CN108441440A

CN108441440A - 一种蜡状芽孢杆菌116及其应用

Info

Publication number: CN108441440A
Application number: CN201810195337.0A
Authority: CN
Inventors: 张翔; 赵双枝; 陈相艳; 刘孝永; 张彦昊; 辛雪
Original assignee: Institute of Agro Food Science and Technology of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Agro Food Science and Technology of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2018-08-24
Anticipated expiration: 2038-03-09
Also published as: CN108441440B

Abstract

本发明公开了一种蜡状芽孢杆菌116及其应用。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)116，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC No：M 2017803，保藏日期是2017年12月18日。本菌株能够诱导性分泌一种胞外壳聚糖酶，发酵液中壳聚糖酶酶活可达40‑80U/mL，经简单的离心处理后，即可直接用于壳聚糖的酶解，因此该菌株在壳聚糖酶的工业化生产中具有极大的应用潜力。

Description

一种蜡状芽孢杆菌116及其应用

技术领域

本发明涉及一种蜡状芽孢杆菌116及其应用。

背景技术

壳聚糖酶是一类来源广泛的水解酶类，微生物来源不同，其产酶条件、酶学性质也有所不同。壳聚糖酶分布广泛，近年来，研究人员已从细菌、真菌、放线菌等微生物中筛选到具有潜在应用能力的壳聚糖酶发酵菌株，但由于产酶量及酶活性普遍较低，适用于规模化生产的菌株很少，难以满足生产需要。

发明内容

本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种蜡状芽孢杆菌116及其应用。本发明提供了一种蜡状芽孢杆菌116，其经液体发酵的方法生产壳聚糖酶，发酵液中壳聚糖酶酶活可达40-80U/mL，得到的发酵液经简单的离心或过滤处理后，即可直接用于壳聚糖的酶解。此外，该菌株以粉末壳聚糖作为产酶诱导物，较之常用的胶体壳聚糖或可溶性壳聚糖具有操作简便、成本低等优势，因此该菌株在壳聚糖酶的工业化生产中具有极大的应用潜力。

本发明所述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)116，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号是：CCTCC No：M2017803，保藏日期是2017年12月18日。

所述的一种蜡状芽孢杆菌116在制备壳聚糖酶中的应用，通过如下技术方案来实现的：

(1)斜面培养：取保存的蜡状芽孢杆菌116菌株接种于试管斜面培养基上，30-32℃培养2-3d；所述的斜面培养基(w/v)：硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.2％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.1％，粉末壳聚糖1.0％，琼脂2.0％，pH 6-7；

(2)种子活化：取斜面保存的蜡状芽孢杆菌116菌株接种于种子培养基中，30-32℃，150rpm转速下培养24h，制得活化种子液；所述的种子培养基(w/v)：蛋白胨0.5％，粉末壳聚糖0.5％，葡萄糖0.1％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，pH 6-7；

(3)发酵产酶：将活化的种子液接入发酵产酶培养基中，30-32℃，150rpm转速下培养60-72h；所述的发酵产酶培养基(w/v)：粉末壳聚糖1.5％，葡萄糖0.1％，硫酸铵2.0％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，pH 6-7。

菌株培养过程中，添加粉末壳聚糖作为诱导物。

蜡状芽孢杆菌116发酵完成后，经离心或过滤得到发酵上清液即可作为酶液使用。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种蜡状芽孢杆菌116，该菌株具有较高的产壳聚糖酶活性，其发酵上清液中壳聚糖酶酶活可达40-80U/mL；该菌株以粉末壳聚糖作为产酶诱导物，较之常用的胶体壳聚糖或可溶性壳聚糖具有操作简便、成本低等优势，适合工厂化放大生产；此外，得到的发酵液经简单的离心或过滤处理后，即可直接用于壳聚糖的酶解，因此该菌株在壳聚糖酶的工业化生产中具有极大的应用潜力。

附图说明：

图1所示为本发明蜡状芽孢杆菌116的菌落形态；

图2所示为本发明菌株显微形态(×1000)；

图3所示为本发明蜡状芽孢杆菌116的系统发育进化树；

图4所示为碳源对蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；

图5所示为氮源对蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；

图6所示为温度对蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；

图7所示为初始pH对蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；

图8所示为发酵时间对蜡状芽孢杆菌株116产壳聚糖酶的影响；

图9所示为装液量对蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；

图10所示为接种量对蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；

图11所示为壳聚糖酶液的DEAE-Sepharose Fast Flow柱洗脱曲线，其中，■-蛋白质浓度；○-520nm吸光值；

图12所示为壳聚糖酶的SDS-PAGE图，其中，1-经离子交换层析纯化的酶液；2-经硫酸铵沉淀纯化的酶液；3-粗酶液；M-标准蛋白样品；图13所示为pH对壳聚糖酶活力的影响；

