KR101869966B1 - 페도박터 속 신균주, 이를 이용한 저온성키틴분해효소 생산방법 및 이를 포함하는 친환경미생물제제 - Google Patents

페도박터 속 신균주, 이를 이용한 저온성키틴분해효소 생산방법 및 이를 포함하는 친환경미생물제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 0℃∼30℃의 온도에서 활성을 나타내는 저온성 키틴분해효소를 생산하는 페도박터 속(Pedobacter sp.) 신균주, 이를 이용한 저온성키틴분해효소 생산방법 및 이를 포함하는 미생물제제에 관한 것이다.

Description

페도박터 속 신균주, 이를 이용한 저온성키틴분해효소 생산방법 및 이를 포함하는 친환경미생물제제{Method for producing of low temperature chitinolytic enzyme using Pedobacter sp., and preparation of an environmentally-friendly microorganism containing Pedobacter sp.}
본 발명은 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 0℃∼30℃의 온도에서 활성을 나타내는 저온성 키틴분해효소를 생산하는 페도박터 속(Pedobacter sp.) 신균주, 이를 이용한 저온성키틴분해효소 생산방법 및 이를 포함하는 친환경미생물제제에 관한 것이다.
키틴은 천연에 존재하는 고분자 다당류로서 N-acetyl-D-glucosamine의 다당체로 구성되어있는 구조이다. 키틴은 셀룰로오스 다음으로 천연에 두 번째로 풍부하게 존재하는 고분자로 하등 동물의 주요구조 다당류로서 특히 갑각류의 외골격, 곤충의 표피, 곰팡이의 세포벽 등에서 발견된다.
키틴은 천연에서는 단백질과 결합하여 당 단백의 형태로 존재하고, 이들 당단백은 알카리로 단백질을 제거하여 제조할 수 있다. 이와 같은 키틴은 염산으로 가수분해하면 단당류인 D-글루코사민 염산염을 얻을 수 있고, 농알카리 용액에서 가열하고 탈아세틸화 시켜 키토산을 얻을 수 있는 등 중요한 천연자원으로서 그 응용성이 점차 증가되고 있다. 특히 최근에는 키틴의 분해산물인 키틴 올리고당에서 항균작용, 항암작용, 면역강화작용, 병원성 진균에 대한 식물의 저항성 유도 작용의 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.
키틴분해효소는 키틴을 분해하는 효소로서 알려져 있으며, 이는 키틴의 glycosidic 결합을 분해하여 키틴 oligosacchride를 생산하는 가수 분해효소이다. 현재까지 보고된 모든 키틴분해효소들은 기질로서 사용되는 키틴이 배지 내에 존재해야 대량 생산되는 유도성 효소(inducible enzyme)로 알려져 있다. 키틴분해효소는 버섯 세포벽 유래 키틴, 효모 세포벽 유래 키틴, 곰팡이 세포벽 유래 키틴, 곤충 외골격 유래 키틴, 갑각류 외골격 유래 키틴을 분해하여 키틴올리고당을 만드는 과정에 사용된다.
키틴 분해 파생물을 획득하기 위해 다양한 미생물에서 키틴 분해 활성이 좋고, 기질 특이성이 있는 키틴분해효소를 개발하고 있다. 일반적으로 키틴분해효소는 37℃∼40℃ 환경에서 균성장이 잘 이루지는 Bacillus sp. 및 Serratia marcescens 등에서 보고되어지고 있으며, 키틴분해효소 활성도 주로 37℃∼40℃에서 활성이 강하게 나타나는 키틴분해효소가 주를 이루고 있다. 저온성 키틴분해효소 및 저온적응성 키틴분해효소에 관한 연구보고는 Pseudoalteromonas sp. DL-6 및 Sanguibacter antarcticus KOPRI 21702 등, 극지방 해양 또는 토양에서 발견되는 미생물에서 보고되고 있다.
한편, 농작물의 수확량에 영향을 끼치는 결정적인 요인 중의 하나로 식물곰팡이병을 들 수 있다. 대표적인 식물병원성곰팡이로는 각종식물의 잿빛 곰팡이병을 일으키는 보트리티스 시네라(Botrytis cinera) 및 작물 시들음 및 썩음병을 일으키는 푸사리움 옥시스포럼(Fusariun oxysporum)등이 있다. 특히 푸사리움 옥시스포럼균은 동양란과 서양란의 재배 시 고가의 품종에 많은 피해를 일으키는 식물병원성곰팡이이다.
