CN101675996A - 壳聚糖纳微球产品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种壳聚糖纳微球产品，其中所述壳聚糖纳微球产品中壳聚糖纳微球的平均粒径为几十纳米至10微米，粒径分布系数C.V.小于20％。本发明还提供了制备所述壳聚糖纳微球的制备方法和用途。

Description

壳聚糖纳微球产品及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖纳微球产品及其制备方法，特别是一种粒径基本均一、10微米以下的壳聚糖纳微球产品及其制备方法。

背景技术

壳聚糖是由葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺共聚物组成的多糖，是甲壳素脱乙酰基的产物，壳聚糖由于分子链上具有游离氨基而可以溶于稀酸溶液，因此比甲壳素具有更为广泛的用途。壳聚糖作为一种阳离子的生物高聚物，具有生物粘附性、生物相容性和生物降解性，壳聚糖的这种独特性使其生物医学领域得到广泛研究和应用，如药物载体、细胞培养载体、固定化酶载体、蛋白质分离介质等。

众多研究发现，壳聚糖是制备口服纳微球和微囊药物制剂的理想材料，这主要因为以下两点：

(a)壳聚糖由于无毒，可生物降解，而且能提高人体免疫力，已作为保健品上市，因此，该材料可用于口服类药物的载体，具备口服安全性，有巨大的潜在市场；

(b)壳聚糖是带正电荷的天然多糖，对带负电荷的粘膜和细胞显示很强的黏附性，能够长时间且高浓度地聚集在上皮细胞，一方面向其传递药物，另一方面，5-6微米以下的微球可打开肠壁上皮细胞间的紧密连接，使大分子物质能够透过上皮细胞顺利转运至体内。Peyer′s小结是人和动物小肠粘膜中由多个淋巴小结聚集形成的淋巴滤泡，约占整个肠道粘膜面积25％，特点是以非受体转运方式使淋巴因子和一些颗粒进入循环系统，是颗粒性物质的主要吸收途径。国内外研究表明壳聚糖作为口服和粘膜给药载体，在Peyer’s小肠处的吸附和被转运的效果远远优于聚乳酸等其它生物可降解性高分子。

作为药物载体，壳聚糖多以壳聚糖微球或微囊的形式使用。然而目前壳聚糖微球或微囊的制备方法非常有限，主要采用乳化交联法、喷雾干燥法和复凝聚法，而这些制备方法大多采用机械搅拌法，采用这种方法在制备乳液过程中，由于粒径不均一，小的乳滴会被大的乳滴吸收，同时大的乳滴又会因剪切力的作用而破坏，这会导致所制得的壳聚糖微球或微囊粒径很不均一。而且，由于乳滴的粒径不均一，在交联过程中小液滴容易被大液滴吸附，大液滴又容易被剪切成小液滴，从而会形成很多交联凝聚物。同时，在液滴的合并和破裂过程中，内包药物容易逃逸到液滴外面，导致药物的包埋率降低。即使在微球形成以后，由于小微球容易被大微球吸附，在产品的洗涤和干燥过程中也容易形成凝聚物。微球和微囊的不均一还会为壳聚糖及其衍生物微球或微囊的实际应用带来许多困难。例如，作为酶的固定化和蛋白质分离介质，由于粒径不均一，小的微球会在柱子中聚集到大微球之间的空隙中，使得分离压力增大，严重时会导致分离无法进行；作为细胞培养载体，粒径不均一会导致养分和细胞密度的不均匀，从而导致细胞生长的不均匀；作为药物缓释载体，由于乳液不稳定会导致药物的包埋率大大降低，另外由于微球或微囊粒径不均一，在系统给药中使药物的靶向性差，导致药物在体内的生物利用度大大降低。

为了克服传统制备方法所制备的壳聚糖微球粒径不均一和不可控的问题，本实验室发展了直接膜乳化法。由于微孔膜乳化法获得均一乳滴的基本条件是分散相与膜表面的界面张力足够大，因此，虽然采用小孔径的膜能够制备小粒径的粒径均一、可控的壳聚糖及其衍生物纳微球，但采用这种方法制备粒径较小的纳微球(如5微米以下)乳化速度非常慢，需要的乳化压力大，不适宜大规模制备小粒径的壳聚糖纳微球，而且采用这种方法很难制备400纳米以下的壳聚糖纳米球。由于直接膜乳化法方法制备的壳聚糖微球的粒径可控范围还不宽，有必要研究新型制备方法，制备出粒径均一、可控的小粒径的壳聚糖纳微球，以进一步拓展壳聚糖纳微球的应用范围。