图14所示为pH对壳聚糖酶稳定性的影响；

图15所示为温度对壳聚糖酶活力影响；

图16所示为温度对壳聚糖酶稳定性的影响；

图17所示为酶促反应米氏常数和最大反应速率的测定。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

以下实施例中，离子交换树脂DEAE Sepharose Fast Flow购自GE Healthcare公司。壳聚糖(脱乙酰度90～95％)购自上海生工生物工程股份有限公司。蛋白质分子量标准品购自北京天根生化科技有限公司。实验所用试剂均为分析纯。

实施例1菌株分类学鉴定

所述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)116，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号是：CCTCC No：M2017803，保藏日期是2017年12月18日。

斜面培养基(w/v)：硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.2％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.1％，粉末壳聚糖1.0％，琼脂2.0％，pH 6-7；

种子培养基(w/v)：蛋白胨0.5％，粉末壳聚糖0.5％，葡萄糖0.1％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，pH 6-7；

发酵产酶培养基(w/v)：粉末壳聚糖1.5％，葡萄糖0.1％，硫酸铵2.0％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，pH 6-7。

菌株116在斜面培养基上培养72h后，菌落呈灰白色、无光泽、不透明、边缘不规则、圆形或近圆形，菌落直径2～4mm左右(说明书附图图1)；菌株革兰氏染色呈阳性(说明书附图图2)，菌体为杆状，两端钝圆，产芽孢，芽孢着生在菌体中间或侧端。

菌株116生理生化实验结果如表1所示，该菌株甘露醇、山梨醇利用实验、吲哚实验及H₂S实验结果为阴性，其余V.P.实验，甲基红实验，接触酶实验，淀粉水解实验，氧化酶实验，酪蛋白分解实验，硝酸盐还原实验等均为阳性结果；

表1菌株116生理生化特征

菌株116经PCR扩增获得16S rDNA的部分序列，长度为1512bp，通过BLAST程序与GenBank数据库中的序列比对，构建系统发育进化树，结果如说明书附图图3所示，菌株116与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的同源关系最近，结合形态学及生理生化实验结果，初步确定菌株116为蜡状芽孢杆菌。

实施例2菌株发酵产壳聚糖酶

(1)菌株发酵

从新鲜斜面挑取一环菌体接入种子培养基中，32℃，150r/min摇床培养24h，以6％的接种量接入发酵产酶培养基中，32℃，150r/min摇床培养72h。

(2)粗酶液的制备

发酵完成后，取菌株发酵液，5000r/min冷冻离心10min，收集上清即为粗酶液，可直接用于壳聚糖的酶解。

(3)壳聚糖酶活力的测定方法

取0.1mL适当稀释的酶液，加入1mL 0.2mol/L pH 5.6醋酸-醋酸钠缓冲液，0.9mL1％胶体壳聚糖(0.2mol/L，pH 5.6醋酸缓冲液)，于50℃保温15min后加入3,5-二硝基水杨酸(DNS)1.5mL终止反应，沸水浴5min显色，冷却后定容至25mL，过滤后测定520nm波长处的吸光度，以等量煮沸灭活的酶液作为空白对照。每毫升酶液每分钟催化生成1μmol还原糖(以氨基葡萄糖计算)所需的酶量为1个酶活单位(U)。

实施例3菌株发酵产酶条件优化

所用的相对酶活力计算方法：每组中所测样品酶活力：每组中的最大样品酶活力×100％。

(1)碳源对菌株产酶的影响

碳源是构建微生物细胞以及合成各种代谢产物的原料，也是微生物获取能量的主要来源。分别以胶体壳聚糖、可溶性淀粉、葡聚糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖替代发酵产酶培养基中的粉末壳聚糖，考察碳源对发酵产酶的影响，结果如说明书附图图4所示，粉末壳聚糖最利于该菌株发酵产酶

(2)氮源对菌株产酶的影响

氮源作为构成菌体蛋白质、核酸以及其它氮素化合物的材料，对微生物生长发育和代谢具有重要意义。分别以硝酸铵、尿素、蛋白胨、硝酸钾替代产酶培养基中的硫酸铵，考察氮源对发酵产酶的影响。结果入说明书附图图5可以看出，以蛋白胨为氮源时壳聚糖酶活力最高，其次是硫酸铵和硝酸铵，相对酶活力分别达到99％和83％。综合考虑成本和产率两方面，本发明选用无机氮源硫酸铵作为发酵氮源。