이와 같이 식물병원성곰팡이에 의한 작물의 피해는 해충, 잡초와 더불어 작물의 생산량 감소 문제를 야기하고 있다. 식물병원성곰팡이의 방제에는 주로 살균제를 이용한 화학적 방법, 재배환경을 개선해주는 물리적 방법 및 미생물을 이용한 미생물학적 방법 등이 있다. 물리적 방법만으로는 큰 효과가 없으며, 화학적 방법은 약제 저항성 균의 출현 및 인축에 대한 독성과 잔류 농약에 의한 환경오염 등의 문제를 야기하고 있다.
현재 농업에 사용되는 항진균제로서는 발리다마이신(validamycin), 카슈사마이신(kasugamycin), 스트렙토마이신(streptomycin) 등이 있으나 식물병원성 진균을 제어할 수 있는 생물농약(바이오컨트롤제제)으로 사용되고 있는 미생물제제는 미비한 실정이다.
국내특허등록번호 제10-0732250호
본 발명자들은 0℃∼30℃의 온도에서 강한 활성을 나타내는 저온성 키틴분해효소를 생산하는 신균주를 통해 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 일반적인 키틴분해효소가 활성을 갖는 온도보다 낮은 저온에서 키틴을 분해할 수 있는 저온성 키틴분해효소를 생산하는 페도박터 속(Pedobacter sp.) 신균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 페도박터 속(Pedobacter sp.) 신균주가 0℃∼30℃의 온도에서 배양되므로, 배양 온도 상승 및 유지에 소요되는 에너지 비용 등이 요구되지 않아 생산원가가 절감되고 수율이 우수한 저온성 키틴분해효소 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 0℃∼30℃의 온도에서 강한 활성을 나타내는 저온성 키틴분해효소를 생산하는 페도박터 속(Pedobacter sp.) 신균주, 이의 배양물 및 저온성 키틴분해효소 중 하나 이상을 포함하여 곰팡이성 식물병원균의 생육을 억제하는 친환경미생물제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 키틴분해효소를 생산하는 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P)를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 키틴분해효소는 0℃∼30℃의 온도에서 활성을 나타낸다.
바람직한 실시예에 있어서, 0℃∼30℃의 온도조건에서 배양된다.
바람직한 실시예에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P)를 키틴이 함유된 배지에서 배양하는 배양단계;를 포함하는 저온성키틴분해효소 생산방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 배양단계에서 얻어진 배양물로부터 저온성키틴분해효소를 정제하는 단계를 더 포함한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 배양단계는 0℃∼30℃의 온도조건에서 수행된다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P), 상술된 어느 하나의 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P)의 배양물, 및 상술된 어느 하나의 방법으로 얻어진 저온성키틴분해효소 중 하나 이상을 포함하는 친환경미생물제제를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 친환경미생물제제는 키틴을 세포벽으로 구성하는 식물병원균의 균사를 분해하여 곰팡이성 식물병원균의 균사성장을 억제한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 곰팡이성 식물병원균은 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 알터나리아 브라시시코라 (Alternaria brassicicola), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 중 하나 이상이다.
또한, 본 발명은 상술된 친환경미생물제제를 토양, 식물 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 식물병은 키틴을 세포벽으로 구성하는 곰팡이성 식물병원균에 의해 유발된다.
본 발명의 페도박터 속(Pedobacter sp.) 일반적인 키틴분해효소가 활성을 갖는 온도보다 낮은 저온에서 키틴을 분해할 수 있는 저온성 키틴분해효소를 생산할 수 있다.
또한, 본 발명의 저온성 키틴분해효소 생산방법은 페도박터 속(Pedobacter sp.) 신균주가 0℃∼30℃의 온도에서 배양되므로, 배양 온도 상승 및 유지에 소요되는 에너지 비용 등이 요구되지 않아 생산원가가 절감되고 수율이 우수하다.
