CN103237815A - 壳聚糖粉末 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以微粉化粉末形式的壳聚糖，涉及其用于控制某些酵母比如酒香酵母(Brettanmyces)的用途，且涉及用于处理液体食品的方法。本发明尤其涉及以微粉化粉末形式的不溶于水的壳聚糖，其中颗粒大小被包括在5-50微米之间，且涉及其在液体食品的处理中和/或用于控制酒香酵母的用途。

Description

壳聚糖粉末
本发明涉及以细的且可控的粉末形式的壳聚糖、其用于控制某些酵母如酒香酵母(Brettanomyces)的用途，且涉及用于处理液体食品的方法。
技术状态
酒香酵母作为污染许多发酵产品的剂被描述，发酵产品包括葡萄酒、苹果酒、啤酒、红茶菌(kombucha)、酸乳酒、龙舌兰酒等。
在葡萄酒生产部门中，检测葡萄园中的污染物酵母变得棘手，这是由于酵母在这个阶段是少数的事实。然而，发酵(用于将糖转化成醇的过程)将导致对这些微生物的现实“选择”。实际上，酒香酵母是特别耐乙醇且特别耐SO2的，且尽管培养基的糖被耗尽，也能够存在于培养基中。而且，用于制造葡萄酒的某些技术或某些程序可以促进酒香酵母在葡萄酒中的发展，比如在酒糟(lees)上成熟。为了酒香酵母可以发展，小于500mg的糖对它们来说是充足的。
很多作者已经证明了酒香酵母污染酵母对不同国家的葡萄酒、对德国起泡葡萄酒、Arbois“vins jaunes”(黄酒)或来自法国南部的葡萄酒都有影响。在1965年，Domercq报告了在葡萄酒源标签“Saint Emilion”和“Premièresde Bordeaux”的葡萄汁(must)中且在被保持在葡萄酒源标签“Medoc”、“Graves”及“Saint Emilion”下的红葡萄酒或白葡萄酒中分离出酒香酵母。至于葡萄树的类型，加州葡萄似乎是最受影响的。例如，在Burgundy中，对于2000年份的，来自这种类型的葡萄树的发酵葡萄酒中的50％及装瓶后它们的25％受到影响。
最后，甚至用制酒业实践的深思熟虑，这种改变的控制仍然是困难的。控制方式本质上是预防的，它们提供了作用于酒香酵母群体的可能性(SO2、DMDC、高温瞬间灭菌、过滤)。然而，这些处理改变了葡萄酒的感官性质且不能保护处理的葡萄酒免受后来的污染。
这个问题不仅与葡萄酒有关，而且扩展到植物源的液体食品，尤其是通过发酵制备的植物源的液体食品。
壳聚糖作为技术辅助是已知的，但其在溶液中的使用需要高的浓度，通过约为30-100g/hL。另一方面，壳聚糖的抗细菌性质和抗真菌性质已经被广泛研究且证明，且现今被充分公认。壳聚糖由于其在相对短的时间之内的抗微生物效果而被熟知，当其被用于具有有机酸的溶液中时，通常在酸性pH下，以约0.5-1.5％的浓度(即0.5g/100mL，5g/L，500g/hL到1,000g/hL的浓度)。这些浓度是高的，因为在大多数化妆品、食品或医疗应用中，需要广泛抑制谱(细菌、酵母)。
同样地，还描述了壳聚糖对除了包含壳聚糖作为其细胞壁的主要成分的那些真菌以外的各种真菌的抗真菌活性。研究溶液中的壳聚糖，用于控制致植物病的菌株(镰胞菌(Fusarium)、根霉(Rhizopus)、Phylium、假丝酵母(Candida)、曲霉菌(Aspergillus))。还研究溶液中的壳聚糖对发酵期间的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和乳酸菌(小球菌(Pediococcus)和乳杆菌(Lactobacillus))的生长的影响。作者证明，相比于乳酸菌(小球菌和乳杆菌)，壳聚糖以更显著方式抑制酿酒酵母的生长。
以具有小于5μm的大小的微粒的形式的壳聚糖的杀真菌作用被AllanC.等(Allan C.等，(1979)The fungicidal effect of chitosan on fungi of varyingcell wall composition Experimental Mycology，3：285-287)描述在针对在壳聚糖的存在下和在没有壳聚糖的存在下测量微生物的生长的抑制的实验室试验中。使用的浓度是高的(0.1-6g/L)。没有提供关于对酒香酵母的作用的数据。而且，作者观察到对壳聚糖的响应可变性和敏感性强烈依赖于属和物种。
Gomes-Rivas等(Gomes-Rivas L.等，(2004)Selective antimicrobial actionof chitosan against spoilage yeasts in mixed culture fermentations，J.IntMicrobial Biotechnol31：16-22)描述了壳聚糖用于特定地控制酒香酵母属/德克酵母属(Dekkera)的作用。然而，作者描述了以具有小于420μm的大小、DA9％(DA＝乙酰化度)的微粒的细粉末的形式的壳聚糖对布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)的生长的影响，及对酿酒酵母的生长的影响。试验是在培养基上进行的。因此，未测量对葡萄酒基质的影响，这使关于这样的壳聚糖作为技术辅助的用途的任何结论随机化。作者指出，在用壳聚糖处理的最初80小时期间，布鲁塞尔酒香酵母的生长被抑制，且超出这个潜伏期，该生长重新开始。它们表明，用600g/hL的壳聚糖来控制布鲁塞尔酒香酵母的生长是可能的。因此，对于合适的工业用途，这个浓度仍然非常高。
专利申请US2004/0176477描述了作为糠秕马拉色氏霉菌(Malasseziafurfur)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)的抗微生物剂使用的水溶性的微粉化壳聚糖。
专利申请FR2599048教导了，根据实例，用浓度为约80g每百升液体食品的壳聚糖来稳定这种液体食品是可能的，尤其是从其颜色的角度。该壳聚糖浓度仍然是高的。
专利US6,482,456描述了壳聚糖的水溶液，即水溶性的壳聚糖。
专利申请FR1164984教导了当为了澄清榨汁必须降低壳聚糖的量时，使用壳聚糖与膨润土的混合物。
如已经提及的，以其阳离子的形式，壳聚糖提供对某些菌株的抗微生物活性。可以容易地被取代的官能团的存在允许修改壳聚糖性质，且因此修改其活性。例如，溶液中的壳聚糖谷氨酸盐或乳酸盐(chitosan glutamateor lactate)已经被用于限制抗微生物作用或抗真菌作用。
然而，至今所提议的壳聚糖并没有被用作技术辅助，以满足这个行业的专业人员的期望，用于预防“酒香酵母风险”。
发明目的
这就是Kitozyme SA建立研究与开发项目以寻找解决上下文所描述的技术问题的技术辅助的原因。
本发明的主要目的是解决在于提供用于控制酒香酵母属的酵母的技术辅助的新的技术问题。
本发明的目的还是解决在于提供用于控制液体食品且尤其是通过发酵制备的液体食品中的不期望的酵母，且尤其是酒香酵母属的酵母的技术辅助的新的技术问题。
本发明的目的还是提供从食品安全的角度是可靠的且不降低处理的液体食品的品质的可用的技术辅助。
本发明的目的是解决工业规模上的，尤其任选地具有醇或发酵的液体食品的行业中的这些技术问题。
发明描述
因此，本发明涉及以粉末形式的壳聚糖，其颗粒大小(粒径)被包括在0.1-200μm之间。
有利地，壳聚糖包括被包括在5-100微米之间，且优选在5-60微米之间，且还优选被包括在5-50微米之间的颗粒大小。
根据备选方案，壳聚糖包括小于70微米，且优选小于50微米的颗粒大小。
