CN106755017A - 一种纳豆激酶的转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物育种技术领域，具体而言，涉及一种纳豆激酶(nattokinase)的转基因方法。本发明的主要内容为利用转基因种子(比如黄豆)或者植株(比如黄瓜)来表达纳豆激酶。利用此方法可以大规模生产纳豆激酶，得到的转基因植株可以直接食用。

Description

一种纳豆激酶的转基因方法

技术领域

本发明涉及植物育种技术领域，具体而言，涉及一种纳豆激酶的转基因方法。

背景技术

纳豆激酶(nattokinase简称NK)是从日本食品中纳豆提取和纯化的酶(EC3.4.21.62)。在中国得到豆豉当中也含有纳豆激酶。Nattō是从发酵大豆制成的，通过将细菌纳豆芽孢杆菌加入到煮沸的大豆中通过发酵产生。并且作为传统食品已经安全使用了几千年。纳豆激酶由作用于大豆的细菌产生。尽管其名称为激酶，但纳豆激酶不是激酶，而是枯草杆菌蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶。它表现出很强的纤维蛋白溶解活性【1】。

纳豆激酶由于其存在于食物当中，可以由胃肠道吸收。纳豆激酶的体外、体内溶栓性，以及动物和临床试验已经证明其具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。在体内作用迅速、持续时间长，还能激活体内的tPA，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性【1】。口服纳豆激酶胶囊可以可以预防心血管疾病，中风，以及老年痴呆。在一个病例中，每天连续服用阿司匹林和400mg的纳豆激酶连续7天以预防中风的患者出现急性脑出血【2】。目前纳豆激酶在亚洲，欧洲，以及美洲都可以买到。

纳豆激酶由aprN基因编，其首先从枯草芽孢杆菌纳豆中克隆并由Nakamura等人测序(1992)【3】。全长多肽含有29个残基的信号肽，其有助于蛋白质从细胞膜分泌出来，77个残基的前肽，在蛋白质折叠过程中作为分子内伴侣起关键作用。成熟的纳豆激酶由275个氨基酸按照固定排列方式组成，分子量是27kDa。纳豆提取的纳豆激酶被认为是安全，溶栓强，低成本，预防治疗心脏和心血管疾病，帮助血液循环系统的最佳膳食补充剂。传统的纳豆发酵过程简单直接，可以在家里做。将煮熟的大豆用纳豆芽孢杆菌接种并在室温下孵育一天进行发酵，直到豆用粘性和粘性物质谷氨酸聚合物覆盖。纳豆工业生产是优化发酵条件，包括最佳温度，pH和调节发酵时间，以增加NK产量。纳豆可以在pH 6～12下保持活性，耐高达60℃的高温，它在60℃以上失去活性【1】。目前市售的NK产品在室温下保持活性至少6个月。

目前，纳豆在日本以外的地方均以胶囊形式被消费。与简单的发酵过程相比，从纳豆浆中提取和纯化纳豆是复杂且低效的。更多的操作单位涉及有机溶剂均化，盐析，蛋白质离子交换和透析等，这些冗长的过程减少纳豆产量以及降低其活性，最终产品中过量的副产物也可能导致过敏。为了增加纳豆的产量和简化其下游纯化过程，越来越多的科研人员利用基因工程重组技术来生产纳豆激酶。大肠杆菌(Escherichia coli)的最简单和最便宜的宿主系统已被广泛用于重组纳豆激酶的生产。虽然纳豆激酶可以在大肠杆菌中表达，但是大量的重组蛋白聚集在一起，导致产生不溶性，无活性包涵体【4】。大多数蛋白质在包涵体溶解和再折叠期间损失，而且重组纳豆激酶的纤维蛋白溶解活性远低于从纳豆分离的NK。枯草芽孢杆菌是另一种有吸引力的表达宿主，因为它具有产生分泌蛋白的能力。Wu等人(2011)改变纳豆激酶(PaprN)启动子的-10元素(TACAAT)为共识-10区(TATAAT)，成功增强纳豆激酶在重组枯草芽孢杆菌(643mg/L)中的表达【5】。然而，枯草芽孢杆菌本身产生大量天然蛋白酶，可以水解重组蛋白。真核表达系统也已经应用于纳豆激酶的产生。Li等(2007)修改了杆状病毒表达系统，在昆虫细胞中表达可溶性，具有高度活性的纳豆激酶【6】。然而，使用昆虫细胞生产纳豆激酶成本太高，不具有实用性。相比较于大肠杆菌系统，酵母能够对重组担保进行翻译后修饰，并具有折叠重组蛋白的机制。巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)具有在发酵培养中生长高密度和产生大量重组蛋白的优点。Luo等人(2003)【7】报道在巴斯德毕赤酵母中表达纳豆激酶并检测纤维蛋白溶解活性。但是因为巴斯德毕赤酵母需要利用甲醇来诱导表达，残留的甲醇对人体非常有害。所以利用酵母表达纳豆激酶没有继续研究。

