans BK)로부터 생산된 자일란 분해효소의 SDS-PAGE 결과이다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 펠렛-결합 분획
레인 3: 세포외 분획
도 2는 본 발명의 바실러스 할로두란스 BK(Bacillus halodurans BK)로부터 생산된 자일란 분해효소 활성을 배양 시간에 따라 나타낸 그래프이다.
●: 펠렛-결합 자일라나제, ▲: β-자일로시다제
○: 아라비노퓨라노시다제
도 3은 본 발명의 바실러스 할로두란스 BK(Bacillus halodurans BK)의 배양 상등액처리에 따른 농업 잔존물로부터 방출된 환원당의 양을 시간의 경과에 따라 나타낸 그래프이다.
◆: 옥수수 외피, ●: 옥수수 속대
□: 사탕수수 착즙박, △: 볏짚
× : 쌀겨, ○: 미강
도 4는 본 발명의 바실러스 할로두란스 BK(Bacillus halodurans BK)의 배양 상등액의 처리에 따른 비표백 크라프트 펄프의 가수분해 정도를 시간의 경과에 따라 나타낸 그래프이다.
◆: 사탕수수 착즙박 펄프, ●: 유칼리투스 펄프
▲: 소나무 펄프
본 발명은 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 이용한 자일란 분해용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 할로두란스 BK(Bacillus halodurans BK), 이를 포함하는 농업 잔존물 및 크라프트 펄프 분해용 조성물 및 상기 균주를 이용하여 자일란 분해효소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
생명공학의 한 가지 목적은 농업 및 식품 산업에서 발생하는 폐기물을 에너지, 화학물 및 동물 사료의 생산에 사용함으로써 환경오염을 억제하는 것이다. 이러한 이유로 인해, 다수의 연구자들은 연료의 생산 및 산업적 이용에 있어서 미생물 효소를 사용하는데 관심을 갖고 있다. 헤미셀룰로스는 고등 식물에 있어서 두 번째로 많은 다당류이기 때문에, 농업 폐기물의 리그노셀룰로스의 효소적 당화에 있어서 셀룰로오스-분해 효소의 중요성이 증가되고 있다.
헤미셀룰로오스의 대부분을 차지하는 자일란은 β-1,4-글리코시드 결합(glycosidic bond)으로 연결된 자일로스(xylose) 골격에 아세테이트(acetate) 또는 아라비노오스(arabinose), 글루쿠론산(glucuronic acid)이 분지를 이루고 있는 이종중합체(heteropolymer)이다.
자일란의 가수분해를 위해서는 자일라나제(1,4-β-자일란 자일라노하이드로라제; EC 3.2.18) 및 β-자일로시다제(1,4-β-자일란 자일로하이드로라제; EC 3.2.1.37)가 필요하며, 측쇄-분해 효소(side chain-cleaving enzyme)로서 α-L-아라비노퓨라노시다제(EC 3.2.1. 55), α-글루쿠로니다제(EC 3.2.1.139) 및 아세틸자일란 에스터라제(EC 3.1.1.72)의 상호작용이 요구된다.
자일란 분해효소와 관련된 연구로는 효모에서 발현된 엔도자일라나제 및 β-자일로시다제가 보고 된 바 있으며, 실리카 플레이트 상에서 표면 고정화한 재조합 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)로부터 생산된 엔도자일라나제가 있다 (Kang S. C. et al., J Microbiol Biotechnol 12:766-772, 2002). 또한, 열 안정성 재조합 자일라나제를 생산하는 자일라나제 유전자, xyn A가 스트렙토마이세스 써모시아네오비오라세우스(Streptomyces thermocyaneoviolaceus)로부터 클로닝되었으며(Choi, J. H. et al., J Microbiol Biotechnol 16:57-63, 2006), 트리코더마 하 지아눔(Trichoderma harzianum)이 분리되었고 자일라나제를 생산하는 것으로 발견되었다.
미생물이 생산하는 자일란 분해효소는 현재 그 이용성이 매우 높으며 앞으로도 그 용도가 다양하게 개발될 것으로 기대되는 효소이다. 즉, 자일란 분해효소는 재생가능한 생물자원인 식물성 섬유물질을 분해하고 당화하여 에너지 자원화할 수 있으며 헤미셀룰로오스로부터 발효성 당을 회수하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 고급용지의 생산 및 폐지재생과 관련하여 크라프트 펄프의 표백(bleaching)을 촉진함으로써 섬유 특성을 향상시키기 위한 용도로 사용될 수 있다.