出乎意料地，用具有小于100微米的颗粒大小的粉末，获得对不期望的酵母群体的非常显著且非常快速的作用是可能的。当颗粒大小小于50微米时，这种作用尤其显著。
颗粒大小是通过激光衍射法得到的颗粒大小。
本发明的壳聚糖优选地具有以下颗粒大小，该颗粒大小具有被包括在5-30μm之间，优选在10-30μm之间，且更优选在10-25μm之间的D(0.5)(总分布的平均直径，且颗粒量的50％具有小于这个值的直径且50％具有更大的直径)。因此，D(0.5)表示考虑到颗粒大小的分布曲线下面积的分布的中间值。
根据备选方案，壳聚糖可以在筛选后使用。
优选地，壳聚糖包括被包括在0-30mol％之间的乙酰化度(DA)。乙酰化度是N-乙酰基-葡萄糖胺单元的数目与总单体数目的比率。壳聚糖的乙酰化度是通过电位滴定来确定的，电位滴定由通过氨基(amine group)的滴定来确定壳聚糖的乙酰化度组成。这是基于Rinaudo等(1999)的工作。简而言之，壳聚糖被放入到在过量的稀盐酸中的溶液中。氨基(在未乙酰化的葡萄糖胺单元(G)上)带正电荷的(过量的HCl)。然后，该溶液通过自动滴定仪(KEM，自动电位滴定仪，AT-500N)，用稀NaOH溶液来滴定，且测量pH。在反应的开始部分，确定过量的HCl。接着，确定带电的氨基的量：
滴定曲线显示出两个拐点。两个NaOH体积之间的差提供了知道游离胺的量的可能性。
依据CAS No.9012-76-4，提及壳聚糖。本发明的壳聚糖是从真菌源制备的多糖。从安全且大量的生物技术的或食品真菌源提取且纯化壳聚糖，真菌源比如双孢蘑菇(Agaricus bisporus)或黑曲酶(Aspergillus niger)。通过富含几丁质的提取物的水解得到壳聚糖。几丁质是由通过β类型(1，4)的键结合到一起的几个N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元组成的多糖。壳聚糖由葡萄糖胺糖单元(脱乙酰化单元)和通过β类型(1，4)的键结合到一起的N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元(乙酰化单元)组成，且形成聚(N-乙酰基-D-葡萄糖胺)-聚(D-葡萄糖)类型的聚合物。在本发明中，葡聚糖(D-葡萄糖单元)的百分数优选地小于聚合物的15％(质量/质量)。
本发明的壳聚糖作为技术辅助是有用的。关于技术辅助，是指除任意设备或仪器以外的物质或材料，其本身不作为食品成分被消耗，意图用于原料、食品或它们的成分的转化，用于满足处理或转化过程的某些技术目的，且可以具有在成品中具有非有意但不可避免的残余物或食品的存在的结果(来自CODEX Alimentarius的定义)。
本发明的壳聚糖有利地为真菌源且优选地源自子囊菌(Ascomycete)类型的真菌的菌丝体，且尤其是源自黑曲霉和/或源自真菌担子菌(Basidiomycete)，且尤其是香菇(Lentinula edodes)(香菇(shiitake))和/或双孢蘑菇。优选地，真菌是黑曲霉。壳聚糖可以是GMO源的，但优选为非GMO源的。可以使用任意类型的壳聚糖。用于制备壳聚糖的方法是被描述在专利WO03068824(EP1483299；US7,556，946)中的方法。
许多研究证明，壳聚糖的抗微生物活性根据壳聚糖的乙酰化度(DA)且根据壳聚糖的分子量(分子量：MW)而变化。因此，本发明覆盖不同的DA和MW范围。
两个参数(DA和MW)独立地影响壳聚糖的抗微生物活性，然而，似乎是MW对抗微生物活性的影响要比DA的影响更重要(Sekiguchi，S.等，(1994)Molecular weight dependency of antimicrobial activity by chitosanoligomers，在：Nishinari，K.&Doi，E.(编辑)，″Food Hydrocolloids：Structures，Properties and Functions″，Plenum Press，New York)。
为了引用近来的实例，对细菌进行研究，主要包括以下那些研究：Omura，Y.等(Omura，Y.等，(2003)Antimicrobial activities of chitosan withdifferent degrees of acetylation and molecular weights Biocontrol.Sci.，8(1)：25-30)；Tsai，G.J.；Zhang，S.L.，Shieh，P.L.(Tsai，G.J.等(2004)Antimicrobial Activity of a Low-Molecular-Weight Chitosan Obtained fromCellulase Digestion of Chitosan J.Food Prot.，67(2)：396-398)；Zivanovic S.等(Zivanovic S.等，(2004)Molecular Weight of Chitosan InfluencesAntimicrobial Activity in Oil-in-Water Emulsions J.Food Prot.，67(5)：952-959。
对于真菌，Eaton，P.等(Eaton，P.等，(2008)Atomic force microscopystudy of the antibacterial effects of chitosans on Escherichia coli andStaphylococcus aureus Ultramicroscopy，108(10)：1128-1134.)已经发现，壳聚糖的分子量(MW)越低，壳聚糖对微生物的生长和增殖的抑制作用就越好。
以相同的方式，很多研究已经证明，壳聚糖的DA与其抗微生物活性之间的逆关系(Hongpattarakere，T.等(2008)Effect of deacetylation conditionson antimicrobial activity of chitosans prepared from carapace of black tigershrimp(Penaeus monodon)Songklanakarin J.Sci.Technol..30(1)：第1页-第9页；Tsai，G.J.，and al.(2002)Antimicrobial activity of shrimp chitin andchitosan from different treatments Fisheries Sci.，68(1)：170-177)。
本发明还涉及包含如前面所定义的壳聚糖的组合物。
尤其，本发明涉及本发明的壳聚糖悬浮液。更具体地，例如从这种悬浮液的定性组成的角度，从这种悬浮液的纯度的角度和/或从壳聚糖源的角度，这种悬浮液适合用作技术辅助。
壳聚糖作为粉末被掺入待处理的液体食品中。考虑到通过消除酒香酵母稳定微生物，壳聚糖尤其被使用。
因此，本发明的壳聚糖是不溶于水的。关于“不溶于水”是指至少90％且优选地95％(质量/质量)的壳聚糖不溶于蒸馏水中。在实例中，由于壳聚糖被认为是完全不溶的，水中的可溶材料的百分数可以被比作杂质。
本发明的壳聚糖是不溶性的，水合后，具有通常大于20％(质量/质量)的晶体部分。
在其用作技术辅助之前，壳聚糖被悬浮且混合在液体(比如诸如水)中，所述液体与待处理的液体食品是相容的，即其不损害液体食品的最终使用。壳聚糖/液体的质量比率(例如：壳聚糖/水)优选地被包括在1/1-1/10之间，且优选是1/5(质量/质量；m/m)。壳聚糖不溶于水，因此必须预先充分地搅拌混合物。优选地，在临将其添加到待处理的液体之前，搅拌混合物。
