JP5329237B2 - タラロマイセス・エマーソニイ酵素系 - Google Patents
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Description
収穫したて(〜200g)の清浄な草(芝生)の切取り及び他の混合植物バイオマスは、堆肥化環境をシミュレーションするために閉容器に置かれ、かつ約2時間、65℃で、一定温度のチャンバ内でインキュベートされた(基質の組み合わされた殺菌及び平衡化)。湿度/含水率は、〜65〜70%に維持された。容器は、間隔を空けて、低パルスの湿性の濾過された空気を提供する線を取り付けられた。2時間後、T.エマーソニイ(当初はCBS814.70からの12年経った単離集団の研究所在庫)の胞子懸濁液(2%殺菌水中で1×108の胞子)は、バイオマスの中心領域に接種するために使用された。温度は、2日間65℃に維持され、かつその後、70℃の空気温度にチャンバ内で内部的に到達するまで、24時間毎に2℃の間隔で上げられた。培養物は、培養純粋性を確実にするために、接種された「ホットスポット」又は中心領域の試料が無菌で除去され、かつ寒天板(好熱性菌類用のエマーソン寒天培地)へ移され、かつ経代培養される前に更に7日間増殖させられた。純粋性は、顕微鏡分析によって照合確認された。基本栄養分を含む液体培地(Tuohy et al.,1992;Moloney et al.,1983)及び2%(w/v)のグルコースは、36時間経った寒天板培養物から1cm2の断片の菌がいを接種された。液体培養物は、220回転/分の振盪で、(100mLの増殖培地を含む)250mLのエルレンマイヤーフラスコ中で36時間、55℃で増殖させられた。菌糸体懸濁液のアリコート(2.0mL)は、36時間後で除去され、殺菌水によって無菌で洗浄され、無菌のペトリ皿(直径10mm)へ移され、かつ時限間隔(10〜60秒)で紫外線によって照射された。殺菌寒天培地(2−デオキシグルコースのような0.2%w/vの個別のカタボライトリプレッサを含むノーブル寒天)は、照射された菌類の菌糸体の試料を接種された。同型培養物は、45及び58℃でインキュベートされた。単一のコロニーは、慎重に選択され(ふんわりした白い外観)、サブローブドウ糖寒天板へ無菌で移され、かつ更に幾つかの移送を介して精製された。株IMI393751は、58℃でインキュベートされた板から取られた単離集団である。突然変異体は、強化された熱的安定性及び酵素生成に関して、親生物との比較研究において評価され、それは同一増殖条件で、培養物外観、胞子形成能力(株IMI393751は、胞子形成をしない)、好熱性及び安定性、酵素生成パターン、差別的な発現及び個別の酵素活性のレベルの点で両方の株の間に明瞭な違いを明らかにした。
様々な寒天培地上での増殖中の培養物の外観 − エマーソン寒天上で培養される時、CBS814.70は、この種の典型的特徴を有し(Stolk & Samson,1972)、すなわち淡いクリーム色/淡黄色で、(接種ゾーン周辺で)寒天表面近くに淡い黄色がかった影を有し、それは培養物が成熟するにつれ、濃い暗い淡黄色の/赤褐色に変わり、かつ多くの子嚢果の密度の高い菌がいから成る。対照的に、IMI393751は、遙かに白く、かつ培養物は非常に「ふんわりした」外観を有する。
表4は、アラビノキシラン及びアセチル化ヘミセルロースが豊富な穀物、ビートパルプ、及び(廃棄物を含む)他の材料を変換するために設計されたタラロマイセス・エマーソニイIMI393751及び2種の以前に特定された突然変異株からの設計された酵素系中の様々な酵素活性の相対量を示す。
タラロマイセス・エマーソニイIMI393751は、基質としての種々の紙廃棄物及び紙製品上で増殖された。分泌された酵素は、抽出され、かつ酵素発現は、プロテオーム及びトランスクリプトーム分析によって、かつ機能アッセイの十分なスペクトルによって観察及び定量化された。幾つかの紙廃棄物は、セルラーゼ(及び相補的活性、例えばコート/仕上げ紙製品が使用されたデンプン−加水分解酵素)の優れた誘発物質であることが判明した。様々な紙廃棄物/製品によって誘発された、相対量/タイプのセルラーゼ酵素に対して、差は、明らかに明瞭であった。得られたデータは、セロビオヒドロラーゼI(CBH I)及びセロビオヒドロラーゼII(CBH II)イソ酵素が、最も重要なセルラーゼ活性であること、かつ標的基質中のセルロースのより完全な糖化/生物変換が望まれる場合(例えばバイオ燃料生成のための単糖の豊富な原料の生成)に、β-グルコシダーゼI(BG I)も、非常に重要であることを確認した。
T.エマーソニイIMI393751及び以前に知られた突然変異体から酵素系/サーモザイム組成物の設計のために概説された戦略は、23を超える中温性及び好熱性菌類種によって炭水化物修飾組成物を生成するように構成された。強力なヘミセルラーゼ(キシラナーゼ、マンナナーゼ)及びペクチナーゼが豊富な酵素系のこれらの菌類種による生成/誘発に特別な注意が払われた。
(a)食品/飲料廃棄物の生物変換:リンゴ果肉/絞り滓
(果肉を取り去った)廃棄物リンゴ、リンゴ果肉及び絞り滓は、地域の果物供給業者、食品加工、及びリンゴ汁(酒)/飲料製造販売店から得られた。T.エマーソニイは、(固体及び液体発酵の両方によって)2〜6%のリンゴ果肉/絞り滓上で培養され、かつ高レベルの炭水化物修飾酵素範囲が、測定された。この系は、高レベルのβ−グルカンヒドロラーゼ、主に非セルロースβ−グルカナーゼ(120時間の液体培養濾液中で〜27.4%)、特に高レベルのα−アラビノフラノシダーゼ(総カルボヒドラーゼ活性の13.3%)及びβ−ガラクトシダーゼ(22.6%)を有する相当量の鍵エキソ−グルコシダーゼを特徴とした。追加のエステラーゼ、ペクチン及びキシラン修飾酵素も、検出された(>7.2〜33.5%)。それ故に、上記分析を使用して、リンゴ廃棄物を分解することに適した酵素系を設計することが可能である。
