CN100539853C - 果蔬生物诱抗保鲜剂 - Google Patents

Abstract

果蔬生物诱抗保鲜剂，由低聚糖10%、表面活性剂2%，水组成，其中表面活性剂为吐温。从果蔬采后主要致病真菌灰霉菌和链格孢发酵后的菌丝体中提取，主要组分为不同聚合度低聚糖，低聚糖是由不同的单糖聚合而成，单糖为葡萄糖，甘露糖，阿拉伯糖，半乳糖和木糖的组成，其摩尔比为1∶3∶6∶2∶1。并含有表面活性剂、稳定剂。作为生防制剂，在采收前、采收后使用能够诱导新鲜果蔬抗病性反应，直接提高果蔬对病原菌的抗性，用于防治果蔬采后灰霉菌、链格孢等病原真菌引起的腐烂。本发明属生物技术在果蔬采后病害腐烂防治上的应用，其生产工艺成熟，生产和使用的成本低廉，为果蔬采后防腐保鲜提供了高效、无毒的无公害生物诱导抗病保鲜剂，应用前景广阔。

Description

果蔬生物诱抗保鲜剂

技术领域

本发明属于农产品保鲜技术及用品，特别涉及一种果蔬生物诱抗保鲜剂及其生产过程以及在新鲜果蔬保鲜中的应用。

背景技术

果蔬采后病原菌引起的腐烂已经成为限制果蔬采后产业发展的瓶颈，据统计，目前全世界果蔬采后腐烂占果蔬总量的20-30％。目前主要采用化学杀菌剂结合冷藏的方法防治果蔬采后病原菌引起的腐烂。然而，化学杀菌剂对人体健康和环境均有害，其使用逐渐受到控制，生物保鲜技术逐渐受到人们的重视。

近年来，有人研究利用特定植物的提取物作为防腐保鲜剂用来防腐保鲜，但是这种方法成本太高，在具体生产实践中难以推广；许多微生物拮抗菌诱导寄主组织的防御反应也成为现在研究的热点，但是由于拮抗菌对营养条件要求苛刻，环境条件常常影响到它的保鲜效果，而且难以规模化生产。采用特定诱导抗病剂提高植物抗病性的研究近年来逐渐受到重视。目前关于诱导抗病剂的研究与应用主要集中于农作物生长阶段，主要成分有壳聚糖、水杨酸、一些化学合成的物质等。然而目前，还没有一种有效的，成本较低的且可以规模化生产的在果蔬采后贮藏保鲜中应用的生物诱抗保鲜剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种果蔬生物诱抗保鲜剂。它是从果蔬采后病原菌中提取一种生物诱抗保鲜剂及制作方法，适用于多种水果蔬菜的保鲜。

本发明的技术方案

一种果蔬生物诱抗保鲜剂，其特征在于，其主要组分为：果蔬致病真菌菌丝体提取低聚糖10％、表面活性剂2％，其余为水。

低聚糖由以下方法取得的物质：

1.灰霉菌(Botrytis cinerea)和链格孢(Alternaria spp.)接种于PDA培养基上27℃培养一周。

PDA培养基成分：马铃薯200g  琼脂18～20g  葡萄糖20g

2.从菌落边缘打取直径为5mm左右的菌饼转入液体培养基中振荡培养五天。接种量7块/200ml，转速为110r/min。

液体培养基：硝酸钾    2.00g     磷酸氢二钾    1.00g

            氯化钾    0.05g     七水合硫酸镁  0.50g

            硫酸亚铁  0.01g     蔗糖          30.00g

            蒸馏水    1000ml    土豆汁        400g

3.用玻璃抽滤器抽滤获取菌丝体，用4L去离子水清洗数次，同时用4L100mmol/L磷酸钠(pH7.2)清洗，用0.5mol/L磷酸钾(pH7.2)清洗数次，再用蒸馏水清洗，随后用2L体积比为1∶1的氯仿，甲醇混合液清洗，最后再用丙酮清洗。

4.菌丝体经超声波捣碎机多次捣碎获取的菌丝体细胞壁。

5.细胞壁提取物按1∶100(w/v)与无离子水混合，在高压灭菌锅中保持3小时，冷却后在11200×g条件下离心20min.

