CN103966119A

CN103966119A - 一株壳聚糖酶产生菌及其应用

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Publication number: CN103966119A
Application number: CN201410120173.7A
Authority: CN
Inventors: 邱乐泉; 吴石金; 钟卫鸿; 钟莉
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2014-08-06

Abstract

本发明提供了一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期：2014年3月19日，保藏编号：CCTCC No：M2014095。本发明经筛选诱变获得的一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41产生的壳聚糖酶为内切酶，酶解壳聚糖后不产生氨基葡萄糖，相比于化学水解方式，能在更短时间内获得壳寡糖，且无污染、条件温和，具有良好的应用前景。

Description

一株壳聚糖酶产生菌及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41，及其在微生物酶解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。

（二）背景技术

壳聚糖（Chitosan）为几丁质脱乙酰化后的产物，溶解性能较几丁质有很大提高，具有良好生物相容性。壳寡糖（Chito-oligosaccharide)一般是指2～10个聚合度的低糖，可通过壳聚糖水解制得，具有较低的分子量，呈水溶性，非常容易被人体吸收，作为一种功能性低聚糖，具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、调节人体免疫及抗癌等功效，在医药、食品等领域中具有广泛的应用前景。

目前制备壳寡糖的方法主要有化学降解法和酶解法，采用化学法降解寡糖得率低，产物分离困难，而且对环境污染严重。酶解法则具有反应条件温和，寡糖得率高，不造成环境污染等优点。壳聚糖水解酶主要有壳聚糖酶、N-乙酰葡萄糖胺酶以及非专一性水解酶等。壳聚糖酶是壳聚糖的专一性水解酶，能特异性将壳聚糖水解成聚合度为2～8的壳寡糖，是制备壳寡糖的主要研究方向。

壳聚糖具有广谱抗菌性，而且对人体无毒无副作用，不同分子量的壳聚糖的抗菌性能有所差异。如管云林等采用Staphylococcus aureus作为试验菌株，发现随壳聚糖的分子量降低抗菌性能增强，并由此提出了壳聚糖抗菌的两个模型。夏文水等采用Escherichia coli作为试验菌株，发现随分子量上升抑制菌效果逐渐下降，而且通过试验测定分子量为1500的壳寡糖抑菌效果最强。Keisuke U等报道平均分子量小于5000的壳聚糖对Staphylococcus aureus和Escherichia coli不仅没有抗菌作用，反而能促进细菌的生长，而分子量约9300的壳聚糖几乎可以完全抑制细菌生长。Yousook等报道分子量为4万的壳聚糖在浓度为0.5%时，对Staphylococcusaureus和Escherichia coli的杀灭率为90%，分子量为18万的壳聚糖在浓度为500ppm时，对Staphylococcus aureus和Escherichia coli的杀菌率几乎为100%。杨玉红曾报道相对分子质量分别为500、2100、3700、5200、9000的壳寡糖对Escherichia coli的抑制作用，发现相对分子质量2100的壳寡糖对大肠杆菌抗菌作用最强，其抑菌作用随壳寡糖质量浓度的增加而增强。

（三）发明内容

发明目的是提供经筛选诱变获得的一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41，及其在微生物酶解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期：2014年3月19日，保藏编号：CCTCC No：M2014095。

本发明筛选到一株产壳聚糖酶菌株，对该菌株进行紫外诱变育种，经补料发酵培养，壳聚糖酶产量最大达4.86U/ml，并研究了采用该菌株产生的壳聚糖酶制备壳寡糖的可能性，测定了壳聚糖不同酶解时间产物的平均聚合度和分子量，考察了壳寡糖对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的抗菌性能，为专一性酶促生产壳寡糖打下基础。

本发明还涉及所述的Mitsuaria sp.GD02-M41在微生物酶解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。

本发明的有益效果主要体现在：本发明经筛选诱变获得的一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41产生的壳聚糖酶为内切酶，酶解壳聚糖后不产生氨基葡萄糖，相比于化学水解方式，能在更短时间内获得壳寡糖，且无污染、条件温和，具有良好的应用前景。