T.エマーソニイは、液体発酵における種々の紙廃棄物上での補足なしに培養された(実施例5参照)。紙コップは、非常に効果的なカルボヒドラーゼ誘発物質であり、高レベルのキシラナーゼ及びデンプン分解酵素活性を有する強力な複数成分酵素カクテルをもたらし、かつセルラーゼ活性のレベルが、従来の増殖基質に関して報告されるよりも高いことが判明した。還元糖を効果的に放出し、かつ紙廃棄物の分解を行うこの酵素系の可能性は、生化学検査及び走査電子顕微鏡法によって明瞭に説明された。走査電子顕微鏡法を使用する、基質の完全性及び形態に関するサーモザイム処理の効果は、紙廃棄物変換のための強力な生物工学ツールとしてのこれらカクテルの可能性を確認する。SEMは、T.エマーソニイカクテルによるセルロースが豊富な基質の処理に続く、多大なセルロース繊維分解(ある種の試料において繊維構造の完全な喪失)の明らかな証拠を提出した。
一次及び二次供給源からの木質残渣及び廃棄物(例えば樹皮、間引き、並びに削り屑及び鋸屑のような加工廃棄物)は、リグニン中に包まれる、ヘミセルロース(〜19〜28%、かつ主にキシラン及びマンナンと、若干の他の多糖類)及びセルロース(〜39〜46%)のような複合炭水化物を含む65〜70%もの乾燥重量を有する広大な資源となる。
検査基質の調製 トウヒチップ(直径2〜10mm)は、2.5%w/wの水分の吸収率まで20分間室温で、二酸化硫黄(3%w/vの水分)によって含浸された。SO2処理されたトウヒは、215℃で2〜5分間、蒸気によって処理された。ヘミセルラーゼ含有量は、ほぼ完全に加水分解された;固体回収率は、開始原材料の60〜65%であった。
標準的酵素加水分解は、〜130回転/分の撹拌によって、300mL、1L及び10Lの反応槽中で37℃、50℃及び60℃で行われた。酵素用量は、緩衝化された基質溶液中のセルロース1g当たり32FPUの各酵素調製であった(Gilleran,2004)。反応緩衝液のpHは、MGBG酵素に関してpH5.0に、かつ商業的調製に関してpH4.8に調節された。試料は、時限間隔を空けて除去され、かつ酵素作用は、各反応混合物(及び対照)を10分間沸騰させることによって終了させられた。最低反応温度(37〜50℃)で、2種の本発明の酵素調製が、商業的なCelluclast調製と同じように性能を発揮し、かつ(ii)3種のMGBG酵素の性能は、商業的Celluclast(及びCelluclast/Novozymブレンド)と同じ範囲にある。
トウヒ加水分解物によるバッチSSF実験は、種々の酵素調製の性能を比較するために行われた。発酵は、4%のトウヒ繊維濃度で行われ、前処理材料は、殺菌水によって所望の濃度まで希釈された。pHは、2MのNaOHの添加によって5.0に維持された。発酵温度は、37℃であり、かつ撹拌器速度は、500回転/分であった。反応培地は、窒素(600ml/分)によって散布され、かつCO2含有量が、ガス分析器によって測定された。酵素調製は、25濾紙単位(FPU)/セルロース1gの装填で、発酵槽に直接添加された。発酵培地には、栄養素が補足された:0.5g/lの(NH4)2HPO4、0.025g/lのMgSO4.7H2O及び1.0g/lの酵母抽出物。添加された酵母(パン酵母、サッカロマイセス・セレビジェー)細胞集団の濃度は、5g/lであり、かつ全てのSSF実験は、72時間37℃で行われた。試料は、種々の時間間隔で引き出され、5分間、14000gで、1.5mlの微小遠心管中で遠心分離され(Z160M;Hemle Labortechnik,Germany)、上清は、次にHPLC分析のために調製された。
順次加水分解及び発酵によって得られたバイオエタノール収率は、商業的及び本発明の酵素調製に関して調査された。SSFの1つの利点は、プロセスが前処理ステップから生じたモノマー糖の初期の高速発酵及び代謝からなることである。一旦グルコースが、添加された加水分解酵素の作用によって基質から放出されると、発酵は速く、そのことはSSFにおいて遊離糖の濃度が、常に低い状態に留まることを意味する。SSFにおいて、発酵速度は、酵素による基質変換速度の減少、又は酵母代謝阻害の、いずれかの律速である方の結果、最終的に減少する。これらの実験において得られたデータは、表15に要約する。
各酵素組成物は、個別の標的用途において評価され、モデル研究は、振盪あり又はなしで、pH2.5〜7.0かつ37〜85℃で50〜250mLの最終反応量中で5〜25gの基質(穀物、穀粉、又は他の植物残渣)によって実験室規模で行われた。酵素性能は、基質前処理、すなわち緩やかな蒸気前処理(105℃、8p.s.iで5分間)、乳鉢及び乳棒を使用する研磨、Parvalux又はUltraturraxホモジナイザ中の均質化あり及びなしで評価された。軟かい果物及び野菜組織/残渣に関して、基質は、混合によって粗くばらされ、かつ前処理なしで、酵素によりインキュベートされた。基質加水分解は、(i)放出された還元糖の測定及び個別の糖を検出及び定量化するアッセイ、(ii)加水分解の糖生成物の確認TLC及びHPLC分析、(iii)残渣の重量/体積減少の分析、(iv)酵素処理前後のセルロース、ヘミセルロース、デンプン及びペクチン含有量の比較、及び(v)紙及び木質廃棄物のような繊維性基質の走査電子顕微鏡法(SEM)による基質分解の物理的分析によって観察された。