6.上清液用0.22um的微孔滤膜过滤.上清液中主要成分即低聚糖，也是诱抗剂，也称为激发子，贮存于冰箱备用。

工业化发酵技术工艺

从经济、实用角度，综合考虑，通过对大批量发酵试验条件优化，筛选出该低聚糖，也是诱抗剂，也称激发子批量生产的最佳液体培养基组分为：

酵母粉    0.35％    蛋白胨    0.15％

黄豆粉    4.0％     蔗糖      2.5 ％

土豆汁    20％      K₂HPO₄    0.5％

MgSO₄     0.05％

先培养菌种，从菌落边缘打取直径为5mm左右的菌饼转入液体培养基中振荡培养3天；接种量7块/200ml，转速为110rpm，随后取500mL液体培养液转入15升发酵罐中(培养基成分见上)，30℃，培养3天，通气量为8L/min，pH6.8，搅拌速度为280rpm，发酵过程中每隔24h经两次流加，液体接种量分别为200mL和100mL，培养结束后对菌丝体进行抽滤，按照以上低聚糖由以下方法取得的物质取得方法：中的3-6步骤获取激发子。发酵罐生成菌丝体回收率可达到8.76g/L，跟三角瓶液体培养菌丝体回收率相差不多。在发酵罐生长过程中，发酵时间比三角瓶发酵时间短，产率没有三角瓶发酵高跟发酵过程中的通气量不同有一定关系，在发酵过程中发现污染没有三角瓶发酵污染机率低。所以，本专利所采用的菌种可以在发酵罐中进行发酵批量生产，不但对激发子产量影响不大，还加快了菌体生长，可以进行批量规模化生产。

本果蔬生物诱抗保鲜剂使用于果蔬的果实、茎、叶的贮藏保鲜，于果蔬的采收前喷雾或采收后喷雾、浸蘸处理，提高果蔬对主要采后病原真菌灰霉菌、链格孢等的抗病性，减少贮藏过程中的常见病原菌引起的腐烂，延长果蔬贮藏保鲜时间。

生物诱抗剂的诱抗活性测定及定量分析

我们通过大豆子叶法测定所制备的诱抗剂活性进行测定，测定结果表明(以中性糖浓度为标准)75ug/ml处的激发子诱抗活性最高，而且其诱抗活性随着浓度的加大而有所下降。其糖组分如下：其中性糖浓度为1.28mg/ml，占细胞壁重量的25.6％；氨基葡萄糖浓度为0.387mg/ml，占细胞壁重量的7.74％；还原糖浓度为1.17mg/ml占细胞壁重量的23.4％。我们通过柱层析及高压液相色谱对诱抗剂组分进行定性分析，结果发现其主要组分为不同聚合度寡聚糖(也称低聚糖)，寡聚糖是由不同的单糖聚合而成，通过对寡糖水解发现单糖为葡萄糖，甘露糖，阿拉伯糖，半乳糖和木糖的组成，其摩尔比为1∶3∶6∶2∶1。