또한, 본 발명의 친환경미생물제제는 0℃∼30℃의 온도에서 강한 활성을 나타내는 저온성 키틴분해효소를 생산하는 페도박터 속(Pedobacter sp.) 신균주, 이의 배양물 및 저온성 키틴분해효소 중 하나 이상을 포함하여 곰팡이성 식물병원균의 생육을 친환경적으로 억제하므로, 곰팡이성 식물병원균을 효과적으로 방제할 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6)에서 분석된 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 작성된 분자계통수이다.
도 2는 본 발명에 따른 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6)의 배양온도가 25℃ 및 30℃인 경우 세포생장을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6)의 배양온도가 25℃와 30℃일 때 각각의 단백질 함량을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6)가 키틴배지의 키틴을 4℃, 25℃, 30℃에서 분해하는 것을 보여주는 결과사진이다.
도 5a는 본 발명에 따른 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6)의 배양온도가 25℃ 및 30℃일 때 생산된 키틴분해효소의 25℃ 환경에서 키틴분해활성을 나타내는 그래프이다.
도 5b는 본 발명에 따른 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6)의 배양온도가 25℃ 및 30℃일 때 생산된 키틴분해효소의 37℃ 환경에서 키틴분해활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6)의 키틴배지에서 25℃ 배양 시료와 30℃ 배양시료의 키틴분해효소가 생산되는 것을 확인 전기영동 사진이고, 생산된 키틴분해효소는 25℃ 환경에서는 키틴분해 활성이 있지만, 37℃ 온도 환경에서는 키틴분해 활성이 없음을 나타낸 전기영동 사진이다.
도 7은 본 발명에 따른 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6)의 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) KACC 40108, 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) KACC 40574, 알터나리아 브라시시코라 (Alternaria brassicicola) KACC40036, 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) KACC47615에 대한 생장 억제활성을 나타내는 도면이다.
본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명의 기술적 특징은 일반적인 키틴분해효소가 활성을 갖는 온도보다 낮은 저온 즉 0℃∼30℃의 온도에서 키틴을 분해할 수 있는 저온성 키틴분해효소를 생산할 수 있는 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6)에 있다.
따라서, 본 발명은 키틴분해효소를 생산하는 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P)를 제공한다.
일반적으로 키틴분해효소는 37℃∼40℃ 환경에서 균성장이 잘 이루지는 Bacillus sp. 및 Serratia marcescens 등에서 보고되어지고 있으며, 키틴분해효소 활성도 주로 37℃∼40℃에서 활성이 강하게 나타나는 키틴분해효소가 주를 이루고 있는데, 본 발명의 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6)는 0℃∼30℃의 온도에서 배양이 이루어지며, 본 발명의 균주에 의해 생산된 키틴분해효소의 활성도 0℃∼30℃에서 활성이 강하게 나타난다. 한편, 본 발명의 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6)의 배양온도 및 본 발명의 균주에 의해 생산된 키틴분해효소의 활성온도는 0℃ 미만의 온도일 수 있으나, 0℃를 초과하는 온도가 효과적이었으며, 후술하는 실시예에서 실험한 바와 같이 4℃이상 30℃이하의 온도에서 보다 효과적이었다. 특히 본 발명의 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6) 및 본 발명의 균주에 의해 생산된 키틴분해효소 등이 포함된 미생물제제가 사용되는 장소인 토양을 고려하면 배양온도를 15℃∼25℃를 포함한 상온으로 할 수 있을 것이다.
그 결과, 본 발명의 저온성키틴분해효소 생산방법은 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P)를 키틴이 함유된 배지에서 배양하는 배양단계;를 포함하는데, 배양단계는 0℃∼30℃의 온도조건에서 수행될 수 있다. 필요한 경우, 저온성키틴분해효소만을 얻기 위해, 배양단계에서 얻어진 배양물로부터 저온성키틴분해효소를 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 즉 배양단계에서 얻어진 배양물에는 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P), PR-M6 균주가 생산한 저온성키틴분해효소, 키틴분해효소에 의해 분해된 키틴분해산물 등이 포함되어 있기 때문이다.
이와 같이 본 발명의 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6)가 생산하는 키틴분해효소는 0℃∼30℃인 환경 조건에서 키틴을 분해하여 키틴올리고당 등 키틴분해유용산물을 생산하게 되므로, 일반적인 키틴분해효소의 활성을 유지하기 위한 별도의 온도조건에 필요한 에너지 비용 없이 고분자의 키틴을 저분자로 분해하여, 버섯 세포벽 유래 키틴, 효모 세포벽 유래 키틴, 곰팡이 세포벽 유래 키틴, 곤충 외골격 유래 키틴, 갑각류 외골격 유래 키틴을 분해할 수 있어, 본 발명의 저온성키틴분해효소는 통상 보고된 키틴올리고당의 활용 분야에 이용할 수 있다.
