CN109797117A - 一种产多酶的双菌制剂的制备及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
一种产多酶的双菌制剂，是由解淀粉芽孢杆菌GUHP‑86与解淀粉芽孢杆菌GZU03制得的，制备方法包括(1)种子液培养基配制和灭菌；(2)配制单一制剂；(3)配制产多酶的双菌制剂。产多酶双菌制剂的应用方法是将烟叶置于密封袋内，分别吸取两种单一制剂用于烟叶，控制产多酶的双菌制剂总体积，又取有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，于培养箱内进行培养，每天定时换气，且当湿度降低时须补加有糖盐溶液。本发明的产多酶的双菌制剂，在烟草发酵过程中能够提高纳豆激酶、蛋白酶和淀粉酶活性，从而提高烟叶品质，不仅大大提高口含烟食用价值，同时还可以强化发酵过程。本发明方法适用于对口含烟品质的改善。
Description
技术领域
本发明涉及微生物，也涉及烟草，进一步来说，涉及由两种杆菌制成的制剂在烟草加工的应用方法。
背景技术
口含烟(Snus)是一种含有尼古丁的无烟烟草制品，由磨成粉末的烟草再加盐和水混合而成，有时也会加入香料，如香柠檬油、玫瑰油或甘草。口含烟是烟的一种重要补充形式，通常放置在唇部和牙龈之间消费,或者放入口中咀嚼使用。袋装口含烟一般是由晾烟或明火烤烟经过粉碎、热处理和包装加工而成的一种潮湿的烟粉或烟丝状烟草制品,使用时含在唇龈之间。
口含烟原料是应响口含烟品质的主要因素。口含烟原料具有刺激性大、青杂气重和香味不协调等缺点。改善口含烟质量可通过微生物发酵。通过微生物发酵，可改善口含烟原料刺激性、香味不协调等缺点，得到香气质更好的口含烟产品。通过微生物代谢，消耗烟草本身蛋白质、纤维素及淀粉等不良成分，同时，微生物代谢过程中往往会产生功效性成分，如产生多种酶，有些酶本身对提高烟叶的香气有帮助，如蛋白酶可以水解烟叶中的蛋白质，水解产物和进一步转化的产物可以产生烟草致香物质；有些酶是对人体健康有益的酶，如淀粉酶对消化系统起着很重要的作用。因此接种合适的功能菌，产生一些功能活性酶，提高烟叶的香气量等品质，使杂气、刺激性下降，具有更好的食用舒适性。
目前将微生物用于口含烟的专利技术仅有ZL2016103176476号《适用于口含烟的烟丝的制备方法及应用》，该技术将合理配方的烟叶组经科学合理的微生物发酵降解烟草中的部分大分子物质，有效降低烟丝苦涩味和辛辣味，并具有柔和与协调的感官特性，所用的菌种为红曲霉(Monascus purpureus Went.)、鲁氏毛霉(Mucor roxianus)或根霉(Rhizopus)或乳酸菌(Lactobacillus)的一种或几种。迄今为止，尚无将解淀粉芽孢杆菌用于烟草提质增香的专利申请件。
发明内容
本发明旨在提供一种产多酶的双菌制剂的制备方法，将两种解淀粉芽孢杆菌分别制成可以用于烟草提质增香的制剂。
本发明的又一目的是提供上述制剂的应用方法，使其在口含烟品质改善方面得到实际应用。
发明人提供的产多酶的双菌制剂，是由解淀粉芽孢杆菌GUHP-86与解淀粉芽孢杆菌GZU03制得的混合制剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)种子液培养基配制和灭菌
按下面配方配制培养基：胰蛋白胨1.25g/L、酵母提取物0.625g/L、NaCl 6.25g/L、葡萄糖0.625g/L、水1000g；配好后按三角瓶容量的20％分别装入三角瓶，用121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却后分别接入所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86和GZU03于37℃、180r/min下进行培养18h±2h，得到种子液；
(2)配制单一制剂
将所得种子液于2℃～5℃、7000～9000r/min下离心10～20min,收集沉淀并用无菌生理盐水洗涤所述沉淀，然后向所属沉淀加入等量的无菌生理盐水,摇匀，分别得到解淀粉芽孢杆菌GUHP-86和解淀粉芽孢杆菌GZU03的单一制剂；
(3)配制产多酶的双菌制剂
在使用时分别将两种解淀粉芽孢杆菌单一制剂按照(4～0)∶(0～4)的体积比例取用，得到产多酶的双菌制剂；
所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86已于2016年1月4日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2016003；所述解淀粉芽孢杆菌GZU03已于2018年1月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2018762；保藏单位地址是中国武汉，武汉大学，其邮编为430072，电话号码为027-68754952。
发明人提供的上述制剂的应用方法，是称取20g烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，分别吸取两种解淀粉芽孢杆菌的菌液用于烟叶，控制菌液总体积4ml，又取4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，于37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时须补加有糖盐溶液。
上述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl2 5g、KCl 0.5g、CaCl2 0.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
上述培养箱内进行培养的时间为3～15天。
本发明的产多酶的双菌制剂，在烟草发酵过程中能够提高纳豆激酶、蛋白酶和淀粉酶活性，从而提高烟叶品质，不仅大大提高口含烟食用价值，同时还可以强化发酵过程。本发明方法适用于对口含烟品质的改善。
附图说明
