KR101779856B1 - 키토산 분해효소를 생산하는 미생물과 이를 이용한 식물 재배용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Paenibacillus mucilaginosus C23(기탁번호 KACC91963P)과 Bacillus ehimensis C25(기탁번호 KACC91964P)에 의한 상추 재배방법으로 종래의 키토산 분해 미생물보다 월등이 빠른 속도로 분해 가능하고, 이 미생물을 이용한 키토산 발효물로 상추재배에 적용할 경우 상추의 생육촉진 뿐 아니라 기능성(폴리페놀, 플라보노이드, 전자공여능) 함량이 증가되는 방법을 제공한다.

Description

키토산 분해효소를 생산하는 미생물과 이를 이용한 식물 재배용 조성물{Chitosan decomposition enzyme producing microorganism and composition for plant cultivation and method using the same}

본 발명은 종래의 미생물보다 키토산 분해에 뛰어난 효능을 가지는 Paenibacillus mucilaginosus C23(기탁번호 KACC91963P), Bacillus ehimensis C25(기탁번호 KACC91964P)의 미생물 및 이를 이용한 식물 재배용 조성물과 재배 방법에 관한 것으로 기존 관행 재배에 비해 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 전자공여능이 증대되는 상추재배 방법에 관한 발명이다.

산업의 발달에 따른 환경의 변화로 자연 상태 그대로의 농작물 관리는 매우 어려움이 따르고, 빠른 효과를 위해서 농약을 많이 사용함에 따라 무차별적 살균력으로 유해균과 함께 유익균도 박멸하게 된다.

또한 농약의 살균력이 소멸되는 시점에서 다시 미생물이 번식하기 시작하는데, 유익한 미생물보다 병원성 미생물이 대부분 먼저 번식하게 되고, 이 병원성 미생물 또한 농약에 대한 내성으로 또 다시 농약을 사용하게 될 경우 더 많은 양을 고농도로 처리해야 하는 악순환에 이른다.

그에 따라 토양에서 유기질을 분해하고, 병원균에 대한 길항작용을 하는 유익균의 세력이 점점 약해져 염류집적, 농약잔류, 농업인의 농약 중독 등이 발생됨은 이미 많이 알려진 사실이다.

최근 생활수준 향상으로 현대인들은 웰빙, 로하스 등으로 친환경에 대한 제품을 중시하고 더 나아가 건강지향에 따른 기능성 농산물에 관심을 더 가지고 이러한 제품들이 각광받고 있다.

이에따라 친환경 제품을 생산하기 위해 저농약, 무농약, 친환경 농법이 필수요소가 되고있고 있으나 농약, 비료 등을 사용하지 않은 농산물 생산은 상품성있는 수준으로 유지하여 재배하는 것이 거의 불가능한 현실이다.

따라서 친환경 농산물 생산의 일환으로 미생물을 이용한 친환경 농법에 관한 연구가 활발히 진행되어 많은 문헌들과 더불어 여러 종류의 미생물 및 미생물관련 제품이 쏟아져 나오고 있으나 대부분 여러 종류의 미생물을 혼합하여 만들어진 유용미생물(EM균, Effective Microorganisms) 형태의 것으로 제대로 된 검증이 이루어지지 않아 뚜렷한 효능을 기대 할 수 있는 제품을 찾기가 어려운 실정이다.

또한 기능성 농산물의 경우 유효성분을 인위적으로 코팅하거나 재배 시 토양처리 관주 등의 방법으로 생산되고 있지만 유효성에 대한 명확한 검증이 이루어지지 않은, 기능성으로서의 역할이 미비한 제품들이 생산되어져 소비자들로부터 불신을 낳고 있는 경우가 많다.

공개특허 10-2011-0091346

본 발명은 종래의 키토산 분해 미생물 보다 키토산 분해능이 뛰어나고 식물생장 촉진, 식물 특히 상추의 폴리페놀, 플로보노이드 함량 증대 및 전자공여능(EDA)이 증가되는 미생물 및 이를 이용한 기능성 식물 재배용 조성물 및 재배 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명의 특징은 키토산 분해효소를 생산하는 패니바실러스 뮤실라지노서스 C23(Paenibacillus mucilaginosus C23)(기탁번호 KACC91963P) 및, 바실러스 에히멘시스 C25(Bacillus ehimensis C25)(기탁번호 KACC91964P)를 제공하는 데 있다.

그리고, 본 발명의 다른 특징은 상기 패니바실러스 뮤실라지노서스 C23 (기탁번호 KACC91963P)또는 바실러스 에히멘시스 C25(기탁번호 KACC91964P)를 이용하여 키토산을 분해하고, 미생물에 의하여 분해된 키토산 발효물을 상추에 시비하여 상추를 재배하는 상추 재배 방법에 있다.