ガラクトオリゴ糖−MGBG16酵素カクテルが、最良である
グルコオリゴ糖−MGBG16及び22が、最良である
フラクトオリゴ糖−MGBG21カクテルが、最良である
研究は、未加工穀物分画(1〜5gのロット)により(140回転/分の振盪で)50〜85℃の範囲にわたる温度で行われた。各酵素調製(基質1g当たり0.5IUの最大用量)による基質中の炭水化物の加水分解は、放出された還元糖を定量化することによって24時間にわたって観察され、試料中に形成された生成物は、定期的間隔を空けて反応混合物から除去された。
一方が37℃に維持され、かつ他方が55℃に維持された、2つの10L上向流嫌気ハイブリッドリアクタ(UAHR;Reynolds,1986)は、それぞれ中温性及び好熱性細菌の個別の混合個体群によってバイオガス生成のために使用された。糖が豊富な加水分解物は、汚泥床を通して汲み上げられ、かつ存在する微生物の群落によって分解された。リアクタ頂部の分離装置は、嫌気性消化中に取り外され得た何らかの汚泥粒子から生成されたガスを分離するために使用された。両方のリアクタは、COD除去(APHA,1992)、全炭水化物減少(Dubois法)、及びメタン生成の効率を観察することによって、650日の運転期間を通して連続的に評価された。糖代謝の指標である脂肪酸生成、及びメタン生成は、ガスクロマトグラフィ(GC)によって観察された。
標準的な酵素加水分解は、〜130回転/分の撹拌によって300mL及び1Lの容器中で、37℃、50℃及び60℃で行われた。酵素用量は、緩衝化基質溶液中で、セルロース1グラム当たり32FPUの各酵素調製であった(Gilleran,(NUI,Galway,Ph.D.Thesis,2004)に記載されたように、実験室規模の研究において、総加工重量=100g)。反応緩衝液のpHは、pH5.0に調節された。試料は、時限間隔を空けて除去され、かつ酵素作用は、10分間の沸騰によって終了した。0〜72時間の期間にわたって以下のものが測定された:
・還元糖の放出及び個別の糖の検出及び定量化(g/Lで表される)
・加水分解の糖生成物のHPLC分析(生成物量は、g/Lで表される)
・残渣の重量/体積減少
・酵素処理前後でのセルロース繊維含有量
検査されたタラロマイセス・エマーソニイ株は:
IMI(Imperial Mycological Institute(CABI Bioscience))393751(特許株)、IMI393753(CBS(Centraal Bureau voor Schimmelcultures)180.68)、IMI393755(CBS355.92)、IMI393756(CBS393.64)、IMI393757(CBS394.64)、IMI393758(CBS395.64)、IMI393759(CBS397.64)、IMI393760(CBS472.92)、IMI393752(CBS549.92)、IMI393761(CBS759.71)である。
株の液体培養は、様々な期間に行われた独立した実験において少なくとも3回繰り返された。(各株/炭素源の組み合わせに関して)複製フラスコから採取された(120時間)培養濾液は、酵素活性に関して検定された;複数の複製が、酵素希釈の範囲で検定された。その上、結果は、アッセイ測定内及び間で、かつ体積の独立の検査で実証された。培養物の外観及び増殖パターンの点で、培養物間には、明瞭な差があった。例えば、IMI393751株は、グルコース上で急速に極めて密度の高い、糸状培養物をもたらしたが、他方で、幾つかの他の株(例えばCBS180.68、CBS355.92、CBS393.64、CBS395.64、CBS397.64、CBS549.92及びCBS759.71)は、限られた増殖及び不定型の形態を示した。すなわち、正常な糸状増殖がなく、かつ粘液性に見える、限られた培養集団が形成された。株CBS394.64は、低い菌糸体バイオマスをもたらしたが、糸状培養物として増殖し、他方でCBS472.92は、同一の増殖条件で、ペレットの形態を取った。以前の研究は、細胞外エキソグルコシダーゼ及びエンドグリカナーゼ活性が、大部分の炭素源上でT.エマーソニイの増殖中に有意量で存在することを示したので、120時間の増殖時点が選択された(pH非制御状態で、鍵となる活性の「最高及び最低に達すること」が観察された。しかしながら、最大活性は、一般的に発酵サイクルの終わりに向かって検出される)。
A.キシラナーゼ生成:植物バイオマス及び非デンプン多糖類が豊富な廃棄物残渣の変換に必要とされた、主要なタイプのエンドヒドロラーゼ活性の2つは、グルカナーゼ及びキシラナーゼである。検定された全ての高分子グリカン分解活性の中で、グルカナーゼ及びキシラナーゼは、存在する優勢なグリカナーゼ活性であった。
393751株は、非常に重要な酵素活性の範囲の高レベルの強力な生成物質であり、
393751株は、2つの鍵となる脱重合ヘミセルラーゼ活性に関して、低コスト誘発物質(イナゴマメ及びTL/PPL)上で、非常に高レベルのキシラナーゼ及びβ−1,3;1,4−グルカナーゼの両方を生成する唯一のT.エマーソニイ株であり、かつ最高の活性レベルが、未加工炭素源上で得られ、それ故に393751株が、強力な一連の酵素カクテルの費用効率の良い源であることを証明する。
目的は、殺菌したセルロースが豊富な臨床廃棄物の生分解性成分を減少させ、従って埋め立てる廃棄物の量を減少させ、かつ酵素処理後に糖が豊富な液体排出物を回収し、かつバイオ燃料の形状でエネルギーを回収することであった。