利用植物系统生产重组人类药物蛋白质已成为一个有吸引力的替代品，并已研究了30多年。然而，各种困难，如低产量，限制生物安全法规，花粉污染和下游加工，阻碍了其实际应用。由于生物信息学，蛋白质组学和基因组学的快速发展正在铺平利用植物生产药用蛋白从实验室到工业应用的途径。2012年5月，胡萝卜衍生的重组taliglucerase alfa(商品名：ELELYSO^TM)成为FDA批准的治疗戈谢病的第一个植物重组酶。真正吸引科学家注意的是2014年埃博拉病毒流行病。埃博拉病毒致死约为50％，在此期间造成11,000人死亡。当时没有有效的治疗方法可以治疗埃博拉病毒，除了Zmapp，一种烟草里面提取的转基因药用抗体。Zmapp给药后7名埃博拉患者恢复100％。因此，Zmapp被FDA于2015年9月授予快速临床试验。鉴于这些成功，研究人员大力研究使用植物作为人类药物的工厂。目前，许多植物来源的重组治疗性蛋白质在临床试验下，并且几个已经得到FDA批准【8】。

利用植物系统生产重组人类药物蛋白质的一个非常有利的方面是，初期研究不需要大量的财政投资来进行。植物可以在温室中生长或在实验室中生长。相对于大肠杆菌，酵母或哺乳动物细胞表达系统，植物维持成本低，并且用于制备重组蛋白的来源(植物叶或种子)是潜在无限的。植物表达系统在生产速度，成本和安全性方面具有超过原核和其它真核细胞系统的几个主要优点。植物可以正确地折叠和装配复杂蛋白质，例如分泌抗体，生产免疫球蛋白。植物还具有翻译后修饰的能力。同时，植物当中不存在侵染人类的动物病原体(朊病毒，病毒和支原体)，因此提高了安全性。一般来说，利用植物系统生产重组人类药物蛋白质及其衍生产品的成本仅为利用哺乳动物细胞培养系统的0.1％和微生物系统的2％～10％【8】。

纳豆激酶可以通过消化道进入循环系统，所以本研究利用转基因大豆和黄瓜植物来生产纳豆激酶。在大豆中，重组蛋白产量可达到总溶解蛋白的4％【9】。大豆是重组纳豆激酶生产的理想平台，因为天然纳豆激酶由发酵大豆产生。可以大规模的从大豆中纯化提取纳豆激酶。而且大豆制剂，例如豆浆，粉末或面粉，已经生产成为婴儿食品，使用后几乎没有副作用。使用大豆制剂技术用于纳豆激酶的应用，省略了从转基因大豆种子中纯化重组纳豆激酶的步骤，大大节省了开支。利用转基因黄瓜来表达纳豆激酶是可以食用纳豆激酶是理想的产品，因为食用省略了纯化和储存纳豆激酶的繁琐和复杂的过程。而且因为黄瓜本身是食品，其植物可以在当地生长，从而抵消长距离运输和储存的成本。食用含有纳豆激酶的黄瓜安全性高，因为一般来说，引起植物疾病的病原体不会感染人类，而且黄瓜可以保持纳豆激酶的活性。其植物细胞壁可以保护纳豆激酶存在于消化系统中很长一段时间不被降解，从而有利于进入循环系统【10】。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种修饰过的纳豆激酶基因，并提供配套的表达系统，以在特定植物中表达纳豆激酶。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

描写独权的技术方案。

一段分离的DNA片段，用于表达纳豆激酶，其序列为SEQ ID NO：1所示。

Natto(aprN)基因序列是根据Genbank Sequence ID:KJ174339.1.在基因的3’端分别加上6×His tag(组氨酸标签)，KDEL(内质网滞留信号)。