이에 본 발명자들은 자일란 분해효소를 생산하는 미생물에 대해 연구하던 중 새롭게 분리 및 동정된 바실러스 속 균주가 자일란 분해효소를 생산하여 농업 잔존물 및 크래프트 펄프에서 자일란을 분해하는데 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 매우 높은 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주 및 그 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 할로두란스 BK(Bacillus halodurans BK)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 농업 잔존물 또는 크라프트 펄프 분해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양한 다음 배양액과 균체를 회수하는 것을 특징으로 하는 자일란 분해효소의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 바실러스 할로두란스 BK(Bacillus halodurans BK)는 호기성이며, 포자를 형성하는 간상의 그램양성 균주로 태국 방콕의 새우 배양 연못에서 분리되었다. 균주는 동정을 위한 16S rRNA 서열 분석결과 바실러스 속(동질성= 1404/1430 (98%))으로 동정되었고, 본 발명자들에 의해 2007년 2월 26일자로 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC, 대전 광역시 유성구 어은동 52번지)에 기탁번호 KCTC 11075BP로 기탁하였다.
본 발명의 바실러스 할로두란스 BK는 호염성 조건 하에서 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며 바람직하게는 탄소원으로 자일란을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 균주의 배양은 자일란을 함유한 버그스 미네랄 염 배지에서 수행할 수 있다. 바람직하게는 pH 범위 9~10.5, 온도 35~37℃의 조건 하에서 1~2일 바람직하게는, 36~48시간 동안 배양할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 미생물은 당 업계에 공지된 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지거나 또는 이보다 우수한 활성을 가지도록 개선 또는 개량될 수 있다.
본 발명의 바실러스 할로두란스 BK는 자일란 분해효소를 생산하는 특징이 있다. 상기 자일란 분해효소로는 자일라나제(xylanase), β-자일로시다제(β-xylosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase), α-글루쿠로니다제(α-glucuronidase) 및 아세틸자일란 에스터라제(acetylxylan esterase)가 포함된다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 바실러스 할로두란스 BK로부터 유래된 세포외 분획, 세포내 분획 및 펠렛-결합 분획에서 자일라나제, β-자일로시다제, 아라비노퓨라노시다제 및 아세틸 에스터라제와 같은 자일란 분해효소의 활성을 측정한 결과(실시예 2 참조), 세포외 분획 및 펠렛-결합 분획에서 자일라나제 활성이 검출되었고, 세포외 분획 및 세포내 분획에서 β-자일로시다제와 아라비노퓨라노시다제 활성이 검출되었다. 또한, 아세틸 에스터라제는 세포외 분획에서만 검출되었다(표 1).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 바실러스 할로두란스 BK 유래 조효소(crude enzyme)의 불용성 자일란에 대한 결합능을 조사한 결과(실시예 3 참조), 본 발명의 균주 유래 효소는 불용성 자일란에 거의 완전하게 결합함을 확인할 수 있었다(도 1 참조). 이는 본 발명의 균주 유래 효소가 자일란-결합 도메인을 가지고 있음을 의미한다.
나아가, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에서 바실러스 할로두란스 BK의 배양 시간에 따른 효소활성을 조사하였다. 그 결과, 배양 1일 후 가장 높은 효소 활성이 관찰되었고 배양 2일부터는 감소되는 경향을 나타냈다(도 2 참조).
본 발명의 바실러스 할로두란스 BK는 자일란 분해효소를 생산하므로 농업 잔존물, 수용성 및 불용성 자일란, 리그노셀룰로스 물질 및 비표백 크라프트 펄프의 가수분해에 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 바실러스 할로두란스 BK 유래 효소가 농업 잔존물(agricultural residue)을 가수분해할 수 있는지 여부를 조사한 결과, 본 발명의 균주 유래 효소는 옥수수 외피, 사탕수수 착즙박, 볏짚, 옥수수 속대, 쌀겨 및 미강과 같은 농업 잔존물을 가수분해하여 환원당을 생성할 수 있음을 확인하였다(도 3 참조). 따라서 상기 박테리아 유래의 효소는 에탄올 생산을 위해 농업 잔존물을 자일로스 및 자일로올리고사카라이드로 가수분해하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서 바실러스 할로두란스 BK 유래 효소가 수용성 및 불용성 자일란을 가수분해할 수 있는지 여부를 조사한 결과, 자일란-결합 세포외 효소 및 펠렛-결합 자일라나제는 자일란-결합능을 가지고 있기 때문에, 불용성 자일란을 효과적으로 가수분해하는 것으로 나타났다. 자일란-비결합 효소의 경 우에는 수용성 자일란을 자일란-결합 효소에 비해 더 잘 가수분해하는 것으로 나타났다(표 2 참조). 상기 실험결과로부터 수용성 자일란의 분해에 있어서는 자일란-결합 도메인이 중요하지 않음을 알 수 있었다.