发明内容

本发明的一个方面提供一种壳聚糖纳微球产品，其中该产品中的壳聚糖纳微球具有约几十纳米至约10微米之间的数均平均粒径和小于约20％的粒径分布系数，所述粒径分布系数按下式计算，

C.V.＝{[∑(d_i-d)²/N]^1/2/d}×100％

式中，C.V.代表粒径分布系数；d_i代表各个纳微球的直径；d代表数均平均粒径，d＝∑d_i/N；N代表用于计算粒径的纳微球的数量，且N≥200个。在本发明的中，壳聚糖纳微球的平均粒径为约100-500纳米，优选得到的壳聚糖纳微球粒径为150-350纳米。

在本发明一些实施方案中，可以用各种分子量的壳聚糖制造该壳聚糖纳微球产品，例如高分子量壳聚糖(分子量上百万)、中等分子量的壳聚糖(分子量几十万)、壳寡糖(分子量低于一万)。

在本发明的一些实施方案中，该壳聚糖纳微球产品还含有添加剂，所述添加剂选自电解质如NaCl、蛋白质如白蛋白、磷脂如卵磷脂、糖类如葡萄糖和甘露醇等。

本发明的另一方面提供所述壳聚糖纳微球产品的用途，例如用于蛋白质、多肽类药物载体、化学药物载体、基因载体和细胞培养的载体等用途。有关的例子如上述参考文献中所述，因此所有上述参考文献通过引用并入本文。

在本发明的一些实施方案中，所述壳聚糖纳微球产品中的壳聚糖纳微球分散于液体中，形成例如悬浮液。在另一些实施方案中，所述壳聚糖纳微球为粉末形式，例如经冻干形成的冻干粉。

本发明的壳聚糖纳微球的尺寸均一，纳微球在水溶液中分散性好，药物包埋率高，药物活性保持好。

本发明的另一方面提供一种制备壳聚糖纳微球产品的方法，其包括以下步骤：

(1)提供溶解了水溶性药物或分散了油溶性药物的壳聚糖醋酸水溶液作为水相W；

(2)提供含有油溶性乳化剂且与水互不相溶的油性物质作为油相O；

(3)将水相W与油相O混合得到W/O型预乳液；

(4)将所述预乳液在较高的压力下使其通过孔径均一的微孔膜得W/O型乳液；

(5)向W/O型乳液中加入一定的交联剂使乳滴交联固化得到壳聚糖纳微球。

步骤(5)中乳滴的交联固化优选在加热条件下进行，加热可以使乳滴迅速成型，避免乳滴之间的凝聚发生，同时可以大大改善最终纳微球的分散性；如果不加热，乳滴固化速度很慢，而且会有大量乳滴固化不上或固化得不好，从而会导致乳滴之间的凝并，使纳微球粒径均一性变差，而固化不好的纳微球之间则容易发生粘连，从而导致纳微球产品的分散性不好。

上述乳滴交联反应中的加热温度为30-50℃，优选的加热温度为35-45℃，交联反应时间为8-10小时。

步骤(4)中所述初乳液在压力作用下通过所述微孔膜，在约0.2MPa至约3.0MPa之间基本恒定的压力下通过所述微孔膜，优选为0.5-1.5MPa。

步骤(4)中所述乳液过膜次数可为多次，即通过同一微孔膜至少一次得到所述W/O型乳液，优选为3-5次。所述微孔膜的孔径为约0.5微米至约3微米，孔径分布跨距Span值为0.7以下。

步骤(4)中所述初乳液通过微孔膜的速度为0.5-15m³m^-2h^-1。

在本发明方法的一些实施方案中，该方法还任选地包括步骤(6)：洗涤和冻干步骤(5)中得到的壳聚糖纳微球。

在本发明方法的一些实施方案中，步骤(5)中得到的所述壳聚糖纳微球具有约几十纳米至约10微米之间的平均粒径和小于约20％的粒径分布系数。因此，本发明的方法特别适合制备本发明上述的壳聚糖纳微球产品。然而，应当理解的是本发明的方法也可以用于制备具有其它粒径和粒径分布的壳聚糖纳微球产品。

在本发明方法的一些实施方案中，所述孔径均一的微孔膜的平均孔径为约0.5微米至约20微米，其中平均孔径为体积平均孔径，定义如下：

d_v＝[(∑n_i d_i ³)/∑n_i]^1/3

上式中，d_v为体积平均孔径，d_i为各个微孔的直径，n_i为孔径为d_i的微孔的数目。

一般来说，壳聚糖纳微球的粒径与该微孔膜的孔径有关和操作压力有关，因此可以通过选择合适孔径的微孔膜和操作压力用于制备具有期望粒径的壳聚糖纳微球，其中微孔膜的孔径分布对壳聚糖纳微球的粒径分布的影响是孔径分布越窄所制备得到的壳聚糖纳微球的粒径分布越窄。在一些方案中，所述孔径均一的微孔膜的孔径分布跨距Span在0.7以下。孔径分布跨距Span值的定义如下式所见：