393751株に由来する10種のサーモザイムカクテルの各々におけるエンドヒドロラーゼ及びエキソグリコシダーゼ酵素活性のプロファイルは、決定された(Tuohy & Coughlan 1992;Tuohy et al,1993,1994,2002;Murray et al,2001,2004)。表34は、カクテルの選択において決定された鍵となる活性の相対レベルを要約する。酵素調製は、異なる濃度で100gのバッチのSTG処理されたセルロースが豊富な廃棄物に、50℃かつ70℃で添加され、かつ24〜48時間、インキュベートされた(50〜60%の水分レベルで)。糖が豊富な溶液(及びセルロースが豊富な材料、例えばティッシュ等)の試料は、48時間にわたって定期的に除去され、かつTuohy et al,1993,1994,2002;Murray et al,2001,2004,Gilleran(2004)and Braet(2005)に記載されたように、(i)重量及び体積減少、(ii)回収された糖が豊富な溶液の体積、(iii)放出された還元糖、(iv)(走査電子顕微鏡法を使用する)酵素処理後の基質の物理的構造、(v)TLCによって放出された糖の定性分析、(vi)HPLC、GC−MS及びESI−Q−TOF−MSによって生成された糖の定量分析、(vii)発酵微生物に潜在的に有害な物質(バイオエネルギー生成)、(viii)加水分解物の無菌性、(ix)バイオエタノール生成、及び(x)バイオガス生成に関して分析された。
A.重量及び体積減少、回収された糖が豊富な溶液の体積、放出された還元糖
酵素処理前及び後の重量は、記録され、かつ全ての酵素調製に関して記録された体積の減少推定がなされた。同じ反応パラメータ(酵素装填、60%の含水量、及び24時間の反応時間)を使用して、50℃で得られた体積減少データ及び還元糖は、図8に示される。
放出された糖の>76〜92%は、7つの最良のカクテルにおいて、単糖類であり、かつこれは、グルコースから主になり、若干のガラクトース、マンノース及びキシロースがあった。例えば、0.2〜0.55g/mLに及ぶ糖レベル、及びHPLCによって決定された単糖類濃度範囲は、以下の通りである(サーモザイムカクテル及び廃棄物バッチに左右される):
グルコース:43〜70%;マンノース:5〜15%;ガラクトース4〜10%;キシロース:20〜30%;セロビオース:4〜12%、及び高オリゴ糖:5〜26%。
回収された液体分画は、バイオエタノールへの糖が豊富な加水分解物の発酵のためにスクリーニングされた酵母種に有害であるように見えなかった、すなわちS.セレビジェー(パン酵母)、パキソレン・タンノフィルス(Pachysolen tannophilus)、ピキア種、カンジダ・シェハーテ(Candida shehatae)、及びクルベロマイセス・マルクシアヌス(Kluveromyces marxianus)の増殖を妨げなかった。その上、(酵素結合アッセイキットを使用する)エタノール生成物の分析は、酵母がエタノールを生成していることを示した。
様々な酵母種、例えばサッカロマイセス・セレビジェー、パキソレン・タンノフィルス、ピキア種、カンジダ・シェハーテ及びクルベロマイセス・マルクシアヌス(及び株)による糖の豊富な原料からのバイオエタノール生成が、評価された。測定された評価項目は、糖の酵母増殖(及び酵母バイオマス)の使用、CO2の発生、及び生成されたエタノールを含んだ。2つの70℃の酵素消化物(図8のカクテル5及び8によって発生した加水分解物)は、1L実験室規模の培養物中の全ての酵母種のバイオエタノール生成の検査原料として選択された。
技術範囲(HPLC、MS)、特にGC−MSが、潜在的有害発酵終了生成物の存在を決定するために使用された。ほぼ完全な糖の使用が、(ペントース糖(キシロース、アラビノース)が豊富な消化物を除き)S.セレビジェーに関して達成され、かつ正常な発酵終了生成物、すなわちグリセロール、酢酸塩及び微量の副産物(溶媒)が、検出された。
大きなバッチのカクテル5及び8消化物は、中温性及び好熱性上向流嫌気ハイブリッドリアクタ(UAHR)嫌気ダイジェスタに供給するために調製された。両方のリアクタの流入液及び流出液の全炭水化物レベルは、測定された(Dubois et al.1956;Laboratory protocol)。流入液及び流出液試料中に存在する還元糖が、決定された(Tuohy et al,1994)。化学的酸素要求量(COD)を決定するために、知られた量の加水分解物が、重クロム酸カリウム(触媒として硫酸銀を有する濃硫酸)を使用して2時間にわたって酸化された(国際検査法;実験室手順)。残りの重クロム酸塩は、硫酸第一鉄アンモニウムの標準化された溶液による滴定によって決定された。COD及び炭水化物除去効率は、試験中に測定された(毎日の試料)。汚泥の特異的メタン生成活性(SMA)は、圧力変換技術を使用して分析された(Colleran and Pistilli,1994;Coates et al.1996)。汚泥の試料は、出口を通して汚泥床から除去され、かつ検査は、(中温性リアクタの汚泥のための)37℃か、(好熱性リアクタの汚泥のための)55℃で行われた。
ゲノミクス及び機能的プロテオミクスの組み合わせが、全ての鍵酵素成分の最適レベルを有するような酵素カクテルを得るために(初期実験において使用された10種のカクテルからの情報に基づき)使用するための最適増殖条件及び基質を識別するために、使用された。2つの誘発物質の組み合わせが選択された:使用済み茶の葉及び廃棄物紙ざらの1:1の混合物、並びにモロコシ及び糖液のないビートパルプの1:1混合物である。上記の使用された10種のカクテルから選択された追加のブレンドが、同じく調製された。新規なカクテル及びブレンドは、成分酵素、並びに商業的セルロース、ヘミセルロース、及び殺菌されたセルロースが豊富な廃棄物の、単純な発酵可能な糖への広範囲な変換に触媒作用を及ぼすその能力に関して特徴付けされた。最大酵素反応性のための最適pH及び温度、最適化された酵素系及びブレンドされたカクテルの熱安定性、並びに反応最終製品、単糖、又は潜在的有害分子(フェノール化合物/ベンゼン誘導体)による潜在的阻害が、決定された。