图1为发酵烟叶中蛋白酶活力测定标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但不是对本发明的限制，基于本发明教导所做的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例为解淀粉芽孢杆菌GUHP-86和GZU03产多酶的双菌制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)种子液培养基配制和灭菌，按下面配方配培养基胰蛋白胨1.25g/L、酵母提取物0.625g/L、NaCl 6.25g/L、葡萄糖0.625g/L，配好后按三角瓶容量的20％分装入三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却后分别接入所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86和GZU03于37℃、180r/min下进行培养18h±2h，得到种子液；
(2)将所述一定量的种子液于4℃、8000r/min下离心15min,收集沉淀并用无菌生理盐水洗涤所述沉淀，然后向所属沉淀加入等量的无菌生理盐水，摇匀，分别得到所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86和GZU03的单一制剂；
(3)在使用时分别将两种解淀粉芽孢杆菌单一制剂按照(4～0)∶(0～4)的体积比例取用，得到产多酶的双菌制剂。
实施例2
本实施例中称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取GZU03 1mL和GUHP-86 3ml所述解淀粉芽孢杆菌制剂于烟叶，4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到样品1。
所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl2 5g、KCl 0.5g、CaCl2 0.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL无菌生理盐水、4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到对比样1。
将样品1和对比样1同时在37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
请10余位本领域感官测评人员对发酵烟叶样品进行感官评定。评吸方法为将口含烟直接置于上唇与上排牙齿之间，每次放入唇内的烟丝颗粒质量为0.2g，标准使用时间定为10min。对烟叶发酵样品的入口口感、香味、劲头、释放均匀性各15分，刺激性、顺应性(口含烟食用时间未达标准使用时间被吐出视为顺应性差)、滋味、余味各10分，总分100分，进行评价。
实施例3
本实施例中称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取GZU03 2mL和GUHP-86 2ml所述解淀粉芽孢杆菌制剂于烟叶，4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到样品2。
所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl2 5g、KCl 0.5g、CaCl2 0.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL无菌生理盐水、4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到对比样2。
将样品2和对比样2同时在37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
感官评定步骤如下：请10余位本领域感官测评人员对发酵烟叶样品进行感官评定。评吸方法同实施例2。
实施例4
本实施例中称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取GZU03 3mL和GUHP-86 1ml所述解淀粉芽孢杆菌制剂于烟叶，吸取4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到样品3。
所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl2 5g、KCl 0.5g、CaCl2 0.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL无菌生理盐水、4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到对比样3。
将样品3和对比样3同时在37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
感官评定步骤如下：请10余位本领域感官测评人员对发酵烟叶样品进行感官评定。评吸方法同实施例2。
实施例5
本实施例中称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86制剂(即20％接种量)于烟叶，4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到样品4。
所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl2 5g、KCl 0.5g、CaCl2 0.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟叶置于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL无菌生理盐水、4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到对比样4。
将样品4和对比样4同时在37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
感官评定步骤如下：请10余位本领域感官测评人员对发酵烟叶样品进行感官评定。评吸方法同实施例2。
实施例6
本实施例中称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL所述解淀粉芽孢杆菌GZU03制剂(即20％接种量)于烟叶，4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到样品5。
所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl2 5g、KCl 0.5g、CaCl2 0.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