一种载体，其包含如上所述的DNA片段。

优选的，如上所述的载体，所述载体为pUC57。

优选的，如上所述的载体，其通过下列步骤构建得到：

a)、将SEQ ID NO：2所示的菜豆种子特异性启动子phas连入pCambia3300的EcoRI/SacI位点，得到pPhas；

b)、以如上所述的载体为模板扩增出纳豆激酶基因以及6×His片段，连接入pPhas的SacI/BamHI位点，得到pPhas-aprN；

c)、将胭脂碱合酶终止子nosT片段连接入pPhas-Natto的BamHI/PstI位点即得。

优选的，如上所述的载体，其通过下列步骤构建得到：

a)、将SEQ ID NO：3所示的番茄果实特异性启动子LA22CD07连入pCambia2200的SacI/KpnI位点，得到pLA22CD07；

b)、以如上所述的载体为模板扩增出纳豆激酶基因以及6×His片段，连接入pLA22CD07的KpnI/BamHI位点，得到pLA22CD07-aprN；

c)、将胭脂碱合酶终止子nosT片段连接入pLA22CD07-aprN的BamHI/PstI位点即得。

一种宿主细胞，其被如上所述的载体所转化；

优选的，所述宿主细胞为农杆菌。

一种转基因方法，用于将纳豆激酶基因转入目的植物，包括：

1)、将如上所述的载体通过宿主细胞介导导入目的植物的细胞；

2)、生出转基因植物；

3)、选择出转基因植物；

4)、可选的，增殖步骤3)获得的植物以获得后代。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于农杆菌的转化技术。农杆菌可包含质粒和本发明提供的DNA片段，所述质粒和DNA片段在用农杆菌转染后被转移至植物的植株或种子，而DNA片段被整合进植物细胞的基因组中。本发明的核苷酸序列尤其适用于双子叶的植物细胞，更优选的为葫芦科植物或豆科植物，但不排除在其它物种中也具有表达纳豆激酶的作用。

优选的，如上所述的转基因方法，所述目的植物为黄瓜或大豆。

纳豆激酶可以通过消化道进入循环系统，所以本研究利用转基因大豆和黄瓜植物来生产纳豆激酶。在大豆中，重组蛋白产量可达到总溶解蛋白的4％【9】。大豆是重组纳豆激酶生产的理想平台，因为天然纳豆激酶由发酵大豆产生。可以大规模的从大豆中纯化提取纳豆激酶。而且大豆制剂，例如豆浆，粉末或面粉，已经生产成为婴儿食品，使用后几乎没有副作用。使用大豆制剂技术用于纳豆激酶的应用，省略了从转基因大豆种子中纯化重组纳豆激酶的步骤，大大节省了开支。利用转基因黄瓜来表达纳豆激酶是可以食用纳豆激酶是理想的产品，因为食用省略了纯化和储存纳豆激酶的繁琐和复杂的过程。而且因为黄瓜本身是食品，其植物可以在当地生长，从而抵消长距离运输和储存的成本。食用含有纳豆激酶的黄瓜安全性高，因为一般来说，引起植物疾病的病原体不会感染人类，而且黄瓜可以保持纳豆激酶的活性。其植物细胞壁可以保护纳豆激酶存在于消化系统中很长一段时间不被降解，从而有利于进入循环系统【10】。

如上所述转基因方法制备得到的转基因植株。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为黄豆种子特异性表达纳豆激酶载体pCAM-phas-aprN构建流程；

3’T：烟草花椰菜花叶病毒35S终止子；bar：除草剂草丁膦基因：35S’：烟草花椰菜花叶病毒35S启动子；phas：菜豆种子特异性启动子；aprN：纳豆激酶基因；6×His：组氨酸标记；nosT(nopaline synthase terminator)：胭脂碱合酶终止子；RB和LB分别是植物DNA的左右边界；

图2为黄瓜表达纳豆激酶载体pCAM-LA22CD07-aprN构建流程；

3’T：烟草花椰菜花叶病毒35S终止子；NptII(Neomycinphosphotransferase IIGene)：霉素磷酸转移酶II基因：35S’：烟草花椰菜花叶病毒35S启动子；LA22CD07：西红柿果实特异性启动子；aprN：纳豆激酶基因；6×His：组氨酸标记；nosT(nopaline synthaseterminator)：胭脂碱合酶终止子；RB和LB分别是植物DNA的左右边界；

图3为利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯化的重组纳豆激酶实验结果图；1:蛋白分子量标准；2：纯化转基因纳豆激酶黄豆蛋白(5μg)；3：纯化转基因纳豆激酶黄瓜(5μg)；4：非转基因大豆蛋白(5μg)；5：非转基因黄瓜蛋白(5μg)；

图4为植物中提取的重组纳豆激酶溶血纤维平板实验结果图；1：非转基因大豆提取液蛋白50μg；2：非转基因黄瓜提取液蛋白50μg；3：转基因纳豆激酶黄豆蛋白提取液50μg；4：转基因纳豆激酶黄瓜蛋白提取液50μg；5：标准纳豆激酶50μg；

图5为植物中提取的重组纳豆激酶溶血实验结果图；1：非转基因大豆提取液蛋白50μL；2：非转基因黄瓜提取液蛋白50μL；3：转基因纳豆激酶黄豆蛋白提取液50μL；4：转基因纳豆激酶黄瓜蛋白提取液50μL；5：标准纳豆激酶50μL。