酵素活性測定:
未加工酵素調製は、内部作用酵素のための10〜30mg/mLの濃度の関連する基質、「フィルタペパラーゼ(filter paperase)」(一般的セルラーゼ)のための50mgの濾紙/反応体積1mL、又は1mMの適切な4−ニトロフェニル−グリコシド誘導体を使用して、様々なリグノセルロース加水分解酵素活性の範囲に関して分析された(Tuohy et al.,2002;Murray et al.,2001)。アッセイは、3つの複製を作成して実行された。全ての結果は、異なる未加工酵素調製を使用する2つの同一の実験を示す。
酵素活性及び安定性のためのpH及び温度要件は、通常のアッセイ手続きを使用して、2.6〜7.6の範囲にわたって、かつ30〜90℃の範囲の温度にわたって評価された。
5〜60FPU(又は必要であれば2〜20キシラナーゼ単位)を含む個別の酵素のアリコートは、1gの標的基質によって、適切なpH及び反応温度で24時間までインキュベートされた。試料は、時限間隔を空けて除去され、かつ糖含有量(還元糖)及び組成物が分析された。
8つのサーモザイムカクテルが、当初の範囲の20のカクテルから選択された。393751株に由来する8つの酵素カクテルの各々におけるエンドヒドロラーゼ及びエキソグリコシダーゼ酵素活性のプロファイルは、決定された(Tuohy & Coughlan,1992,Tuohy et al.,1993,1994,2002;Murray et al,2001,2004)。
A.テンサイ頂部及び茎(乾燥重量1g/総容量10ml)
B.テンサイ果肉(乾燥重量1g/総容量10ml)
C.テンサイ果実(乾燥重量1g)
D.テンサイ皮(乾燥重量1g)
最適な反応条件は、75℃かつpH4.0であった。表38は、最適な条件で16時間後に放出された還元糖を示す。インキュベーションを48時間に増加させると、皮及び果実分画の場合に加水分解%が上昇した。酵素装填条件の最適化は、表39に示した収率で、インキュベーション時間を半分(すなわち24時間)に減少させることを可能にした。
研究は、植物全体及びテンサイ加水分解物からのバイオエタノールの生成を調査するために行われた。植物全体の加水分解物中に存在する、90%を超えるグルコースは、S.セレビジェーによってバイオエタノールに変換された(40g/Lの発酵可能な糖から、約9.0g/Lのエタノールが得られた)。他の酵母種、例えば、パキソレン・タンノフィルスが、バイオエタノールの生成(嫌気性条件)に関して調査された。後者の酵母は、繰り返された発酵(>92〜95%の代謝)において放出されたグルコース及びペントース糖(キシロース及びアラビノース)を使用した。しかしながら、エタノール収率は、S.セレビジェーによるよりも僅かに低かった(40g/Lの発酵可能な糖から約6.7g/Lのエタノールが得られた。
温度最適条件:75〜80℃、カクテル次第で、>75〜87%の活性が85℃で残っている。
タラロマイセス・エマーソニイは、適切な炭素源上で増殖した場合、14〜20の別個のエンドキシラナーゼ成分を分泌する。これらのエンドキシラナーゼの13種が、均質に精製され、かつ触媒特性に関して特徴付けられた。精製されたエンドキシラナーゼの分子量は、30〜130kDaの間で変動する。キシラナーゼ及びグルカナーゼ発現は、同じ栄養培地及び炭素誘発物質上で同一条件で増殖した10種のT.エマーソニイ株の間で等しくない。新しい低分子量のキシラナーゼが識別され、キシラン分解系T.エマーソニイIMI393751株からのXyn XII(17.5kDa)である。20kDa以下のMr値を有するキシラナーゼの分泌は、多数の他の細菌及び菌類種において、報告されたが、T.エマーソニイに関して、これの前には報告されていない。
T.エマーソニイIMI393751は、120時間、45℃、210回転/分で(あるいは、固体(静的)発酵で11日間、33%の基質、67%の水分、45℃で)コムギブラン及びビートパルプの1:1の混合物上で増殖した。未加工及び分割された酵素試料のキシラナーゼ及びタンパク含有量は、以前に記載されたように分析された(Tuohy & Coughlan,1992;Tuohy et al,1993,1994;Murray et al,2001)。未加工酵素抽出物は、以前に記載されたように採取された(Tuohy & Coughlan,1992)。H1P 10−43中空繊維透析器を備えたAmicon DC2システムを使用する限外濾過は、高分子量キシラナーゼ(濃縮水)から新規なキシラナーゼ(透過分画)を分離するために使用された。Xyn XIIは、(NH4)2SO4(0〜90%遮断)による沈殿又は「塩析」、Sephacryl S−200 SFでのゲル透過クロマトグラフィ(GPC)(溶出液として100mMのNaOAc緩衝液、pH5.0)、Whatman DE−52でのイオン交換クロマトグラフィ(IEC)(30mMのNaOAc緩衝液、pH5.0によって平衡化される;キシラナーゼは、線形緩衝化された0.0〜0.3MのNaCl勾配の適用によって溶出された)を含む分画技術の組み合わせを使用して均質に精製され、その後にPhenyl Sepharose CL−4Bでの疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)(30mMのNaOc緩衝液、pH5.0中で15%(NH4)2SO4によって平衡化される)が続いた。