本发明的壳聚糖或壳聚糖悬浮液被添加到待处理的液体食品中。在待处理的液体的整个体积上且例如在通过以小的体积倒出产品的泵送期间，壳聚糖还应是均匀的，以确保良好地分布在酒主体中。因此，壳聚糖应被逐渐添加。优选的是，在添加壳聚糖的同时，使待处理的液体均化。对于处理葡萄酒，通常需要大桶(vat)的完全泵过。在处理结束，通过抽取除去壳聚糖(技术辅助)，以除去壳聚糖和被吸附的微生物。例如，在7天到10天的作用时间后且在待处理的液体的自然倾析后，且通常在发酵的液体食品比如葡萄酒的处理中，进行这个除去步骤。
本发明还涉及壳聚糖或如前面所定义的组合物作为抗真菌剂和主要用于控制酵母，尤其是酒香酵母属酵母和/或德克酵母属酵母，且甚至更尤其是异酒香酵母、布鲁塞尔酒香酵母、克劳森酒香酵母、班图酒香酵母、郎比可酒香酵母、B.naardenensis和/或B.nanus的用途。本发明的壳聚糖的作用不限于特定的菌株，因为相同类型的几种菌株被测试。如前面所示的，现有技术中的壳聚糖的已知浓度是高的，因为在大多数化妆品、食品或医疗应用中，需要宽抑制谱(细菌、酵母)。现在，本发明不寻找这种作用，相反，例如在发酵如在例如葡萄酒酿酒期间，必须避免有用的细菌和酵母的抑制。因此，本发明是出乎意外的，因为以非常低的剂量(＜10g/hL)，本发明的壳聚糖选择性地作用于不期望的酵母。
另一方面，本发明涉及壳聚糖或如前面所定义的组合物作为抗真菌剂和特别用于控制液体食品，且尤其是植物源的即从植物(葡萄、苹果、马铃薯、甜菜根等)制备的液体食品，且尤其是通过发酵制备的液体食品例如葡萄酒、啤酒、苹果酒、起泡葡萄酒或果汁中的不期望的酵母的用途。本发明涉及液体食品的处理，液体食品比如水、发酵的饮料(通过在溶液中的食品转化成醇、通过基本产品的发酵而得到的饮料)、利口酒(其中添加了醇的葡萄汁)、烈酒(通过发酵饮料的蒸馏得到的)，主要的利口酒为：彼诺甜酒(Pineau des Charentes)(基于法国白兰地(Cognac))、阿马尼亚克烧酒(Floc de Gascogne)(基于阿马尼亚克酒)、香槟酒和勃艮第葡萄酒的果仁酒(Ratafia of Champagne and Burgundy，Riquiqui)、来自Jura的Macvin、来自Beziers的Cataroise、来自Normandie的Pommeau(基于苹果白兰地酒)。液体食品可以从植物的不同部位得到：叶、根、谷物、果实等。因此，本发明涉及所有的液体食品，包括可能受到酒香酵母类型的不期望的酵母污染的所有液体；来自发酵的液体(食品或非食品)，比如发酵前或发酵期间的葡萄汁，或发酵液体(例如来自植物(马铃薯、甜菜根......或葡萄)的葡萄汁/生物质)；植物源的非发酵液体食品(果汁)，及来自葡萄汁的发酵的液体食品。
因此，本发明的处理可以应用到皮斯科白兰地(Pisco)、彼诺甜酒、烈酒、苹果酒、啤酒、用于工业目的的酒精、及葡萄酒。
意外发现，本发明的壳聚糖可以用作针对液体食品，且特别是植物源的，任选发酵的液体食品中的不期望的酵母的抗真菌剂，液体食品从其组成的角度，通常是复杂的。壳聚糖除去另外得到的或还在发酵的液体植物食品之内的酵母，尤其是上面所引用的属或物种的那些酵母的能力是不可预测的。
根据另一方面，本发明涉及用于液体食品，且特别为植物源的液体食品，且尤其是通过发酵制备的植物源的液体食品的医疗和/或预防处理的方法，其中将除去不期望的酵母，应防止不期望的酵母的存在，和/或应限制不期望的酵母的群体，且尤其是酒香酵母属和/或德克酵母属的酵母，甚至还特别是异酒香酵母、布鲁塞尔酒香酵母、克劳森酒香酵母、班图酒香酵母、郎比可酒香酵母、B.naardenensis和/或B.nanus，所述方法包括在壳聚糖或如前面所定义的组合物的存在下，放置液体食品。
本发明还涉及生产房屋(生产工厂、葡萄酒和烈酒库房等)中的卫生学和预防方法，使用该方法可以特别避免停止生产用于清洁。预防用途通常与医疗处理一样重要(工厂的葡萄酒和烈酒库房的预防卫生学)。
根据本发明的待处理的液体食品尤其是葡萄酒、啤酒或苹果酒。
不期望的酵母特别是异酒香酵母和/或布鲁塞尔酒香酵母。本发明尤其涉及用于处理液体食品，任选地发酵的液体食品，以对抗酒香酵母属的酵母且尤其是布鲁塞尔酒香酵母物种的存在的方法。
根据优选的备选方案，壳聚糖以1-10g/hL待处理的液体食品，且优选地被包括在2-5g/hL待处理的液体食品之间的浓度存在。因此，与现有技术的其它产品相比，使用的浓度是特别低的，对于使用二碳酸二甲酯(DMDC)的处理，现有技术的其它产品通常需要多于20g/hL左右。
液体食品在壳聚糖的存在下放置足够的时间段，用于除去、限制或防止酵母的存在，尤其是前述酵母的存在。该时间段通常为至少3天，且优选至少5天，且还优选至少7天。
关于“除去”酵母的存在，是指将不期望的酵母的群体减少到检测阈值(10CFU/mL)以下的事实。关于“限制”，是指将群体限制为不期望的酵母群体的至少10倍或甚至100倍。关于“预防”，是指预防不期望的酵母群体的发展、增殖，和/或限制不期望的酵母群体。
处理可以是在发酵期间的液体食品上进行的。实际上，意外发现本发明的壳聚糖允许发酵的持续，且尤其是酒精发酵和/或苹果酸-乳酸发酵。发酵没有由于本发明的壳聚糖的存在而被扰乱。尤其，本发明的壳聚糖对酿酒酵母的群体没有有害作用。
壳聚糖和/或包含壳聚糖的组合物优选地被分离，例如通过液体食品的抽取、澄清、过滤和/或离心，以保存液体食品。在与本发明的壳聚糖充分接触一段时间后，可以抽取液体食品。
在阅读了解释性的说明书后，对于本领域的技术人员来说，本发明的其它目的、特征和益处将变得明显，所述说明书参考仅作为阐述给出且不以任何方式限制本发明的范围的实施例。
实施例是本发明的主要部分，且从被视为整体的、包括实施例的说明书中，相对于任意现有技术状态似乎是新的的任意特征在其功能且在其一般性上是本发明的主要部分。
因此，每一个实施例具有一般的范围。
另一方面，在实施例中，所有的百分数是按重量计给出的，除非另有说明；且温度是以摄氏度给出的，除非另有说明；且压力是大气压力，除非另有说明。
实施例
A-酵母菌株
用于葡萄酒的人工接种的布鲁塞尔酒香酵母的菌株为：被鉴定为在地中海葡萄园中占大多数且具有100％A和100％B基因型的菌株。它们源自ICV-DNAid菌株的收集(collection)。在28℃下温育7天后，它们被保持在4℃下的倾斜的琼脂糖培养基(YAC培养基)上。
B-用于曲(leaven)的培养的培养基和条件
曲是驯化培养基(acclimatization medium)，在该培养基中酵母可以生长且达到约107CFU/mL的群体，同时适应不是非常有利的环境(酸pH、高的乙醇含量)。
用于实验的曲的组成被描述在下面的表1中：
表1-用于布鲁塞尔酒香酵母的曲培养基的组成
化合物 浓度/条件
酵母氮源(Yeast Nitrogen Base) 6.7g/L
葡萄糖 20g/L
乙醇 10％(v/v)
软化水 达到期望体积
pH 用酒石酸晶体调节到3.5
灭菌 121℃下20分钟
C-分析计数技术
活酒香酵母的计数是根据以下的程序通过在特定的琼脂糖培养基YAC(YEPD+放线菌酮+氯霉素)上培养来完成的：在无菌环境下取出样品且将样品在含9ml或9.9mL的无菌生理水的管中级联稀释。通过涂抹在YAC琼脂糖培养基上，培养来自合适的稀释物的100μl，以在琼脂糖上具有30-300之间的菌落。将培养皿在28℃下温育10天。培养物加倍。