나아가, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 바실러스 할로두란스 BK 유래 효소가 리그노셀룰로스 물질 및 비표백 크라프트 펄프를 가수분해할 수 있는지 여부를 조사하였다(실시예 7 참조). 그 결과, 본 발명의 효소는 염기성 조건 하에서 리그노셀룰로스 물질 및 비표백 크라프트 펄프를 가수분해하여 환원당을 생성함을 확인할 수 있었다(표 3 참조).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 비표백 크라프트 펄프에 바실러스 할로두란스 BK 유래 자일란 분해효소를 염기성 조건 하에서 처리하여 가수분해하고 일정한 시간 간격에 따라 방출된 환원당의 함량을 측정하였다(실시예 8 참조). 그 결과, 사탕수수 착즙박의 자일란이 가장 가수분해하기 쉬운 것으로 나타났다(도 4 참조). 펄프 자일란의 분해는 펄프 전-표백 프로세스에 있어서 중요한 인자(key)가 되는 파라미터이므로, 본 발명의 바실러스 할로두란스 BK 유래 효소는 펄프의 가공에 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 바실러스 할로두란스 BK를 포함하는 농업 잔존물 또는 크라프트 펄프 분해용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 바실러스 할로두란스 BK는 생균, 사균, 건조균, 배양액의 형태로 포함될 수 있다. 상기 배양액은 본 발명에 따른 균주를 적합한 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 여액을 농축한 농축액, 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 라이소자임(lysozyme)을 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등이 포함된다.
상기 배양액 및 세포 파쇄액에는 자일란 분해효소를 포함하는 조효소액이 함유되어 있다. 보다 구체적으로 자일란 분해효소를 함유한 조효소액의 분리는 본 발명의 박테리아 배양액을 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 세포외 분획을 수득하거나 상등액을 회수하고 남은 펠렛을 세척한 다음 재현탁하고 원심분리하여 펠렛 결합-분획을 수득함으로써 수행할 수 있다. 나아가, 펠렛-결합 분획을 회수한 후 남은 펠렛을 라이소자임으로 처리하여 세포내 분획을 수득함으로써 수행할 수 있다.
상기와 같이 분리한 조효소액 및 효소는 농업 잔존물 또는 크라프트 펄프 분해에 모두 사용할 수 있으며, 수율 및 경제성을 최대화할 수 있도록 고정화 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바실러스 할로두란스 BK는 다양한 고정화 담체를 사용하여 당 업계에 공지된 방법에 따라 고정될 수 있다. 고정화 담체로는 당 업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들면 이에 한정되지는 않으나, 셀룰로오스(cellulose), 덱스트란(dextran), 아가로오스(agarose), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 알긴산나트륨(sodium alginate) 등이 있다. 또한, 본 발명의 미생물은 세라 믹(ceramic), 슬래그(slag) 또는 플라스틱(plastics) 등과 같은 고체표면에 고정시켜 사용할 수 있다. 당업계에 공지된 고정화 방법으로는 예를 들면, 공유결합, 이온결합, 흡착법, 가교법, 포괄법 등이 있다.
본 발명의 균주는 고정화된 담체에서 생장, 번식 할 수 있는 수준의 양 이상으로 사용되어야 하며 미생물이 과다하여 담체가 그 기능을 충분히 수행할 수 없어서도 안 된다. 이러한 관점에서 볼 때 본 발명의 바실러스 할로두란스 BK의 사용량은 미생물의 종류 및 기질의 종류에 따라 다를 수 있으나 일반적으로 본 발명의 조성물은 1~2g의 양으로 미생물이 함유되도록 한다.
또한, 본 발명의 조성물은 미생물 보호제로서 적합한 글리세롤, 분유, 우유, 탈지분유 또는 동식물유 등을 추가로 첨가할 수 있으며, 영양 공급원으로서 섬유소 분말, 대두박 분말, 면실박 분말, 각종 동식물성 펩톤, 밀기울 분말, 옥수수 추출물, 효모 추출액, 당밀, 포도당, 설탕, 옥수수시럽 등과 같은 탄소원 및 질소원과 무기염류 등을 추가로 포함하여 본 발명에 따른 미생물의 생장을 촉진하도록 할 수 있다.