HICに先立ち、キシラナーゼ試料は、15%(w/v)の最終濃度に(NH4)2SO4によって塩浴された。緩衝塩及び(NH4)2SO4は、Sephadex G−25(図示せず)への試料の適用によって除去された。最後に、キシラナーゼが豊富な分画は、pH7.0で、DE−52の第2アニオン交換カラムへの適用、それに続くSephacryl S−100 HRでのゲル透過クロマトグラフィ(平衡化及び灌漑緩衝液として使用される100mMのNaOAc緩衝液、pH5.0)、及び50mMのNH4OAc緩衝液、pH5.5で前平衡化されたDEAE−Sepharoseでの最終分画ステップ(キシラナーゼを溶出するために使用される0.0〜0.2MのNaCl勾配)によって更に分画された。貯留された酵素は、Sephadex G−25又はBioGel P−6への適用によって脱塩され、かつ電気泳動分析の前に凍結乾燥された。
選択された物理化学的特性
新しい酵素の純度は、Laemmli法に従って、15%(アクリルアミド/ビスアクリルアミド)ゲル中でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認された。SDS−PAGEは、17.5kDaの推定されたMrに対応した銀染色上の単一のタンパク帯を明らかにした。更に、Xyn XIIのpH5.0のpI値に対応する単一のタンパク帯が、IEF上で得られた。OSXのXyn XII触媒による分解に最適な温度は、75℃であると決定され、活性の最適pHは、pH4.0〜4.5であった。しかしながら、pH3.0での10分間のインキュベーション期間中に25〜81%の間のそれぞれの元の活性を失ったXyn I−XIと異なり、Xyn XIIは、酸に対して著しく安定しており、かつ延長されたインキュベーションでも、pH3.0で91%を超えるその元の活性を保持した。
Xyn XIIの適切に希釈されたアリコートは、(全て1.0%(w/v)濃度で)種々のキシラン、β−グルカン、ペクチンポリマー及びフルクタンを含む一連の多糖類によってインキュベートされた。延長された30分間のインキュベーション期間中に放出された還元糖は、上記のように定量化された。アリールグリコシド(1.0mM)に対する活性は、微量検定法を使用して決定された(Murray et al.,2001)。速度定数を決定するため予備研究は、通常のアッセイ条件で[基質]キシランを、0.2〜25mg/mlの間で変化させることによって行われた。
同じ炭素源上の鍵酵素の発現は異なる
T.エマーソニイIMI393751及び他の株によって生成されたキシラナーゼの数、タイプ及び相対存在量は、異なる。先に示したように、培養濾液中の酵素レベルは、際立って異なり、かつT.エマーソニイ株が、異なるレベルの同じキシラナーゼを生成するか、又は異なるイソ型を発現することを示唆している。この点を説明するために、ゲルSDS−PAGE電気泳動及びIEFによる酵素電気泳動染色(Tuohy & Coughlan(1992)によって記載されたように、復元される)は、IMI393751及びCBS549.92株培養濾液によって行われた。これらの研究は、(i)異なるキシラナーゼが発現され、かつ(ii)発現されたキシラナーゼイソ型の数が際立って異なることを確認した。
キシラナーゼイソ型が検出された(イソ型−pI及びMrの参考にはTuohy et al.,(1994)参照)
IMI393751:Xyn IV、Xyn V、Xyn VI、Xyn IX及びXyn XI、Xyl I(β−キシロシダーゼ)及びXyl II
CBS549.92:Xyn II、Xyn VII(注:Xyn VIIは、先行する特許で公開された配列と等しい(GenBank Accession Number AX403831)、及び非常に低い量のXyl I(β−キシロシダーゼ)。
その上、IMI393751は、茶の葉/紙皿上で(及び茶の葉のみの上で)の増殖中にXyn XIIを生成する唯一の株である。
異なる炭素源上のキシラナーゼ発現パターンは、等しくない、すなわち
IMI393751:
炭素源としてのグルコース:Xyn I、Xyn VIII、少量のXyn XI、かつβ−キシロシダーゼは、なし
イナゴマメ:Xyn IV、Xyn V、Xyn VI、Xyn IX及びXyn XI、Xyl I(β−キシロシダーゼ)及びXyl II
TL/PPL:Xyn III、Xyn V、Xyn IX、Xyn X、Xyn XII、Xyl I及びXyl II
CBS549.92:
グルコース:Xyn IVと等しいかもしれない、低レベルの成分、かつβ−キシロシダーゼは、なし
イナゴマメ:Xyn II、Xyn VII及び非常に低い量のXyl I(β−キシロシダーゼ)
TL/PPL:Xyn I、Xyn VII及びXyn IXと類似したタンパク、若干のXyl I
様々な株が、上記のような鍵となるキシラナーゼの発現に対して比較された。しかしながら、その上IMI393751及びCBS549.92の誘発された培養物中に存在するキシラナーゼは分画され、かつ精製キシラナーゼ成分の特異的活性が比較された。第1の場合に、IMI393751のみが、Xyn XIIを生成するように見える。更に、特異的活性が比較される時(アッセイ基質としてのOSXの結果は、以下に示す)、個別の酵素の特異的活性の若干の差が、明瞭に観察される(図22)。
T.エマーソニイIMI393751は、一連の炭素源上で培養され、かつSDS−PAGE及びIEFを復元すること、それに続く、以上で概説した酵素電気泳動染色によってプロファイルが作成される。以下は、得られた結果の幾つかの実例である。
