CN107384948A - 在植物高表达目标蛋白的方法及表达植物体的医疗用蛋白质的口服给药用组合物的制备方法 - Google Patents

在植物高表达目标蛋白的方法及表达植物体的医疗用蛋白质的口服给药用组合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供表达目标蛋白的植物、其制备方法及利用其的生物制药品口服给药用组合物的制备方法。提供具有如下特性的方法，即，利用本发明的植物细胞的目标蛋白表达系统解决现有培养植物细胞的问题、大量生产包含生物医药蛋白质的目标蛋白的同时，使目标蛋白对存在于消化器官内的蛋白质分解酶具有抗性，从而对实现植物来源生物制药品的商业化非常有效。

Description

在植物高表达目标蛋白的方法及表达植物体的医疗用蛋白质 的口服给药用组合物的制备方法
技术领域
本发明涉及表达目标蛋白的植物、其制备方法及利用其的目标蛋白的生产方法，更详细地，涉及在作为存在于叶绿体的蛋白质的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(RbcS，ribulose bisphosphate carboxyl ase/oxygenase small subunit)中融合目标蛋白，并将其导入植物体来大量生产的技术及利用其的生物制药品口服给药用组合物的制备。
背景技术
生物制药品(biopharmaceutical)是指将存在于生物内的物质作为医药品，广义的可定义成基于作为尖端的生物技术的基因重组、细胞融合、细胞培养等生物工程技术生产的医药品。将这些生物制药品分类成蛋白质医药品、治疗用抗体、疫苗，基因治疗剂及细胞治疗剂。
目前，大部分的重组蛋白质利用如动物细胞和昆虫细胞等高等细胞作为宿主来或通过如酵母或病毒等微生物来生产。然而，通过动物细胞培养的重组蛋白质的生产存在如下缺点：培养基的价格昂贵、可感染人类的病毒污染可能性高、由于可能流入来源于牛血清蛋白质而需要用于去除这些的额外的工序。并且，在细菌或酵母的情况下，具有易于大量生产重组蛋白质的优点，与此相反，存在合成蛋白质后完全不发生变形过程或由于与人类不同而不适于生产糖蛋白的问题。
对此，最近作为重组蛋白质的代替生产系统植物细胞培养被受关注。在植物细胞的情况下，不仅不会被动物来源病毒或病原菌感染，而且不存在动物来源物质混入的担忧，因此被看作是安全的生产系统。
但是，与包括动物细胞的其他宿主细胞相比，在植物细胞培养中呈现相对低的蛋白质表达水平和缓慢的生长速度。对此，急需开发为了植物来源生物制药品的商业化，而在植物体内生产重组蛋白质的情况下，用于提高导入基因表达效率的技术。
另一方面，蛋白质医药品最广泛使用的是以注射剂型给药到人体的方式，是蛋白质医药品可最有效的起作用的方法，但是，存在可能给患者带来痛苦的问题。尤其，在如糖尿病等代谢性疾病的情况下，由于需要长时间定期利用注射来给药，因此患者受会很大的痛苦。因这种理由，急需开发蛋白质医药品的口服给药技术。在植物体内生产出的生物制药品的情况下，可以不用单纯分离纯化蛋白质而进行口服给药，因此可成为一种划时代的方法，但是，另一方面，将蛋白质医药品口服给药的情况下，存在会被从胃分泌出的胃蛋白酶(pepsin)、从肠分泌出的胰蛋白酶(trypsin)分解的问题。
发明内容
对此，本发明人通过确认如下的事实来完成了本发明，即，众所周知，在叶绿体中形成蛋白质复合体来稳定存在的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因在植物细胞中使目标蛋白表达增加，此目标蛋白和核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基的融合蛋白质与RbcL相结合形成巨大分子，从而对存在于胃中的因胃蛋白酶(pepsin)的蛋白质分解抗性增加。
因此，本发明的目的在于，提供用于高表达目标蛋白的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因片段及基因构建体。
本发明的再一目的在于，提供用于高表达目标蛋白的重组表达载体。
本发明的另一目的在于，提供高表达目标蛋白的转化植物体。
本发明的还一目的在于，提供高表达目标蛋白的转化植物体的制备方法。
本发明的又一目的在于，提供制备用于在植物细胞中高表达目标蛋白的表达载体，并利用其从植物体中大量生产目标蛋白的方法。
本发明的又一目的在于，提供目标蛋白与核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段相结合的融合蛋白质。
本发明的又一目的在于，在目标蛋白与核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段相结合的状态下，通过制备500～800kD大小的巨大复合体，使对存在于消化器官内的蛋白质分解酶具有抗性的方法。
本发明的又一目的在于，提供包含目标蛋白与核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段相结合的融合蛋白质作为有效成分的口服给药用药学剂型组合物。
为了实现如上所述的本发明的目的，本发明提供核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(RbcS，ribulose bisphosphate carboxylase/oxygena se small subunit)基因片段，其特征在于，提高在植物细胞内位于其下游的目标蛋白的表达量。
为了实现上述目的，本发明提供以可使如下的基因启动的方式依次连接如下的基因的用于高表达目标蛋白的基因构建体：(a)核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因；以及(b)编码目标蛋白的基因。
根据本发明的优选一实施例，上述核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的序列可以为由序列1表示的多核苷酸序列。