또한, 곰팡이성 식물병원균의 생육온도인 토양온도 15℃∼25℃ 환경에서 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주가 잘 생육할 수 있는 점을 고려하면 본 발명의 페도박터 속(Pedobacter sp.) 균주(PR-M6), 이의 배양물 및 저온성 키틴분해효소 중 하나 이상을 토양에 관주했을 때 곰팡이성 식물병원균의 생육을 억제하는 친환경 미생물제제로서 뛰어난 효능이 기대될 수 있다.
따라서, 본 발명의 친환경 미생물제제는 키틴을 세포벽으로 구성하는 식물병원균 예를 들면 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 알터나리아 브라시시코라 (Alternaria brassicicola), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 등을 포함하는 곰팡이성 식물병원균의 균사성장을 억제할 수 있으므로, 본 발명의 친환경미생물제제를 토양, 식물 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하여 키틴을 세포벽으로 구성하는 곰팡이성 식물병원균에 의해 유발되는 식물병을 효과적으로 방제할 수 있다.
실시예. 신규한 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주의 분리 및 동정
1. 균주의 분리
본 발명의 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주는 다음과 같은 과정을 통해 분리되었다. 먼저 버섯이 썩은 토양을 채취하여, 수집한 토양 시료 1 g을 멸균 증류수에 현탁시킨 후 30℃에서 30분간 활성화시키고 상등액을 멸균수로 10배씩 3회 희석하였다. 1x103배로 희석된 버섯썩은 토양 시료를 CCT 평판배지(1 리터당 콜로이달 키틴 5 g; 효모 추출물 0.5 g; K2HPO4 1.0 g; MgSO4ㅇ7H2O 0.5 g; FeSO4ㅇ7H2O 0.1 mg; MnSO4ㅇH2O 0.1 mg; ZnSO4ㅇ7H2O 0.1 mg)에 도말한 후, 도말된 배지는 항온 항습 배양기에서 36 내지 48시간 동안 배양하였다. 그리고 배양된 집락들 중 CCT 배지에 함유된 콜로이달 키틴을 분해하면서 형태학적으로 상이한 것을 1차적으로 선택하여 LB 아가에 평판 획선하여 순수 분리하였다. 상기 선발된 1차 분리균주를 팽이버섯 평판배지(1 리터당 팽이버섯가루 5 g)에 접종하여, 팽이버섯가루의 분해환을 비교적 빨리 형성시키는 것과 분해환의 크기가 상대적으로 큰 균주를 최종 선발하였다.
2. 16s-rRNA 서열분석을 통한 균주의 동정
서열 분석을 위해 분리된 Pedobacter sp. PR-M6 균주를 LB broth에 배양하고 배양액 1.5 mL를 취해 원심 분리한 후 0.8% 멸균생리식염수로 수세하였다. 그리고 genomic DNA kit를 사용하여 chromosomal DNA를 추출하여 PCR을 위한 주형 DNA로 사용하였으며, 세균의 16s rRNA의 증폭을 위해 9 F (5'-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3 ')와 1412R (5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3') 프라이머를 사용하였다. PCR 수행 후 PCR 산물을 전기영동을 통해 증폭 산물을 확인하고 QIAquick PCR purification kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하였다. 염기서열은 ABI PRISM Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, USA) and ABI PRISM 3730xl Analyzer (AppliedBiosystems) 사용하여 Geno Tech Co. (Daejeon, Korea)에서 실시하였다. 제공된 염기서열을 이용하여 NCBI에서 블라스트 검색을 실시하였으며, MEGA 7.0 프로그램을 사용하여 계통도를 조사하여 도 1에 나타내었고, 상기 균주는 페도박터 속(Pedobacter sp.)로 동정되었다.
상기 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6의 16s rRNA 염기서열은 서열번호 1에 나타내었고, 상기 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주는 국립농업과학원 농업미생물은행에 2017년 3월 16일자로 기탁하여 KACC 92170P 수탁번호를 부여받았다.