(i)誘発物質として茶の葉:Xyn III、Xyn V、Xyn IX、若干Xyn X、及びXyn XII;Xyl I及びXyl II
(ii)イナゴマメ:Xyn IV、Xyn V、Xyn VI、Xyn IX及びXyn XI、Xyl I(β−キシロシダーゼ)及びXyl II
(iii)ライムギフレーク:Xyn IV、Xyn V、Xyn VI、Xyn IX、pI6.5の特別に新規な「キシラナーゼ」成分により;Xyl I(β−キシロシダーゼ)及びXyl II
(iv)小売りの小麦粉:Xyn III、Xyn VI、Xyn VIII、Xyn IX、Xyn X、Xyl I(β−キシロシダーゼ)及びXyl II、pI5.8の追加の新規な「キシラナーゼ」成分による
(v)モロコシ:Xyn I、Xyn VIII、Xyn IX、Xyn X、Xyn XI、若干Xyl I(β−キシロシダーゼ)及びXyl II
(vi)キシロース:Xyn I及びXyn VIII、Xyl I
(vii)グルコース:Xyn I、Xyn VIII、より少量のXyn XI、かつββ−キシロシダーゼは、なし
グルタチオンペルオキシダーゼ
培養濾液試料(非濃縮及び濃縮試料)は、7.5%の未変性PAGEゲル上を動かされ、50℃で還元グルタチオン中に浸漬され、その後に0.002%のH2O2によるインキュベーションが続いた。ゲルは、次に1%の塩化第二鉄/1%のフェリシアン化カリウムによって染色された。酵素電気泳動染色はまた、培養濾液上で酵素アッセイにより補足された。
培養濾液試料(非濃縮及び濃縮試料)は、7.5%の未変性PAGEゲル上を動かされ、その後に3%のH2O2によるインキュベーションが続いた。ゲルは、次に1%の塩化第二鉄/1%のフェリシアン化カリウムによって染色された(カタラーゼ帯は、濃い黄色の帯として現れる)。酵素電気泳動染色はまた、標準的な公開された方法を使用して、培養濾液上で酵素アッセイにより補足された。
B.寒天培地
1.サブローブドウ糖寒天(Oxoid Ltd.,UK)
2.ジャガイモマルトース寒天(Oxoid Ltd.,UK)
3.ツァペック・ドックス(Oxoid Ltd.,UK;pH調節されず)
4.コーンミール寒天(Oxoid Ltd.,UK)
5.麦芽エキス寒天(Oxoid Ltd.,UK)
6.栄養寒天(Difco Ltd.,UK)
7.エマーソン寒天(酵母カリウム溶性デンプン;YpSs)
以下の成分が、1Lの蒸留H2Oに添加された:
15.0gの可溶性デンプン(Sigma−Aldrich,Dublin,Ireland)
4.0gの酵母抽出物(Oxoid Ltd.,UK)
1.0gのリン酸二水素カリウム(KH2PO4)
0.5gの硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4.7H2O)
20.0gの寒天No.1(Oxoid Ltd.,UK)
8.酵母グルコース寒天(YGA)
以下の成分が、1Lの蒸留H2Oに添加された:
20.0gのグルコース(Sigma−Aldrich,Dublin,Ireland)
10.0gの酵母抽出物(Oxoid Ltd.,UK)
15.0gの寒天No.1(Oxoid Ltd.,UK)
(a)培養物直径の測定(キャリパを使用)
(b)7.0Mピクセルのデジタルカメラを使用して写真記録
(c)可視的な表現型の変化/差を記録する
(d)胞子形成の表示(顕微鏡分析)又は他の方法で
様々な寒天培地上でのT.エマーソニイ株の培養は、以下の事項に関して393751株と、他の9種の株の間の明瞭な差を明らかにした:
表43及び44:45℃での増殖速度及び範囲の要約−2日目及び5日目に行われた培養物直径の測定
表45:55℃での増殖速度−5日目に行われた培養物直径の測定
表46:可視的な表現型の変化及び胞子形成の証拠の要約。
重要な観察結果1:多くのIMI/CBS株は、多色培養物をもたらした。しかしながら、これらの培養物の純度が、確認された。色/顔料が生成され、かつ生成パターンは、ペニシリウムの多くの種、例えばP.ピノフィルム(pinophilum)に特有のものである。
重要な観察結果2:表20に示すように、393751株と、その他の間には胞子形成の点で明瞭な差が存在する。
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Claims (27)
- 寄託番号IMI393751を有するタラロマイセス・エマーソニイ株、又はその突然変異体であって、30℃から90℃の増殖温度範囲を有し、かつ55℃を超える温度で酵素を分泌する微生物株。
- 55℃以上で活性な好熱性酵素をコード化する、請求項1に記載の微生物株。
- 55℃を超える温度で酵素活性を保持する請求項1又は2に記載の微生物株に由来する細胞外培養濾液を含む酵素組成物。
- 植物若しくは植物由来材料、又は病院廃棄物を含む廃棄物の生物変換のための請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 植物残渣からの単糖類が豊富な材料の生成における請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 木材、紙製品、紙及び織物の加工及び再利用における請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 紙廃棄物の糖化における請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 抗菌、生体制御及びスライムコントロールにおける請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用(ただし、前記酵素組成物、又は前記微生物株は、人体にin vivoで投与されない。)。