（四）附图说明

图1为Mitsuaria sp.GD02的系统发育树；

图2为水解时间对壳寡糖完全水解的影响；

图3为发酵时间对壳寡糖完全水解的影响；

图4为HCl浓度对壳寡糖完全水解的影响；

图5为TLC薄层层析；1，7：氨基葡萄糖标准品；2：酶解5min；3：酶解10min；4：酶解20min；5：酶解30min；6：酶解60min；

图6为壳聚糖/壳寡糖对大肠杆菌生长的影响；

图7为壳聚糖/壳寡糖对酵母菌生长的影响；

图8为壳聚糖/壳寡糖对金黄色葡萄球菌生长的影响。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1.材料与方法

1.1试剂

壳聚糖（脱乙酰度90.14%，浙江玉环海洋生化有限公司）；盐酸氨基葡萄糖（分析纯，中国医药集团上海试剂公司）；3,5-二硝基水杨酸（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）；GF254硅胶板（青岛海洋化工厂）；其他试剂均为分析纯。

1.2培养基

壳聚糖液体培养基：壳聚糖10g/L，K₂HPO₄1.0g/L，(NH₄)₂SO₄2.0g/L，NaH₂PO₄2.0g/L，CaCl₂0.1g/L，MgSO₄0.5g/L，溶剂为水，pH6.0，110℃灭菌20min。

牛肉膏蛋白胨培养基：3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，溶剂为水，pH7.0～7.2，120℃灭菌20min。

胶体壳聚糖：1g壳聚糖中加入3mL的1mol/L HCl，加蒸馏水至100mL,调pH至6.5，配成1%的胶体壳聚糖。

1.3方法

1.3.1壳聚糖酶产生菌的筛选

取采自浙江玉环海洋生化有限公司的废弃虾壳堆积地的土样1g加入盛有10mL无菌水的试管中，摇匀后取0.2mL上清液加入到初筛平板中，涂布均匀，在37℃下培养四天。取出观察菌落的生长情况和透明圈大小，取生长良好以及生长圈较大的单菌落，接至胶体壳聚糖平板，培养3天后取出平板，测量各菌落直径（d）和其透明圈的直径（D），以D/d的比值作为菌株产壳聚糖酶能力的指标。将平板初筛所得的各菌株分别接至装100mL胶体壳聚糖液体培养基的250mL三角瓶中，30℃、150rpm培养48h后，取样测定发酵液的酶活力。结合平板筛选的结果，挑取酶活力最高的菌株，观察菌体形态并做进一步鉴定。

1.3.2壳聚糖酶活力的测定

将1%的壳聚糖溶液与适量酶液混合，在37℃下反应10min，沸水浴5min灭活，加入1mL0.25mol/L NaOH使未降解的壳聚糖沉淀，5000×g离心10min，去除沉淀，取上清液1mL于新试管中，加入1.5mL DNS和2mL蒸馏水摇匀，沸水浴反应5min取出冷却，测定OD540nm，以氨基葡萄糖为标准品，根据标准曲线计算还原糖含量。一个酶单位定义为在37℃，反应1min水解产生1umol还原糖所需的酶量。

1.3.3壳聚糖酶产生菌的诱变育种

将培养了48小时的菌液5000×g，4℃离心10min，用0.85%无菌生理盐水稀释浓度至108个/mL，采用紫外诱变（功率30W，照射距离为35cm）不同时间，将处理后的菌悬液适当稀释后，取上述悬液0.1mL涂布于固体培养基上，30℃避光培养3d，通过计算透明圈直径和菌落直径的比值，初筛出优良菌株。将初筛的优良菌株接种至壳聚糖液体培养基中进行复筛（30℃，200rpm，培养72h），检测发酵液中的壳聚糖酶的活性，选育出酶活性较高的菌株，作为第二轮筛选的出发菌株，第二轮诱变方法与第一轮相同。

1.3.4壳聚糖酶产生菌的补料液体发酵

将2L壳聚糖培养基到瑞士比欧KLF20002.5L发酵罐中110℃灭菌20min。将突变株M41进行摇瓶发酵48h后，将种子液加入发酵罐中，接种量10%，设定溶氧100%，转速105，并且转速和溶氧连动，空气流量100，温度30℃，发酵时间127h。在发酵72h时开始以1ml/min补料2%的壳聚糖。记录发酵数据，在不同时间取样测定酶活力、总糖及残糖。总糖包括发酵液中所有的糖，残糖主要为可被菌体直接利用的单糖，总糖含量采用盐酸酸解法测定，残糖含量采用DNS法测定。