Span＝(d₉₀-d₁₀)/d₅₀

上式中，d₉₀、d₁₀和d₅₀分别表示所有孔径中有90％、10％、50％的孔其孔径小于该值所表示的孔径尺寸。孔径分布跨距(Span值)越小，孔径分布越窄，即孔径越均一。

在本发明方法的一些实施方案中，所述孔径均一的微孔膜为表面亲水或疏水的微孔膜。一般来说，当操作压力较大时，微孔膜的表面亲、疏水性对所制备得到的壳聚糖纳微球粒径和粒径均一性影响不大；当操作压力较小时，疏水性微孔膜较亲水性微孔膜所制备得到的壳聚糖纳微球粒径小且粒径均一性好。所述孔径均一的微孔膜的表面疏水性可以通过本领域中已知的方法改变。在一些方案中，所述孔径均一的微孔膜为经过化学修饰的表面疏水的玻璃微孔膜，例如经过化学修饰的表面疏水的SPG(Shirasu-porous glass)膜，25℃下该膜表面与纯水之间的接触角在100-140°之间。

在本发明方法的一些实施方案中，步骤(4)中所述预乳液通过至少一个，优选至少两个孔径均一的微孔膜以得到所述W/O型乳液。在另一些实施方案中，步骤(4)中所述预乳液通过同一孔径均一的微孔膜至少一次，优选至少两次以得到所述W/O型乳液。例如，所述预乳液可以连续或间歇地在相同压力条件下通过两个或更多个孔径均一的微孔膜，这些孔径均一的微孔膜具有相同或不同的孔径。或者，所述预乳液可以通过同一孔径均一的微孔膜两次或更多次，每次通过在相同或不同的压力条件下进行。通过选择具有合适孔径的微孔膜，将预乳液通过所述孔径均一的微孔膜一次或多次或者通过一个或多个微孔膜后，所得W/O型乳液中的水相液滴的粒径分布C.V.值会逐渐变小，直至小于20％，因此在步骤(5)中交联固化后即可得到本发明的平均粒径为约几十纳米至约10微米和C.V.值小于20％的壳聚糖纳微球产品。

在本发明方法的一些实施方案中，步骤(4)中所述初乳液是在压力作用下通过所述孔径均一的微孔膜的。在一些实施方案中，所述压力为基本恒定的压力，其与所用膜孔径、操作压力和水相中壳聚糖含量有关。例如所述基本恒定的压力可以为约0.5MPa至约3.0MPa。还例如以孔径为1.4微米的膜、壳聚糖的醋酸水溶液浓度为0.5％制备纳微球时，所用压力可以为0.95MPa；在65℃下，以孔径为5.7微米的膜、壳聚糖的醋酸水溶液浓度为0.5％制备纳微球时，所用压力可以为0.5MPa。在一些实施方案中，所述基本恒定的压力是指压力的波动不超过10％，优选不超过5％，更优选不超过1％。

在本发明方法的一些实施方案中，步骤(4)中所述预乳液通过孔径均一的微孔膜的速度与膜孔径、水相中壳聚糖分子量和含量、油水相比和压力有关。在一些实施方案中，该速度可以为约0.5MPa至约1.5MPa。例如以孔径为1.4微米的膜、壳聚糖分子量为50000Da、其醋酸水溶液浓度为0.5％、水油相体积比30∶1制备壳聚糖纳微球时，所用压力可以为0.95MPa，乳液生成速度可以为0.5m³m^-2h^-1，乳化过程在瞬间完成。

在本发明方法的一些实施方案中，步骤(5)中W/O型乳液中水相液滴可以通过加入化学交联剂如戊二醛饱和的甲苯溶液固化得到壳聚糖纳微球。在另一些实施方案中，所述水相液滴可以通过加入沉淀剂如三聚磷酸盐等、高分子胶凝剂如海藻酸盐、加热等方式使液滴固化得到壳聚糖纳微球。