상기와 같은 방법에 의해 수득된 조성물은 일반적인 제형기를 사용하여 적당한 크기의 분말, 펠렛 또는 과립 등의 다양한 형태로 제형화 될 수 있다. 상기에서 제형화된 본 발명의 조성물은 그대로 사용되거나 또는 실온에서 풍건하거나 동결 건조 또는 고온 건조 방법으로 건조시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에 의해 가수분해 될 수 있는 농업 잔존물로는 농업 및 식품산업의 섬유성 폐기물을 말하며 식물의 줄기, 잎, 짚, 속대, 겨, 손상된 곡류, 과일, 야채류 등과 가공 후의 껍질, 종자, 잎, 송이, 껍질, 착즙박 등이 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면, 한정되지는 않으나 옥수수 외피(corn hull), 옥수수 속대(corn cop), 사탕수수 착즙박(sugarcane bagasse), 볏짚(rice straw) 쌀겨(rice husk) 및 미강(rice bran) 등이 있다.
상기 농업 잔존물을 본 발명의 조성물로 가수분해함으로써 다양한 당류로 전환시킬 수 있다. 따라서 환경오염을 방지하면서 농업 잔존물을 재활용할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 조성물에 의해 가수분해 될 수 있는 크라프트 펄프의 예로는 이에 한정되지는 않으나 사탕수수 착즙박 펄프, 유칼리투스 펄프 및 소나무 펄프 등이 있다.
상기 크라프트 펄프를 본 발명의 조성물로 가수분해함으로써 크라프트 펄프 내 자일란의 함량을 감소시켜 펄프의 광도와 표백도를 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 균주를 배양한 다음 배양액과 균체를 회수하는 것을 특징으로 하는 자일란 분해효소의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 균주의 바람직한 배양 조건 및 배양액과 균체의 회수방법은 상술한 바와 같다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에 만 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
미생물 및 배양
호염성 바실러스 할로두란스 BK(Bacillus halodurans BK, KCTC 11075BP)는 태국 방콕의 새우 배양에 사용되는 연못에서 분리되었다. 상기 미생물을 0.5% 자일란을 함유한 버그스 미네랄 염 배지(Berg's mineral salts medium)(Berg, B. et al., J. Appl. Bacteriol. 35:201-214, 1972)에서 배양하였다. 오토클래브 후 배지의 pH는 1% Na2CO3를 이용하여 10.5로 조정하였다. 상기 배양물을 회전 교반기에서 37℃로 2일간 배양하였다.
<실시예 2>
본 발명의 박테리아 유래 분획의 효소활성 분석
상기 실시예 1의 박테리아로부터 유래된 세포외, 세포내 및 펠렛-결합의 3개의 분획에서 자일라나제, β-자일로시다제, 아라비노퓨라노시다제 및 아세틸 에스터라제와 같은 자일란분해 효소 활성을 측정하였다.
호염성 자일란(0.5%) 배지에서 박테리아를 37℃에서 3일간 배양한 후 상기 배양물을 10,000rpm으로 10분간(4℃) 원심분리하였다. 상등액을 회수하여 세포외 효소 활성의 분석에 사용하였다. 펠렛(세포+자일란 잔여물)을 원심분리에 의해 다량의 PBS(phosphate-buffered saline, 0.15M sodium chloride in 0.1M potassium phosphate buffer, pH 7.0)로 세척하였다. 상기 펠렛을 2% 트리에틸아민(TEA)에 4℃에서 30분간 일정하게 교반하여 재현탁하였다. 원심분리 후, 상등액을 회수하고 펠렛-결합 분획의 효소 활성을 측정하기 위해 사용하였다. 상기 펠렛을 동일한 조건 하에서 PBS로 다시 한번 세척하고 PBS에 재현탁한 다음 pH 8.0(10mM Tris-HCl 완충액)에서 라이소자임(10mg/ml)으로 30℃에서 20분간 반응시켰다. 원심분리 후, 상등액을 회수하여 세포 내 효소 활성 분석에 사용하였다.
자일라나제 활성은 귀리 스펠트 자일란(Sigma, USA)으로부터 방출된 환원당의 양을 측정함으로써 결정하였다. 반응 혼합물은 50mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.0)에 용해되어 있는 0.5% 자일란 및 효소로 이루어져 있다. 50℃에서 10분간 반응시킨 후, 증가된 환원당을 소모기-넬슨 방법(Somogyi-Nelson)에 의해 측정하였다(Somogyi, M. J. Biol. Chem 195:19-23, 1952). 효소 활성의 1unit은 상기 조건 하에서 1분간 1mol의 환원당을 방출시키는 효소의 양으로 정의하였다.