1.3.5壳聚糖酶液的制备

将培养了48小时的菌液5000×g，4℃离心30min，去除沉淀，得到粗酶液，用硫酸铵以90%饱和度盐析，静置6小时后，4℃，20000×g离心30min。得到的沉淀用20mL0.02mol/l pH6.0PBS溶解，然后放入透析袋中用相同的PBS透析脱盐过夜，得到壳聚糖酶液，并测定其蛋白浓度和酶活力。

1.3.6壳聚糖酶解产物的制备

将10mg/mL的壳聚糖溶液与1U/mL壳聚糖酶液等体积混合，在37℃下反应，分别在5min，10min，20min，30min，60min取出反应液，分光光度法测定酶解后壳聚糖的分子量与聚合度。

1.3.7壳低聚糖的相对分子质量测定

取1mL酶解液用DNS法测定OD540nm，记为A0。另取反应液0.2mL，加入6mol/L HCL溶液3mL，置于沸水中反应2h，用适量的6mol/L NaOH溶液中和后，蒸馏水稀释至10mL。取稀释后的水解液3mL，与DNS反应，测得吸光度A₁，如果A₀与A₁处于标准曲线线性范围之内，则壳低聚糖的平均聚合度为：n=10A₁/A₀

由此可以计算出该壳低聚糖的平均相对分子质量为：M=(10A₁/A₀)*179-(10A₁/A₀-1)18。

式中，179为氨基葡萄糖单元的相对分子质量，18为水的相对分子质量。

1.3.8TLC薄层层析

准确吸取各时间段的反应液1uL以及1%的氨基葡萄糖标准品点于高效硅胶板GF254上(25cm*10cm)，距底端距离为1.5cm。置于预饱和好的层析缸中，上行法展开。展开时间为2小时，展距15cm。取出，用吹风机吹干，浸滞法显色。终点呈综红色。显色剂为：0.5%的茚三酮丙酮溶液，展层剂为：乙酸乙酯:甲醇:水:氨水=5:9:1:1.5。

1.3.9抑菌性能检测：

将酶解后获得的壳寡糖液旋转蒸发浓缩4倍，与2×牛肉膏培养基各取适量配制成壳寡糖终浓度分别为0.25%、0.5%、0.75%、1%的培养基，分别加入0.2mL的OD=1.5的大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），37℃，200rpm摇床培养24小时后，在OD660nm下测其吸光度，记录数据，以加入0.2mL无菌水的培养基为对照。

2结果与分析

2.1菌种鉴定

将初筛平板上透明圈明显的单菌落接入壳聚糖液体培养基进一步检测，其中菌株GD02的降解效果最优。该菌株在壳聚糖固体培养基平板上形成的菌落为圆形，淡黄色，菌落表面光滑。菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性，好氧，不产芽孢。菌株生理生化特性测定结果为：淀粉水解、接触酶实验等呈阳性，而柠檬酸盐利用，甲基红实验，V-P实验、吲哚实验等呈阴性。对该菌株DNA进行PCR扩增，采用细菌16S rDNA通用引物，扩增到1024bp的DNA片段，GenBank中登录号为KF986731。通过NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示该菌株与Mitsuaria属的序列同源性最高，采用MEGA4.1软件将该菌株的16S rDNA序列与Genbank中的若干个相关种的16S rDNA序列进行分析比对，以Rubrivivax gelatinosusIL144（NC017075.1）为外群构建系统发育树，结果如图1所示，该菌株与Mitsuaria sp.KN1（HQ231945.1）位于同一个系统发育的分支。结合该菌株形态特征、部分生理生化特征、16S rDNA序列分析及可产生壳聚糖酶的特性，与Mitsuaria属特征相符，故将该菌株命名为Mitsuariasp.GD02。

2.2Mitsuaria sp.GD02的紫外诱变育种

将菌悬液经紫外线分别照射不同后，30℃避光培养，72h，选取D/d值较大的8株菌用于摇瓶复筛，以出发菌株（M0）作对照，DNS法测定发酵液酶活，第一轮的筛选结果见表1。