生物诱抗剂的保鲜效应

此诱抗剂应用于多种果蔬的保鲜上均取得了较理想的保鲜效果，能够有效的诱导提高果蔬对采后病原菌的抗病性。下面我们以其在葡萄的保鲜效应为例进行说明：

生物诱抗剂在葡萄果粒上的保鲜效应

通过对葡萄果皮上抗病性相关酶苯丙氨酸解氨酶活性，过氧化物酶，多酚氧化酶的活性测定，结果显示诱抗剂处理后果皮的酶活性明显高于清水对照处理。同时我们也测定果皮抗病物质的含量，结果表明：诱抗剂处理过的果皮木质素和酚类物质含量明显高于清水对照处理。葡萄储藏90天后我们对其自然发病情况进行调查，结果显示：对照的发病率56.78％，发病指数为4.66；诱抗剂处理过的发病率为19.78％，发病指数为1.04。人工接种病原菌后的调查结果显示：对照一天后就开始发病，而激发子处理后的4天后才开始发病，7天后对照全部发病，病情指数为4.32；激发子处理后的发病率为38％，发病指数为1.11，这些结果表明诱抗剂在葡萄果粒防腐保鲜上取得的较好的效果，不仅延缓了发病时间，而且降低了发病率和病情指数。

生物诱抗剂在葡萄果梗上的保鲜效应

通过对葡萄果梗上抗病性相关酶苯丙氨酸解氨酶活性，过氧化物酶，多酚氧化酶的活性测定，结果显示：诱抗剂处理后果梗的酶活明显高于清水对照处理。同时我们也测定果皮的抗病物质含量，结果表明：诱抗剂处理过果梗的木质素和酚类物质含量明显高于清水对照处理。葡萄储藏90天后我们对其自然发病情况进行调查显示：对照的发病率67.33％，发病指数为4.12；诱抗剂处理过的发病率为13.78％，发病指数为1.56。人工接种病原菌后的调查结果显示：对照一天后就开始发病，而激发子处理的5天后才开始发病，10天后对照全部发病，病情指数为3.89；激发子处理后的发病率为18％，发病指数为1.03，这些结果表明诱抗剂不但在葡萄果粒上取得了较好防腐保鲜效果，而且在果梗也上取得的较好的效果。

诱抗剂对葡萄品质的影响

通过测定葡萄果粒的含糖量，含酸量，细胞膜透性和果梗叶绿素发现诱抗剂处理过的葡萄果粒含糖量高于对照，含酸量和细胞膜透性低于对照，果梗叶绿素含量在整个储藏期间明显高于对照，这些实验结果表明诱抗剂在一定程度上提高果蔬品质。

技术特点

1.生产工艺简单，易于操作

2.成本低廉，可工厂化大批量生产

3.施用方法简单，受外界环境影响较小

4.不但可诱导采后果蔬采后诱导抗性，而且无污染，无公害，无毒副作用，使用方便，安全

5.贮藏保鲜效应好，可以延缓果蔬衰老，提高果蔬品质。

6.使用方式：采收前一周配成50～200μg/ml浓度，对果实或茎、叶等进行喷雾处理。也可以在采收后用相同浓度的诱导抗病剂进行浸蘸或喷雾处理。

具体实例：

一种果蔬生物诱抗保鲜剂，其主要组分为：果蔬致病真菌菌丝体提取低聚糖10％、表面活性剂2％，其余为水，其中表面活性剂主成分为吐温80。

低聚糖由以下方法取得的物质：

1、灰霉菌(Botrytis cinerea)和链格孢(Alternaria spp.)接种于PDA培养基上27℃培养一周。

PDA培养基成分：马铃薯200g  琼脂18～20g  葡萄糖20g

2、从菌落边缘打取直径为5mm左右的菌饼转入液体培养基中振荡培养五天。接种量7块/200ml，转速为110r/min。

液体培养基：硝酸钾    2.00g      磷酸氢二钾    1.00g

            氯化钾    0.05g      七水合硫酸镁  0.50g

            硫酸亚铁  0.01g      蔗糖          30.00g

            蒸馏水    1000ml     土豆汁        400g

3.用玻璃抽滤器抽滤获取菌丝体，用4L去离子水清洗数次，同时用4L100mmol/L磷酸钠(pH7.2)清洗，用0.5mol/L磷酸钾(pH7.2)清洗数次，再用蒸馏水清洗，随后用2L体积比为1∶1的氯仿，甲醇混合液清洗，最后再用丙酮清洗。

4.菌丝体经超声波捣碎机多次捣碎获取的菌丝体细胞壁。

5.细胞壁提取物按1∶100(w/v)与无离子水混合，在高压灭菌锅中保持3小时，冷却后在11200×g条件下离心20min.

