CN104988126B - 一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3及其基因和NagGH3制备方法 - Google Patents

一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3及其基因和NagGH3制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种β‑N‑乙酰葡糖胺酶NagGH3及其基因和NagGH3的制备方法。本发明提供的β‑N‑乙酰葡糖胺酶NagGH3具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明提供了一种β‑N‑乙酰葡糖胺酶NagGH3的编码基因nagGH3。nagGH3具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明提供了包含nagGH3的重组载体，该重组载体为重组质粒。本发明提供了包含重组载体的宿主细胞，重组载体转化宿主细胞得到重组菌株。本发明提供的β‑N‑乙酰葡糖胺酶NagGH3可促进壳二糖的水解，具有耐盐和耐产物抑制的性质，可应用于海产品加工、医学、功能性食品等行业。

Description

一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3及其基因和NagGH3制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3及其基因和NagGH3的制备方法。
背景技术
几丁质是由N-乙酰-D-胺基葡萄糖单体通过β-1,4键组成的多糖，广泛存在于真菌、昆虫细胞壁以及甲壳类动物外骨骼中。几丁质的蕴藏量在地球上的天然高分子中占第二位，其含量仅次于纤维素，主要是用来作为支撑身体骨架，以及对身体起保护的作用。
几丁质在内切几丁质酶作用下，可水解为N-乙酰壳寡糖。β-N-乙酰葡糖胺酶为外切型糖苷水解酶，属于几丁质降解酶系中的一种，可催化N-乙酰壳寡糖降解为N-乙酰-D-胺基葡萄糖，在几丁质彻底水解中起到关键性作用。但是大多数β-N-乙酰葡糖胺酶易受到水解产物即N-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制，而影响几丁质的水解(Yang et al.,Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2014,62:5181–5190)。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3。
本发明的第二个目的是提供编码上述β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的编码基因nagGH3。
本发明的第三个目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的第四个目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的第五个目的是提供所述β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的制备方法。
本发明提供了一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3，该β-N-乙酰葡糖胺酶Nag GH3具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明中所述β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3总共含567个氨基酸，理论分子量为63.27kDa，其中N端有20个氨基酸为预测信号肽序列“MLKPILAFSLAI LSSLGVYA”，成熟的β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3含547个氨基酸。β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的最适pH值为7，在pH值为6.5～8.0的范围内维持35％以上的酶活性(图2)；经pH值为5.0～8.0的缓冲液处理1h，该酶剩余酶活约65％以上。β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的最适温度为40℃；在37℃下处理1h，该酶剩余酶活为25.4％。β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3可促进几丁质的水解；在3.0％和5.0％(w/v)的NaCl中，β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的酶活性提高约0.3倍；在20％(w/v)的NaCl中，该酶仍然具有55％的活性；当反应体系加入终浓度为10mM的N-乙酰-D-胺基葡萄糖时，该酶仍保留约46％活性。
本发明提供了一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的编码基因nagGH3。具体的，nagGH3具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，全长1704bp，起始密码为ATG，终止密码为TAA，从鞘氨醇杆菌中提取得到。
本发明提供了包含nagGH3的重组载体，该重组载体为重组质粒。
本发明还提供了一种重组载体的构建方法：将β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的编码基因nagGH3插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达载体的核苷酸序列相连接。优选的，将本发明的β-N-乙酰葡糖胺酶基因和表达载体大肠杆菌的质粒pEasy-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2-nagGH3。
本发明提供了包含重组载体的宿主细胞，重组载体转化宿主细胞得到重组菌株。优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌中的一种；更优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，将重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2-nagGH3转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/nagGH3。
本发明提供了一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的制备方法，包括：
用重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
培养重组菌株，诱导重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3表达；
回收所表达的β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3。
本发明提供了一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3，其最适pH值为7，最适温度为40℃，可促进几丁质的水解，具有耐盐和耐产物抑制的性质，可应用于海产品加工、医学、功能性食品等行业。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为在大肠杆菌中表达的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的SDS-PAGE分析；其中，M:蛋白质Marker；S1:含有重组载体pEasy-E2-nagGH3的大肠杆菌菌体破碎上清液；S2:纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3；