실험예 1. 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주의 배양 온도 따른 특성 확인
PR-M6 균주의 배양온도에 따른 균주성장 특성을 다음과 같이 실험하였다. CCT 액체 배체 배지에 PR-M6 균주 1%(v/v)를 접종하고 25 또는 30℃ 환경에서 6일간 배양하였다. 1일 간격으로 세포생장은 분광광도계를 사용하여 600 nm로 흡광도를 측정하였으며, 단백질 함량은 Bradford (1976) 방법에 따라 발색시약과 반응하여 595 nm로 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 2에 도시된 바와 같이 PR-M6 균주는 25℃ 환경에서 세포생장이 더 잘 되며, 단백질 함량 또한, 도 3에 도시된 바와 같이 4일차 배양 일자부터 25℃ 환경에서 생산성이 더 높게 나타났으며, 5일차 고정상에 도달할 때 최대치인 133.5 μg/mL의 함량을 보여주었다.
실험예 2. 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주의 배양온도 조건에 따른 키틴분해 활성 확인
PR-M6 균주가 생산하는 키틴분해효소의 온도 조건에 따른 활성 특징을 다음과 같이 조사하고 그 결과를 도 4에 나타내었다. 온도 조건에 따른 활성 특징 조사는 CCT 평판배지에 PR-M6 균주를 접종한 후 4℃, 25℃, 및 30℃에서 각각 배양하여 키틴분해환 형성으로 확인 하였다. 그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, PR-M6 균주는 4℃, 25℃, 및 30℃ 환경에서 모두 키틴분해효소를 생산하여 키틴을 분해 할 수 있는 균주임을 확인할 수 있었다.
이와 같은 본 발명 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주의 온도에 따른 키틴분해효소 생산성을 조사한 결과를 통해 본 발명의 PR-M6균주에 의해 생산된 키틴분해효소가 일반적으로 알려진 키틴분해효소보다 그 활성이 더 낮은 온도에서 나타나는 저온성임을 알 수 있었다.
실험예 3. 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주의 배양온도에 따른 키틴분해효소의 특징 분석
PR-M6 균주를 25℃ 및 30℃에서 각각 6일간 배양하여 생산된 각 키틴분해효소의 특징을 조사하기 위해, 배양 일자 별 시료 50 μL을 사용하였으며, 기질은 0.5%(w/v) colloidal chitin 500 μL, 50 mM sodium acetate 완충용액 450 μL을 혼합하여 항온수조 내에서 25 또는 37℃에서 3시간 동안 배양하고 1 N NaOH용액 200 μL으로 반응을 정지 시켰다. 반응 용액을 10,000 rpm으로 5분간 원심분리 한 후 500 μL의 상등액에 1 mL의 Schales' 시약(0.5M Sodium carbonate+1.5M Potassium ferricynide)을 가하여 15분간 중탕하고, 분광광도계를 사용하여 420 nm로 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다. 본 방법에 의한 키틴분해효소 활성 단위(unit, U)는 시간당 1 μmole의 엔아세틸글루코산민(GlcNAc)를 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.
도 5a 및 도 5b에서 보는 바와 같이 PR-M6 균주는 25℃ 환경의 CCT 액체배지에서 키틴분해 활성이 최대치인 31.3 U/mg protein을 보였고, 25℃ 및 30℃ 환경에서 생산된 각 키틴분해효소를 25℃ 및 37℃ 환경에서 반응 시켰을 때 키틴분해 활성은 25℃ 환경에서 생산된 키틴분해효소가 활성이 더 높으며, 키틴분해 활성 반응 또한 25℃ 환경에서 활성이 강하게 나타남을 알 수 있었다.