在本发明方法的一些实施方案中，步骤(1)中所述水相溶液中的壳聚糖分子量为50000Da，所述壳聚糖的浓度范围可以为约0.05wt％至约5.0wt％。

在本发明方法的一些实施方案中，步骤(1)中所述溶液还含有添加剂，所述添加剂选自电解质、白蛋白、卵磷脂、葡萄糖、甘露醇等。

在本发明方法的一些实施方案中，步骤(2)中所述油性物质选自液体石蜡、石油醚、橄榄油、棉子油、豆油、葵花子油、其它烷类碳氢化合物。

在本发明方法的一些实施方案中，步骤(2)中所述油溶性乳化剂其亲水亲油平衡值HLB可以在3-6之间，具体的例子可以是失水山梨醇倍半油酸酯、甘油醚的聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、亲油-亲水嵌段共聚物，PO-500、PO-310。基于油相O的质量，油相中油溶性乳化剂的浓度为约0.5wt％至约10wt％。

在本发明方法的一些实施方案中，水相与油相的体积比在约1∶1至约1∶1000之间，例如1∶20至1∶60。

本发明的在另一方面提供一种用于生产上述壳聚糖纳微球产品的装置，如图2所示。

除非特别说明，在本发明中使用的术语具有以下含义。

在本发明中使用的术语“壳聚糖”是指现有技术中命名为“壳聚糖”(Chitosan)的产品，包括天然壳聚糖、改性壳聚糖及其衍生物。例如，从虾壳、蟹壳等海产品废弃物中提取的天然多糖，是由葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)共聚物组成的多糖，是甲壳素(Chitin)脱乙酰基的产物。

在本发明中使用的术语“壳聚糖纳微球”是指由壳聚糖乳滴通过固化形成的纳米至微米级的纳微球，可以具有实心、多孔、中空、中空多孔等结构。

在本发明中使用的术语“均匀乳液”或“均一乳液”是指粒径均一壳聚糖纳微球固化前的乳液。

在本发明中使用的术语“粒径”是指以激光粒度仪测得的微球的数均或体积平均粒径。粒径分布系数C.V.是由Zeta电位及粒度分析仪ZetaPlus(BrookhavenInstruments Cooperation，USA)测得的数据根据下式：

C.V.＝{[∑(d_i-d)2/N]1/2/d}×100％

计算得到的，其中N为用于计算粒径的纳微球的数量，且N≥200个，d_i为各个纳微球的直径，d为数均平均粒径。

在本发明中使用的术语“膜孔径”是指微孔膜的体积平均孔径。

附图说明

图1是制备壳聚糖纳微球的原理及流程示意图。

图2是制备用于形成壳聚糖纳微球的均一乳液的装置示意图。

图3是实施例1制备的壳聚糖纳微球的扫描电镜照片。

图4是比较例1制备的壳聚糖纳微球的扫描电镜照片。

图5是比较例2制备的壳聚糖纳微球的扫描电镜照片。

图6是比较例3制备的壳聚糖纳微球的扫描电镜照片。

图7是比较例1、比较例2、比较例3和实施例1制备的壳聚糖纳微球的粒径分布比较图。

图8是实施例2制备的壳聚糖纳微球的扫描电镜照片。

图9是实施例5制备的壳聚糖纳微球的扫描电镜照片。

图10是不同操作压力下制备的壳聚糖纳微球的平均粒径与操作压力之间的关系图。

图11是采用不同孔径的SPG膜制备的壳聚糖纳微球的平均粒径与SPG膜孔径之间的关系图。

具体实施方式

如果没有特别指明，本发明中所有浓度单位均为wt％。

下面对本发明进行更为详尽的描述。

总体上讲，本发明采用了快速膜乳化法制备出了粒径为几十纳米至约10微米的壳聚糖纳微球。

根据本发明的某些的实施方案，采用未经或经过化学修饰的表面亲水或疏水性的玻璃膜作为微孔膜，先将油水两相混合，通过均质乳化或者搅拌制得W/O的预乳液，之后在较高的压力下使预乳液快速通过微孔膜降低乳液中液滴的尺寸，经过反复几次膜乳化可以得到粒径均一的乳液，之后将乳液交联固化得到粒径均一的壳聚糖纳微球。

在一些实施方案中，采用这种新型的膜乳化法可以制备尺寸均一、粒径小于10微米的壳聚糖纳微球，而且纳微球的分散性很好。另外，除了能制备得到尺寸小于10微米、粒径均一的壳聚糖纳微球，还可以通过选择不同的膜孔径和操作压力控制所得纳微球的平均粒径。

在一些实施方案中，本发明的制备方法包括如下步骤：将一定量的壳聚糖溶解于1％的醋酸水溶液中，所得溶液作为水相；取一定量的油溶性乳化剂溶于与水不相溶的有机相中作为油相；将水相与油相迅速混合后，通过均质乳化或机械搅拌制备得到W/O型预乳液；在较高压力下将预乳液迅速压过经过或未经疏水处理的玻璃微孔膜得到粒径均一的W/O型乳液；为使粒径更均一可将每次得到的乳液作为预乳液，在较高压力下反复通过膜孔压出；向此乳液中加入一定量的交联剂或沉淀剂，或通过加热使乳滴固化，得到尺寸均一的壳聚糖纳微球。壳聚糖纳微球的粒径分布系数可以控制在20％以内，粒径可以在10微米以下或更大的范围内通过膜孔径和操作压力进行控制。