具体实施方式

本发明以pUC57-Natto质粒为模板，将编码纳豆激酶aprN(全长)基因用PCR方法扩增出来，然后克隆到植物载体系统中。利用豇豆启动子(Phas)将纳豆激酶定位在大豆种子中表达。利用果实特异性启动子(LA22CD07)激活纳豆激酶在后期成熟的黄瓜中表达。黄豆的抗性基因为Bar，可以抗除草剂。黄瓜的抗性基因为nptII，对卡那霉素具有抗性。构建好的植物表达载体用限制性内切酶酶切来鉴定其正确性。

除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。

为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。

在描述本发明的化合物、组合物、蛋白质、肽等以及方法之前，应当理解，这些实施方式不限于所描述的特定方法、方案以及试剂，这是因为它们可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方式目的，并且不旨在限制本实施方式或权利要求的范围。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例

Natto(aprN)基因序列是根据Genbank Sequence ID:KJ174339.1.在基因的3’端分别加上6×His tag(组氨酸标签)，KDEL(内质网滞留信号)，该序列如SEQ ID NO：1所示。再在基因的5’端加上KpnI酶切位点，在基因的3’端分别加上SacI、PacI和BamHI酶切位点。整个序列经过人工合成(Genscript，Piscataway，NJ 08854，USA)联入克隆载体pUC57(http://www.genscript.com/)的EcoRV酶切位点中，我们命名为pUC57-Natto。

黄豆种子表达纳豆激酶载体(pCAM-phas-aprN)构建过程(图1)。

1.以菜豆(Phaseolus vulgaris)总DNA为模板，利用菜豆种子特异性启动子(phas)引物：

Phas F:5’-gcc GAATTC ATTGTACTCCCAGTATCATTAT-3’

(划线为添加的酶切位点EcoRI)

Phas R:5’-gcc GAGCTC AGTAGAGTAGTAGTACTCTGGATG-3’

(下划线为添加的酶切位点SacI)

扩增出的片段经序列测定后，双酶切(EcoRI/SacI)片段连接入pCambia3300(购自Cambia，Australia)的EcoRI/SacI位点，生成pPhas。

2.以pUC57-Natto DNA为模板，利用纳豆激酶基因引物：

PhasNat F:5’-gcc GAGCTC ATGAGAAGCAAAAAATTGTGGA-3’

(下划线为添加的酶切位点SacI)

PhasNat R:5’-gcc-GGATCC TCATAGCTCATCTTTATGGTGG-3’

(下划线为添加的酶切位点BamHI)

扩增纳豆激酶以及6×His片段，连接人pPhas的SacI/BamHI位点，得到pPhas-aprN。

3.以pCambia1301载体DNA(购自Cambia，Australia)为模板，利用胭脂碱合酶终止子nosT的引物：

NosT F:5’-gccGGATCC CGTTCAAACATTTGGCAATA-3’

(下划线为添加的酶切位点BamHI)

NosT R:5’-gccCTGCAG CTGCAGCCCGATCTAGTAACATAGATGA-3’

(下划线为添加的酶切位点PstI)

扩增出nosT片段，扩增出的片段经序列测定后，双酶切连接入pPhas-Natto的BamHI/PstI位点，得到黄豆种子特异性表达纳豆激酶载体pCAM-phas-aprN。

黄瓜表达纳豆激酶载体(pCAM-LA22CD07-aprN)构建过程(图2)。

1.以番茄(Lycopersicon esculentum)总DNA为模板，利用番茄果实特异性启动子(LA22CD07)引物：

LA22CD07F:5’-gcc-GAGCTC CGTGCGTTGCACGTTTATCT-3’

(下划线为添加的酶切位点SacI)

LA22CD07R:5’-gcc-GGTACCTAATGGAAGAAATCAAGCT-3’

(下划线为添加的酶切位点KpnI)

扩增出的片段经序列测定后连接入pCambia2200(购自Cambia，Australia)的SacI/KpnI位点，生成pLA22CD07。

2.以pUC57-Natto DNA为模板，利用纳豆激酶基因引物:

PhasNat F:5’-gcc-GGTACC ATGAGAAGCAAAAAATTGTGGA-3’

(下划线为添加的酶切位点KpnI)

PhasNat R:5’-gcc-GGATCC TCATAGCTCATCTTTATGGTGG-3’

(下划线为添加的酶切位点BamI)

