CN112725394B - 一种用于葡萄酒添加剂的低聚壳聚糖及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于葡萄酒添加剂的低聚壳聚糖及其制备方法，属于食品添加剂的技术领域。本发明制备的低聚壳聚糖，以壳聚糖为原料，经过壳聚糖酶酶解后，获得低聚壳聚糖；所述低聚壳聚糖的平均分子量为3000‑20000。本发明制备的低聚壳聚糖在葡萄酒中可以作为抑菌剂应用，尤其对酒香酵母菌的抑制上有着明显的效果。

Description

一种用于葡萄酒添加剂的低聚壳聚糖及其制备方法
技术领域
本发明属于食品添加剂的技术领域，具体涉及一种用于葡萄酒添加剂的低聚壳聚糖及其制备方法。
背景技术
传统的葡萄酒制酒工艺中常以二氧化硫作为抑菌剂和抗氧化剂等用于葡萄酒酿造和储存。但葡萄酒中的二氧化硫会导致部分人群的过敏反应，此外，二氧化硫主要抑制葡萄酒中的细菌活性，对有害酵母(如酒香酵母、德克酵母等)的抑菌性不显著，并且二氧化硫的过量使用也会对葡萄酒的风味产生不良影响。
壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基而成的一类碱性多糖，具有抑菌、抗氧化、絮凝、抗肿瘤、增强免疫应答等一系列生物活性，但由于其难溶于水，仅溶于某些稀酸，如盐酸、冰乙酸等，限制了它的应用。低聚壳聚糖是通过壳聚糖降解获得，近年来的研究表明，在一定范围内，低聚壳聚糖随着脱乙酰度的增高，分子量的降低，其抑菌性、抗氧化性等都会得以提高。常用的降解壳聚糖的方法有化学法和酶解法两种。其中酶解法相对于化学法，具有条件温和易控，副产物少、不易造成环境污染等优势。酶解法中又包括非专一性酶解法和专一性酶解法非专一性酶法常采用复合酶酶解，如纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、蛋白水解酶等，但各酶对壳聚糖的降解机制还不十分清楚，操控复杂，酶解产物分子量分布较宽，而以专一性的壳聚糖酶酶解壳聚糖，具有条件温和，反应易控，副产品少，所需分子量范围的低聚壳聚糖产品得率高等优势，因此是一种非常有前途的降解方法。但目前，大多微生物发酵生产的壳聚糖酶，产酶少、酶活低，导致酶解成本较高，无法满足工业化生产需要，此外，虽然壳聚糖在葡萄酒行业已有应用，但其多以未经降解的壳聚糖直接添加，而且只是被批准作为絮凝剂、澄清剂使用。因此，如何细化壳聚糖的物化特性，扩大壳聚糖的应用范围，开发满足葡萄酒行业需求的壳聚糖产品，仍有待深入研究。
发明内容
针对现有技术中暂无葡萄酒专用抑菌壳聚糖的问题，本发明提供一种用于葡萄酒添加剂的低聚壳聚糖及其制备方法，以解决上述问题。本发明通过采用特定的壳聚糖酶，细化壳聚糖的酶解过程，可以获得分子量分布较窄，适用于葡萄酒生产应用的低聚壳聚糖。
本发明的技术方案为：
一种用于葡萄酒添加剂的低聚壳聚糖，以壳聚糖为原料，经过壳聚糖酶酶解后，获得低聚壳聚糖；所述低聚壳聚糖的脱乙酰度≥85％，平均分子量为3000-20000。
优选的，所述壳聚糖酶是通过蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)116发酵后分离纯化所得；所述蜡状芽孢杆菌116公开于专利201810196500.5，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC No：M 2017803，保藏日期是2017年12月18日。
本发明还提供了一种用于葡萄酒添加剂的低聚壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：(1)原料准备；(2)溶解；(3)酶解；(4)灭酶；(5)浓缩干燥。
优选的，所述步骤(1)为：选用脱乙酰度≥85％的壳聚糖粉末；所述壳聚糖的平均分子量为10万～100万。
优选的，所述步骤(2)为：将壳聚糖粉末溶解于冰乙酸水溶液中，搅拌均匀，得壳聚糖溶液；所述冰乙酸水溶液浓度为0.5～2％(w/v)，用量为以壳聚糖粉末用量计10～40g/L。
优选的，所述步骤(3)为：将步骤(2)所制得壳聚糖溶液pH调节至4.5～6.5，然后加入壳聚糖酶，调整酶解温度为40～60℃，酶解时间4～24h，得酶解液。
优选的，所述壳聚糖酶的用量为以壳聚糖重量计按5～20u/g。
优选的，所述步骤(4)为：酶解反应结束后，将酶解液加热至80～100℃，保温10min，然后冷却至室温，得低聚壳聚糖溶液。
优选的，所述步骤(5)为：低聚壳聚糖溶液经浓缩后，通过喷雾干燥或冷冻干燥的方式，得到低聚壳聚糖产品。
本发明制备的低聚壳聚糖在葡萄酒中作为抑菌剂使用。
本发明的有益效果为：