所述微孔膜可以是本身为亲水性的玻璃膜，或经过化学修饰后变成疏水性，膜孔径本身可以不发生变化。所使用的微孔膜孔径可以为0.5-5微米，更优选为1-3微米。所制备的纳微球的平均粒径可能与所用的膜孔径存在线性关系，可通过选择膜孔径来制备所需粒径的壳聚糖纳微球。

在本发明的一些实施方案中，乳化过程可以在不同的操作压力下进行。所使用的操作压力可以为0.5-3.0MPa，优选为0.7-1.5MPa。由于不同操作压力所制备的壳聚糖纳微球粒径不同，所制备的纳微球的平均粒径可能与操作压力存在某种线性关系，在膜孔径确定的情况下，可通过控制操作压力制备所需粒径的壳聚糖纳微球。

在本发明的一些实施方案中，所用压力和所制备的壳聚糖纳微球粒径与所用膜孔径、水相壳聚糖分子量和含量、油相种类或粘度、油水比有关。以孔径为5.2微米的膜、壳聚糖分子量为50000Da、壳聚糖含量为0.5％、油相为石油醚与液体石蜡的体积比为7∶5、油水相的体积比为30∶1为条件制备壳聚糖纳微球为例，所用压力可以为0.95MPa，所得壳聚糖纳微球粒径为200-300nm。

根据本发明方法制备的壳聚糖纳微球产品，可以用于化学药物、生物活性药物、DNA、菌类、细胞等的包埋载体，其中纳微球的尺寸在几十纳米至10微米可控，而且粒径均一、分散性好。该技术解决了传统乳化法难以制备粒径均一可控、传统膜乳化法难以制备小粒径壳聚糖纳微球的问题，在保证粒径均一的前提下能快速制备粒径小于10微米的壳聚糖纳微球。

本发明提供的琼脂糖凝胶微球及其制备方法还能够带来下列效果：

(1)本发明提供了一种尺寸均一、粒径可控的壳聚糖纳微球产品，此纳微球产品分散性好，可以可用于包埋化学药物、生物活性药物等，还可用制备用于作为活细胞、基因等载体。

(2)本发明提供了一种制备(1)中所述的壳聚糖纳微球产品的制备方法，即快速膜乳化法，该方法所制备的纳微球粒径从几百纳米至几微米可控，粒径均一性好，其粒径分布的C.V.值在20％以下，这种方法易于放大和规模化生产；这种方法除了可以制备壳聚糖纳微球外，还可以拓展到其它纳微球产品的制备，如聚乳酸纳微球、海藻酸盐纳微球等。

(3)本发明提供了壳聚糖纳微球的交联固化方式，即在加热条件下进行，这种交联固化方式使得最终得纳微球产品粒径均一性更好、分散性好。

(4)采用本发明的制备方法，能够很容易的制备出传统乳化法很难制备的小粒径(纳米级)的壳聚糖纳微球，从而可以进一步拓展壳聚糖纳微球的应用范围和途径。

(5)本发明所使用的试验设备简单，不需要使连续相流动的泵或搅拌装置，容易实现工艺的放大，而且制备工艺比较简单，操作易于控制，乳液的生成速率比较快，效率高。

实施例

下面，对本发明的壳聚糖纳微球的制备方法举例加以说明。但是，应当理解，这些举例说明仅仅是为了便于更好地理解本发明，而决非对本发明范围的限制。

在实施例中所用的“壳聚糖”分子量为50000Da；可用的“亲水性的微孔膜”或“疏水处理的微孔膜”是未经或经疏水修饰方法处理后的SPG玻璃膜(SPGTECHNOLOGY Co.，Ltd生产，型号为PJN06L)。例如，化学修饰的表面疏水微孔膜可经如下疏水处理得到：将亲水性的玻璃膜在纯净水中常温下超声30分钟，然后放入3％(V/V)的修饰剂KP-18(产地：日本)的水溶液中，之后减压(真空度为0.5MPa)超声2h，再在120℃下加热4h。可用的微孔膜还包括Ise Chemical Co.，Ltd(日本)生产的SPG(Shirasu-porous glass)膜。