(3)温度对菌株产酶的影响

设定菌株发酵温度分别为28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，测定发酵液的酶活力，考察温度对发酵产酶的影响。由说明书附图图6可以看出，32℃时该菌株发酵产酶活力最高，随着温度的升高或降低，酶活力均呈下降的趋势。

(4)初始pH对菌株产酶的影响

将产酶培养基初始pH分别调至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，对菌株进行发酵培养，测定发酵液的酶活力，考察初始pH对发酵产酶的影响。由说明书附图图7可以看出，初始pH对菌株发酵产酶影响显著，当初始pH调节为6.0，更适于该菌株产壳聚糖酶。

(5)发酵时间对菌株产酶的影响

将菌株接入产酶培养基中，分别以24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h作为菌株培养时间，测定发酵液酶活力，考察发酵时间对菌株产酶的影响。在不同发酵时间测定该菌株的产酶活性，结果说明书附图图8所示，菌株发酵24h即能检测到壳聚糖酶活力，随着发酵时间延长至72h，发酵液中酶活力达到最高，随后酶活力呈下降趋势。

(6)装液量对菌株产酶的影响

将500mL三角瓶的培养基装液量分别设为50mL、80mL、100mL、120mL、150mL、180mL，对菌株进行培养，考察装液量对发酵产酶的影响。结果如说明书附图图9所示，500mL三角瓶中装液量为120mL时，菌株产酶活力最高，随着装液量的增加或减少，酶活力都会受到影响。

(7)接种量对菌株产酶的影响

将种子液以不同接种量2％、4％、6％、8％、10％接入产酶培养基中，测定发酵液酶活力，考察接种量对发酵产酶的影响。接种量对菌株发酵产酶影响不大，如说明书附图图10所示，在接种量为4％时，相对酶活力最高，随着接种量的增加，相对酶活力随之下降，但趋势较缓，当接种量为10％时，相对酶活力仍保持在90％以上。

(8)正交实验设计

以最适碳源添加量、最适氮源添加量、温度、初始pH、发酵时间、装液量、接种量为因素，设计七因素三水平正交实验，确定最适发酵条件。综合单因素实验结果，以粉末壳聚糖添加量、硫酸铵添加量、初始pH、温度、发酵时间、装液量、接种量为因素，进行L₁₈(3⁷)正交实验，结果如表2所示，在实验的7个因素中，初始pH、发酵时间、硫酸铵添加量极差R值较大，其余因素极差R值较小，由此可见对产壳聚糖酶活力影响较大的3个因素依次为初始pH、发酵时间、硫酸铵添加量。由K值结果显示，该菌株最适产酶发酵条件为粉末壳聚糖添加量1.5％，硫酸铵添加量3％，初始pH 6.0，温度32℃，发酵72h，500mL三角瓶中装液量120mL，接种量4％，在此最适产酶发酵条件下，菌株116发酵液中壳聚糖酶酶活力可达43.89U/mL。

表2正交试验结果分析

实施例4发酵罐培养菌株116发酵产酶

种子活化后，采用优化后的培养基和培养条件，用16L罐发酵，控制发酵过程中pH6.0，培养温度32℃，、通风搅拌发酵55h，搅拌速度为180rpm，通风比为1:0.8，发酵上清液中壳聚糖酶活力为71.25U/mL，发酵液经过滤处理后，收集上清液，可直接用于壳聚糖的酶解。

实施例5

壳聚糖酶的分离纯化

1.硫酸铵沉淀

向粗酶液中缓慢加入硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度达到35％，4℃静置过夜后6000r/min冷冻离心，去除杂蛋白。在上清液中继续加入硫酸铵，使其饱和度达到90％，4℃静置过夜后6000r/min冷冻离心，弃去上清，将沉淀重悬于PBS缓冲液(pH 7.5，50mmol/L磷酸盐缓冲液)，把所得蛋白质溶液转移至透析袋中，在相同缓冲液中4℃透析24h(定时更换缓冲液)。

2.DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析

将透析后的样品加入到用PBS缓冲液预平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱(3×20cm)，先用3倍柱床体积的PBS缓冲液洗脱至OD 280不变，再用含0～1mol/L氯化钠的PBS缓冲液进行线性梯度洗脱，体积流量为1mL/min，每管收集6mL，经酶活力检测后收集有酶活组分。

3.SDS-PAGE检测壳聚糖酶纯度及分子量

采用不连续垂直板电泳系统，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，缓冲体系为pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲液。

