KR102449689B1

KR102449689B1 - 페니바실러스 라우투스 js-1 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 항진균용 및 식물병 방제용 조성물

Info

Publication number: KR102449689B1
Application number: KR1020220068893A
Authority: KR
Inventors: 정우진; 최준석; 신혜민; 송용수
Original assignee: 전남대학교 산학협력단
Priority date: 2022-06-07
Filing date: 2022-06-07
Publication date: 2022-09-30

Abstract

본 발명은 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) JS-1 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 항진균용 및 식물병 방제용 조성물에 관한 것으로서, 상기 균주는 식물병원균의 세포벽 구성물질인 키틴을 분해 또는 손상시켜 식물 병원균 균사 성장을 억제시키는 용도로 활용될 수 있고, 키틴 및 키토산 기질에 비의존적으로 키틴 분해 효소 및 키토산 분해 효소를 생산하므로, 이를 효과적으로 식물병원균에 대한 항진균 용도 및 식물병의 방제에 이용할 수 있다.

Description

페니바실러스 라우투스 JS-1 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 항진균용 및 식물병 방제용 조성물 {Composition for antifungal and controlling plant diseases comprising Paenibacillus lautus JS-1 strain or a culture solution thereof}

본 발명은 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) JS-1 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 항진균용 및 식물병 방제용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 키틴 분해 효소와 키토산 분해 효소를 동시 생산하는 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주 또는 이의 배양액을 이용하여 부란병, 탄저병 또는 근부병을 방제하고 이를 유발하는 원인균에 대한 항진균 활성을 나타내는 친환경 미생물 제제에 관한 것이다.

자연계에 풍부하게 존재하는 키틴과 키토산은 고분자 다당류로서 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 또는 D-글루코사민(D-glucosamine)의 다당체로 구성되어 있는 구조를 지닌다. 이들은 항균, 면역 증진, 약물 전달 등의 특성을 가지고 있어 다양한 산업에 이용되고 있으며, 이러한 키틴과 키토산은 중요한 천연자원으로서 그 응용성이 점차 증가되고 있다.

키토산은 키틴을 탈아세틸화시켜 제조되고 있으며, 키토산이 식이섬유로서 콜레스테롤 또는 지질의 흡수를 저해하고 고혈압을 조절하는 기능이 있다는 것이 밝혀지면서 활용 범위가 넓어지고 있다. 특히 최근에는 키틴의 분해산물인 키틴 올리고당(oligosaccharide)과 키토산 올리고당에서 항균작용, 항암작용, 면역강화작용, 병원성 진균에 대한 식물의 저항성 유도 작용의 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.

키틴 분해 효소는 키틴의 글루코시딕(glycosidic) 결합을 분해하여 키틴 올리고당을 생산하는 가수분해 효소이다. 현재까지 보고된 모든 키틴 분해 효소들은 기질로서 사용되는 키틴이 배지 내에 존재해야만 대량 생산되는 유도성 효소(inducible enzyme)로 알려져 있다. 키틴 분해 효소는 버섯 세포벽 유래의 키틴, 효모 세포벽 유래의 키틴, 곰팡이 세포벽 유래의 키틴, 곤충 외골격 유래의 키틴, 갑각류 외골격 유래의 키틴을 분해하여 키틴 올리고당을 만드는 과정에 사용될 수 있다.

키토산 올리고당은 키토산에 비해 분자량이 작고 점도가 낮으며 수용성으로 다양한 분야의 활용으로 부가가치가 높은 소재이다. 키토산으로부터 올리고당을 만드는 방법으로는 물리적, 화학적, 효소적 방법이 있다. 소재의 안전성, 효율성, 올리고당의 중합도, 올리고당의 크기 조절 등 키토산 분해 효소를 이용한 올리고당 생산이 바람직한 방법으로 알려져 있다.

이러한 고분자의 키틴과 키토산을 올리고당으로 분해하는 데에는 키틴 분해 효소와 키토산 분해 효소를 생산하는 미생물의 중요도가 큰 것으로 알려져 있다. 키틴 분해 효소와 키토산 분해 효소는 올리고당 생성 반응뿐만 아니라 식물병원성 진균류에 대한 세포벽 분해, 균사 변형, 성장 억제와 같은 항균활성 특성을 가지고 있다.