本发明通过研究发现，分子量处于3000～20000的低聚壳聚糖对酒香酵母菌等有害酵母的抑制上有着明显的效果。因此，本发明制备的低聚壳聚糖可添加到葡萄酒酿造、储存各环节，表现出较好抑菌性、抗氧化性等生物活性，尤其是对葡萄酒中酒香酵母属，德克酵母属等有害酵母具有显著的抑菌活性，提升葡萄酒的品质及安全性。此外，本发明采用的低聚壳聚糖制备方法条件温和，简单易行，利用本发明生产出的低聚壳聚糖，具有分子量相对集中，有高于60％的产物是在目标分子量范围内，溶解性好纯度高等优点。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于葡萄酒添加剂的低聚壳聚糖，具体制备方法如下：
(1)原料准备
选用来源于甲壳动物的脱乙酰度85％，平均分子量为12万的壳聚糖原料50g。
(2)溶解
将壳聚糖粉末溶解于2.5L 1％的冰乙酸水溶液中，加热至45～55℃，不断搅拌直至壳聚糖完全溶解，得壳聚糖溶液。
(3)酶解
将步骤(2)中的壳聚糖溶液pH调节至5.6，按酶活10u/g壳聚糖计，取壳聚糖酶溶液10mL加入壳聚糖酶溶液中，其中壳聚糖酶溶液的酶活为50u/mL，控制酶解温度50℃，酶解8h，得壳聚糖酶解液。
(4)灭酶
酶解反应结束后，将酶解液加热至80～100℃，保温10min，然后冷却至室温，得低聚壳聚糖溶液。
(5)浓缩干燥
将低聚壳聚糖溶液进行浓缩，然后通过喷雾干燥的方式，得到低聚壳聚糖产品。经检测，制备的低聚壳聚糖脱乙酰度85％，平均分子量为5900，其中低聚壳聚糖分子量分布在3000～20000占比为64.1％。
实施例2
一种用于葡萄酒添加剂的低聚壳聚糖，具体制备方法如下：
(1)原料准备
选用来源于真菌的脱乙酰度95％，平均分子量为21万的壳聚糖为原料30g。
(2)溶解
将壳聚糖粉末溶解于1L 1.5％的冰乙酸水溶液中，加热至45～55℃，不断搅拌直至壳聚糖完全溶解，得壳聚糖溶液。
(3)酶解
将步骤(2)中的壳聚糖溶液pH调节至5.6～5.8，按酶活20u/g壳聚糖计，取壳聚糖酶溶液12mL加入壳聚糖酶溶液中，其中壳聚糖酶溶液的酶活为50u/mL，控制酶解温度50℃，酶解12h，得酶解液。
(4)灭酶
酶解反应结束后，将酶解液加热至80～100℃，保温10min，然后冷却至室温，得低聚壳聚糖溶液。
(5)浓缩干燥
将低聚壳聚糖溶液进行浓缩，然后通过冷冻干燥的方式，得到低聚壳聚糖产品。经检测，制备的低聚壳聚糖脱乙酰度为95％，平均分子量为9800，其中低聚壳聚糖分子量分布在3000～20000占比为71.4％。
测试例
将实施例1和实施例2制备的低聚壳聚糖与市售壳聚糖、市售壳寡糖以及二氧化硫分别添加到人工污染酒香酵母的葡萄酒中，葡萄酒中初始酒香酵母浓度为3.2×105cfu/mL，经处理5天后，经检测相关参数如下表1：
表1-检测数据
Figure BDA0002874506470000041
由表1数据可以得出以下结论：本发明所制备的低聚壳聚糖平均分子量在3000～20000范围内，对葡萄酒中的酒香酵母有明显的抑制效果，而分子量过高或过低的市售壳聚糖、壳寡糖，对酒香酵母的抑制能力较弱。二氧化硫对酒香酵母无显著抑菌能力。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种低聚壳聚糖在葡萄酒中作为抑菌剂的应用，其特征在于，所述低聚壳聚糖以壳聚糖为原料，经过壳聚糖酶酶解后获得；所述低聚壳聚糖的脱乙酰度≥85%，平均分子量为3000-20000；所述低聚壳聚糖用于抑制酒香酵母；所述低聚壳聚糖在葡萄酒中加入量为100mg/L；
所述壳聚糖酶是通过蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）116发酵后分离纯化所得；所述蜡状芽孢杆菌116，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC No：M 2017803，保藏日期是2017年12月18日；
所述低聚壳聚糖制备包括以下步骤：（1）原料准备；（2）溶解；（3）酶解；（4）灭酶；（5）浓缩干燥；
所述步骤（1）为：选用脱乙酰度≥85%的壳聚糖粉末；所述壳聚糖的平均分子量为10万~100万；
所述步骤（2）为：将壳聚糖粉末溶解于冰乙酸水溶液中，搅拌均匀，得壳聚糖溶液；所述冰乙酸水溶液浓度为0.5~2% w/v，用量为以壳聚糖粉末用量计10~40g/L；
所述步骤（3）为：将步骤（2）所制得壳聚糖溶液pH调节至4.5~6.5，然后加入壳聚糖酶，调整酶解温度为40~60℃，酶解时间4~24h，得酶解液；
所述壳聚糖酶的用量为以壳聚糖重量计按5~20u/g。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）为：酶解反应结束后，将酶解液加热至80~100℃，保温10min，然后冷却至室温，得低聚壳聚糖溶液。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（5）为：低聚壳聚糖溶液经浓缩后，通过喷雾干燥或冷冻干燥的方式，得到低聚壳聚糖产品。
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