根据本发明的再一优选一实施例，上述目标蛋白可以为选自由抗原、抗体、抗体片段、结构蛋白质、调节蛋白质、转录因子、毒蛋白、激素、激素类似物、细胞因子、酶、酶抑制剂、转运蛋白、受体、受体的片段、生物防御诱导物质、储存蛋白质、移动蛋白质(movementprotein)、防御蛋白质(exploitive protein)及报告蛋白组成的组中的一种以上，但并不限定于此。
根据本发明的优选一实施例，基因构建体还可包含位于核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的5’末端的启动子基因，上述启动子可选自来源于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的35S启动子、来源于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaicvirus)的19S核糖核酸(RNA)启动子、植物的肌动蛋白启动子及泛素蛋白质启动子，但并不限定于此。
根据本发明的另一一实施例，还可包含位于编码目标蛋白的基因的3’末端的蛋白标签基因，上述蛋白标签可以为选自由Avi标签、钙调蛋白(Calmodulin)标签、聚谷氨酸(polyglutamate)标签、E标签、FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、免疫球蛋白-Fc(IgG-Fc)标签、CTB标签、Softag1标签、Softag3标签、链球菌(Strep)标签，TC标签、V5标签、VSV标签及XpresS标签组成的组中的一种，但并不限定于此。
本发明还提供包含上述基因构建体的重组表达载体。
为了实现本发明的再一目的，本发明提供利用上述重组表达载体进行转化，且高表达目标蛋白的转化植物体。
根据本发明的优选一实施例，上述植物可选自粮食作物类，包括水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、小豆、燕麦、高粱；蔬菜作物类，包括拟南芥、白菜、萝卜、辣椒、草莓、西红柿、西瓜、黄瓜、甘蓝、甜瓜、南瓜、葱、洋葱、胡萝卜；特用作物类，包括人参、烟草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生、油菜；果树类，包括苹果树、梨树、枣树、桃子、葡萄、柑橘、柿子、李子、杏、香蕉；以及花卉类，包括玫瑰、康乃馨、菊花、百合、郁金香，但并不限定于此。
为了实现本发明的另一目的，本发明提供高表达目标蛋白的转化植物体的制备方法，包括：制备重组表达载体的步骤；以及将上述重组表达载体导入植物体的步骤。
在本发明的优选一实施例中，在将上述重组表达载体导入植物体的步骤中，可使用选自由基于土壤杆菌(Agrobacterium sp.)-介导的方法、基因枪轰击法(particle gunbombardment)、碳化硅晶须法(s ilicon carbide whiskers)、超声波处理法(sonication)、电穿孔法(e lectroporation)及聚乙二醇(PEG，polyethylenglycol)-介导性转化方法组成的组中，但并不限定于此。
为了实现本发明的还一目的，本发明提供目标蛋白的生产方法，上述蛋白质的生产方法包括：步骤(a)，制备上述重组表达载体；步骤(b)，通过将上述重组表达载体导入植物来制备转化植物体；步骤(c)，培养上述转化植物体；以及步骤(d)，从上述转化植物体或培养液分离纯化目标蛋白。
在本发明的优选一实施例中，通过将上述重组表达载体导入缺失存在于基因组中的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的植物来制备转化植物体，并由此可有效地生产目标蛋白。
为了实现本发明的又一目的，本发明提供包含与目标蛋白及目标蛋白的5’末端相结合的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段的融合蛋白质。
在本发明的优选一实施例中，上述核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段可以为由序列2表示的氨基酸序列。
在本发明的优选一实施例中，上述融合蛋白质可以为500～800kD的巨大复合体。融合蛋白质大小可根据与核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段相结合的目标蛋白的大小而不同。
在本发明的优选一实施例中，上述融合蛋白质的特征在于，对消化酶具有抗性。
为了实现本发明的又一目的，本发明提供包含核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段与目标蛋白的5’末端相结合的融合蛋白质作为有效成分的口服给药用药学剂型组合物。
为了实现本发明的又一目的，本发明提供包含表达核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段与目标蛋白的5’末端相结合的融合蛋白质的转化植物体作为有效成分的口服给药用药学剂型组合物。
在本发明的优选一实施例中，上述核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段可以为由序列2表示的氨基酸序列。
因此，本发明提供表达目标蛋白的植物、其制备方法及利用其的目标蛋白的生产方法。由于可通过本发明从植物体获得高效率、高表达的目标蛋白，因此可利用于利用植物体的产业用或医疗用蛋白质的大量生产中，尤其，可应用于口服给药用蛋白质医药品生产及口服给药用药学剂型组合物的制备中，并无需单纯分离所生产的蛋白。
附图说明
图1为根据本发明一实施例制备的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合构建体的示意图。
图2为确认因根据本发明的一实施例制备的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合，目标蛋白在植物细胞中高表达的蛋白质印迹照片。