壳聚糖纳微球的制备按图1所示的步骤制备，具体方法和步骤说明如下：

1)W/O型乳液的制备

将一定量的壳聚糖、NaCl以及其它添加剂加入到一定量的醋酸或柠檬酸等酸性水溶液中，并在磁力搅拌条件下充分溶解作为水相；将一种以上的油溶性乳化剂溶于油性液体作为油相。将水相与油相迅速混合后通过均质乳化、搅拌或超声等方法制备得到W/O型预乳液，在一定压力下迅速通过未经或经疏水处理的微孔膜得到粒径均一的W/O型乳液；该过程在图2所示的装置中完成。

壳聚糖的浓度可根据需要进行配制，通常情况下，其浓度为0.2wt％-2.0wt％，不同浓度的壳聚糖溶液所需的操作压力也不尽相同，其制备所得到的纳微球粒径也有所差别。水相添加剂可包括白蛋白、卵磷脂、葡萄糖、甘露醇等对人体无害的水溶性物质。油相为在常温下呈液体状且与水不互溶的油性物质，可使用液体石蜡和石油醚、橄榄油、棉子油、豆油、葵花子油、其它烷类碳氢化合物等，也可使用其混合物。一般所选择的油相沸点要比较高，挥发性弱较好。油性乳化剂可以溶解于所使用的油相，可使用失水山梨醇倍半油酸酯(Arlacel83)、甘油醚的聚合物(如PO-500、PO-310)、聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯(司班85)、失水山梨醇单油酸酯(司班80)、失水山梨醇三硬脂酸酯(司班65)、亲油-亲水嵌段共聚物等。油相中乳化剂的浓度为0.5-10wt％，水相与油相的体积比为1∶1-1∶1000。

2)壳聚糖纳微球的制备

向上述步骤1)所得到的乳液中加入交联剂或沉淀剂或采用加热的方式使乳滴固化，并进行洗涤、冻干，得到粒径均一的壳聚糖纳微球。

交联剂或沉淀剂的加入方式可以为缓慢滴加或迅速加入，交联剂或沉淀剂可以为水溶液也可以为油溶性溶液，交联剂或沉淀剂的溶液可以直接加入到上述步骤1)所得到的乳液中，也可以在与制备乳液相同的油相中超声制备成细乳液后加入到上述步骤1)所得到的乳液中，固化在室温或40℃以下进行，固化在磁力搅拌或机械搅拌下进行，搅拌速率可以为100-500rpm，例如300rpm；固化时间为1-10小时，例如3小时。

乳液滴固化后，将所得凝胶微球依次用石油醚、乙醇、蒸馏水等洗涤(用作细胞载体时不得用丙酮或乙醇洗涤)，并将所得壳聚糖纳微球冻干，低温保存；或不冻干直接将纳微球在常温或低温下保存于蒸馏水或细胞培养液中。

实施例1

将孔径为1.4微米的亲水性SPG玻璃膜置于液体石蜡与石油醚按体积比5∶7的混合油相中浸泡过夜或超声半小时使膜孔充分湿润。准确称取一定量的壳聚糖溶于1％醋酸水溶液中，磁力搅拌下使其充分溶解得到壳聚糖醋酸水溶液，其浓度为0.5wt％，将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清夜作为水相备用。将油溶性乳化剂PO-500加入到60ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为5∶7)中，其浓度为4wt％，搅拌至完全溶解作为油相。将2ml的上述壳聚糖醋酸水溶液与油相混合并用均质乳化器在三档(6000rpm)下乳化1分钟，形成预乳液。然后，将所得乳液迅速倒入如图2所示的膜乳化装置中，在0.95MPa的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的SPG微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为预乳液在0.95MPa的氮气压力下再次通过SPG微孔膜，反复乳化五次，最终得到粒径均一的W/O型；乳化完毕，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶液，其中戊二醛的用量依据如下比例计算得到，即戊二醛上的醛基与壳聚糖上氨基的摩尔比为2∶1，在加热条件下(35℃下)交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在10000rpm下离心，倾去上清夜将壳聚糖纳微球从油相中分离出来，依次用石油醚、丙酮、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用Zeta电位及粒度分析仪ZetaPlus测量，在水中微球的平均直径为360.0纳米，C.V.值为13.8％，扫描电镜照片如图3所示，结果表明所制备的壳聚糖纳微球粒径均一。

比较例1(机械搅拌法)