扩增纳豆激酶以及6×His片段，连接人pLA22CD07的KpnI/BamHI位点，得到pLA22CD07-aprN。

3.利用胭脂碱合酶终止子nosT的引物扩增的nosT片段(见上)连接入pLA22CD07-aprN的BamHI/PstI位点，得到黄瓜表达纳豆激酶载体，pCAM-LA22CD07-aprN。

将表达载体利用电击方法导入农杆菌(A.tumefaciens)EHA101菌株。

将构建好的植物表达载体pCAM-phas-aprN和pCAM-LA22CD07-aprN利用电击方法分别导入农杆菌(A.tumefaciens)EHA105菌株中。农杆菌制备步骤：

1.从-80℃冰箱中取出EHA101以及LBA4404感受态细胞，置于冰上解冻；

2.将40μl解冻的EHA101和LBA4404感受态细胞转移至0.1CM的电极杯中，一起置于冰上预冷.

3.取1μl纯化后的质粒加入0.1CM的电极杯中，与感受态细胞混匀。

4.打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1kV。

5.擦干电极杯，放入电转仪。按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入250μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

6.28℃，220rpm复苏1小时。

7.取50μl转化产物涂板(LB平板含有卡那霉素kanamycin 50mg/L和利福平rifampicin 25mg/L)，放于28℃培养过夜，2～3天后查看转化结果，挑单菌落培养。

利用农杆菌介导转化方法分别将含有纳豆激酶基因(aprN)的植物表达载体转入双子叶植物黄豆【11】和黄瓜当中【12】。通过公开发表的方法【11，12】，分别得到25株具有卡那霉素抗性的黄瓜植株和抗除草剂(草丁膦)的大豆植株。通过CTAB的方法提取植物基因组总DNA。利用地高辛标记的纳豆激酶基因基因探针DNA杂交技术(Southern Blot)确定得到T0代转基因大豆和黄瓜植物。T0植株在温室里面分别培养6个月(黄瓜)和8个月(大豆)后，得到黄瓜果实和黄豆种子。

根据Conlone(2007)【13】发表的蛋白提纯的方法，分别从黄瓜果实和黄豆种子中提取出总可溶性蛋白。使用Ni-NTA进行亲和层析，将组氨酸标签(His-Tag)的融合纳豆激酶担保纯化出来。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法，来鉴定重组蛋白。SDS-PAGE电泳显示(图3)，从黄瓜果实和黄豆种子中表达的重组融合蛋白大约为30kDa，符合我们最初的设计。也表明植物成功的表达出来成熟的纳豆激酶蛋白。

纳豆激酶活性通过改进的纤维蛋白板方法检测【14】。将0.5％琼脂糖在50mL的PBS缓冲液中中煮沸，并在40℃水浴中冷却。将1mg/mL纤维蛋白原，0.1IU/mL凝血酶和0.1IU/mL纤溶酶原混合其中。将混合物缓慢倒入培养皿中，静置，直到琼脂糖固化。在培养板中用无菌打孔器形成孔(3mm直径)。将然后用将大豆种子以及黄瓜果实中纯化的纳豆激酶分别以50μg加载到每个孔中，并将板在室温下温育过夜。商用纳豆激酶作为阳性对照。结果显示来自黄豆种子以及黄瓜果实的重组纳豆激酶蛋白都可以降解纤维蛋白(如图4所示)。纯化的重组蛋白在纤维蛋白板上显示出半透明的溶解区域，表明纤维蛋白已被降解为可溶性肽。相比之下，来自非转基因黄豆种子以及黄瓜蛋白均不显示纤维蛋白切割活性。溶血实验证明，纯化的重组蛋白可以溶解血块，而非转基因黄豆种子以及黄瓜蛋白均不能溶解血块(图5)。

综上所述，通过使用种子以及果实特异性启动子，我们成功的将纳豆激酶分别转入黄豆以及黄瓜果实当中。以这种方式产生的重组纳豆激酶可以降解纤维蛋白以及溶解血块。因此，我们证明利用转基因植物可生产有活性，安全，廉价并可以直接服用的纳豆激酶。基于植物种子平台可大规模生产低成本的功能性纳豆激酶。富含纳豆激酶的蔬菜水果可以直接为人们食用，即保留了纳豆激酶的活性，又可延迟纳豆激酶在消化道系统中被消化液降解。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

参考文献：

1.Dabbagh F,Negahdaripour M,Berenjian A,Behfar A,Mohammadi F,ZamaniM,Irajie C,Ghasemi Y(2014)Nattokinase:production and application.ApplMicrobiol Biotechnol.98(22):9199-206.doi:10.1007/s00253-014-6135-3.