图2为纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的pH活性；
图3为纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的pH稳定性；
图4为纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的热活性；
图5为纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的热稳定性；
图6为纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3在不同浓度NaCl中的活性；
图7为纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3水解二乙酰壳二糖的产物分析；其中，M:N-乙酰-D-胺基葡萄糖；CK:二乙酰壳二糖与灭活的NagGH3；S:二乙酰壳二糖与有活性的NagGH3；
图8为纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3水解四乙酰壳四糖的产物分析；其中，M:N-乙酰-D-胺基葡萄糖；CK:四乙酰壳四糖与灭活的NagGH3；S:四乙酰壳四糖与有活性的NagGH3；
图9为纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3在不同浓度N-乙酰-D-胺基葡萄糖中的活性。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
试验材料和试剂
1、菌株及载体：鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)同文献报道菌种性质，如中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株Sphingobacterium spiritivorum CGMCC 1.10853；大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和表达载体pEasy-E2购于Novagen公司。
2、酶类及其它生化试剂：DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；pNP(p-nitrophenol)、pNP-GlcNAc(p-nitrophenylβ-N-acetylglucosaminide)、pNP-G(p-nitrophenylβ-D-glucopyranoside)和pNP-Xyl(p-nitrophenylβ-D-xylopyra noside)购自Sigma公司；二乙酰壳二糖及四乙酰壳四糖购自百灵威科技公司；Genomic DNA Clean&Concentration试剂盒购自Zymo Research公司；TureseqTM DNA Sample Preparation Kit购自Illumima公司，其它都为国产试剂,均可从普通生化试剂公司购买得到。
3、培养基：
LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，呈中性。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1：β-N-乙酰葡糖胺酶基因nagGH3的克隆
提取鞘氨醇杆菌基因组DNA：将培养2d的液体菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，裂解液组成为：50mM Tris，20mM EDTA，NaCl 500mM，2％SDS(w/v)，pH8.0，70℃水浴裂解60min，每隔10min手动混匀一次，在4℃下以10000rpm的速率离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下以10000rpm的速率离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃环境中备用。
用超声打断仪Biorupter将5μg的鞘氨醇杆菌基因组打断为400–600bp的片段，用Genomic DNA Clean&Concentration试剂盒对打断的DNA片段进行纯化，纯化后用TureseqTMDNA Sample Preparation Kit进行DNA片段的末端补平、3'端加A碱基和加接头、及DNA片段的PCR扩增(操作按试剂盒说明书进行)。用MiSeq基因组测序仪(Illumima公司)对上述制备好的文库进行基因组测序。
基因组测序得到的数据经读码框预测和本地BLAST比对，得到β-N-乙酰葡糖胺酶基因nagGH3，该基因序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的制备
以5'CAGAAAAAACCGGATTTTGTG 3'和5'AAGGCCTTTTCCGAAA GTATAT 3'为引物对，鞘氨醇杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环后72℃保温10min。PCR结果得到β-N-乙酰葡糖胺酶基因nagGH3，并将该酶基因nagGH3与表达载体pEasy-E2相连接，获得含有β-N-乙酰葡糖胺酶基因nagGH3的重组质粒pEasy-E2-nagGH3，将pEasy-E2-nagGH3转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/nagGH3。
取含有重组质粒pEasy-E2-nagGH3的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/nagGH3，以0.1％的接种量接种于LB(含50μg mL～1Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含50μg mL～1Amp)培养液中，快速振荡培养约2～3h(OD600达到0.6～1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体，破碎后在4℃下13,000rpm离心10min，吸取上清进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3在大肠杆菌中得到了表达，经纯化后，产物为单一条带。
实施例3：纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的性质测定
1、纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的活性分析
实施例2纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的活性测定方法采用pNP法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含50μL适量酶液，450μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加2mL 1M Na2CO3终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解pNP类化合物产生1μmolpNP所需的酶量。对底物壳二糖、羧甲基纤维素、葡聚糖及昆布多糖的活性测定方法采用DNS法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5％；反应体系含50μL适量酶液，450μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应适当时间，然后加2.0mLDNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量。