셀룰라제 활성은 기질로 카르복시메틸셀룰로스(Sigma, USA)를 이용하여 상술한 바와 동일한 조건 하에서 측정하였다. β-자일로시다제, 아라비노퓨라노시다제, β-글루코시다제 및 아세틸 자일란 에스터라제 활성은 이전의 공지된 방법에 따라 분석하였다(Ratanakhanokchai K et al., Appl. Environ. Microbiol. 65:694- 697, 1999). 단백질 농도는 표준물질로서 소 혈청 알부민을 이용한 로우리 방법에 의해 측정하였다(Lowry O H et al., J. Biol. Chem. 193:265-275, 1951).
실험 결과, 자일라나제 활성은 세포외 분획 및 펠렛-결합 분획에서 검출되었고, β-자일로시다제와 아라비노퓨라노시다제는 세포외 및 세포내 분획에서 모두 검출되었다. 아세틸 에스터라제는 세포외 분획에서만 검출되었다. 효소들 중에서 자일라나제가 가장 높은 활성을 가지고 있었다. 특히, 자일라나제 활성은 펠렛-결합 분획에 비해 세포외 분획에서 6배나 높은 것으로 나타났다(표 1).
자일라나제, 아라비노퓨라노시다제, 아세틸 에스터라제 및 β-자일로시다제의 단백질 mg 당 효소의 비활성도(specific activity)는 각각 1.23, 0.11, 0.06, 및 0.04unit이었다. 한편, 셀룰라제 활성은 검출되지 않았다.
바실러스 할로두란스 BK 균주의 세포외, 펠렛-결합, 세포내 분획에서의 효소 활성
효소 유래 효소활성(U/mg protein)
자일라나제 β-자일로시다제 아라비노퓨라노시다제 아세틸자일란-에스터라제
세포외 10.14 0.51 0.78 0.98
펠렛-결합 1.69 ND ND ND
세포내 ND 0.64 2.25 ND
ND: 효소활성이 검출되지 않음
<실시예 3>
불용성 자일란과의 결합능
상기 실시예 2에 나타낸 바와 같이 자일라나제, β-자일로시다제, 아라비노퓨라노시다제 및 아세틸 에스터라제는 모두 세포외 분획에서 검출되었으며, 펠렛-결합 분획에서는 자일라나제 활성만이 검출되었다.
조효소(crude enzyme)의 SDS-PAGE 및 지모그램(Zymogram)은 자일라나제의 2개의 주요 단백질 밴드를 나타내는 것으로 보고 된 바 있으며, 그들의 분자량은 약 29 및 40 kDa로 추정되고 있다. 또한, 저분자량 자일라나제(29kDa)는 자일란-결합 영역을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Millward-Sadler et al., Molec Microbiol 11:375-382, 1994).
이에 본 발명의 자일란 분해효소가 불용성 자일란에 결합하는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2의 바실러스 할로두란스 BK의 세포외-분획 또는 펠렛-결합 분획의 단백질 5mg에 불용성 자일란(귀리 스펠트) 50mg이 용해된 50mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.0) 1.0ml을 첨가하였다. 그 다음 상기 시료를 원심분리하기 전에 4℃에서 30분간 흔들었다. 상등액에 남아있는 효소의 양을 측정하기 위해 공지된 방법에 따라 SDS-PAGE를 수행하고 쿠마시-블루 R-250으로 염색하였다(Laemmli U.K. Nataure 227:680-685, 1970).
실험결과, 자일란 분해효소는 불용성 자일란에 결합하는 것으로 나타났다. 한편, 세포외-분획에서는 9개의 이성화 형태를 지닌 자일란 분해효소가 함유되어 있음을 확인할 수 있었다. 이들의 분자량은 23, 30, 39, 및/또는 40, 45, 56, 63 및 82kDa로 다양하게 나타났다(도 1).
< 실시예 4>
시간의 경과에 따른 자일란 분해효소 활성
배양 시간에 따른 자일란 분해효소 활성을 1일 간격으로 측정하였다. 박테리아의 배양은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였으며, 1일 간격으로 배양액을 회수하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 효소 활성을 측정하였다.
실험 결과, 배양 1일 후 가장 높은 효소 활성이 관찰되었고 그 다음에는 약하게 감소되는 경향을 나타냈다. 아라비노퓨라노시다제 및 β-자일로시다제가 세포내 분획에서 검출되었으며, 펠렛-결합 자일라나제는 배양 1일 후에 최고점에 도달하였다(도 2). 이러한 효소들의 활성 수준은 배양 2일 후 감소하였다.