2.Chang YY,Liu JS,Lai SL,Wu HS,Lan MY(2008)Cerebellar hemorrhageprovoked by combined use of nattokinase and aspirin in a patient withcerebral microbleeds.Intern Med 47(5):467–9.doi:10.2169/internalmedicine.47.0620.

3.Nakamura T,Yamagata Y,Lchishima E(1992)Nucleotide sequence of thesubtilisin NAT gene,aprN,of Bacillus subtilis(natto).Biosci BiotechnolBiochem 56:1869-1871.

4.Ni H,Guo PC,Jiang WL,Fan XM,Luo XY,Li HH(2016)Expression ofnattokinase in Escherichia coli and renaturation of its inclusion body.JBiotechnol 231:65-71.doi:10.1016/j.jbiotec.2016.05.034.

5.Wu SM,Feng C,Zhong J,Huan LD Enhanced production of recombinantnattokinase in Bacillus subtilis by promoter optimization.World J MicrobBiot.2011；27:99–106.

6.Li X,Wang X,Xiong S,Zhang J,Cai L,Yang Y(2007)Expression andpurification of recombinant nattokinase in Spodoptera frugiperdacells.Biotechnol Lett 29(10):1459-64.

7.Luo L,Huang Z,Pan L,Yang R,Liang S(2003)Expression of NattokinaseGene in Yeast Pichia Pastoris.Journal of South China University of Technology(Natural Science).31(2):1-4.

8.Yao J,Weng Y,Dickey A,Wang K(2015)Plants as Factories for HumanPharmaceuticals:Applications and Challenges.Int J Mol Sci 16(12):28549–65.10.3390/ijms161226122.

9.Bost K,Piller K.Protein expression systems:why soybean seeds？”inSoybean—Molecular Aspects of Breeding ISBN:978-953-307-240-1,ed Sudaric A.(Rijeka:InTech).2011；pp.1–18.doi:10.5772/15376.、

10.Merlin M1,Pezzotti M1,Avesani L(2017)Edible plants for oraldelivery of biopharmaceuticals.Br J Clin Pharmacol 83(1):71-81.doi:10.1111/bcp.12949.

11.Jia y,Yao X,Zhao M,Zhao Q,Du Y,Yu C,Xie F(2015)Comparison ofsoybean transformation efficiency and plant factors affecting transformationduring the Agrobacterium infection process.Int J Mol Sci 16(8),18522-18543；doi:10.3390/ijms160818522.

12.Bi H,Dong X,Wu G,Wang M,Ai X(2015)Decreased TK activity altersgrowth,yield and tolerance to low temperature and low light intensity intransgenic cucumber plants.Plant Cell Rep.2015Feb；34(2):345-54.doi:10.1007/s00299-014-1713-5.

13.Epub 2014 Dec 4.Conlon HE1,Salter MG(2007)Plant proteinextraction.Methods Mol Biol 362:379-83.

14.Li G,Wang KY,Li D,Wang N,Liu D(2012)Cloning,expression andcharacterization of a gene from earthworm Eisenia fetida encoding a blood-clot dissolving protein.PLoS One.2012；7(12):e53110.doi:10.1371/journal.pone.0053110.