한국공개특허 10-2015-0046448 (2015.04.30) 한국등록특허 10-1239757 (2013.02.27) 한국공개특허 10-2016-0113457 (2016.09.29)

이에 본 발명자들은 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) JS-1 균주가 식물병원균의 균사 생장을 효율적으로 억제하는 키틴 분해 효소, 키토산 분해 효소를 복합적으로 생산하므로 상기 균주 또는 이의 배양액이 항진균 및 식물병 방제용 미생물제제로서 우수한 것을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 키틴 분해 효소 및 키토산 분해 효소 생산 활성을 갖는 페니바실러스 라우투스 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 페니바실러스 라우투스 균주를 배양하는 배양 단계를 포함하는 키틴 분해 효소 및 키토산 분해 효소의 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 페니바실러스 라우투스 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 항진균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 페니바실러스 라우투스 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주 또는 이의 배양액의 항진균 또는 식물병 방제 용도에 관한 것이다.

본 발명은 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) JS-1 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 항진균용 및 식물병 방제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주는 키틴 및 키토산 기질에 비의존적으로 키틴 분해 효소 및 키토산 분해 효소를 생산하므로, 기질 선택의 폭이 넓으며 비용 및 생산 효율성을 높일 수 있다.

본 발명자들은 토양으로부터 분리한 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주가 생산하는 키틴 및 키토산 복합 분해 효소를 이용하여 부란병, 탄저병, 근부병의 원인균을 성장 억제시킴으로써 식물병의 예방 효과를 유도할 수 있음을 확인하였다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 키틴 분해 효소 및 키토산 분해 효소 생산 활성을 갖는 페니바실러스 라우투스 균주이다.

본 발명에 있어서 상기 균주는 수탁번호 KACC92413P로 기탁된 것일 수 있다.

상기 균주는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 암호화되는 16S rRNA를 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 페니바실러스 라우투스 균주를 배양하는 배양 단계를 포함하는 키틴 분해 효소 및 키토산 분해 효소의 생산 방법이다.

상기 배양 단계는 25 내지 35℃에서 3 내지 18일 동안 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 25 내지 30℃에서 5 내지 15일 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 배양 단계는 키틴 함유 배지에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태는 페니바실러스 라우투스 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 항진균용 조성물이다.

본 발명에 있어서 상기 배양액은 키틴 분해 효소 또는 키토산 분해 효소를 함유하는 것일 수 있고, 바람직하게는 키틴 분해 효소 및 키토산 분해 효소를 모두 함유하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 배양액은 균주 배양물로부터 균주를 제거한 상등액인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 항진균은 발사 세라토스페르마(Valsa ceratosperma), 콜레토트리쿰 트룬카툼(Colletotrichum truncatum), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 및 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물병원균에 대한 활성인 것일 수 있다.

상기 발사 세라토스페르마는 사과 또는 배에서 부란병을 유발하는 원인균이고, 상기 콜레토트리쿰 트룬카툼, 및 콜레토트리쿰 아쿠타툼은 고추, 사과, 무, 또는 대두에서 탄저병을 유발하는 원인균이고, 상기 푸사리움 솔라니는 인삼 또는 천마에서 근부병(뿌리썩음병)을 유발하는 원인균이다.

본 발명의 또 다른 양태는 페니바실러스 라우투스 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물이다.

본 발명에 있어서 상기 식물병은 부란병, 탄저병 및 근부병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 식물병은 사과, 배, 고추, 무, 대두, 인삼 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 대상으로 발병하는 것일 수 있다.

상기 식물병 방제용 조성물은 식물을 대상으로 엽면처리 또는 관주처리를 통하여 적용되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 동정된 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) JS-1 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 근거로 작성된 분자계통수이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주의 배지 종류별 세포생장 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주의 배지 종류별 단백질 함량을 나타낸 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주의 배지 종류별 키틴(Chitin) 분해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 키틴, TSB(Tryptic Soy Broth), LB(Luria-Bertani) 배지에서 배양한 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주로부터의 키틴분해효소 생산 여부를 확인한 전기영동 사진이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 키틴, TSB, LB 배지에서 배양한 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주로부터의 키토산분해효소 생산 여부를 확인한 전기영동 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주의 대치배양으로 인한 발사 세라토스페르마(Valsa ceratosperma) KACC40031, 콜레토트리쿰 트룬카툼(Colletotrichum truncatum) KACC40810, 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum) KACC40042, 및 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) KACC40384에 대한 균사 생장 억제 효과를 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주의 항균 활성으로 인한 발사 세라토스페르마 KACC40031, 콜레토트리쿰 트룬카툼 KACC40810, 콜레토트리쿰 아쿠타툼 KACC40042, 및 푸사리움 솔라니 KACC40384에 대한 균사 변형을 나타낸 사진이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.