<실시예 5>
농업 잔존물의 가수분해
옥수수 외피(corn hull), 옥수수 속대(corn cop), 사탕수수 착즙박(sugarcane bagasse), 볏짚(rice straw) 쌀겨(rice husk) 및 미강(rice bran)과 같은 농업 잔존물을 40mesh로 분쇄한 다음 따뜻한 증류수로 세척하여 남아있는 당 성분을 세척하였다. 상기 각각의 농업 잔존물(0.5% 건조중량)에 pH 7.0(50mM 인산나트륨 버퍼), 50℃에서 실시예 2의 박테리아 배양 상등액을 첨가하여 60분간 배양하면서 15분 간격으로 샘플링하여 생성된 환원당의 양을 측정하였다. 환원당의 양은 소모기-넬슨 방법(Somogyi-Nelson)에 의해 측정하였다(Somogyi, M. J. Biol. Chem 195:19-23, 1952).
실험 결과, 옥수수 외피의 가수분해율이 가장 높은 것으로 나타났으며 그 다음으로는 사탕수수 착즙박, 볏짚, 옥수수 속대, 쌀겨 및 미강의 순으로 나타났다(도 3).
바실러스 할로두란스 BK는 자일란-결합능을 가진 세포외 셀룰라아제-프리 자일란분해 효소를 생산한다. 따라서 조효소는 농업 잔존물을 가수분해할 수 있다. 이러한 농업 잔존물의 효소 가수분해에 대한 각기 다른 내성은 그들의 리그닌 함량에 의한 것이다. 또한, 자일란의 함량, 위치, 구조와 같은 인자들이 각기 다른 가수분해 내성과 관련이 있다. 한편, 상기 효소는 이러한 물질의 세포벽에서 자일란을 가수분해하는 것으로 나타났고, 이러한 물질로부터 환원당을 상당한 양으로 생산하였다. 따라서 상기 박테리아 유래의 효소는 에탄올 생산을 위해 농업 잔존물을 자일로스 및 자일로올리고사카라이드로 가수분해하는데 사용될 수 있다.
<실시예 6>
수용성 및 불용성 자일란의 가수분해
상기 실시예 2의 바실러스 할로두란스 BK 유래 세포외 효소, 비결합 세포외 효소, 결합 세포외 자일라나제 및 펠렛-결합 자일라나제에 의한 불용성 및 수용성 자일란의 가수분해 정도를 분석하였다. 세포외 효소의 배양액상에 존재하는 불용성 및 수용성 자일란은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 귀리 스펠트 자일란(Sigma, USA)의 탈이온수 현탁액(0.5%) 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 상기 혼합물을 3,000ㅧg에서 10분간 원심분리하고 수용성 분획을 포함하는 상등액을 회수한 다음 냉동건조하였다. 불용성 분획을 포함한 펠렛을 20부피의 탈이온수로 2회 세척하고 냉동건조하였다.
상기 불용성 및 수용성 자일란에 본 발명의 효소(30mg protein)를 pH 7.0, 50℃의 조건 하에서 20분간 처리하고 방출된 환원당의 양을 소모기-넬슨법에 의해 측정하였다.
실험 결과, 결합 세포외 효소 및 펠렛-결합 자일라나제는 자일란-결합능을 가지고 있기 때문에, 불용성 자일란을 효과적으로 가수분해하는 것으로 나타났다. 결합 효소에 의한 환원당의 양은 효소 환원당량의 75.3%였다. 비결합 효소(53.2%)가 수용성 자일란을 결합 효소에 비해 더 잘 가수분해하는 것으로 나타났다(표 2). 따라서 자일란-결합 영역은 수용성 자일란의 가수분해에서 중요하지 않음을 알 수 있었다.
불용성 및 수용성 자일란의 가수분해
귀리 스펠트 자일란 효소 환원당(mg/ml) 상대적 환원당(%)
불용성 자일란 세포외 효소 0.81 100.00
비결합 세포외 효소 0.30 37.04
결합 세포외 자일라나제 0.61 75.31
펠렛-결합 자일라나제 0.34 41.97
수용성 자일란 세포외 효소 0.79 100.00
비결합 세포외 효소 0.42 53.16
결합 세포외 자일라나제 0.29 36.71
펠렛-결합 자일라나제 0.14 17.72
<실시예 7>
리그노셀룰로스 물질 및 비표백 크라프트 펄프의 자일란 가수분해
옥수수 외피, 사탕수수 착즙박, 볏짚 및 유칼리투스 나무와 같은 리그노셀룰로스 물질(1% 건조중량)에 바실러스 할로두란스 BK 유래 자일란분해 효소(1U)를 pH 7.0, 50℃의 조건 하에서 1시간 동안 처리하여 가수분해하였다. 또한 사탕수수 착즙박 펄프, 유칼리투스 펄프 및 소나무 펄프와 같은 비표백 크라프트 펄프에 바실러스 할로두란스 BK 균주 유래 자일란 분해효소를 pH 9.0 및 40℃의 조건 하에서 1시간 동안 처리하여 가수분해하고 세포외 분획에 방출된 환원당의 함량을 실시예 2와 동일한 방법으로 분석하였다.