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州晟源光热新能源科技股份有限公司

<120> 一种纳豆激酶的转基因方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60

gcgttcagca acatgtctgc gcaggctgcc ggaaaaagca gtacagaaaa gaaatacatt 120

gtcggattta agcagacaat gagtgccatg agttccgcca agaaaaagga tgttatttct 180

gaaaaaggcg gaaaggttca aaagcaattt aagtatgtta acgcggccgc agcaacattg 240

gatgaaaaag ctgtaaaaga attgaaaaaa gatccgagcg ttgcatatgt ggaagaagat 300

catattgcac atgaatatgc gcaatctgtt ccttatggca tttctcaaat taaagcgccg 360

gctcttcact ctcaaggcta cacaggctct aacgtaaaag tagctgttat cgacagcgga 420

attgactctt ctcatcctga cttaaacgtc agaggcggag caagcttcgt tccttctgaa 480

acaaacccat accaggacgg cagttctcac ggtacgcatg tcgccggtac gattgccgct 540

cttaataact caatcggtgt tctgggcgta gcgccaagcg catcattata tgcagtaaaa 600

gtgcttgatt caacaggaag cggccaatat agctggatta ttaacggcat tgagtgggcc 660

atttccaaca atatggatgt tatcaacatg agccttggcg gacctactgg ttctacagcg 720

ctgaaaacag tagttgataa agcggtttcc agcggtatcg tcgttgctgc cgcagccgga 780

aacgaaggtt catccggaag cacaagcaca gtcggctacc ctgcaaaata tccttctact 840

attgcagtag gtgcggtaaa cagcagcaac caaagagctt cattctccag cgtaggttct 900

gagcttgatg taatggctcc tggcgtgtcc atccaaagca cacttcctgg aggcacttac 960

ggcgcttata acggaacgtc catggcgact cctcacgttg ccggagcagc agcgctaatt 1020

ctttctaagc acccgacttg gacaaacgcg caagtccgtg atcgtttaga aagcactgca 1080

acatatcttg gaaactcttt ctactatgga aaagggttaa tcaacgtaca agcagctgca 1140

caacaccatc accaccacca taaagatgag ctatga 1176

<210> 2

<211> 1498

<212> DNA

<213> Vigna unguiculata

<400> 2

attgtactcc cagtatcatt atagtgaaag ttttggctct ctcgccggtg gttttttacc 60

tctatttaaa ggggttttcc acctaaaaat tctggtatca ttctcacttt acttgttact 120

ttaatttctc ataatctttg gttgaaatta tcacgcttcc gcacacgata tccctacaaa 180

tttattattt gttaaacatt ttcaaaccgc ataaaatttt atgaagtccc gtctatcttt 240

aatgtagtct aacattttca tattgaaata tataatttac ttaattttag cgttggtaga 300

aagcataaag atttattctt attcttcttc atataaatgt ttaatataca atataaacaa 360

attctttacc ttaagaagga tttcccattt tatattttaa aaatatattt atcaaatatt 420

tttcaaccac gtaaatctca taataataag ttgtttcaaa agtaataaaa tttaactcca 480

taattttttt attcgactga tcttaaagca acacccagtg acacaactag ccattttttt 540

ctttgaataa aaaaatccaa ttatcattgt atttttttta tacaatgaaa atttcaccaa 600

acaatcattt gtggtatttc tgaagcaagt catgttatgc aaaattctat aattcccatt 660

tgacactacg gaagtaactg aagatctgct tttacatgcg agacacatct tctaaagtaa 720

ttttaataat agttactata ttcaagattt catatatcaa atactcaata ttacttctaa 780

aaaattaatt agatataatt aaaatattac ttttttaatt ttaagtttaa ttgttgaatt 840

tgtgactatt gatttattat tctactatgt ttaaattgtt ttatagatag tttaaagtaa 900

atataagtaa tgtagtagag tgttagagtg ttaccctaaa ccataaacta taacatttat 960

ggtggactaa ttttcatata tttcttattg cttttacctt ttcttggtat gtaagtccgt 1020

aactagaatt acagtgggtt gccatggcac tctgtggtct tttggttcat gcatgggtct 1080

tgcgcaagaa aaagacaaag aacaaagaaa aaagacaaaa cagagagaca aaacgcaatc 1140

acacaaccaa ctcaaattag tcactggctg atcaagatcg ccgcgtccat gtatgtctaa 1200

atgccatgca aagcaacacg tgcttaacat gcactttaaa tggctcaccc atctcaaccc 1260

acacacaaac acattgcctt tttcttcatc atcaccacaa ccacctgtat atattcattc 1320

tcttccgcca cctcaatttc ttcacttcaa cacacgtcaa cctgcatatg cgtgtcatcc 1380

catgcccaaa tctccatgca tgttccaacc accttctctc ttatataata cctataaata 1440

cctctaatat cactcacttc tttcatcatc catccatcca gagtactact actctact 1498

<210> 3

<211> 2226

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 3

cgtgcgttgc acgtttatct cttaactatt ttataaaatt tgtacttgat agacttccta 60

ttggtagtta ttcatgtcaa attattttga aaaataaaag aaattgctac tataaagtgt 120