D-壳聚糖的微粉化
在通过苏打的作用从黑曲霉的菌丝体开始时，通过提取和脱乙酰作用(N-乙酰基-葡萄糖胺基团的水解)得到壳聚糖。在几个洗涤和净化步骤后，然后干燥且研磨壳聚糖，以得到期望的颗粒大小。还可能的是，使用商购的不溶于水的壳聚糖，然后使其微粉化。根据本发明，得到的微粉化壳聚糖应该是不溶于水的。
源自真菌源(黑曲霉)的壳聚糖的微粉化是通过具有相对的空气喷嘴的研磨机来实现的。根据待处理的粉末的量，可以使用不同品牌和型号的设备：例如，对于＞200kg的量可以使用Hozokawa-Alpine品牌(型号200AFG)的设备，且例如，对于较小的量可以使用Netzsch-Model CGS10的设备。
连续研磨粉末，直到微粉化的粉末通过选择涡轮，用于得到其中颗粒具有小于100μm，或甚至50μm的直径的粉末。然后，用来自MalvernInstruments Ltd.的激光衍射仪Laser Mastersizer2000来进行粉末的颗粒大小分析。
D(0.50)被包括在10-30μm之间且优选地在10-25μm之间，或甚至在10-20μm之间。
E-用于实施例1-26的壳聚糖的批次的特征
表1
Figure BDA00002777131000121
*通过从干燥样品的重量减去灰分、蛋白质和葡聚糖来计算的。
ND：未检出。
某一百分数的残余葡聚糖存在于壳聚糖中。
实施例1.1-用不同剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加不同剂量的壳聚糖，处理具有2.8105个细胞/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的年份2006的成品Medoc酒(Merlot)。
表2-处理7天后，布鲁塞尔酒香酵母的定量PCR计数
处理剂量 对照 0.2g/hL 0.5g/hL 0.7g/hL lg/hL 2g/hL 5g/hL
酒香酵母计数 2.8105 3563 1527 509 254 0 0
处理7天后，以2g/hL剂量的壳聚糖能够完全除去存在于葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母。
实施例1.2-用不同剂量的壳聚糖来处理被间型酒香酵母(Brettanomyces intermedius)污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加不同剂量的壳聚糖(DA≈4.2mol％)，处理具有3.7106个细胞/mL的间型酒香酵母的起始繁殖水平的年份2009的成品葡萄酒。对照葡萄酒没有经历任何处理。
表3-处理10天后，间型酒香酵母的定量PCR计数和在特定的琼脂糖培养基上的计数
Figure BDA00002777131000131
处理10天后，在4g/hL剂量下，壳聚糖能够显著减少存在于葡萄酒中的间型酒香酵母。
实施例2-用4g/hL剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母菌株A污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖或通过添加20g/hL剂量的DMDC，处理具有106个细胞/mL的布鲁塞尔酒香酵母菌株A的起始群体水平的年份2008的来自Languedoc Roussillon(Merlot)的成品葡萄酒。对照葡萄酒没有经历任何处理。
图1-处理后，追踪葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母菌株A群体
说明-
模式1：对照；
模式2：用20g/hL DMDC处理；
模式3：用4g/hL壳聚糖处理；
看到，对于布鲁塞尔酒香酵母菌株A，用壳聚糖处理(模式3)与用DMDC处理(模式2)一样有效。实际上，在用两种类型处理的5-10天内，看到布鲁塞尔酒香酵母菌株A群体的充分减少(≤10CFU/mL)。
实施例3-用4g/hL剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母菌株B污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖或通过添加20g/hL剂量的DMDC，处理具有105个细胞/mL的布鲁塞尔酒香酵母菌株B的起始群体的年份2008的来自Languedoc Roussillon(Merlot)的成品葡萄酒。对照葡萄酒没有经历任何处理。
图2-处理后，追踪葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母菌株B的群体
说明-
模式1：对照；
模式2：用20g/hL DMDC处理；
模式3：用4g/hL壳聚糖处理；
看到，对于布鲁塞尔酒香酵母菌株B，用壳聚糖处理(模式3)与用DMDC处理(模式2)一样有效。实际上，在用两种类型处理的5-10天内，看到布鲁塞尔酒香酵母菌株B群体的显著减少(≤10CFU/mL)。
实施例4-用4g/hL剂量的不同颗粒大小的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加4g/hL剂量的不同颗粒大小：＜25μm、＜50μm、＜90μm的壳聚糖，处理具有105个细胞/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的年份2008的来自Languedoc Roussillon(Merlot)的成品葡萄酒。对照葡萄酒没有经历任何处理。
图3-处理后，追踪葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母的群体
说明-
模式1：对照；
模式2：用4g/hL壳聚糖处理-颗粒大小＜25μm；
模式3：用4g/hL壳聚糖处理-颗粒大小＜50μm；
模式4：用4g/hL壳聚糖处理-颗粒大小＜90μm。
处理7天后，具有＜25μm的颗粒大小的壳聚糖的使用(模式2)和具有＜50μm的颗粒大小的壳聚糖的使用(模式3)使布鲁塞尔酒香酵母的群体减少了5,000-10,000倍，达到检测阈值(≤10CFU/mL)。
具有＜90μm的颗粒大小的壳聚糖(模式4)使布鲁塞尔酒香酵母的群体在10天内减少到检测阈值(≤10CFU/mL)，即比其它模式多3天。
实施例5-用2g/hL剂量的具有不同乙酰化度的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加2g/hL剂量的具有不同乙酰化度：8.5mol％、22.0mol％的壳聚糖，处理具有5.105个细胞/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的年份2008的来自Languedoc Roussillon(Cabernet Sauvignon)的成品葡萄酒。对照葡萄酒没有经历任何处理。
图4-处理后，追踪葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母的群体
说明-
模式1：对照；
模式2：用2g/hL壳聚糖处理-DA22mol％；
模式3：用2g/hL壳聚糖处理-DA8.5mol％；
处理11天后，具有22mol％的DA的壳聚糖的使用(模式2)和具有8.5mol％的DA的壳聚糖的使用(模式3)使布鲁塞尔酒香酵母的群体减少了100倍。