表1：Mitsuaria sp.GD02的紫外诱变育种（第一轮）

*:M0为出发菌株；**：相对酶活力=突变株酶活力/出发株M0的酶活力

从第一轮中选出相对酶活较高的M1、M2、M4、M6菌株进行第二轮的诱变筛选，方法同第一轮，其结果见表2。

表2：Mitsuaria sp.GD02的紫外诱变育种（第二轮）

经两轮紫外诱变，得到菌株编号为M41的突变株，其酶活力比出发菌株增加2.89倍，产壳聚糖酶能力较强，可达3.16U/mL。

2.3突变株M41的补料液体发酵

突变株M41的补料液体发酵结果如图2所示。在发酵初期的25h中，酶活力快速升高，总糖下降，残糖出现先上升后下降，这是因为随着酶的产生，分解壳聚糖后残糖量增加，但随着菌体的生长，残糖不断被利用，因此随后出现下降。在72小时后达到最高值4.86U/ml，72h后开始以1ml/min补料2%的壳聚糖，虽然生物量有所上升，但补料并没有使得酶活力得到进一步升高，至发酵结束，发酵液中仍有约20umol/ml的壳聚糖没有被利用，说明补加2%的壳聚糖并没有对发酵起到很大影响。相比于摇瓶发酵，在补料液体发酵中，突变株M41的壳聚糖酶产生量有所上升，最大达到4.86U/ml。

2.4壳寡糖的酶解制备及其平均聚合度、相对分子量的测定

将10mg/mL的壳聚糖溶液与1U/mL突变株M41的壳聚糖酶液等体积混合，在37℃下反应，分别在5min，10min，20min，30min，60min取出反应液，即为壳寡糖液。参考文献中低聚糖的平均聚合度及相对分子量的分光光度测定法，并在其基础上，并进行了改进，测定壳聚糖的不同时间酶解产物的平均聚合度及相对分子量。

2.4.1壳寡糖完全水解时间的确定

在盐酸浓度确定的情况下，水解过程需要一定的时间，才能达到完全水解的程度。0.3mL1%的壳聚糖5min酶解产物在6mol/L盐酸中沸水浴，以确定完全水解所需的时间，结果如见图3所示。90min后，OD值平稳，水解趋于完全，考虑到各低聚糖样品相对分子质量的差异，对完全水解所需的时间会有所不同，本试验方法采用120min的水解时间，以使各样品均完全水解。

2.4.2HCl浓度对壳寡糖完全水解的影响

由于需对壳寡糖进行完全水解，以释放其还原端，而盐酸浓度对水解的完全程度有较大的影响。将0.3mL1%的壳聚糖5min酶解产物置于不同浓度盐酸中沸水浴2h，用适量的6mol/L NaOH溶液中和后，DNS法测定各水解液的OD_540nm，结果如见图4所示。结果表明，盐酸浓度大于6mol/L后，吸光度达到最大值，说明水解趋于完全。但盐酸浓度过高时，吸光度反而有所下降，这可能是由于水解液酸度过高对后续DNS显色反应所需的碱性介质有一定的影响或者是由于酸度过高，水解过程副反应增多。

2.4.3壳聚糖酶解产物中还原糖含量的测定

将分别酶解5min、10min、20min、30min、60min后制备的壳寡糖液，DNS法测定OD_540nm即为A₀，然后用6mol/L盐酸对其进行沸水浴2h完全水解，DNS法测定其OD_540nm即为A₁，将数据导入平均聚合度公式：n=10A₁/A₀，及相对分子量计算公式：M=(10A₁/A₀)*179-(10A₁/A₀-1)1，就可得到反应相应时间后反应液的平均聚合度和相对分子量。结果如表3所示。Mitsuaria sp.GD02所产壳聚糖酶在水解壳聚糖10min后，平均聚合度即为9.9，水解1h后平均聚合度即为6.8，说明该菌株所产壳聚糖酶能较快的制备壳寡糖，且平均聚合度较为理想，具有较好的应用前景。