结果如说明书附图图11所示，经检测，洗脱下来的蛋白峰中只有一个峰具有壳聚糖酶活力，将不同纯化步骤后的酶液及标准分子量蛋白样品进行SDS-PAGE检测，结果如说明书附图图12所示，经离子交换层析后，壳聚糖酶在SDS-PAGE下只显示一条蛋白质谱带，表明该酶已达到电泳纯，对应于标准蛋白样品分子量的迁移率，得出该酶分子量约为43.7kDa。根据实验数据计算壳聚糖酶分步分离纯化结果，如表3所示，经纯化后，壳聚糖酶的纯化倍数为9.55倍，酶活回收率为57.88％。

表3壳聚糖酶分离纯化结果

实施例6

壳聚糖酶的酶学性质分析

1.pH对壳聚糖酶活性及酶的稳定性的影响

分别以不同pH缓冲液配制底物和稀释酶液，然后测其酶活力，考察pH对壳聚糖酶活力的影响；将壳聚糖酶置于不同pH缓冲液中，4℃保持30min，然后测其残余酶活力，考察pH对壳聚糖酶稳定性的影响。如说明书附图13、14所示。该酶最适pH为5.6，当pH高于5.6时，其活性迅速下降，pH为6.0时，相对酶活力已降至60％以下，壳聚糖酶在pH 3.6～5.6范围内有较好的催化活力，4℃下维持30min，该酶相对酶活力仍能保持85％以上。

2.温度对壳聚糖酶活性及酶的稳定性的影响

将壳聚糖酶液置于不同温度下测其活力，考察温度对壳聚糖酶活力的影响；在不同温度下，将壳聚糖酶液保温1h，然后测其残余酶活力，考察温度对壳聚糖酶稳定性的影响。如说明书附图15、16所示，该酶最适反应温度为50℃，在40～55℃范围内，该酶仍能保持较好的酶活力，相对酶活力在85％以上；该酶在低于40℃时酶活力较为稳定，但当温度升至50℃时，温浴1h后酶活即完全丧失。

分离纯化的壳聚糖酶分子量为43.7kDa，这与现有技术的芽孢杆菌属菌株所产壳聚糖酶的分子量25～45kDa范围较为一致，但该酶的pH稳定范围在pH 3.6-5.6，较其它壳聚糖酶更加耐酸，此外，当pH升为7.0时，相对酶活力仍能保持在70％以上，可见该酶与其它芽孢杆菌属所产壳聚糖酶相比，不仅对较低的pH环境有耐受能力，而且对pH的适应范围也相对较宽。

3.金属离子对壳聚糖酶活性的影响

在酶反应体系中分别加入不同金属离子，使其终浓度达到5mmol/L，4℃保持4h，然后测其酶活力，考察金属离子对壳聚糖酶活力的影响。

添加不同金属离子(5mmol/L)对壳聚糖酶酶活力的影响如表4所示，反应体系中Mn²⁺对该酶有强烈的激活作用，酶活提高了1.12倍。Mn²⁺可能参与到壳聚糖酶活性中心的构建，即通过结合酶活性中心以外的部位，增大酶与底物之间的亲和力，使酶活力得到增强。而金属离子Cu²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺、Ag⁺对壳聚糖酶有不同程度的抑制作用，酶活分别降低了33％、29％、28％、35％。由于重金属离子的螯合作用，干扰了酶对底物的降解，从而导致酶活下降。因此，在以后对该酶的使用过程中，要严格注意反应体系中金属离子的存在状况。

表4金属离子对壳聚糖酶活力的影响

4.壳聚糖酶的底物特异性

分别以胶体壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、甲壳素为底物，考察不同底物对壳聚糖酶活力的影响。

在酶反应体系中分别以1％胶体壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素和甲壳素作为底物，以考察菌株116所产壳聚糖酶对不同底物的降解特性。结果如表5所示，该酶只对胶体壳聚糖具有降解活性，对葡聚糖、羧甲基纤维素和甲壳素均没有降解作用。

表5壳聚糖酶的底物特异性

5.壳聚糖酶动力学参数的测定

在壳聚糖酶活力测定体系中，改变底物胶体壳聚糖溶液浓度，以底物浓度的倒数为横坐标(1/[S])，反应速度的倒数为纵坐标(1/V)，按照Lineweaver-Burk法作图，结果如说明书附图17所示，测得米氏常数(K_m)和最大反应速率(V_max)分别为11.10mg/mL，和1.38μmol/min·mL。

Claims

1.一种蜡状芽孢杆菌116，其特征在于：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)116，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC No：M 2017803，保藏日期是2017年12月18日。

2.如权利要求1所述的一种蜡状芽孢杆菌116在制备壳聚糖酶中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，菌株培养过程中，添加粉末壳聚糖作为诱导物。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，蜡状芽孢杆菌116发酵完成后，经离心或过滤得到发酵上清液即可作为酶液使用。