采用与实例1相同的配方，准确称取一定量的壳聚糖加入到一定量的1％醋酸水溶液中，使壳聚糖的浓度为0.5wt％，在磁力搅拌条件下使其充分溶解，将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清夜作为水相备用。将油溶性乳化剂PO-500加入到60ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为5∶7)中，浓度为4wt％，搅拌至完全溶解作为油相。将2ml的上述壳聚糖醋酸水溶液倒入到油相中，1000rpm下磁力搅拌30min，得到W/O型乳液；乳化完毕，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶液，其中戊二醛的用量依据如下比例计算得到，即戊二醛上的醛基与壳聚糖上氨基的摩尔比为2∶1，在35℃下交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在10000rpm下离心，倾去上清夜将壳聚糖纳微球从油相中分离出来，依次用石油醚、丙酮、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用Zeta电位及粒度分析仪ZetaPlus测量，在水中微球的平均直径为10.54微米，C.V.值为115.97％，所得微球的扫描电镜照片如图4所示，结果表明所制备得到的壳聚糖微球粒径很不均一。

比较例2(均质乳化法)

采用与实例1相同的配方，准确称取一定量的壳聚糖加入到一定量的1％醋酸水溶液中，使壳聚糖的浓度为0.5wt％，在磁力搅拌条件下使其充分溶解，将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清夜作为水相备用。将油溶性乳化剂PO-500加入到60ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为5∶7)中，浓度为4wt％，搅拌至完全溶解作为油相。将2ml的上述壳聚糖醋酸水溶液倒入到油相中，在6000rpm下均质乳化60秒，得到W/O型乳液；乳化完毕，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶液，其中戊二醛的用量依据如下比例计算得到，即戊二醛上的醛基与壳聚糖上氨基的摩尔比为2∶1，在35℃下交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在10000rpm下离心，倾去上清夜将壳聚糖纳微球从油相中分离出来，依次用石油醚、丙酮、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用Zeta电位及粒度分析仪ZetaPlus测量，在水中微球的平均直径为763.6纳米，C.V.值为65.34％，所得微球的扫描电镜照片如图5所示，结果表明所制备得到的壳聚糖微球粒径很不均一。

比较例3(超声法)

采用与实例1相同的配方，准确称取一定量的壳聚糖加入到一定量的1％醋酸水溶液中，使壳聚糖的浓度为0.5wt％，在磁力搅拌条件下使其充分溶解，将此溶液在2000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清夜作为水相备用。将油溶性乳化剂PO-500加入到60ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为5∶7)中，浓度为4wt％，搅拌至完全溶解作为油相。将2ml的上述壳聚糖醋酸水溶液倒入到油相中，在80W的功率下下超声乳化3min，得到W/O型乳液；乳化完毕，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶液，其中戊二醛的用量依据如下比例计算得到，即戊二醛上的醛基与壳聚糖上氨基的摩尔比为2∶1，在35℃下交联反应10小时，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在10000rpm下离心，倾去上清夜将壳聚糖纳微球从油相中分离出来，依次用石油醚、丙酮、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用Zeta电位及粒度分析仪ZetaPlus测量，(微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Masterrizer 2000E进行测量，)在水中微球的平均直径为550.9纳米，C.V.值为46.55％，所得微球的扫描电镜照片如图6所示，结果表明所制备得到的壳聚糖微球粒径很不均一。

将实施例1与比较例1、比较例2、比较例3所制备得壳聚糖纳微球进行粒径分布的比较，如图7所示，其中快速膜乳化法代表实施例1所得壳聚糖纳微球的粒径分布、机械搅拌法代表比较例1所得壳聚糖纳微球的粒径分布、均质乳化法代表比较例2所得壳聚糖纳微球的粒径分布、超声乳化法代表比较例3所得壳聚糖纳微球的粒径分布。可见，实施例1中的快速膜乳化法得到的微球粒径最均一。

实施例2

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是所用孔径为1.4微米的SPG膜经过疏水处理，乳滴的交联固化反应在加热条件下进行，加热的温度为45℃，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为350.0纳米，C.V.为14.18％，所得微球的扫描电镜照片如图8所示，结果表明所制备得到的壳聚糖微球粒径比较均一。

实施例3

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，所不同的是乳滴固化反应的交联时间为8小时，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为370.2纳米，C.V.为13.98％。

实施例4

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，所不同的是乳滴固化反应的交联时间为4小时，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为390.2纳米，C.V.为15.96％。

实施例5

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是交联反应在室温下进行，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为420纳米，C.V.为23.16％，所得的扫描电镜照片如图9所示，结果表明所制备得到的壳聚糖纳微球粒径均一性稍差。

实施例6

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是交联反应在室温下进行，所用的SPG膜孔径为2.8微米，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为520纳米，C.V.为28.16％，结果表明所制备得到的壳聚糖纳微球粒径均一性稍差。

实施例7

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是过膜次数为2次。所得壳聚糖纳微球的平均粒径为390.0纳米，C.V.为16.36％。