表3：壳聚糖酶解产物的平均聚合度及相对分子量

2.4.4TLC薄层层析分析壳聚糖的降解情况

TLC薄层层析结果如图5所示。随着酶解时间的增加，壳聚糖分子量下降，低聚糖含量明显上升，各酶解时间的产物均未出现氨基葡萄糖，

说明该壳聚糖酶为内切酶，但由于未加入不同聚合度低聚糖的标准品，故难以确定酶解产物中主要由哪些聚合度的低聚糖组成。

2.4.5不同浓度壳聚糖/壳寡糖对大肠杆菌的抑制效果

不同浓度壳聚糖/壳寡糖对大肠杆菌的抑制效果如图6所示。在浓度为0.25%的时候，仅有20min酶解产物对大肠杆菌产生抑制效果，而其他的酶解产物并没有表现出对大肠杆菌有抑制性。在0.5%浓度时，10min和20min的酶解产物表现出很好的抑制性，比壳聚糖的抑制效果明显，在浓度达到1％的时候，三者的抑制效果均达到完全抑制。5min酶解产物的抑制效果最差。

2.4.6不同浓度壳聚糖/壳寡糖对酿酒酵母的抑制效果

不同浓度壳聚糖/壳寡糖对酿酒酵母的抑制效果如图7所示。20min酶解产物在浓度为0.25%时就表现出明显的抑制效果，从0.5％开始就几乎可以完全抑制酿酒酵母的生长。而对于10min酶解产物，在浓度为0.25%时几乎不表现对酿酒酵母的抑制性，当浓度达到和超过0.5%时，表现出明显的抑制效果。同样以5min酶解产物的抑制效果最差。

2.4.7不同浓度壳聚糖/壳寡糖对金黄色葡萄球菌的抑制效果

不同浓度壳聚糖/壳寡糖对酿酒酵母的抑制效果如图8所示。在0.25%的浓度下，所有的酶解产物及壳聚糖都很难对金黄色葡萄球菌产生明显抑制效果，当浓度上升到0.5%时，10min和20min的酶解产物表现出较强的抑制效果，随着浓度的增加，抑制效果越明显。将壳聚糖/壳寡糖对酿酒酵母、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果进行比较，发现抑制效果表现出酿酒酵母>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌。夏文水等曾采用Escherichia coli作为试验菌株，发现随分子量上升抑制菌效果逐渐下降，而且通过试验测定分子量为1500的壳寡糖抑菌效果最强。而Keisuke U等的报道则认为平均分子量小于5000的壳聚糖对Staphylococcus aureus和Escherichia coli不仅没有抗菌作用，反而能促进细菌的生长；本发明的结果表明20min的酶解产物（平均聚合度为8.8，分子量约为1434.5Da）表现出的抑制效果最好，与夏文水研究结果相似。

3.结论

本发明从采自浙江玉环的土样中分离到一株壳聚糖酶产生菌，经形态学，部分生理生化和16SrDNA序列分析，发现该菌株与Mitsuaria属特征相符，将其命名为Mitsuaria sp.GD02。

采用紫外诱变法对Mitsuaria sp.GD02进行2轮诱变育种，得到Mitsuaria sp.GD02-M41的突变株（将其进行保藏，保藏编号为CCTCCNo：M2014095），发酵液酶活力比出发菌株增加2.89倍，产壳聚糖酶能力较强，可达3.16U/mL；将该突变株进行补料液体发酵，其壳聚糖酶产生量进一步上升，最大达到4.86U/ml。

将1U/mL Mitsuaria sp.GD02-M41（CCTCC No：M2014095）壳聚糖酶与10mg/mL的壳聚糖溶液等体积混合进行酶解10min后，可获得平均聚合度10以内的壳寡糖，酶解60min后，平均聚合度为6.8，TLC薄层层析分析表明，该壳聚糖酶为内切酶，酶解壳聚糖后不产生氨基葡萄糖，相比于化学水解方式，能在更短时间内获得壳寡糖，且无污染、条件温和，具有良好的应用前景。

检测不同浓度壳聚糖/壳寡糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酿酒酵母的抑菌性能，发现其抑制效果为酿酒酵母>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌，且0.75%的酶解20min的产物（即平均聚合度为8.8，分子量约为1434.5Da的壳寡糖）的可完全抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酿酒酵母的生长。

Claims

1.一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期：2014年3月19日，保藏编号：CCTCC No：M2014095。

2.如权利要求1所述的Mitsuaria sp.GD02-M41在微生物酶解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。