实施例6.1-用4g/hL剂量的不同颗粒大小的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加4g/hL剂量的不同颗粒大小：＜25μm、＜90μm的壳聚糖(DA≈8.5mol％)来处理具有105个细胞/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的年份2008的来自Languedoc Roussillon(Merlot)的成品葡萄酒。对照葡萄酒没有经历任何处理。
图5A-处理后，追踪葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母的群体
说明-
模式1：对照；
模式2：用4g/hL壳聚糖处理-颗粒大小＜25μm；
模式3：用4g/hL壳聚糖处理-颗粒大小＜90μm；
处理9天后，具有颗粒大小＜25μm(模式2)；＜90μm(模式3)的壳聚糖批次的使用使得布鲁塞尔酒香酵母群体能够下降到检测阈值(≤10CFU/mL)，而未处理的对照(模式1)的群体在相同的时间段期间维持在其起始水平(105CFU/mL)。
实施例6.2-用4g/hL剂量的不同颗粒大小的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加4g/hL剂量的不同颗粒大小：＜25μm、＜90μm的壳聚糖(DA≈22mol％)来处理具有105个细胞/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的年份2008的来自Languedoc Roussillon(Merlot)的成品葡萄酒。对照葡萄酒没有经历任何处理。
图5B-处理后，追踪葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母的群体
说明-
模式1：对照；
模式2：用4g/hL壳聚糖处理-颗粒大小＜25μm；
模式3：用4g/hL壳聚糖处理-颗粒大小＜90μm；
处理9天后，具有＜25μm的颗粒大小的壳聚糖批次的使用(模式2)使得布鲁塞尔酒香酵母群体能够下降到检测阈值(≤10CFU/mL)，而未处理的对照(模式1)的群体在相同的时间段期间维持在其起始水平(105CFU/mL)。
具有＜90μm的颗粒大小的壳聚糖(模式3)使布鲁塞尔酒香酵母的群体能够在21天中减少到检测阈值(≤10CFU/mL)，即比模式2多12天。
实施例7-用4g/hL剂量的壳聚糖对其中布鲁塞尔酒香酵母的植入时间是可变的红葡萄酒处理的效率(实验室试验)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖，处理其中3天前或24天前植入了将布鲁塞尔酒香酵母的具有年份2008的来自Languedoc Roussillon(Merlot)的成品葡萄酒。
图6-处理后，追踪葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母的群体
说明-
模式1：用4g/hL壳聚糖处理3天前植入的布鲁塞尔酒香酵母群体
模式2：用4g/hL壳聚糖处理24天前植入的布鲁塞尔酒香酵母群体
用这个实施例，可以证明壳聚糖对布鲁塞尔酒香酵母的影响依赖于它们在葡萄酒中的植入持续时间。因此，24天前植入葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母的群体(模式2)对壳聚糖更加敏感。7天后，布鲁塞尔酒香酵母的群体减少且达到检测阈值(≤10CFU/mL)，但在新鲜植入的布鲁塞尔酒香酵母的群体(模式1)中，达到相同的结果需要10天。
实施例8-4g/hL剂量的壳聚糖的使用对酿酒酵母(葡萄酒的酒精发酵过程中的重要的酵母)的影响(实验室试验)
用糖补充Casino品牌的白葡萄汁，以达到200g/L的含量，且用氮气补充该白葡萄汁，以达到200mg/L的上限含量，且然后用30g/hL剂量的酿酒酵母ICV
Figure BDA00002777131000171
接种。
在酒精发酵的过程中，在2个不同的瞬间，添加壳聚糖：
-1035的密度：发酵3天后
-1015的密度：发酵6天后
对照葡萄汁没有经历任何处理。
图7-酿酒酵母的群体中的时间依赖性变化且追踪用壳聚糖处理前和用壳聚糖处理后在葡萄汁中的密度
说明-
模式1：对照葡萄汁
模式2：用4g/hL壳聚糖处理-发酵3天后(密度1035)；
模式3：用4g/hL壳聚糖处理-发酵6天后(密度1031)；
酿酒酵母的群体的生长动力学在发酵3天后达到约6.107CFU/mL的最大值，且然后，酵母的数量保持在5.107CFU/mL下，持续10天，以在发酵13天后，最终开始其减少阶段。对于所有的模式，这些动力学是相似的。因此，我们可以推断，壳聚糖对酿酒酵母没有任何负面影响。
实施例9-4g/hL剂量的壳聚糖的使用对酒类酒球菌(Oenococcusoeni)(葡萄酒的苹果酸-乳酸发酵中的重要的细菌)的影响(实验室试验)
在酒精发酵结束，用酒类酒球菌
Figure BDA00002777131000181
或不用酒类酒球菌
Figure BDA00002777131000182
来接种年份2008的来自Languedoc Roussillon(Merlot)的红葡萄酒。
在自发模式的苹果酸-乳酸发酵的范围之内，或在通过接种的苹果酸-乳酸发酵的范围之内，添加壳聚糖。
对照葡萄酒没有经历用酒类酒球菌的任何接种或用壳聚糖的任何处理。
图8-酒类酒球菌的群体的时间依赖性变化且追踪用壳聚糖处理前和用壳聚糖处理后的葡萄酒中的苹果酸降解。
说明-
模式1：自发模式的苹果酸-乳酸发酵中的对照葡萄酒-不用壳聚糖处理
模式2：自发模式的苹果酸-乳酸发酵中的葡萄酒-用4g/hL壳聚糖处理
模式3：通过接种的苹果酸-乳酸发酵中的葡萄酒-在接种前8天，用4g/hL壳聚糖处理
在用乳酸菌接种前8天进行的壳聚糖处理对实现苹果酸-乳酸发酵(模式3)没有任何影响。
在自发的苹果酸-乳酸发酵(模式2)的情况下，壳聚糖处理具有使苹果酸-乳酸发酵的潜伏期延长3天的作用。
因此，壳聚糖对苹果酸-乳酸发酵的过程(无论是以自发模式还是使用接种)没有影响。然而，建议，在处理结束后，在用乳酸菌进行接种之前，等待8天。
实施例10-用4g/hL剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的在酒精发酵过程中的红葡萄酒(350hL大桶)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖，处理来自酒窖C的具有＜10CFU/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的在缓慢酒精发酵过程中的红葡萄酒(Merlot)。对照葡萄酒没有经历任何处理。
表4-葡萄酒的分析特征
Figure BDA00002777131000191
注意到，处理后，壳聚糖没有改变常规分析参数。
表5-计算布鲁塞尔酒香酵母的起始污染水平(T0)、在未处理的葡萄酒(T7)上的污染水平发展(evolution)及用壳聚糖处理的葡萄酒(TR7)上的污染水平发展。
Figure BDA00002777131000192
在这个实施例中，起始污染水平(t0)是低的(＜10CFU/mL)。然而，7天后，布鲁塞尔酒香酵母的群体在未处理的样品(T7)中发展。
另一方面，用壳聚糖处理能够使得处理的样品(TR7)的布鲁塞尔酒香酵母的群体减少。
这个实施例表明，对于除去酒精发酵期间的酒中的布鲁塞尔酒香酵母，壳聚糖是有效的。