称取20g经121℃、5min巴氏杀菌的烟叶于14cm×20cm规格的密封袋内，吸取4mL无菌生理盐水、4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，得到对比样5。
将样品5和对比样5同时在37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时补加一定有糖盐溶液。
感官评定步骤如下：请10余位本领域感官测评人员对发酵烟叶样品进行感官评定。评吸方法同实施例2。
实施例2-6中不同样品在发酵过程中的感官评价分值见表1。
表1不同样品在发酵过程中的感官评价分值
由表1中结果可知，本发明的解淀粉芽孢杆菌GUHP-86和GZU03制剂可以强化烟草的发酵过程。经实施例2中的解淀粉芽孢杆菌GUHP-86和GZU03制剂处理后的烟叶发酵15天后，对烟叶的感官评价较普通烟叶增加了25％，即本发明的解淀粉芽孢杆菌GUHP-86和GZU03制剂具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，提升了烟叶品质。同时，接种量为20％时，感官评价评分最高，发酵效果最好，对烟叶的改善更大，得到的发酵烟品质更好。
实施例7
将实施例2-6中的样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、发酵对比样经发酵15天后的发酵烟叶命名为发酵样品1、发酵样品2、发酵样品3、发酵样品4、发酵样品5、发酵对比样，分别测定发酵样品1、发酵样品2、发酵样品3、发酵样品4、发酵样品5、发酵对比样中纳豆激酶活性。
粗酶液提取：称取发酵样品1g，精确至0.0002g。用25mL磷酸缓冲溶液浸提24h，然后用慢速定性滤纸过滤，滤液待用。
向试管中加入1.4mLTris-HCl(50mmol/L，pH7.8)缓冲液和0.4mL纤维蛋白原溶液(7.2mg/mL)，37℃温育5min后加入0.1mL凝血酶(20U/mL)，再37℃温育10min形成人工血栓，加入0.1mL样品粗酶液，37℃温育60min，加入2mL三氯乙酸(0.2moL/L)溶液静置20min终止反应，13000r/min离心10min，取上清液于275nm波长处测定吸光度。酶活定义：每1分钟275nm处吸光度增加0.01所需要的酶量定义为1个单位的纤维蛋白降解酶活力(FU)。
不同发酵样品纳豆激酶活力测定结果见表2。
表2不同发酵样品纳豆激酶活力测定结果
实施例8
将实施例3中的样品2、对比样2经发酵15天后的发酵烟叶命名为发酵样品2、发酵对比样2，分别测定发酵样品2和发酵对比样2中蛋白酶活性。
粗酶液提取：称取发酵样品1g，精确至0.0002g。然后用25mL磷酸缓冲溶液浸提24h，然后用慢速定性滤纸过滤，滤液待用。
采用福林-酚试剂法测定酶活性。首先制备酪氨酸标准曲线(图1)，然后取样品粗酶液1.00mL，置于40±0.2℃恒温水浴中，预热2min，加酪蛋白溶液1.00mL，摇匀，40±0.2℃恒温水浴中，反应10min，加三氯乙酸溶液2.00mL，摇匀，取出静止10min，用慢速定性滤纸过滤。取滤液1.00mL，加碳酸钠溶液5.00mL、福林试剂使用液1.00mL，置于40±0.2℃恒温水浴中，显色20min。于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。同时做空白对照，唯一不同是在加酪蛋白之前先加入三氯乙酸使酶失活。以发酵对比样进行调零，测得蛋白酶酶活为54.45U/g，表明GUHP-86能产生较高酶活的蛋白酶。
实施例9
将实施例3中的样品2、对比样2经发酵15天后的发酵烟叶命名为发酵样品2、发酵对比样2，分别测定发酵样品2和发酵对比样2中是否产淀粉酶。
对加有可溶性淀粉的LB平板进行打孔，然后接入水提取发酵样品2所得的提取液，碘染后发现有透明圈，表明其产淀粉酶。
对加有可溶性淀粉的LB平板进行打孔，然后接入水提取发酵对比样2得的提取液，碘染后未发现明显的变化，表明其基本不产淀粉酶。
Claims (4)
1.一种产多酶的双菌制剂，其特征在于它是由解淀粉芽孢杆菌GUHP-86与解淀粉芽孢杆菌GZU03制得的，其制备方法包括以下步骤：
(1)种子液培养基配制和灭菌
按下面配方配制培养基：胰蛋白胨1.25g/L、酵母提取物0.625g/L、NaCl 6.25g/L、葡萄糖0.625g/L、水1000g；配好后按三角瓶容量的20％分别装入三角瓶，用121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却后分别接入所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86和GZU03于37℃、180r/min下进行培养18h±2h，得到种子液；
(2)配制单一制剂
将所得种子液于2℃～5℃、7000～9000r/min下离心10～20min,收集沉淀并用无菌生理盐水洗涤所述沉淀，然后向所属沉淀加入等量的无菌生理盐水,摇匀，分别得到解淀粉芽孢杆菌GUHP-86和解淀粉芽孢杆菌GZU03的单一制剂；
(3)配制产多酶的双菌制剂
在使用时分别将两种解淀粉芽孢杆菌单一制剂按照(4～0)∶(0～4)的体积比例取用，得到产多酶的双菌制剂；
所述解淀粉芽孢杆菌GUHP-86已于2016年1月4日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2016003；所述解淀粉芽孢杆菌GZU03已于2018年1月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2018762；保藏单位地址是中国武汉，武汉大学，其邮编为430072，电话号码为027-68754952。
2.如权利要求1所述产多酶双菌制剂的应用方法，其特征在于该方法是称取20g烟叶置于14cm×20cm规格的密封袋内，分别吸取两种单一制剂用于烟叶，控制产多酶的双菌制剂总体积4m l，又取4mL有糖盐溶液于烟叶中，充分混匀，于37℃培养箱内进行培养，每天定时进行换气，且当湿度降低时须补加有糖盐溶液。
3.如权利要求2所述产多酶双菌制剂的应用方法，其特征在于所述有糖盐溶液制备步骤如下：称取MgCl2 5g、KCl 0.5g、CaCl2 0.5g、NaCl 0.5g、葡萄糖2g，补水至1000mL，溶解，得到有糖盐溶液。
4.如权利要求2所述产多酶双菌制剂的应用方法，其特征在于所述培养箱内进行培养的时间为3～15天。
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