CN105647833A - 一株解淀粉芽孢杆菌的筛选及其在刺参养殖上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及功能微生物筛选及应用技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌的筛选及其在刺参养殖上的应用。本发明的一株解淀粉芽孢杆菌，于2015年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；请求保藏人：鲁东大学；保藏编号为CCTCC？NO：M2015774，该菌命名为解淀粉芽孢杆菌<i>Bacillus？amyloliquefaciens？</i>ZYTC1-1。本发明解淀粉芽孢杆菌筛选自健康刺参肠道，该菌株具有较强的产蛋白酶和淀粉酶能力，能够提高刺参肠道中淀粉酶活力，促进刺参的生长，提高刺参的免疫力和抗病力，可广泛应用于刺参的养殖及水产饲料领域。
Description
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选及应用技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌的筛选及其在刺参养殖上的应用。
背景技术
随着国内外刺参需求量的增加及水产品贸易的国际化发展，近年来，刺参养殖业发展突飞猛进。但是，高密度养殖及不规范操作所导致的养殖环境恶化、疾病的发生给刺参养殖业带来了巨大的经济损失。传统防治疾病的方法主要是使用抗生素，抗生素使用易产生耐药性菌株问题，且存在动物体内残留问题，危害食品安全，因此寻找抗生素替代品成为必然。
益生菌作为外源的添加剂可以参与动物体内的微生物平衡，直接通过增强动物对肠内有害微生物群落的抑制作用，或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，进而间接起到促进动物生长的作用，提高动物饲料的转化率。因此，近些年对于益生菌的筛选尤其是养殖动物土著菌的筛选成为本领域内的研究热点，也对水产饲料配方的改进具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株新型解淀粉芽孢杆菌及其在刺参养殖上的应用。所述解淀粉芽孢杆菌筛选自健康刺参肠道，该菌株具有较强的产蛋白酶和淀粉酶能力，能够提高刺参肠道中淀粉酶活力，促进刺参的生长，提高刺参的免疫力和抗病力，可广泛应用于刺参的养殖及水产饲料领域。
本发明一方面提供了一株解淀粉芽孢杆菌，于2015年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；请求保藏人：鲁东大学；保藏编号为CCTCC NO：M2015774，该菌命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens ZYTC1-1。
本发明另一方面提供了上述解淀粉芽孢杆菌在刺参养殖中的应用。具体为：当刺参苗变态为稚参后，摄食能力进一步加强，每斤刺参在2000-4000头时，在鼠尾藻粉中以109CFU/g的添加量投喂上述解淀粉芽孢杆菌，连续投喂一个月。
本发明筛选到的解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1，具有较强的产蛋白酶和淀粉酶的能力，促进刺参生长，降低刺参病害发生的几率。所述解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1可作为益生菌应用于刺参的养殖生产过程中，有效提高刺参肠道中淀粉酶活力，对刺参的生长具有显著的促进作用，还可以有效提高刺参的免疫力及对灿烂弧菌的抵抗能力。与对照组相比，添加109 CFU/g解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1的益生菌组中刺参的终末平均体重、特定生长率、淀粉酶活性、吞噬活性、超氧化物歧化酶活性、总抗氧化力活性和一氧化氮合酶活性分别提高了17.72%、17.77%、81.34%、41.99%、8.47%、61.70%及54.21%，而累积死亡率下降了25%；取得了显著的技术效果。
附图说明
图1：本发明一株解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1的菌落形态。
解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1，已于2015年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015774。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员了解本发明。
实施例1
菌株的分离、筛选、鉴定及安全性验证
1、样品
采集于烟台市莱州刺参养殖场的健康刺参的肠道。
2、培养基：
1)芽孢杆菌分离培养基：葡萄糖10g，磷酸钙5g，硫酸铵0.5g，氯化钾0.2g，七水硫酸镁0.1g，硫酸锰0.0001g，硫酸亚铁0.0001g，酵母提取物0.5g，蒸馏水1000ml，pH6.8-7.2，琼脂20g，121˚C灭菌30min。
2)改良的TSB培养基：胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）30g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH7.4-7.6，配制固体培养基加入15-20g的琼脂，121˚C灭菌20min。
3)淀粉水解培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000ml， pH7.2-7.4，配制固体培养基加入15-20g的琼脂，115 ˚C 灭菌 20min。
4)酪素水解双层平板培养基： (1)溶液A：蛋白胨10g、酵母膏3g、琼脂10g、陈海水
1000ml；(2)溶液B：酪蛋白10g、蒸馏水250ml；(3)溶液C：琼脂10g、蒸馏水250ml。在碱性条件下溶解酪蛋白，配制溶液B时，滴加NaOH溶液使酪蛋白刚好全部溶解。分别将三种溶液灭菌(121˚C，20min)，待其都冷却到50˚C左右，先将 B液和C液混合，倒入平板形成一薄层，待薄层凝固后将A液倒入，制成双层平板。
3、筛选方法
健康刺参从养殖场采集后，加冰运输至实验室，无菌条件下解剖获得刺参肠道，肠道称重后，加入9倍体积的无菌生理盐水，用匀浆器在冰上进行研磨，充分研磨后进行10倍梯度稀释，接种芽孢杆菌分离培养基，28˚C培养24h-48h。选取均匀清晰的单菌落，在改良的TSB培养基上划线纯化。纯化后的细菌，用改良的TSB液体培养基扩大培养，用甘油生理盐水-80˚C保存。单菌落依次命名为ZYTC1-1、ZYTC1-2、ZYTC1-3、……、ZYTC1-9。