실험예 4. 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주의 키틴분해효소 전기영동 패턴 확인
키틴분해효소 활성 전기영동 패턴 확인은 Trudel과 Asselin (1989) 방법에 따라 10%(w/v) 폴리아크릴아마이드 분리겔에 0.01%(w/v) glycol chitin 기질을 이용하여 다음과 같이 수행하였다. 전기영동 후 1%(v/v) Triton X-100이 포함된 100 mM sodium acetate(pH 5.0) 완충 용액을 25 또는 37℃에서 24시간 배양하고, 0.01%(w/v) Calcofluor white M2R(Sigma F3543)이 포함된 500 mM Tris-HCl(pH 8.9) 용액에 착색하였다. 자외선 투과조명기를 사용하여 키틴분해효소 활성 패턴을 조사하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
전기영동 결과 45 kDa(chiII), 41 kDa(chiIII), 37 kDa(chiIV) 크기의 3 종류의 동질 키틴분해 활성 밴드를 확인 하였으며, 도 6에 도시된 바와 같이 25℃에서 배양했을 때 생산된 키틴분해효소의 활성이 30℃ 배양에서 생산된 키틴분해효소의 활성과 비교하였을 때 더 강한 활성을 보였다. 25℃ 및 30℃에서 생산된 키틴분해효소를 포함하고 있는 폴리아크릴아마이드 분리겔을 25℃ 및 37℃ 환경에서 각각 반응 시켰을 때, 25℃ 환경에서는 활성이 나타났지만, 37℃ 환경에서는 키틴분해활성이 상실하여 저온성 키틴분해효소 특징을 보여주었다.
실험예 5. 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주의 식물병원균 저해 효과 확인
페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주의 식물병원균 저해 효과 확인하기 위하여, PR-M6 균주를 대상으로 키틴을 세포벽으로 구성하는 식물병원균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 알터나리아 브라시시코라 (Alternaria brassicicola), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)과 다음과 같이 대치 배양하여 균사 생장 억제능력을 조사하고 그 결과를 도 7에 도시하였다. 공시 시험 균주들(R. solani KACC 40108, B. cinerea KACC 40574, A. brassicicola KACC40036, F. oxysporum KACC47615)은 국립농업과학원 농업미생물은행(KACC) 으로부터 분양 받아 사용하였다. 공시한 각각의 병원균 균총을 8 mm cork borer를 이용하여 절단한 후 PDA (Potato Dextrose Agar; Difco) 배지 중앙에 치상한 후 PR-M6균주를 대치 배양하였다. 대치 배양된 각각의 식물병원균을 병원균 생장온도인 25℃ 에서 3-6일간 배양 한 후 선발 균주들의 균사 생장 억제 능력을 조사하였다.
그 결과, 본 발명의 PR-M6 균주는 모든 병원균에 대해서 항균활성을 보였는데, 즉 도 7에 도시된 바와 같이 PR-M6 균주가 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 알터나리아 브라시시코라 (Alternaria brassicicola)균주에 대한 뚜렷한 생장 억제능을 보였기 때문이다. 이러한 실험결과는 PR-M6 균주 및 이의 배양액이 키틴을 세포벽으로 구성하는 식물병원균의 방제를 위한 미생물 제제로서의 잠재적 우수성이 크다는 것을 보여준다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.
국립농업과학원 농업미생물은행(국내) KACC92170P 20170316
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Claims (12)

  1. 키틴분해효소를 생산하는 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P).
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 키틴분해효소는 4℃∼30℃의 온도에서 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P).
  3. 제 1 항에 있어서,
    4℃∼30℃의 온도조건에서 배양되는 것을 특징으로 하는 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P).
  4. 제 1 항에 있어서,
    서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P).
  5. 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P)를 키틴이 함유된 배지에서 배양하는 배양단계;를 포함하는 키틴분해효소 생산방법으로서, 상기 키틴분해효소는 4℃∼30℃의 온도에서 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 키틴분해효소 생산방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 배양단계에서 얻어진 배양물로부터 키틴분해효소를 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키틴분해효소 생산방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 배양단계는 4℃∼30℃의 온도조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 키틴분해효소 생산방법.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P), 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 페도박터 속(Pedobacter sp.) PR-M6 균주(KACC92170P)의 배양물, 및 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 방법으로 얻어진 키틴분해효소 중 하나 이상을 포함하는 친환경미생물제제.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 친환경미생물제제는 키틴을 세포벽으로 구성하는 식물병원균의 균사를 분해하여 곰팡이성 식물병원균의 균사성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 친환경미생물제제.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 곰팡이성 식물병원균은 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 알터나리아 브라시시코라 (Alternaria brassicicola), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 중 하나 이상인 것을 특징으로 친환경미생물제제.
  11. 제 8 항의 친환경미생물제제를 토양, 식물 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 식물병은 키틴을 세포벽으로 구성하는 곰팡이성 식물병원균에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 식물병 방제방법.
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