实施例11-用4g/hL剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的在缓慢苹果酸-乳酸发酵过程中的红葡萄酒(200hL大桶)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖，处理来自SG酒窖的具有＜10CFU/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的在苹果酸-乳酸发酵过程中的红葡萄酒(Merlot)。对照葡萄酒(T7)没有经历任何处理。
表6-葡萄酒的分析特征
Figure BDA00002777131000201
注意到，处理后，壳聚糖没有改变常规分析参数。
表7-计算布鲁塞尔酒香酵母的起始污染水平(T0)、在未处理的葡萄酒(T7)中的污染水平发展及在用壳聚糖处理的葡萄酒(TR7)中的污染水平发展。
酒香酵母类型的酵母(CFU/mL)
葡萄酒的起始污染水平(T0) ＜10
7天后，对照葡萄酒的污染水平(T7) 10
7天后，用壳聚糖处理的葡萄酒的污染水平(TR7) ＜10
在这个实施例中，起始污染水平(T0)是低的(＜10CFU/mL)。然而，7天后，布鲁塞尔酒香酵母的群体在未处理的样品(T7)中发展。
另一方面，用壳聚糖处理提供了使布鲁塞尔酒香酵母的群体保持在检测阈值(≤10CFU/mL)以下的可能性。
这个实施例证明，对于除去在缓慢的苹果酸-乳酸发酵过程中的葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母，壳聚糖是有效的。
实施例12-用4g/hL剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母低度污染的在苹果酸-乳酸发酵结束的红葡萄酒(130hL大桶)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖，处理来自MT酒窖的具有≤10CFU/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的在苹果酸-乳酸发酵结束的红葡萄酒(Syrah Carignan Grenache blend)。对照葡萄酒(T7)没有经历任何处理。
表8-葡萄酒的分析特征
Figure BDA00002777131000211
注意到，处理后，壳聚糖没有改变常规分析参数。
表9-计算布鲁塞尔酒香酵母的起始污染水平(T0)、在未处理的葡萄酒(T7)上的污染水平发展及用壳聚糖处理的葡萄酒(TR7)上的污染水平发展。
酒香酵母类型的酵母(CFU/mL
葡萄酒的起始污染水平(T0) ＜10
7天后，对照葡萄酒的污染水平(T7) 80
7天后，用壳聚糖处理的葡萄酒的污染水平(TR7) 0.04
尽管起始污染水平是低的(≤10CFU/mL)，但7天后，污染水平在对照样品中发展。另一方面，布鲁塞尔酒香酵母的发展能够在用壳聚糖处理的葡萄酒中被充分停止。
这个实施例证明，对于除去在苹果酸-乳酸发酵结束的葡萄酒中的起始群体低的布鲁塞尔酒香酵母，壳聚糖是有效的。
实施例13-用4g/hL剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母中度污染的在苹果酸-乳酸发酵结束的红葡萄酒(45hL大桶)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖来处理来自MP酒窖的具有30CFU/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的在苹果酸-乳酸发酵结束的红葡萄酒(Syrah Mourvedre Blend)。对照葡萄酒(T7)没有经历任何处理。
表10-葡萄酒的分析特征
Figure BDA00002777131000212
注意到，处理后，壳聚糖没有改变常规分析参数。
表11-计算布鲁塞尔酒香酵母的起始污染水平(T0)、在未处理的葡萄酒(T7)中的污染水平发展及用壳聚糖处理的葡萄酒(TR7)中的污染水平发展。
酒香酵母类型的酵母(CFU/mL)
葡萄酒的起始污染水平(T0) 30
7天后，对照葡萄酒的污染水平(T7) ＞3000
7天后，用壳聚糖处理的葡萄酒的污染水平(TR7) ＜10
尽管起始污染水平(30CFU/mL)是中度的，但在未用壳聚糖处理的样品中，污染水平在7天后达到了非常高的水平(＞3,000CFU/mL)。另一方面，用壳聚糖处理的样品具有≤10CFU/mL的布鲁塞尔酒香酵母群体。
这个实施例表明，对于除去在苹果酸-乳酸发酵结束的葡萄酒中的起始群体中度的布鲁塞尔酒香酵母，壳聚糖是有效的。
实施例14-用4g/hL剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母深度污染的在苹果酸-乳酸发酵结束的红葡萄酒(500hL大桶)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖来处理R酒窖的具有3,400CFU/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的在苹果酸-乳酸发酵结束的红葡萄酒(Syrah)。对照葡萄酒(T7)没有经历任何处理。
表12-葡萄酒的分析特征
Figure BDA00002777131000221
注意到，处理后，壳聚糖没有改变常规分析参数。
表13-计算布鲁塞尔酒香酵母的起始污染水平(T0)、在未处理的葡萄酒(T7)上的污染水平发展及在用壳聚糖处理的葡萄酒(TR7)上的污染水平发展。
酒香酵母类型的酵母(CFU/mL)
葡萄酒的起始污染水平(T0) 3400
7天后，对照葡萄酒的污染水平(T7) ＞3000
7天后，用壳聚糖处理的葡萄酒的污染水平(TR7) 20
看到，用壳聚糖处理允许有效地除去存在于葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母。处理后7天，与保持高污染水平的对照样品相比，用壳聚糖处理的样品具有非常少的布鲁塞尔酒香酵母群体(＜20CFU/mL)。
这个实施例表明，对于除去在苹果酸-乳酸发酵结束的葡萄酒中的起始群体高的布鲁塞尔酒香酵母，壳聚糖是有效的。
实施例15-用4g/hL剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母深度污染的在苹果酸-乳酸发酵结束的红葡萄酒(80hL大桶)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖来处理来自G酒窖的具有1,800CFU/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的在苹果酸-乳酸发酵结束的红葡萄酒(Syrah，Grenache Blend)。对照葡萄酒(T7)没有经历任何处理。
表14-葡萄酒的分析特征
Figure BDA00002777131000231
注意到，处理后，壳聚糖没有改变常规分析参数。
表15-计算布鲁塞尔酒香酵母的起始污染水平(T0)、在未处理的葡萄酒(T7)中的污染水平发展及在用壳聚糖处理的葡萄酒(TR7)上的污染水平发展。
酒香酵母类型的酵母(CFU/mL)
葡萄酒的起始污染水平(T0) 1800
7天后，对照葡萄酒的污染水平(T7) ＞3000
7天后，用壳聚糖处理的葡萄酒的污染水平(TR7)R7) ＜10