实施例8

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是过膜次数为3次。所得壳聚糖纳微球的平均粒径为370.0纳米，C.V.为15.20％。

实施例9

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是所用操作压力为0.85MPa。所得壳聚糖纳微球的平均粒径为370.0纳米，C.V.为14.22％。

实施例10

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是所用操作压力为0.65MPa。所得壳聚糖纳微球的平均粒径为398.5纳米，C.V.为15.66％。

实施例11

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是所用操作压力为0.50MPa。所得壳聚糖纳微球的平均粒径为459.4纳米，C.V.为16.88％。

实施例1、实施例9、实施例10和实施例11所制备的壳聚糖纳微球平均粒径与操作压力之间的关系如图10所示。由图上可以看出壳聚糖纳微球平均粒径与操作压力之间基本呈线性关系。

实施例12

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是所使用的SPG微孔膜的孔径为2.8微米，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为420.5纳米，C.V.值15.66％。

实施例13

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是所使用的SPG微孔膜的孔径为5.2微米，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为608.5纳米，C.V.值17.66％。

实施例14

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是所使用的SPG微孔膜的孔径为7.0微米，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为840纳米，C.V.值16.68％。

实施例15

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是所使用的SPG微孔膜的孔径为9.2微米，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为1180纳米，C.V.值17.28％。

实施例1、实施例10、实施例11、实施例12和实施例13所制备的壳聚糖纳微球平均粒径与SPG膜孔径之间的关系如图11所示。由图上可以看出壳聚糖纳微球平均粒径与SPG膜孔径之间基本呈线性关系。

实施例16

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是壳聚糖浓度为0.2wt％，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为340.5纳米，C.V.值15.22％。

实施例17

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是琼脂糖的浓度为1.0wt％。所得壳聚糖纳微球的平均粒径为520纳米，C.V.值为17.46％。

实施例18

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是油水相体积比为20∶1，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为400纳米，C.V.值为15.22％。

实施例19

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是油水相体积比为60∶1，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为320纳米，C.V.值为14.62％。

实施例20

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是作为油相的石油醚和液体石蜡之间的体积比1∶1，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为406纳米，C.V.值为16.62％。

实施例21

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，其中不同的是油相为纯石油醚，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为346纳米，C.V.值为15.72％。

实施例22

采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖纳微球，所不同的是水相中添加了多肽药物胰岛素，所得壳聚糖纳微球的平均粒径为375.50纳米，C.V.值为14.62％，药物包埋率为85％，药物活性保持为90％。

通过阅读本发明，本领域技术人员将想到本发明的许多改动和其它实施方案，并根据本发明教导预知其益处。因此，应当理解，以上实施方案和实施例并未限制本发明，并且对其进行的改动和其它的实施方案也包括在所附权利要求的范围内。虽然本文使用特定术语，但是它们仅仅以其一般的和描述性意义使用，并不是为了限制权利要求中定义的本发明的范围。

Claims (6)

1、一种尺寸均一、可控的壳聚糖纳微球产品及其制备方法，所制备得到的壳聚糖纳微球产品粒径为几十纳米至10微米，其粒径分布系数小于约20％，其中所述粒径分布系数按下式计算，

C.V.＝{[∑(d_i-d)²/N]^1/2/d}×100％

式中，C.V.代表粒径分布系数；d_i代表各个纳微球的直径；d代表纳微球的数均平均粒径，d＝∑d_i/N；N为用于计算粒径的纳微球数量，且N≥200个。

2、根据权利要求1的壳聚糖纳微球产品，其中壳聚糖纳微球的平均粒径优选为100-500纳米，更优选为150-350纳米。

3、根据权利要求1的壳聚糖纳微球产品，其中的壳聚糖包括不同分子量和脱乙酰度的壳聚糖及其衍生物产品。

4、根据权利要求1的壳聚糖纳微球产品的制备方法，包括如下具体步骤：

(1)提供溶解了水溶性药物或分散了油溶性药物的壳聚糖醋酸水溶液或水溶液作为水相；

(2)提供含有油溶性乳化剂且与水互不相溶的油性物质作为油相；

(3)将水相与油相混合得到W/O型预乳液；

(4)将所述预乳液在较高的压力下使其通过孔径均一的微孔膜得W/O型乳液；

(5)向W/O型乳液中加入一定的交联剂使乳滴交联固化得到壳聚糖纳微球。

5、根据权利要求4所述的方法，其中步骤(5)中的乳滴交联需要在加热条件下进行，交联反应时间为2-12小时，乳滴固化后得到壳聚糖纳微球。

6、根据权利要求1的壳聚糖纳微产品作为药物载体的用途。

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