상기에서 키토산 분해효소는 Paenibacillus mucilaginosus C23(기탁번호 KACC91963P), Bacillus ehimensis C25(기탁번호 KACC91964P) 균주 중 어느 하나를 사용할수 있고, 이 균주를 10-90:90-10 중량비로 혼합하여 사용할 수도 있다.

상기한 바와 같이 구성된 본 발명은 Paenibacillus mucilaginosus C23(기탁번호 KACC91963P), Bacillus ehimensis C25(기탁번호 KACC91964P) 미생물을 이용하여 상추 생육촉진 및 증수 효과가 116.4% 향상되었고 비해가 전혀 없었다.

뿐만아니라 상기 미생물을 이용하였을 때 무처리 및 대조구는 수확 후 0일째부터 폴리페놀함량이 감소하였으나 본 발명에서의 상추는 7일 이후부터 감소하는 경향이 나타나 폴리페놀 성분이 오랫동안 함유되는 장점을 가진다.

또한, 상기 미생물을 이용하였을 때 총플라보노이드 함량이 무처리의 경우 0일째부터 서서히 감소하였으나 대조구와 미생물 처리구는 7일째 증가하다 14일부터 감소하는 경향을 보였고 그 함량은 미생물 처리구에서 높게 나타는 장점을 가진다.

또한 상기 미생물을 이용하였을 때 전자공여능(EDA) 정도는 무처리의 경우 0일째부터 급격하게 감소하였으나 대조구와 미생물 처리구는 7일째 증가하다 14일부터 감소하는 경향을 보였고 그 함량은 미생물 처리구에서 높게 나타나는 장점을 가진다.

또한 본 발명의 미생물들을 사용하여 상추를 재배할 경우 생육 촉진, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 증대, 전자공여능(EDA) 증가에 효과적이다.

본 발명은 상기 미생물 C23, C25를 이용하여 식물생육촉진 및 폴리페놀, 플라보노이드 함량증대, 전자공여능(EDA)이 증가되는 상추재배를 제시하고 있으나 한가지 식물에 제한되는 것은 아니며 다양한 식물군에 적용 가능하다.

도 1은 분리된 키토산분해효소(Chitosanase) 생산 미생물의 사진.
도 2는 Bacillus ehimensis C25(기탁번호 KACC91964P) 미생물의 16S rDNA를 기초로한 상동성 결과 도면.
도 3은 Paenibacillus mucilaginosus C23(기탁번호 KACC91963P) 미생물의 16S rDNA를 기초로한 상동성 결과 도면.
도 4는 Paenibacillus mucilaginosus C23(기탁번호 KACC91963P)과 Bacillus ehimensis C25(기탁번호 KACC91964P)의 혼합 미생물의 균주 성장 및 Chitosanase 활성변화 그래프.
도 5는 에탄올로 추출된 재배 시간별 상추 추출액 사진.
도 6은 에탄올로 추출된 비료별 상추 추출액 사진.
도 7은 상추 추출액의 총 폴리페놀 함량 그래프 사진.
도 8은 상추 추출액의 총 플라보노이드 함량을 나타내는 도면.
도 9는 상추 추출액의 전자공여능(EDA)을 나타내는 도면.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 설명한다.

실시예 1. 미생물 선정

<콜로이달 키토산(colloidal chitosan) 준비>

Colloidal chitosan은 10 g chitosan에 증류수 400mL를 첨가하고 교반시킨 후 여기에 다시 1M 아세트산(acetic acid) 100 mL를 첨가하고 교반을 하룻밤 시킨 뒤 거름종이를 이용하여 여과하고 여과된 액을 1N 수산화나트륨(NaOH)를 이용하여 중화시킨 뒤 6,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 침전물만을 모아 증류수로 3회 수세하고 소디움 아세테이트 버퍼(sodium actetate buffer) (pH 5.5)에 1% 되게 현탁시켜 준비하였다.

<균주 분리>

도 1은 본 발명에 따른 분리된 Chitosanase 생산균주 C23, C25의 사진이다.