ctttggaaaa tgaaaaccct ttccaatctt tatatagttc tttttcgatg atttttgaat 180

ttctttttaa tgtaattata taagtgaggt cttaaaaaaa ttatacatat gcatccttac 240

ttctaggatg taacttgtaa atgtaaatat atatatagat atagaaaagg catgtaactt 300

gtaaatgaaa atataaatat agatatagag aagaagaaac ttgatattaa catatgacaa 360

tataatggaa gtatcaacgt aactccaaca atcctttgtc acaacctaca tataattaat 420

attgttattg taataatata tgatctcttt gtcatgcttt ccctattaaa gcaatgaaat 480

gttattagaa tgactcgctg ttatatatct tgcaaattaa taaattacat tgatagttaa 540

cgaagaagtt gagggtcaca ttaattagta catgacagga cattaagaga atcaatactt 600

attggagaga agtttgatgg tcacacacat caattggtga aactgatata attaatcaaa 660

taaattgaat aacatctgga agagaattaa atgggcgtaa aaggaatgac aaatagaagt 720

taatcttttt tttatctttt tttaaaacga ttaattaact tttaaaggat gatatgtatt 780

atttattgtt ttatattatg ttgatttatt gtaggaataa aatggtaatt cagcttttgt 840

actttgaatt tttccactta taatataata agattcttgc ggcttgttga ccaataattg 900

acaaaatata ttgaaattta ttgtaaataa tttttttgac taaagtgcaa aacaacttca 960

taaatatgtg tttttgaaat taaaaaaaaa aatctatatt attctctaac aattactttt 1020

attattataa tgtatctgta tagtccatgt agtttcattt tattttatca aagttaaaat 1080

attaatttat aatttaaata tcttaacatt tatcaaagac tgacattttt tttcttatat 1140

tcagatgttt aataataaat agtcttgatc atttactgtt caaatctaga gacaaaatcg 1200

taatcactca attgtgtatt aaaatttaga catgttaatc ttaatgaaaa caaatgaaac 1260

ctaagctata tatgacaata catgttgcta acatgtatca tctgacacat tatttaattt 1320

ttatcattgt atcttactat gtgtatatgc atcaaataaa atatacgcat gtataaatat 1380

acatatgtat ctgataaaag tgtacaagtt tgtatgttaa aaatctaaat atcggtgaat 1440

cgtaaaaaaa aaaagagaat gttgattgtt ttgtttattt tcttagaaga agttgtgata 1500

tgtcagatcc attataattg ttataagcat gattttctcg ttaattatta actttcaatt 1560

atactattta attatacacg ctccttagtt aatgcaaata catataaatt atatttattt 1620

tgagaaatta atgagacttc tttgccatga tcgaaacttg tagtaaaatt taaacgatcc 1680

atcgaaatat gctttttgca agttaagatg gaattcagca atagtgtaaa ctatgatttg 1740

tttgcctgtt gggtgtacgg aaattttaag tgagtatgat tgacatacat tataatgtct 1800

tttagatgtt aaatttagat ttcttttcaa ttaaagatga aaagtcacat accaaaagta 1860

ttaaactaga aatattacaa tagctcaaga aataaaaatg ttatttttcg ttatttattt 1920

atgcaacgaa tgtttaaaaa tgcaaacaaa agtttctttt atataaaatt gaattgaaaa 1980

tatctaataa ataatatctt tagattaaat tatcatgctt ttagacgcaa aattaagata 2040

tgtaataatt cgagaatcag aatgaaatta tcccacctac tctaaaatta aaagatacaa 2100

taatttacct aaatcaaaac gacgccgtag tactgtacct tttggacttt ggatgttgta 2160

tctatttgga aacgaagcaa ctcatccttc tttcataaaa tcgatctagc ttgatttctt 2220

ccatta 2226

Claims (10)

1.一段分离的DNA片段，用于表达纳豆激酶，其序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种载体，其包含权利要求1所述的DNA片段。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为pUC57。

4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，其通过下列步骤构建得到：

a)、将SEQ ID NO：2所示的菜豆种子特异性启动子phas连入pCambia3300的EcoRI/SacI位点，得到pPhas；

b)、以权利要求2或3所述载体为模板扩增出纳豆激酶基因以及6×His片段，连接入pPhas的SacI/BamHI位点，得到pPhas-aprN；

c)、将胭脂碱合酶终止子nosT片段连接入pPhas-Natto的BamHI/PstI位点即得。

5.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，其通过下列步骤构建得到：

a)、将SEQ ID NO：3所示的番茄果实特异性启动子LA22CD07连入pCambia2200的SacI/KpnI位点，得到pLA22CD07；

b)、以权利要求2或3所述载体为模板扩增出纳豆激酶基因以及6×His片段，连接入pLA22CD07的KpnI/BamHI位点，得到pLA22CD07-aprN；

c)、将胭脂碱合酶终止子nosT片段连接入pLA22CD07-aprN的BamHI/PstI位点即得。

6.一种宿主细胞，其被权利要求2～5任一项所述的载体所转化；

优选的，所述宿主细胞为农杆菌。

7.一种转基因方法，用于将纳豆激酶基因转入目的植物，其特征在于，包括：

1)、将权利要求2、4、5任一项所述的载体通过宿主细胞介导导入目的植物的细胞；

2)、生出转基因植物；

3)、选择出转基因植物；

4)、可选的，增殖步骤3)获得的植物以获得后代。

8.根据权利要求7所述的转基因方法，其特征在于，所述目的植物为双子叶植物。

9.根据权利要求8所述的转基因方法，其特征在于，所述目的植物为葫芦科植物或豆科植物。

10.根据权利要求9所述的转基因方法，其特征在于，所述目的植物为黄瓜或大豆。