실시예 1: 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주의 동정

1-1. 균주의 분리

식물 근권에서 토양을 채취하여, 수집한 토양 시료 1 g을 멸균 증류수에 현탁시킨 후 30℃에서 30분 동안 활성화시키고 상등액을 멸균수로 10배씩 4회 희석하였다. 1x10⁴배로 희석된 식물근권 토양 시료를 CCT 평판배지(1 리터당 콜로이달 키틴(Colloidal chitin) 5 g; 효모 추출물 0.5 g; K₂HPO₄ 1.0 g; MgSO₄·7H₂O 0.5 g; FeSO₄·7H₂O 0.1 mg; MnSO₄·H₂O 0.1 mg; ZnSO₄·7H₂O 0.1 mg)에 도말한 후, 도말된 배지는 항온 배양기에서 36 내지 48시간 동안 배양하였다.

배양된 집락(colony)들 중 CCT 배지에 함유된 콜로이달 키틴을 분해하면서 형태학적으로 상이한 것을 1차적으로 선택하여 LB(Luria-Bertani) 아가에 평판 획선하여 순수 분리하였다.

1-2. 16s-rRNA 서열분석을 통한 균주의 동정

서열 분석을 위해 분리된 집락을 LB broth에 배양하고 배양액 1.5 mL를 취해 원심분리한 후 0.8% 멸균생리식염수로 수세하였다. Genomic DNA kit를 사용하여 염색체(chromosomal) DNA를 추출하고 이를 PCR을 위한 주형 DNA로 사용하였으며, 균주의 16S rRNA의 증폭을 위해 하기 표 1의 프라이머를 사용하였다.

서열번호	명칭	서열 (5'-3')
1	9F primer	GAG TTT GAT CCT GGC TCA G
2	1412R primer	ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT

PCR 수행 후 PCR 산물에 대하여 전기영동을 수행함으로써 증폭 산물을 확인하고 QIAquick PCR purification kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하였다. 염기서열은 ABI PRISM Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Kits(Applied Biosystems, USA) 및 ABI PRISM 3730xl Analyzer(Applied Biosystems)를 사용하여 마크로젠(Macrogen Co.)(Daejeon, Korea)에서 실시하였다.

제공된 염기서열을 이용하여 NCBI에서 블라스트 검색을 실시하였으며, MEGA 10 프로그램을 사용하여 계통도를 조사하여 도 1에 나타내었고, 상기 균주는 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus)로 동정되었다.

상기 페니바실러스 라우투스 JS-1의 16s rRNA 염기서열은 서열번호 3으로 나타내었고, 상기 균주는 국립농업과학원 농업미생물은행에 2022년 04월 04일자로 기탁하여 KACC92413P의 수탁번호를 부여받았다.