키토산분해효소 생산성 미생물 분리를 위해서 경북 지역에서 채취한 토양 1g에 멸균 증류수를 9mL 첨가하고 충분히 혼합하여 토양 현탁액을 준비하였다. 토양 현탁액 0.1 mL를 0.9 mL 멸균증류수에 넣고 연속적으로 희석한 희석액을 뉴트리언트 아가(Nutrient agar) 고체배지에 0.1 mL를 도말하고 37℃에서 하룻밤 배양한 뒤 육안 상 형태가 다른 균주를 분리하였다. 분리된 균주들은 키토산 분해효소 생산성을 확인하기 위해서 colloidal chitosan을 0.1% 함유하는 키토사나제 미니멀 아가(chitosanase minimal agar)(CMA) 배지에 획선을 그어 접종 후 37℃에서 삼일간 배양하고 균주 생육 주변에 투명환 생성을 확인하였다.

그 결과, 경북지역 경작지 토양에서 26개 균주를 분리 할 수 있었으며, 이들을 대상으로 CMA배지에 키토산분해효소 생산성을 확인한 결과, C23과 C25 균주에서 배지 주변에 키토산이 분해된 산물인 투명한 환을 생성함을 확인 할 수 있었다.

<분리된 균주 동정>

도 2와 도 3은 C23과 C25 미생물의 16S rDNA를 기초로한 상동성 결과에 관한 도면이다.

chitosanase 생산성 미생물의 동정을 위해 그람염색 후 현미경상 균의 형태를 관찰하였다. 또한 16S rDNA를 기초로한 분자생물학적 동정을 위해서 균주를 한백금이 채취하여 뉴트리언트 브로쓰(Nutreint broth)에서 하룻밤 배양한 뒤 genomic DNA를 정제하고 primer 8F(5'AGT TGA TCC CTC AG)와 1492R (5'ACC TTG TTA CGA CTT)을 이용하여 선발균주의 16Sr DNA를 PCR 증폭 후 (주) 솔젠트(대전)에 의뢰하여 증폭된 PCR 산물의 염기서열 분석하고 NCBI에 등록된 염기서열과 비교하여 균주들의 계통분석 및 상동성을 비교하여 최종 동정하였다.

16Sr DNA를 기초로 미생물 동정 결과, C23은 Paenibacillus mucilaginosus 97%, C25은 Bacillus ehimensis 99%에 상동성을 나타내어 Paenibacillus mucilaginosus C23, Bacillus ehimensis C25로 각각 명명하였다.

<chitosanase 생산 미생물의 토양 적응도 시험>

도 4는 Paenibacillus mucilaginosus C23(기탁번호 KACC91963P)과 Bacillus ehimensis C25(기탁번호 KACC91964P)의 혼합 미생물의 균주 성장 및 Chitosanase 활성변화 그래프이다. 상기의 미생물은 Nutrient broth에 100 mL에 백금이를 이용하여 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양을 하여 전배양액을 준비하고 전배양액을 10%(v/v)되게 Nutrient broth 1L에 배양하여 준비하였다. 토양 처리를 위한 분상 형태의 미생물 제조를 위해 살균된 곡물과 미생물 배양액을 질량비로 100: 5로 혼합기를 이용하여 충분히 혼합한 후 37℃에서 10일간 배양 한 후 이를 건조시켜 잔여 수분을 증발시켰다.

곡물에 접종한 chitosanase 생산 미생물을 토양에서 잘 적응하는지 시험하기 위해 포트(pot)에 멸균된 상토와 미생물을 9:1로 혼합한 뒤 28℃ 항온에서 28℃에서 1-14일간 보관하면서 토양에서의 미생물수와 chitosanase 활성을 비교하였다.

우선 chitosanase 활성은 DNS법을 이용하여 측정하였다. 즉 효소 0.1% colloids chiton(pH 5.5, sodium actetate buffer) 5 mL에 토양 3g을 가하고 혼합한 뒤 37℃ shaking water bath에서 60분간 반응을 시켰다. 그 후 대조군에 토양을 동일량을 첨가하고 DNS 시약을 5 mL 첨가하고 끓는 물에 10분간 중탕 시킨 후 즉시 차가운 물에 냉각시키고 반응액을 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액 만을 회수하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. chitosanase 활성단위(U)는 주어진 조건에서 분단 1μmole의 glucosamine을 생성하는 효소량(unit/g)으로 정의하였다. 미생물 수는 토양 1g을 채취하여 멸균 증류수를 이용하여 10배 희석한 후 Nutrient agar에 희석액을 도말하고 37℃에서 하룻밤 배양 한 후 생성된 콜로니를 계수하여 측정하였다.