用壳聚糖处理提供了显著降低布鲁塞尔酒香酵母的群体的可能性。与布鲁塞尔酒香酵母持续生长＞3,000CFU/mL的未处理样品相比，用壳聚糖处理的样品(TR7)具有≤10CFU/mL的布鲁塞尔酒香酵母群体。
这个实施例表明，对于除去在苹果酸-乳酸发酵结束的葡萄酒中的起始群体高的布鲁塞尔酒香酵母，壳聚糖是有效的。
实施例16-用4g/hL剂量的壳聚糖来处理被异酒香酵母污染的苹果酒(实验室试验)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖或通过添加20g/hL剂量的DMDC，处理具有107个细胞/mL的异酒香酵母的起始群体水平的商购苹果酒。对照苹果酒没有经历任何处理。
图9-处理后，追踪苹果酒中的异酒香酵母的群体
说明-
模式1：对照；
模式2：用4g/hL壳聚糖处理；
模式3：用20g/hL DMDC处理；
看到，仅用壳聚糖处理(模式2)使异酒香酵母的群体水平显著减少，在不到5天内，从107CF/mL减少到100CFU./mL，然而，10天后，异酒香酵母的群体大量增加，达到5104CFU/mL。
用DMDC处理(模式3)对异酒香酵母没有影响。
实施例17-用不同剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的果汁(实验室试验)
通过添加不同剂量的壳聚糖(DA≈4.2mol％)，处理具有布鲁塞尔酒香酵母污染的商购果汁(Joker)。对照果汁没有经历任何处理。
处理7天后，壳聚糖允许完全除去存在于果汁中的布鲁塞尔酒香酵母。
实施例18-用不同剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的用于生产工业酒精的葡萄汁基质(musk matrix)(实验室试验)
通过添加不同剂量的壳聚糖(DA≈4.2mol％)，处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的用于生产工业酒精的葡萄汁基质。对照基质没有经历任何处理。
处理7天后，壳聚糖允许完全除去存在于工业葡萄汁基质中的布鲁塞尔酒香酵母。
实施例19-用4g/hL剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖，处理具有1.1103个细胞/mL的起始布鲁塞尔酒香酵母群体水平的年份2010的成品Bordeaux葡萄酒。
表16：通过定量PCR计数和选择性培养基上的计数，追踪4g/hL剂量的壳聚糖处理的效率
Figure BDA00002777131000251
呈现在表16中的结果显示了，取决于分析方法的差异：虽然通过琼脂糖培养基的培养，早在第一次测试(处理后10天)时，估计活的群体小于10个菌落形成单位，但是对于RT-PCR分析，需要等到处理后30天以得到这个结果。
这将说明，壳聚糖可能与酒香酵母细胞的膜壁相互作用，造成后者的破坏；在细胞死亡之前，这种机制将诱导来自与亚致死状态相当的细胞的响应。在这个亚致死状态中，细胞将在它们完全死亡之前通过定量RCP被识别为活的，持续几天，尽管琼脂糖培养基上的分析将立刻将它们识别成不能培养的。
实施例20-用8g/hL剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加8g/hL剂量的壳聚糖，以20％悬浮液开始处理具有103个细胞/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的年份2009的来自Vallée du
Figure BDA00002777131000252
的成品葡萄酒。
对于这个测试，称量壳聚糖且混合在5ml的蒸馏水中(20％母体悬浮液)。取100μl的该母体悬浮液，且然后，以用于250ml的体积的8g/hL(基于总液体体积，按壳聚糖的重量计)的量添加到待处理的葡萄酒中。
表17-葡萄酒的分析特征
Figure BDA00002777131000261
表18-处理10天后，布鲁塞尔酒香酵母在培养基上的计数
酒香酵母类型的酵母(CFU/I)
葡萄酒的起始污染水平(T0) ＞10,000
10天后，用壳聚糖处理的葡萄酒的污染水平(TR10) ＜1
处理10天后，8g/hL剂量的壳聚糖允许完全除去存在于葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母。
实施例21-用4g/hL剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖，从20％悬浮液开始处理具有270个细胞/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的年份2009的来自Vallée du
Figure BDA00002777131000262
的成品葡萄酒。
对于每一个测试，称量壳聚糖且混合在5ml的蒸馏水中(20％母体悬浮液)。取50μl该母体悬浮液且然后添加到待处理的葡萄酒中。
表19-葡萄酒的分析特征
Figure BDA00002777131000263
表20-处理10天后，布鲁塞尔酒香酵母的Q-PCR计数
酒香酵母类型的酵母(CFU/mL)
葡萄酒的起始污染水平(T0) 270
10天后，对照葡萄酒的污染水平(T10) 未检出
处理10天后，4g/hL剂量的壳聚糖允许完全除去存在于葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母。
实施例22-用4g/hL剂量的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加4g/hL剂量的壳聚糖，处理具有105个细胞/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的年份2003的来自Bordeaux的成品葡萄酒。对照葡萄酒没有经历任何处理。测试被进行双份。
表21：处理10天后，在抽取的葡萄酒中，可培养的酵母群体在选择性培养基上的计数和在起始群体中的对数减少
Figure BDA00002777131000271
应用对照且显示在表21中的结果表明大量布鲁塞尔酒香酵母群体存留。另一方面，在用壳聚糖处理的模式的结果中，注意到，未检测到可培养的酵母群体。通过采用在临处理之前存在于葡萄酒中的可培养群体(2.1105CFU/mL)作为参照，计算对数减少。这个对数减少通常大于5。
表22：在处理10天后，通过落射荧光显微术在酒糟上进行活酵母群体和死酵母群体的计数，且活细胞在酒糟中的百分数表示活细胞与在酒糟中计算出的全体细胞的比率。
处理10天后用落射荧光显微术对酒糟的分析(表22)表明，在未处理的对照中，没有死细胞计数。
相反，在用4g/hL剂量的壳聚糖处理的模式中，测试的酵母中的大部分是死的，且活酵母的百分数是非常低的。
实施例23-用4g/hL剂量的具有不同颗粒大小和乙酰化度(DA)的壳聚糖来处理被布鲁塞尔酒香酵母污染的红葡萄酒(实验室试验)
通过添加4g/hL剂量的具有不同颗粒大小和乙酰化度：＜50μm，DA＝15(mol％)(配方A)和＜90μm，DA＝15(mol％)(配方B)的壳聚糖，处理具有105个细胞/mL的布鲁塞尔酒香酵母的起始群体水平的年份2003的来自Bordeaux的成品葡萄酒。对照葡萄酒没有经历任何处理。测试被进行双份。
表23：处理10天后，在抽取的葡萄酒中，可培养的酵母的群体在选择性培养基上的计数和在起始群体中的对数减少。
Figure BDA00002777131000281