서열번호	3
명칭	Paenibacillus lautus JS-1
서열	gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcggac 50 ttgatggagt gcttgcactc ctgatggtta gcggcggacg ggtgagtaac 100 acgtaggcaa cctgccctca agactgggat aactaccgga aacggtagct 150 aataccggat aatttatttt gcagcattgt gaaataatga aaggcggagc 200 aatctgtcac ttgaggatgg gcctgcggcg cattagctag ttggtggggt 250 aacggcccac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgaacggc 300 cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 350 gaatcttccg caatgggcga aagcctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga 400 tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ccaaggaaga acgtcttcta 450 gagtaactgc taggagagtg acggtacttg agaagaaagc cccggctaac 500 tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcaagcgt tgtccggaat 550 tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggttc tttaagtctg gtgtttaaac 600 ccgaggctca acttcgggtc gcactggaaa ctggggaact tgagtgcaga 650 agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gatatgtgga 700 ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg gctgtaactg acgctgaggc 750 gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 800 taaacgatga atgctaggtg ttaggggttt cgataccctt ggtgccgaag 850 ttaacacatt aagcattccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact 900 caaaggaatt gacggggacc cgcacaagca gtggagtatg tggtttaatt 950 cgaagcaacg cgaagaacct taccaagtct tgacatccct ctgaatcctc 1000 tagagataga ggcggccttc gggacagagg tgacaggtgg tgcatggttg 1050 tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1100 cccttgattt tagttgccag cactttgggt gggcactcta gaatgactgc 1150 cggtgacaaa ccggaggaag gcggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1200 tatgacttgg gctacacacg tactacaatg gctggtacaa cgggaagcga 1250 agccgcgagg tggagccaat cctataaaag ccagtctcag ttcggattgc 1300 aggctgcaac tcgcctgcat gaagtcggaa ttgctagtaa tcgcggatca 1350 gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca 1400 ccacgagagt ttacaacacc cgaagtcggt ggggtaaccc gcaagggagc 1450 cagccgccga aggtggggta gatgattggg gtgaagtcgt aacaaggtag 1500 ccgtatcgga aggtgcggtg gatacctccc cttttctaaa ctggatcgcc 1550 tccttaaagt ttgatcatgc ctcgggctag cccgcccgga acctatcaaa 1600 gctaggtgtc aggagtttca attccccttg attcccaact ttaagaaatt 1650 aaactattcc tcttgtgtaa tcacggtcgc 1680

실시예 2: 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주의 배양 배지 종류에 따른 특성 확인

2-1. 배지 조건에 따른 균주 성장 특성

CCT(Colloidal chitin), TSB(Tryptic Soy Broth), 및 LB(Luria-Bertani) 액체 배지에 JS-1 균주 1%(v/v)를 접종하고 30℃ 조건에서 7일 동안 배양하였다. 1일 내지 2일 간격으로 분광광도계를 사용하여 600 nm로 흡광도를 측정하여 세포 생장을 확인하였고, 단백질 함량은 Bradford(1976) 방법에 따라 발색시약과 반응하여 595 nm로 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 2a에서 확인할 수 있듯이, JS-1 균주는 TSB 배지 조건에서 세포생장이 가장 잘 되고, CCT 배지, LB 배지에서는 3일차에 정점을 보였다.

도 2b에서 확인할 수 있듯이, 단백질 함량은 5일차까지는 LB 배지 조건에서 가장 높게 나타났고, 7일차에서는 TSB 배지 조건에서의 단백질 함량이 가장 높아지는 특징을 보여주었다.

2-2. 배지 조건에 따른 키틴 분해 활성

JS-1 균주가 생산하는 키틴 분해 효소의 배지 조건에 따른 활성 특징을 조사하였다.

실시예 2-1에서와 같이 JS-1 균주를 CCT, TSB, 및 LB 액체 배지에 접종하고 30℃ 조건에서 7일 동안 배양하였다. 1일 내지 2일 간격으로 생산된 키틴 분해 효소의 특징을 조사하기 위하여, 배양 일자별 JS-1 균주 배양물 50 μL을 시료로 사용하였고, 기질은 0.5%(w/v) 콜로이달 키틴 500 μL, 50 mM 소듐 아세테이트(sodium acetate) 완충 용액 450 μL을 혼합한 CCT 액체배지로서 항온수조 내에서 25 또는 37℃에서 3시간 동안 배양하고 1 N NaOH 용액 200 μL으로 반응을 정지시켰다.

반응 용액을 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 500 μL의 상등액에 1 mL의 Schales’ 시약(0.5 M Sodium carbonate + 1.5 M Potassium ferricynide)을 가하여 15분 동안 중탕하고, 분광광도계를 사용하여 420 nm로 흡광도를 측정하였다. 본 방법에 의한 키틴 분해 효소 활성 단위(unit, U)는 시간당 1 μmole의 N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine; GlcNAc)를 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.

그 결과, 도 2c에서 확인할 수 있듯이, JS-1 균주는 CCT 액체배지에서 키틴 분해 활성이 우수하였으며, 시간이 지남에 따라 점진적으로 증가하였다. 배양 7일 후의 키틴 분해 효소 활성 값은 2.4 U/mL로 다른 두 배지 대비 가장 높았다.