6.上清液用0.22um的微孔滤膜过滤.上清液中主要成分即低聚糖，也是诱抗剂，也称为激发子，贮存于冰箱备用。

低聚糖，也是诱抗剂，也称激发子批量生产的最佳液体培养基组分为：

酵母粉  0.35％    蛋白胨  0.15％

黄豆粉  4.0％     蔗糖    2.5％

土豆汁  20％      K₂HPO₄  0.5％

MgSO₄   0.05％

先培养菌种，从菌落边缘打取直径为5mm左右的菌饼转入液体培养基中振荡培养3天；接种量7块/200ml，转速为110rpm，随后取500mL液体培养液转入15升发酵罐中(培养基成分见上)，30℃，培养3天，通气量为8L/min，pH6.8，搅拌速度为280rpm，发酵过程中每隔24h经两次流加，液体接种量分别为200mL和100mL，培养结束后对菌丝体进行抽滤，按照以上低聚糖由以下方法取得的物质取得方法：中的3-6步骤获取激发子。

使用实施例

实例1：生物诱抗保鲜剂剂对葡萄的保鲜效果：

采前一周用100μg/ml生物诱抗保鲜剂对葡萄果实进行喷雾处理，采收后及时预冷，按照目前生产中葡萄贮藏保鲜的常规保鲜工艺，葡萄保鲜期可延长20天，腐烂率降低10％。

实例2：生物诱抗剂对蒜薹的保鲜效果：

采前一周用150μg/ml生物诱抗保鲜剂对蒜薹进行喷雾处理，贮藏保鲜过程中定期与专用保鲜剂配伍喷雾处理，贮藏8个月后，腐烂率比未经该生物诱导抗病保鲜剂处理的蒜薹降低15％，保鲜期可延长一个月。

实例3：生物诱抗剂对西红柿的保鲜效果：

采前用150μg/ml生物诱抗保鲜剂对西红柿果实进行喷雾处理，或者贮藏前用100μg/ml浸蘸处理，贮藏30天时灰霉病发病率比未经该生物诱导抗病保鲜剂处理降低20％，保鲜期可延长10天。

Claims (1)

1、一种果蔬生物诱抗保鲜剂，其特征在于，其主要组分为：果蔬致病真菌菌丝体提取的低聚糖10％、表面活性剂2％，其余为水，其中表面活性剂为吐温80；

低聚糖是由以下方法取得的物质：

1).将灰霉菌Botrytis cinerea和链格孢Alternaria spp.分别接种于PDA培养基上27℃培养一周；

2).从菌落边缘打取直径为5mm左右的菌饼转入液体培养基中振荡培养五天；接种量7块/200ml，转速为110r/min；

液体培养基：硝酸钾      2.00g      磷酸氢二钾    1.00g

            氯化钾      0.05g      七水合硫酸镁  0.50g

            硫酸亚铁    0.01g      蔗糖          30.00g

            蒸馏水      1000ml     土豆汁        400g

3).用玻璃抽滤器抽滤获取菌丝体，用4L去离子水清洗数次，同时用其pH7.2的4L100mmol/L磷酸钠，清洗，用pH7.2的0.5mol/L磷酸钾用清洗数次，再用蒸馏水清洗，随后用2L体积比为1∶1的氯仿，甲醇混合液清洗，最后再用丙酮清洗；

4).菌丝体经超声波捣碎机多次捣碎获取的菌丝体细胞壁；

5).细胞壁提取物按1∶100 w/v与无离子水混合，在高压灭菌锅中保持3小时，冷却后在11200×g条件下离心20min；

6).上清液用0.22um的微孔滤膜过滤，浓缩，浓缩液即为果蔬生物诱抗保鲜剂主要低聚糖成分。