실험 결과, 옥수수 외피 및 사탕수수로부터 방출된 환원당 함량은 실험에 사용된 물질에 비해 더 높은 것으로 나타났다. 이는 자일란 함량과 구조적 복잡성에 기인한 것으로 사료된다. 또한, 본 발명의 효소는 사탕수수 착즙박, 유칼리투스 나무 및 소나무의 펄프에서 자일란을 가수분해하는 것으로 나타났다(표 3).
리그노셀룰로스 물질 및 비표백 크라프트 펄프의 가수분해
기질 환원당(㎍/U enzyme)
리그노셀룰로스 물질 옥수수 외피 198.8
사탕수수 착즙박 95.9
볏짚 52.1
유칼리투스 나무 46.2
비표백 크라프트 펄프 사탕수수 착즙박 펄프 159.8
유칼리투스 펄프 79.5
소나무 펄프 45.4
< 실시예 8>
비표백 크라프트 펄프의 시간의 경과에 따른 가수분해 정도
사탕수수 착즙박 펄프, 유칼리투스 펄프 및 소나무 펄프와 같은 비표백 크라프트 펄프에 바실러스 할로두란스 BK 균주 유래 자일란분해 효소를 pH 9.0 및 40℃의 조건 하에서 처리하여 가수분해하고 일정한 시간 간격에 따라 방출된 환원당의 함량을 측정하였다.
실험 결과, 사탕수수 착즙박의 자일란이 가장 가수분해하기 쉬운 것으로 나타났으며 사탕수수 착즙박의 경우 180분에 방출된 환원당의 수준이 유칼리투스 나무와 소나무에 비해 각각 2.01 및 3.52배 높은 것으로 나타났다(도 4). 펄프 자일란의 분해는 펄프 전-표백 프로세스에 있어서 중요한 인자(key)가 되는 파라미터이다.
본 발명에 따른 바실러스 할로두란스 BK는 자일란 분해효소를 생산하므로 이를 이용하여 농업 잔존물 및 크라프트 펄프를 가수분해함으로써 농업 잔존물의 재활용 산업 및 펄프 산업에 사용될 수 있다.

Claims (14)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 이용하여 자일란을 분해하기 위한 조성물에 있어서,
    상기 자일란 분해효소는 β-자일로시다제(β-xylosidase),α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase), 또는 아세틸자일란 에스터라제(acetylxylan esterase)로부터 선택된 1종이고,
    상기 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주는 바실러스 할로두란스 BK(Bacillus halodurans BK, 기탁번호:KCTC 11075BP) 균주이고,
    상기 자일란은 농업 잔존물내 자일란이고,
    셀룰로오스(cellulose), 덱스트란(dextran), 아가로오스(agarose), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 알긴산나트륨(sodium alginate), 세라믹(ceramic), 슬래그(slag), 또는 플라스틱(plastics)으로부터 선택된 고정화 담체를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 자일란 분해용 조성물
  4. 제3항에 있어서, 바실러스 할로두란스 BK(Bacillus halodurans BK) 균주(기탁번호: KCTC 11075BP)의 생균, 사균, 건조균 또는 배양액으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제3항에 있어서, 상기 농업 잔존물이 식물의 줄기, 잎, 짚, 속대, 겨, 손상된 곡류, 과일 및 야채류, 가공 후의 껍질, 종자, 잎, 송이, 껍질, 착즙박으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 이용하여 자일란을 분해하기 위한 조성물에 있어서,
    상기 자일란 분해효소는 β-자일로시다제(β-xylosidase),α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase), 또는 아세틸자일란 에스터라제(acetylxylan esterase)로부터 선택된 1종이고,
    상기 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주는 바실러스 할로두란스 BK(Bacillus halodurans BK, 기탁번호:KCTC 11075BP) 균주이고,
    상기 자일란은 크라프트 펄프내 자일란이고,
    셀룰로오스(cellulose), 덱스트란(dextran), 아가로오스(agarose), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 알긴산나트륨(sodium alginate), 세라믹(ceramic), 슬래그(slag), 또는 플라스틱(plastics)으로부터 선택된 고정화 담체를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 자일란 분해용 조성물
  13. 제12항에 있어서, 바실러스 할로두란스 BK(Bacillus halodurans BK) 균주(기탁번호: KCTC 11075BP)의 생균, 사균, 건조균 또는 배양액으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 크라프트 펄프가 사탕수수 착즙박 펄프, 유칼리투스 펄프 및 소나무 펄프로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
KR1020070020157A 2007-02-28 2007-02-28 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 이용한 자일란 분해용 조성물 KR100862397B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070020157A KR100862397B1 (ko) 2007-02-28 2007-02-28 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 이용한 자일란 분해용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070020157A KR100862397B1 (ko) 2007-02-28 2007-02-28 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 이용한 자일란 분해용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080079768A KR20080079768A (ko) 2008-09-02
KR100862397B1 true KR100862397B1 (ko) 2008-10-13

Family

ID=40020558

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020070020157A KR100862397B1 (ko) 2007-02-28 2007-02-28 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 이용한 자일란 분해용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100862397B1 (ko)