토양에서 미생물 생육은 3일째 급격히 증가하여 log 6.46 CFU/g를 나타냈으며, 7일과 14일째에 각각 log 6.66 CFU/g. log 6.60 CFU/g로 큰 변화는 나타내지 않아 키토산 분해 효소가 토양에서 잘 서식하고 있음을 확인 할 수 있었다.

chitosanase 활성은 미생물 균주 생육이 증가한 3일째까지는 큰 변화가 없었으나 7일 이후 활성이 크게 증가되어 14일 째 158.73 μM unit/g으로 최고를 나타내었다. 일반적으로 미생물 효소 생산성은 생육기를 지난 미생물 생장속도와 사멸속도가 유사한 일정 정지기 시점에 최고가 된다. 본 실험에서 토양에서의 chitosanase 효소활성은 미생물의 생육이 토양에서 일정 군집이 유지된 안정화 시점에서 토양에서 효소 활성이 나타날 수 있음을 할 수 있다.

실시예 2. 작물 생육시험을 통한 효과시험 분석 - 생육촉진

<실험방법>

본 실험에 사용한 상추는 무처리구, 대조구(공지의 시판 미생물 제제), C23와 C25 혼합 처리구(질량비 1:1) 총 3가지 조건으로 pot에서 재배된 상추를 사용하여 비해 및 작물의 변화 등을 조사하였다.

이때, 상기 C23와 C25 혼합 처리구는 두 미생물을 물에 300배 희석해서 관주 및 옆면시비하며, 기존 물대신 사용한다.

<생육 촉진 실험결과>

상추의 생육을 조사한 결과, 표 1에 나타내는 바와 같이 엽장은 무처리,대조구 11.6cm로 나타났으나 이에 비해 처리구에서는 12.4cm로 높게 나타났으며 엽폭 또한 무처리구 대조구에 비해 5.4cm로 처리구에서 높게 나타났다. 엽수는 무처리나 대조구에서 8.8~9.0매였으나 처리구에서 9.5매로 높아졌으며 엽중은 무처리나 대구에서 21.6~22.6g이었으나 추천량 처리구에서는 23.4g으로 비교적 높게 나타났다.

무처리, 대조구에 비해 처리구에서 엽장, 엽폭, 엽수, 엽중 모두 높게 나타나 115.5~116.4% 이상 증진 효과를 보였다.

처리명	엽장(cm)	엽폭(cm)	엽수(매/수)		엽중(g/주)
무처리	11.6	5.2	8.8		21.6
대조구	11.6	5.3	9.0		22.6
처리구	12.4	5.4	9.5		23.4

실시예 3. 작물 생육시험을 통한 효과시험 분석 - 총 폴리페놀 함량

<추출조건>

도 5와 도 6은 에탄올로 추출된 재배시간별, 처리구별 상추추출액 사진이다. 재배된 상추를 1g 취하고 80% 에탄올 50ml와 혼합하여 상온(25℃)에서 24시간 방치하여 추출한 다음, 원심분리하여 상등액을 회수하여 상추추출액을 준비하였다.

<총 폴리페놀함량 분석 방법>

총 폴리페놀 함량은 Folin-ciocal 법에 따라 준비되어진 분석시료 1 ㎖에 1/10으로 희석한 Folin-ciocalteu reagent (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)용액 1 ㎖를 가하여 실온에서 5분간 방치한 후, 7.5% Na2CO3용액 4 ㎖를 가하여 1시간 동안 추가 반응시켜 Microplate reader (Infinite M200 PRO, Tecan, Groedig Salzburg, Austria)를 이용하여 756 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 화합물 함량은 tannic acid (Sigma Chemical Co.)를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 정량하였다.

<총 폴리페놀함량 분석 결과>

도 7은 상추추출액의 총 폴리페놀 함량의 그래프이다. 지표물질로써 Tannic acid를 사용하여 총 폴리페놀 함량을 정량한 결과, 도 7 및 표 2에 나타내는 바와 같이 무처리구와 대조구는 0일째에 7.00mg/g함량으로 시간이 지날수록 점점 감소하였으며, 처리구의 경우 7일째부터 총 폴리페놀 함량이 감소하는 경향을 나타내었다. 무처리구는 처리구와 대조구에 비해 총 폴리페놀 함량이 감소하는 경향이 빨리 나타난 것을 표에서 알 수 있다. 처리구에서 재배된 상추가 다른 두 시험구에 비해 총 폴리페놀 성분을 오랫동안 함유할 수 있음을 확인할 수 있었다.

day	sample(mg/g)
	무처리	처리구	대조구
0	7.00±0.13a	7.00±0.13a	7.00±0.13a
7	2.84±0.25b	7.08±0.03a	6.24±0.05b
14	1.12±0.02c	4.17±0.02b	2.58±0.02c
30	0.24±0.00d	0.22±0.01c	0.29±0.03d

실시예 4. 작물 생육시험을 통한 효과시험 분석 - 총 플라보노이드함량

<추출조건>

실시예 3.과 동일

<총 플라보노이드함량 측정 방법>

총 플라보노이드 함량은 AlCl3의 방법에 준하여 준비된 분석시료 1 ㎖에 5% NaNO2용액 150 ㎕를 가하여 실온에서 5분간 반응 후, 10% AlCl3용액 300 ㎕를 넣고 5분 동안 추가 반응시켰다. 반응 종료를 위하여 1M NaOH 1 ㎖를 가한 다음 Microplate reader (Tecan)를 이용하여 510 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 물질 함량은 catechin (Sigma Chemical Co.)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 정량하여 결과를 나타내었다.