将单菌落过夜培养16-18h，分别点种于淀粉水解培养基和酪素水解双层平板培养基上，每种菌点种3个重复，28˚C恒温培养，48 h形成明显菌落后观察透明圈的大小；淀粉水解培养基需滴加卢戈氏碘液。具体结果如表1所示。
表1 潜在益生菌株产酶能力
注：1表示不产生蛋白酶或者淀粉酶，1-2表示产酶能力一般，>2表示产酶能力较强。
从表1的数据可以看出，本发明筛选到的9株芽孢杆菌中菌株ZYTC1-1产蛋白酶和淀粉酶的能力最强。
4、菌株鉴定
1）菌落形态特征：将上述菌株ZYTC1-1重新划线培养，其单菌落呈现为扁平状、圆形、土黄色、边缘锯齿状，革兰氏染色阳性。
2）提取上述菌株ZYTC1-1的基因组DNA，利用PCR技术扩增16S rDNA序列，通过测序获得ZYTC1-1的16S rDNA序列，具体序列见附件序列表的核苷酸序列，将该菌株的16S rDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号GenBank NO. KU588858。通过BLAST比对分析，其与已公布的多株解淀粉芽孢杆菌的16S rDNA序列相似度高达99%，鉴定证实菌株ZYTC1-1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），与生化鉴定结果一致。
3）将上述菌株ZYTC1-1命名为解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1（Bacillusamyloliquefaciens ZYTC1-1），已于2015年12月24日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015774。
5、安全性验证
益生菌的筛选应以安全性为出发点，因此安全性检验是益生菌筛选中必不可少的环节，小规模的浸浴实验是判断潜在益生菌对养殖动物幼体安全性的常用方法。使用平均体重为0.2g的刺参，经过2周暂养后，分为两组，一组为对照组不添加潜在益生菌，一组为实验验证组，水体中添加107 CFU/ml 的上述菌株ZYTC1-1，每组设3个平行，每个平行放刺参30头，期间投喂鼠尾藻粉，24h换水一次，换水后重新添加菌液，浸浴实验进行7d，7d后统计各处理组刺参的存活率。结果表明在107 CFU/ml菌液的浸浴下，刺参并没有出现患病和死亡，表明上述潜在益生菌菌株ZYTC1-1对刺参幼体是安全的。
实施例2
解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1对刺参稚参生长、免疫及抗病力的影响
实验设对照组和益生菌添加组，每组分别设三个平行。每个平行放刺参35头（初始体重0.2106±0.001 g）。对照组投喂鼠尾藻粉；益生菌添加组在鼠尾藻粉中按109 CFU/g添加上述解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1进行投喂。养殖实验在室内静水养殖系统开展，每天傍晚投喂一次，每天换水50%，养殖周期为30天。期间海水的盐度在27-30 ppt，pH7.8-8.1，温度19-23˚C，连续充氧保证溶氧充足。
养殖实验结束后，对每个平行的所有刺参进行计数并称重，以此求出每个平行所有刺参的平均终末体重，并计算出特定生长率。每个平行中随机取10头刺参，无菌条件下用手术刀解剖刺参腹部获取体腔液和刺参肠道，获取的体腔液加入等体积的抗凝剂，取一部分抗凝体腔液用于体腔细胞计数及吞噬活性测定；另一部分抗凝体腔液离心收集体腔细胞沉淀（4000rpm，10 min，4 ˚C），获取的细胞沉淀加入生理盐水重悬，超声波破碎后，离心（4000rpm，10 min，4 ˚C），所得上清液为体腔细胞破碎上清液(CLS)，上清液用于超氧化物歧化酶、总抗氧化力及一氧化氮合酶活性的测定。获取的刺参肠道称重后，加入9倍体积的生理盐水，用匀浆器在冰上进行研磨，研磨得到的混合液体，离心（4000rpm，10 min，4 ˚C）得到的上清用于肠道淀粉酶活性、胰蛋白酶活性和脂肪酶活性的测定，并在24h内测定完毕。取样完毕后，每个平行随机取20头刺参，以灿烂弧菌为病原菌，进行浸浴攻毒，浸浴攻毒进行7天，统计累积死亡率。
表2 解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1对刺参生长、消化酶活性及免疫抗病力的影响
注：表中数据表示平均值±标准误，不同的字母表示差异显著（P＜0.05）。
从表2可以看出，与对照组相比，添加了上述解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1的益生菌组中刺参的终末平均体重、特定生长率、淀粉酶活性、吞噬活性、超氧化物歧化酶活性、总抗氧化力活性和一氧化氮合酶活性分别提高了17.72%、17.77%、81.34%、41.99%、8.47%、61.70%及54.21%，而累积死亡率下降了25%，从而说明本发明所述解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1显著提高了刺参肠道淀粉酶活力，对刺参的生长有显著的促进作用，可以有效提高刺参的免疫力及对灿烂弧菌的抵抗能力，因此可以作为益生菌广泛应用于刺参稚参的养殖生产过程中。
序列表
<110>鲁东大学
<120>一株解淀粉芽孢杆菌的筛选及其在刺参养殖上的应用
<210> 1
<211> 1446
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）
<400> 1
cggggcggtc tatcatgcaa gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg 60
gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 120
cggggctaat accggatggt tgtctgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg 180
ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 240
ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc 300
cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag 360
caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca 420
agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta 480
cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540
agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt 600
cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg 660
aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga 720
cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780
aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta 840
agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt 960
gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt 1020
gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080
ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc 1140
ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200
ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg 1260
ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg 1320
cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380
cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaacctttt aggagccagc cgccgaagtg 1440
acaaca 1446
Claims (6)
1.一株解淀粉芽孢杆菌ZYTC1-1，该菌种于2015年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为：CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015774，命名为Bacillusamyloliquefaciens ZYTC1-1。
2.按照权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens ZYTC1-1，其16S rDNA序列见附件序列表的序列。
3.按照权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
1）、制备培养基
制备芽孢杆菌分离培养基、制备改良的TSB培养基、制备淀粉水解培养基、制备酪素水解双层平板培养基；
2）、筛选
健康刺参从养殖场采集后，加冰运输至实验室，无菌条件下解剖获得刺参肠道，肠道称重后，加入9倍体积的无菌生理盐水，用匀浆器在冰上进行研磨，充分研磨后进行10倍梯度稀释，接种芽孢杆菌分离培养基，28˚C培养24h-48h，选取均匀清晰的单菌落，在改良的TSB培养基上划线纯化，纯化后的细菌，用改良的TSB培养基扩大培养，用甘油生理盐水-80˚C保存形成但菌落，将单菌落过夜培养16-18h，分别点种于淀粉水解培养基和酪素水解双层平板培养基上，每种菌点种3个重复，28˚C恒温培养，48 h形成明显菌落。
4.按照权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于
所述芽孢杆菌分离培养基：葡萄糖10g，磷酸钙5g，硫酸铵0.5g，氯化钾0.2g，七水硫酸镁0.1g，硫酸锰0.0001g，硫酸亚铁0.0001g，酵母提取物0.5g，蒸馏水1000ml，pH6.8-7.2，琼脂20g，121˚C灭菌30min；
所述改良的TSB培养基：胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）30g，氯化钠10g，蒸馏1000ml，
pH7.4-7.6，配制固体培养基加入15-20g的琼脂，121˚C灭菌20min；
所述淀粉水解培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000ml，
pH7.2-7.4，配制固体培养基加入15-20g的琼脂，115 ˚C 灭菌 20min；
所述酪素水解双层平板培养基：
溶液A：蛋白胨10g、酵母膏3g、琼脂10g、陈海水1000ml；
溶液B：酪蛋白10g、蒸馏水250ml；
溶液C：琼脂10g、蒸馏水250ml；
在碱性条件下溶解酪蛋白，配制溶液B时，滴加NaOH溶液使酪蛋白刚好全部溶解；分别将三种溶液灭菌(121˚C，20min)，待其都冷却到50˚C左右，先将 B液和C液混合，倒入平板形成一薄层，待薄层凝固后将A液倒入，制成双层平板。
5.按照权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于所述解淀粉芽孢杆菌作为益生菌应用于刺参的养殖生产过程中。
6.按照权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于所述解淀粉芽孢杆菌作为益生菌应用于刺参的养殖生产过程中的具体操作步骤为：当刺参苗变态为稚参后，摄食能力进一步加强，每斤刺参在2000-4000头时，在鼠尾藻粉中以109CFU/g的添加量投喂上述解淀粉芽孢杆菌，并连续投喂一个月。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Screening of a Bacillus amyloliquefaciens and its application in Stichopus japonicus culture Effective date of registration: 20211216 Granted publication date: 20190723 Pledgee: Yantai financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: LUDONG University Registration number: Y2021980015152 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20220317 Granted publication date: 20190723 Pledgee: Yantai financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: LUDONG University Registration number: Y2021980015152 |