2、纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的pH活性和pH稳定性测定：
酶的最适pH测定：将β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3在37℃下和0.1M pH为5.0～9.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将酶液置于0.1M pH为4.0～10.0的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH为7及40℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：0.1M McIlvaine buffer(pH为4.0～8.0)和0.1M glycine-NaOH(pH为9.0～10.0)。以pNP-GlcNAc为底物，反应10min，测定NagGH3的酶学性质。结果表明：NagGH3的最适pH为7，在pH6.5～8.0的范围内维持35％以上的酶活性，(图2)；经pH5.0～8.0的缓冲液处理1h，该酶剩余酶活约65％以上(图3)。
3、纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的热活性及热稳定性测定：
酶的最适温度测定：在pH为7的缓冲液中，于0～60℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于37℃和50℃中，处理0～60min后，在pH7及40℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNP-GlcNAc为底物，反应10min，测定NagGH3的酶学性质。结果表明：NagGH3的最适温度为40℃(图4)；该酶在37℃下处理1h，剩余酶活为25.4％(图5)。
4、不同金属离子及化学试剂对纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3活力的影响：
在酶促反应体系中加入1mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在40℃及pH7条件下，以pNP-GlcNAc为底物测定酶活性。结果(表1)表明，1mM的SDS和HgCl2可完全抑制NagGH3，FeSO4、AgNO3、FeCl3和PbAC对NagGH3的抑制较强，MgSO4和NiSO4对NagGH3的抑制较弱，其余金属离子和化学试剂对NagGH3的影响较小。
表1.金属离子及化学试剂对重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3活力的影响
5、纯化的β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3在NaCl中的活性：
酶在NaCl中的活性测定：在酶促反应体系中加入3.0～30.0％(w/v)NaCl，于pH为7.0及40℃下进行酶促反应。以pNP-GlcNAc为底物，反应10min，测定纯化的NagGH3的酶学性质。结果表明：NagGH3具有良好的耐盐性，在反应体系中加入3.0％和5.0％(w/v)的NaCl，该酶酶活性提高约0.3倍，在反应体系中加入20％(w/v)的NaCl，该酶仍然具有55％的活性(图6)。
6、纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3对底物的降解：
在pH7及40℃下，重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3对pNP-GlcNAc的酶活为19.36Umg-1、对二乙酰壳二糖的酶活为1.58U mg-1、对四乙酰壳四糖的酶活为0.86U mg-1，对pNP-G、pNP-Xyl、羧甲基纤维素、葡聚糖及昆布多糖均无酶活。
7、纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3水解N-乙酰壳寡糖的产物分析：
产物分析反应体系含80μL0.5％二乙酰壳二糖或四乙酰壳四糖和80μL纯酶液，在pH7及40℃下，反应6h。采用薄层层析法进行产物分析，薄层层析法步骤如下：
(1)配制展开剂(冰醋酸、双蒸水、正丁醇体积比为1：1：2，配制适量)倒入展开槽，静置约30min；
(2)将硅胶板放于110℃烘箱活化30min，冷却后划线，点样(每次0.5μL，吹干，共点3次)；
(3)将点样的一端硅胶板朝下放入展开槽，点样点不可没入展开剂；
(4)待展开剂到硅胶板上沿1.5cm时，取出硅胶板，吹干，再展一次；
(5)第二次展开结束后，硅胶板直接浸入适量显色剂(1g二苯胺溶入50ml丙酮，溶解后加1ml苯胺及5ml 85％的磷酸，混匀，现用现配)；
(6)几秒后，立即取出硅胶板并放入90℃烘箱10～15min，使斑点显色
结果表明，NagGH3可将二乙酰壳二糖及四乙酰壳四糖水解为N-乙酰-D-胺基葡萄糖单糖(图7、8)。
8、N-乙酰-D-胺基葡萄糖对重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3活性的影响
在酶促反应体系中加入终浓度为2–10mM N-乙酰-D-胺基葡萄糖，于pH7.0及40℃下进行酶促反应。以pNP-GlcNAc为底物，反应10min，测定纯化的NagGH3的酶学性质。结果表明：当反应体系加入终浓度10mM N-乙酰-D-胺基葡萄糖时，该酶仍保留约46％的活性，表明N-乙酰-D-胺基葡萄糖对NagGH3抑制作用较低(图9)。
本发明提供了一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3，其最适pH值为7，最适温度为40℃，可促进几丁质的水解，具有耐盐和耐产物抑制的性质，可应用于海产品加工、医学、功能性食品等行业。

Claims (5)

1.一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3，其特征在于，所述β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3从鞘氨醇杆菌中提取得到；所述β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3具有耐盐、耐N-乙酰-D-胺基葡萄糖抑制及水解二乙酰壳二糖的性质。
2.权利要求1所述的β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的编码基因nagGH3，其特征在于，所述编码基因nagGH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.包含权利要求2所述编码基因的重组载体，由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的基因片段与表达载体重组构建而成。
4.含有权利要求3所述重组载体的重组菌株。
5.权利要求1所述的一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的制备方法，包括：用重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3表达，得到β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3。
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