<총 플라보노이드함량 측정 결과>

도 8은 상추 추출액의 총 플라보노이드 함량에 관한 그래프이다. 지표물질 Catechin을 이용하여 총 플라보노이드 함량을 정량한 결과, 도 8 및 표 3에 나타내는 바와 같이 처리구와 대조구는 7일째 총 플라보노이드 함량이 증가하다가 14일 감소하는 경향을 보이며 30일째는 거의 없는 것을 확인할 수 있었으며, 무처리군의 경우에는 시간이 지날수록 총 플라보노이드 함량이 점차 감소하는 경향을 보였다. 이에 처리구에서 재배된 상추에서 총 플라보노이드 성분이 오랫동안 함유되어 있음을 확인할 수 있었으며 총 폴리페놀 분석 결과와 동일함을 확인할 수 있었다.

day	sample(mg/g)
	무처리	처리구	대조구
0	2.44±0.03 a	2.44±0.03b	2.44±0.03b
7	1.14±0.01b	3.32±0.06 a	3.08±0.09 a
14	0.40±0.01c	1.77±0.04c	1.07±0.03c
30	0.04±0.01d	0.03±0.02d	0.04±0.02d

실시예 5. 작물 생육시험을 통한 효과시험 분석 - 전자공여능(EDA) 측정

<추출조건>

실시예 4와 동일

<전자공여능 측정 방법>

전자공여능(Electron donating ability;EDA)은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)법의 방법에 따라 분석시료 0.5ml를 DPPH(Wako, Tokyo, Japan) 용액 5를 가하여 실온에서 15분 반응시킨 후 Microplate reader (Tecan)를 이용하여 517 에서 흡광도를 측정하였다. 측정되어진 흡광도는 다음 식을 통해 계산하여 전자공여능을 나타내었다. 전자공여능(%)= [1-시료첨가군의 흡광도/시료무첨가군의 흡광도]

<전자공여능 측정 결과>

도 9는 상추 추출액의 전자공여능(EDA)에 관한 그래프이다. DPPH법을 이용한 전자공여능 정도(EDA)는 도 9 및 표 4에 나타내는 바와 같이 20mg/ml농도에서 EDA가 65.66%였으며, 처리구와 대조구의 경우 7일째 70%정도 전자공여능(EDA)이 증가하였다가 14일째 감소하는 경향을 나타냈으며, 무처리구는 시간이 지날수록 점차 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 또한 무처리구는 시간이 지날수록 전자공여능(EDA)의 감소가 큰 폭을 나타내며 감소하는 반면, 처리구와 대조구는 30일째 급격한 감소의 경향을 나타낸 것을 확인할 수 있었다. 전자공여능(EDA) 역시 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량 결과와 마찬가지로 처리구에서 재배한 상추가 항산화 활성도가 높은 것을 확인할 수 있었으며, 상기 실험 결과를 비추어봤을 때 상추 재배 30일째에는 처리조건에 상관없이 생리활성물질이 모두 감소됨을 확인할 수 있었다.

day	sample(%)
	무처리	처리구	대조구
0	65.66±0.20 a	65.66±0.20b	65.66±0.20 a
7	29.35±1.65b	75.04±0.88 a	70.10±0.28 a
14	9.97±0.45c	43.11±2.36c	25.81±3.66b
30	0.42±0.79d	3.60±1.41d	4.05±4.54c

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하였으나 상시 실시예에만 국한되지 않고, 본 발명의 청구범위에 기재된 범위 내에서 다양하게 변형실시가 가능하며, 이는 본 발명의 권리 범위내에 속하는 것임을 명백히 밝히는 바이다.

국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91964P 20140613 국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91963P 20140613

Claims (9)

1. 키토산 분해효소를 생성하는 패니바실러스 뮤실라지노서스 C23(Paenibacillus mucilaginosus C23)(기탁번호 KACC91963P).
2. 삭제
3. 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 함유하는 식물 재배용 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제

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