- 園芸用途における請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 穀物ベースの飼料の消化率を強化するための動物飼料生成における請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 改良された消化率及び低い非セルロース性β−グルカン含有量を有する単胃動物のための低ペントース含有穀物ベースの飼料生成における請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 獣医学的健康管理において使用するための生理活性能力を有する機能性飼料の生成における請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 専門乳製品又は食餌性製品、例えば老人及び小児の健康管理用の食品及び飲料製剤の形成における請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 製パン及び製菓部門、並びに新規な健康食品パン製品の形成における請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 食品産業でのフレーバ、芳香及び知覚前駆体化合物の生成における請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 機能性食品の生成のための請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 非アルコール及びアルコール飲料、果汁及び健康飲料の生成のための請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- (混合結合1,3(4)及び1,3(6)−グルコオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシログルコオリゴ糖、ペクチンオリゴ糖、分枝及び線状キシロオリゴ糖、(ガラクト)グルコマンノオリゴ糖を含む)生理活性オリゴ糖、単糖が豊富な陸生及び海洋植物、植物残渣、菌類及び廃棄物又は副産物からのグリコペプチド及びフラボノイドグリコシドのような生物薬剤の生成における請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- フラボノイド及びシアン発生性グリコシド、サポニン、オリゴ糖及びフェノール類(フェルラ及びp−クマル酸、エピカテキン、カテキン、ピロガル酸等を含む)を含む天然の抗細菌及び抗ウイルス活性を有する生体分子の生物学的利用能を増加させるための請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用(ただし、前記酵素組成物、又は前記微生物株は、人体にin vivoで投与されない。)。
- 天然の抗酸化生体分子、例えば種々の果物及び液果を含む全ての植物材料、残渣、廃棄物からのカロチノイド、リコペン、キサントフィル、アントシアニン、フェノール類及びグリコシドの生物学的利用能を増加させるための請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用(ただし、前記酵素組成物、又は前記微生物株は、人体にin vivoで投与されない。)。
- ペニシリウム種及びストレプトマイセス種を含む菌類及び細菌による抗生物質の微生物生成で使用するために、未加工植物材料、植物残渣及び廃棄物からの原料の生成のための請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- クエン酸の微生物生成で使用するために、未加工植物材料、植物残渣及び廃棄物からの原料の生成のための請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 化粧品の調製で一般的に安全とみなされるプロセスによって、藻類多糖類(例えばラミナラン及びフコイダン)及び植物抽出物に由来する添加物からのオリゴ糖の生成のための請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- バイオセンサ生成における研究試薬として、かつレセプタ−リガンド相互作用を探査するための機能グリコミクスにおいて、かつ酵素−基質特異性のプロファイル作成のための基質ライブラリの生成におけるツールとして使用する、オリゴ糖及びグリコペプチドの生成のための請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 修飾セルロース及びβ−グルカン、セロオリゴ糖、修飾デンプン及びマルトオリゴ糖、ラクツロース及びポリオール(例えばマンニトール、グルシトール又はズルシトール、キシリトール、アラビトール)の生成のための請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- 廃棄物の発熱量を変化させる方法における請求項3に記載の酵素組成物、又は請求項1又は2に記載の微生物株の使用。
- ケトミウム好熱菌及びサーモアスカス・オーランティアカス株の一方又は両方を更に含む請求項4から26のいずれか1項に記載の使用。
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