실시예 3: 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주의 키틴 분해 효소와 키토산 분해 효소 전기영동 패턴 확인

실시예 2-1에서의 배양 일자별 배양물에 대하여 키틴 분해 효소 활성 전기영동 패턴을 확인하기 위하여, Trudel과 Asselin(1989) 방법에 따라 10%(w/v) 폴리아크릴아마이드 분리겔에 0.01%(w/v) 글라이콜 키틴(glycol chitin)을 기질로 이용하여 수행하였다. 상기 방법에 따르면 전기영동 수행 후 겔 상에 전개된 키틴 분해 효소에 의하여 겔에 함유된 기질인 글라이콜 키틴이 분해되므로 효소의 활성을 확인할 수 있다.

전기영동 수행 후 1%(v/v) Triton X-100이 포함된 100 mM 소듐 아세테이트(pH 5.0) 완충 용액으로 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 0.01%(w/v) 칼코플로어 화이트(Calcofluor white) M2R(Sigma F3543)이 포함된 500 mM Tris-HCl(pH 8.9) 용액에 착색하였다. 자외선 투과조명기를 사용하여 키틴 분해 효소 활성 패턴을 조사하였다.

도 3a에서 확인할 수 있듯이, 전기영동 결과 CCT, TSB, 및 LB 배지 배양 시료에서 76, 64, 52, 40, 30, 및 28 kDa 크기에 해당하는 6종의 동질 키틴 분해 효소 활성 밴드를 확인하였다.

키토산 분해 효소 활성 전기영동 패턴 확인은 폴리아크릴아마이드 분리겔에 0.01%(w/v) 글라이콜 키토산(glycol chitosan)을 기질로 이용하였으며, 그 외 방법은 키틴 분해 효소 활성 확인 방법과 동일하다.

도 3b에서 확인할 수 있듯이, 키토산 분해 효소의 경우 CCT 및 TSB 배지 시료에서 41 및 27 kDa 크기의 2종의 동질 키토산 분해 효소 활성 밴드를 확인하였고, LB 배지 배양 조건에서는 27 kDa 크기의 단일 키토산 분해 효소 활성 밴드를 나타내는 특징을 확인하였다.

키틴 기질, 또는 키토산 기질이 존재하지 않는 TSB 배지에서 키틴 분해 효소, 키토산 분해 효소를 생산하는 것으로 보아 JS-1 균주는 키틴 또는 키토산 기질 비의존성 균주임을 확인하였다.

실시예 4: 페니바실러스 라우투스 JS-1 균주의 식물병원균 저해 효과 확인

JS-1 균주를 대상으로 사과나무, 배나무의 부란병 원인균인 발사 세라토스페르마(Valsa ceratosperma), 고추, 사과, 대두 작물의 탄저병 원인균인 콜레토트리쿰 트룬카툼(Colletotrichum truncatum), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 인삼, 천마 뿌리의 근부병 원인균인 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)에 해당하는 식물병원균들과 대치 배양하여 균사 생장 억제능력을 조사하였다. 공시 시험 균주들(V. ceratosperma KACC40331, C. truncatum KACC40810, C. acutatum KACC40042, 및 F. solani KACC40384)은 국립농업과학원 농업미생물은행(KACC)으로부터 분양 받아 사용하였다.

구체적으로, 공시한 각각의 병원균 균총을 3 mm 콜크 보러(cork borer)를 이용하여 절단한 후 PDA(Potato Dextrose Agar; Difco) 배지 패트리 디쉬 지름의 1/3 지점에 치상한 후 2/3 지점에 JS-1 균주를 대치 배양하였다. 대조군으로는 증류수를 사용하였다. 대치 배양된 각각의 식물병원균을 병원균 생장온도인 25℃에서 14일 동안 배양한 후 선발 균주들의 균사 생장 억제 능력을 조사하였다.

그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이, JS-1 균주는 발사 세라토스페르마, 콜레토트리쿰 트룬카툼, 콜레토트리쿰 아쿠타툼, 및 푸사리움 솔라니 모두에 대한 뚜렷한 균사 생장 억제력으로 항균활성을 보였다. CCT, TSB, LB 배지에서 배양된 JS-1 균주는 모두 동일한 항진균 활성을 보였다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, JS-1 균주의 대치배양으로 성장을 저해받은 균사를 현미경으로 확대 확인한 결과, 대조군 대비 JS-1 균주 처리군에서는 균사의 변형이 이루어짐(붉은 화살표)을 확인하였다. 이로부터 JS-1 균주가 세포벽이 키틴으로 구성된 식물병원균의 방제에 있어서 미생물 제제로서의 잠재적 우수성이 크다는 것을 확인할 수 있다.