显示在表23中的对照的结果表明大量布鲁塞尔酒香酵母群体存留。另一方面，考虑用壳聚糖处理的模式的结果，注意到，未检测到可培养的酵母群体。通过采用在临处理之前存在于葡萄酒中的可培养群体(2.1 105CFU/mL)作为参照，计算对数减少。这个对数减少通常大于5。
表24：在处理10天后，通过落射荧光显微术在酒糟上进行活酵母群体和死酵母群体的计数，且活细胞在酒糟中的百分数表示活细胞与在酒糟中的全体计数细胞的比率。
Figure BDA00002777131000291
处理10天后通过落射荧光显微术对酒糟的分析(表24)表明，在未处理的对照中，没有死细胞计数。
相反，在用4g/hL剂量的壳聚糖处理的模式中，检测的酵母中的大部分是死的。不管配方，活酵母的百分数是低的。然而，注意，配方B(颗粒大小＜90μm)的活细胞的百分数大于配方A(颗粒大小＜50μm)的活细胞的百分数。
实施例24-通过酿酒标准(oenological codex)的方法的壳聚糖的溶解度-纯度和可溶性残余物-剂量
根据本发明的壳聚糖几乎是完全不溶的。
不溶性材料的百分数应等于或大于95％。以以下的方式(选自国际酿酒标准的添加的壳聚糖的OIV专论)来确定：
将5g壳聚糖溶解在100mL的二次蒸馏水中，且搅拌2分钟。冷却后，在拉紧的过滤器上过滤或在膜上过滤。蒸发滤液且在100-105℃下干燥。可溶性材料的含量不应大于5％。
对10批次壳聚糖测量的不溶性材料的％被转移到下面的表25中。
壳聚糖的批号 不溶物质的％
1 96.79％
2 94.50％
3 97.76％
4 96.42％
5 98.54％
6 95.06％
7 98.62％
8 95.61％
9 97.19％
10 95.42％
实施例25-结晶度的计算
通过X射线衍射测量根据本发明的完全水合的壳聚糖的结晶度。通过将壳聚糖粉末放置在过量的去离子水(其重量的10倍)中，持续24小时，使壳聚糖粉末水合。使用衍射仪Siemens D5000(辐射Cu Kα，40kV，45mA，可变发散槽V20，Ni过滤器+在检测器前面的0.6mm和0.2mm的槽)。通过使用以2.5秒/步，2θ为2-60°且步长为0.04°的步进扫描模式收集数据。
通过晶体峰面积与晶体峰面积和2θ为7-49°的无定形区域的面积的和之间的比率，计算结晶度。报告的结果是每一批壳聚糖的2个测量结果的平均值。
表26
Figure BDA00002777131000301
实施例26-残余壳聚糖在处理的葡萄酒中的剂量
通过1μm Pall类型的过滤器，在Buchner上过滤用壳聚糖处理的葡萄酒。然后用水(Eur.Ph.)洗涤过滤后得到的残渣。然后回收存在于过滤器上的残渣，放置在烧瓶中且通过离心用水(Eur.Ph.)洗涤，直到得到下部上清液的100μS的电导率的测量结果。冷冻、冷冻干燥且回收残渣(100mg)。将残渣悬浮在10mL的水+50μl的乳酸中。然后，将样品稀释在1％的醋酸中，且然后，注入HPLC-ELSD i(高效液相色谱法偶联ELSD(蒸发光散射检测器)检测器)中，且相对于用壳聚糖标准品的校准，测定剂量。分析的结果如下：
样品中的壳聚糖含量：低于检出限(10mg/L)。

Claims (14)

1.一种以粉末形式的不溶于水的壳聚糖，其颗粒大小被包括在5-50微米之间。
2.根据权利要求1或2所述的壳聚糖，其特征在于，其包括被包括在0-30mol％之间的乙酰化度(DA)。
3.根据权利要求1-3中任一项所定义的壳聚糖，其特征在于，其包括具有被包括在5-30微米(μm)之间的D(0.5)的颗粒大小。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的壳聚糖，其特征在于，其包括具有被包括在10-30微米之间，且还优选地在10-25微米之间的D(0.5)的颗粒大小。
5.一种组合物，其特征在于，其包含如前述权利要求中任一项所定义的壳聚糖。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，其作为如权利要求1-4中任一项所定义的壳聚糖在液体中且优选地在水中的悬浮液出现。
7.以粉末形式的不溶于水的壳聚糖或如权利要求1-4中任一项所定义的壳聚糖或如权利要求5或6所定义的组合物，作为用于处理液体食品，且特别地用于控制酵母，尤其是酒香酵母和/或德克酵母(Dekker)，甚至更特别地是异酒香酵母(B.anomalus)、布鲁塞尔酒香酵母(B.bruxellensis)、克劳森酒香酵母(B.claussenii)、班图酒香酵母(B.custersianus)、郎比可酒香酵母(B.lambicus)、B.naardenensis和/或B.nanus的抗真菌剂的用途，在1-10g/hL待处理的液体食品且优选地被包括在2-5g/hL待处理的液体食品之间的浓度下，所述不溶于水的壳聚糖的颗粒大小被包括在0.1-200微米之间。
8.以粉末形式的不溶于水的壳聚糖或如权利要求1-4中任一项所定义的壳聚糖或如权利要求5或6所定义的组合物，作为用于控制液体食品，特别是植物源的液体食品，且尤其是通过发酵制备的液体食品例如葡萄酒、啤酒、苹果酒、起泡葡萄酒或果汁中的不期望的酵母的抗真菌剂的用途，在1-10g/hL待处理的液体食品且优选地被包括在2-5g/hL待处理的液体食品之间的浓度下，所述不溶于水的壳聚糖的颗粒大小被包括在0.1-200微米之间。
9.一种用于植物源的液体食品，且特别是通过发酵制备的植物源的液体食品的医疗和/或预防处理的方法，其中必须除去不期望的酵母，必须防止所述不期望的酵母的存在，和/或必须限制所述不期望的酵母的群体，且尤其是酒香酵母属和/或德克酵母属的酵母，且甚至更尤其是异酒香酵母、布鲁塞尔酒香酵母、克劳森酒香酵母、班图酒香酵母、郎比可酒香酵母、B.naardenensis和/或B.nanus，所述方法包括在以粉末形式的不溶于水的壳聚糖或如权利要求1-4中任一项所定义的壳聚糖或如权利要求5或6所定义的组合物的存在下，放置所述液体食品，在1-10g/hL待处理的液体食品且优选地被包括在2-5g/hL待处理的液体食品之间的浓度下，所述不溶于水的壳聚糖的颗粒大小被包括在0.1-200微米之间。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述液体食品为葡萄酒、啤酒或苹果酒，和/或其中所述不期望的酵母为异酒香酵母和/或布鲁塞尔酒香酵母。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，如权利要求1-4中任一项所定义的或在如权利要求5或6所定义的组合物中的所述壳聚糖以1-10g/hL待处理的液体食品，且优选地被包括在2-5g/hL待处理的液体食品之间的浓度存在。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其特征在于，在壳聚糖的存在下，所述液体食品被放置至少3天，且优选至少5天，且还优选地至少7天。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述处理是在发酵期间在食品液体上进行的。
14.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖和/或包含所述壳聚糖的所述组合物被分离，例如通过所述液体食品的抽取、澄清、过滤和/或离心，以保存所述液体食品。
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