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biotechnology Letters 24: pp.1487~1490, 2002*
Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol.93, No.4, pp.428-430, 2002
Journal of Molecular catalysis B: Enzymatic 21, 2003, pp.221~230.*
The Journal of Biological Chemistry, Vol.279, No.53, pp.55097-55103, 2004.12.31.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080079768A (ko) 2008-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chi et al. Bioproducts from Aureobasidium pullulans, a biotechnologically important yeast
Biely Microbial xylanolytic systems
Mihajlovski et al. From agricultural waste to biofuel: enzymatic potential of a bacterial isolate Streptomyces fulvissimus CKS7 for bioethanol production
Sanghi et al. Optimization of xylanase production using inexpensive agro-residues by alkalophilic Bacillus subtilis ASH in solid-state fermentation
JP5329237B2 (ja) タラロマイセス・エマーソニイ酵素系
Lowe et al. Cellulases and xylanase of an anaerobic rumen fungus grown on wheat straw, wheat straw holocellulose, cellulose, and xylan
Bajaj et al. Production of xylanase from an alkalitolerant Streptomyces sp. 7b under solid-state fermentation, its purification, and characterization
Okafor et al. Xylanase production by Aspergillus niger ANL 301 using agro-wastes
Sanjivkumar et al. Biosynthesis, purification and characterization of β-1, 4-xylanase from a novel mangrove associated actinobacterium Streptomyces olivaceus (MSU3) and its applications
Teunissen et al. Anaerobic fungi and their cellulolytic and xylanolytic enzymes
Shin et al. A complete enzymatic recovery of ferulic acid from corn residues with extracellular enzymes from Neosartorya spinosa NRRL185
Theodorou et al. Anaerobic fungi in the digestive tract of mammalian herbivores and their potential for exploitation
EA021855B1 (ru) Штаммы talaromyces и ферментные композиции
EA028880B1 (ru) Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров
Odeniyi et al. Production characteristics and properties of cellulase/polygalacturonase by a Bacillus coagulans strain from a fermenting palm-fruit industrial residue
Guo et al. Enhancing digestibility of Miscanthus using lignocellulolytic enzyme produced by Bacillus
Santos et al. Production of α-amylase from Streptomyces sp. SLBA-08 strain using agro-industrial by-products
Ismail et al. Valorization of corn cobs for xylanase production by Aspergillus flavus AW1 and its application in the production of antioxidant oligosaccharides and removal of food stain
EP1292669B1 (en) Novel bacillus sp. wl-1 strain producing mannanase
Marimuthu et al. Production and Optimization of Xylanase Enzyme from Bacillus subtilis using Agricultural Wastes by Solid State Fermentation.
Kovacs et al. Production of chitinolytic enzymes with Trichoderma longibrachiatum IMI 92027 in solid substrate fermentation
Fadel et al. Cellulases and animal feed production by solid-state fermentation by Aspergillus fumigatus NRCF-122 mutant
WO2007114729A1 (en) Method of lignocellulose materials saccharification using enzymes produced by penicillium fimiculosum
Nurudeen et al. Cellulase and Biomass Pro duction from Sorghum (Sorghum guineense) Waste by Trichoderma longibrachiatum and Aspergillus terreus
KR100862397B1 (ko) 자일란 분해효소를 생산하는 바실러스 속 균주를 이용한 자일란 분해용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130930

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140122

Year of fee payment: 8

LAPS Lapse due to unpaid annual fee