농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행

KACC92413P

20220418

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for antifungal and controlling plant diseases comprising Paenibacillus lautus JS-1 strain or a culture solution thereof <130> PN220162 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9F primer <400> 1 gagtttgatc ctggctcag 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1412R primer <400> 2 acggctacct tgttacgact t 21 <210> 3 <211> 1680 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Paenibacillus lautus JS-1 <400> 3 gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcggac ttgatggagt 60 gcttgcactc ctgatggtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtaggcaa cctgccctca 120 agactgggat aactaccgga aacggtagct aataccggat aatttatttt gcagcattgt 180 gaaataatga aaggcggagc aatctgtcac ttgaggatgg gcctgcggcg cattagctag 240 ttggtggggt aacggcccac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgaacggc 300 cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg 360 caatgggcga aagcctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa 420 agctctgttg ccaaggaaga acgtcttcta gagtaactgc taggagagtg acggtacttg 480 agaagaaagc cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcaagcgt 540 tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggttc tttaagtctg gtgtttaaac 600 ccgaggctca acttcgggtc gcactggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt 660 ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gatatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc 720 gactctctgg gctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga 780 taccctggta gtccacgccg taaacgatga atgctaggtg ttaggggttt cgataccctt 840 ggtgccgaag ttaacacatt aagcattccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact 900 caaaggaatt gacggggacc cgcacaagca gtggagtatg tggtttaatt cgaagcaacg 960 cgaagaacct taccaagtct tgacatccct ctgaatcctc tagagataga ggcggccttc 1020 gggacagagg tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080 aagtcccgca acgagcgcaa cccttgattt tagttgccag cactttgggt gggcactcta 1140 gaatgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gcggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1200 tatgacttgg gctacacacg tactacaatg gctggtacaa cgggaagcga agccgcgagg 1260 tggagccaat cctataaaag ccagtctcag ttcggattgc aggctgcaac tcgcctgcat 1320 gaagtcggaa ttgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggtct 1380 tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttacaacacc cgaagtcggt ggggtaaccc 1440 gcaagggagc cagccgccga aggtggggta gatgattggg gtgaagtcgt aacaaggtag 1500 ccgtatcgga aggtgcggtg gatacctccc cttttctaaa ctggatcgcc tccttaaagt 1560 ttgatcatgc ctcgggctag cccgcccgga acctatcaaa gctaggtgtc aggagtttca 1620 attccccttg attcccaact ttaagaaatt aaactattcc tcttgtgtaa tcacggtcgc 1680 1680

Claims

키틴 분해 효소 및 키토산 분해 효소 생산 활성을 갖는 수탁번호 KACC92413P로 기탁된 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) JS-1 균주.
삭제
수탁번호 KACC92413P로 기탁된 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) JS-1 균주를 배양하는 배양 단계를 포함하는 키틴 분해 효소 및 키토산 분해 효소의 생산 방법.
제3항에 있어서, 상기 배양 단계는 키틴 함유 배지에서 수행되는 것인, 키틴 분해 효소 및 키토산 분해 효소의 생산 방법.
수탁번호 KACC92413P로 기탁된 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) JS-1 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 항진균용 미생물제제로서,
상기 항진균은 발사 세라토스페르마(Valsa ceratosperma), 콜레토트리쿰 트룬카툼(Colletotrichum truncatum), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 및 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물병원균에 대한 활성인 것인, 항진균용 미생물제제.
삭제
제5항에 있어서, 상기 배양액은 키틴 분해 효소 또는 키토산 분해 효소를 함유하는 것인, 항진균용 미생물제제.
삭제
수탁번호 KACC92413P로 기탁된 페니바실러스 라우투스(Paenibacillus lautus) JS-1 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물로서,
상기 식물병은 부란병, 탄저병 및 근부병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 식물병 방제용 조성물.
삭제
제9항에 있어서, 상기 배양액은 키틴 분해 효소 또는 키토산 분해 효소를 함유하는 것인, 식물병 방제용 조성물.
삭제
제9항에 있어서, 상기 식물병은 사과, 배, 고추, 무, 대두, 인삼 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 대상으로 발병하는 것인, 식물병 방제용 조성물.