图3为确认与正常植物体相比，根据本发明制备的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合蛋白质表达在核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基缺失突变体中更高的蛋白质印迹照片。
图4为在根据本发明的一实施例制备的转化植物体中确认核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合蛋白质的表达的蛋白质印迹照片。
图5为按浓度融合有根据本发明一实施例的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基蛋白质的目标蛋白(核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基-FL：瘦素：血球凝集素(RbcS-FL：leptin：HA))对胃蛋白酶的抗性效果实验结果。
图6为按反应时间融合有根据本发明一实施例的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基蛋白质的目标蛋白(核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基-FL：瘦素：血球凝集素)对胃蛋白酶的抗性效果实验结果。
图7为示出确认融合有根据本发明一实施例的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基蛋白质的目标蛋白的复合体形成结果的蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Blue-NativePAGE)结果。
图8为确认根据本发明一实施例的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基-FL：瘦素：血球凝集素的消化管内稳定性的结果。
图9为确认根据本发明一实施例的融合蛋白质RFeEx4fG15的高表达的结果。
图10为确认根据本发明一实施例的融合蛋白质RFeEx4fG15的核酮糖二磷酸羧化酶复合体形成的结果。
具体实施方式
以下，更详细的说明本发明。
如上所述，本发明人为了发明在植物细胞中可大量生产目标蛋白的方法，关注于可在细胞内稳定目标蛋白的蛋白质域融合，分离公知在拟南芥的叶绿体中形成蛋白质复合体并稳定存在的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因，并且确认了若融合上述核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因，则在植物细胞中目标蛋白的表达增加的事实(参照实施例2)。
因此，本发明提供核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因片段，其特征在于，提高在植物细胞内位于其下游的目标蛋白表达量。
优选地，上述核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因可由序列1的碱基序列组成。并且，上述碱基序列的变异体包含在本发明的范围内。具体地，上述基因可包含与序列1的碱基序列分别具有70％以上的、更优选地具有80％以上、进而优选地具有90％以上、最优选地具有95％以上的序列同源性的碱基序列。对于多核苷酸的“序列同源性的百分比”通过比较两个被排列成最佳的序列和比较区域来进行确认，与对于两个序列的最佳排列的参照序列(不包括添加或消除)相比，比较区域中的多核苷酸序列的一部分可包括添加或消除(即，间隔)。
并且，本发明提供以可使如下的基因启动的方式依次连接如下的基因的用于高表达目标蛋白的的基因构建体：(a)核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(ribulosebisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit)；以及(b)编码目标蛋白的基因。
本发明的基因构建体还可包含位于核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的5’末端的启动子基因。
本发明的基因构建体还可包含位于编码目标蛋白的基因的3’末端的蛋白标签基因。
在本发明的基因构建体中，以可使如下的基因启动的方式依次连接如下的基因：(a)启动子基因；(b)核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(ribulose bisphosphatecarboxylase/oxygenase small subunit)基因；(c)编码目标蛋白的基因及(d)蛋白标签基因。
作为上述的启动子只要是可在植物体内表达插入基因的，就没有特别限制，但是，优选地，上述启动子可以为选自来源于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的35S启动子、来源于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的19S核糖核酸启动子、植物的肌动蛋白启动子及泛素蛋白质启动子。
上述核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因可以为编码酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基的基因，最优选地，可以为来源于拟南芥的由序列1表示的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因。
上述目标蛋白作为指所要生产的蛋白质的术语，并不限制于特定蛋白质。具体地，目标蛋白可以为选自由抗原、抗体、抗体片段、结构蛋白质、调节蛋白质、转录因子、毒蛋白、激素、激素类似物、细胞因子、酶、酶抑制剂、转运蛋白、受体、受体的片段、生物防御诱导物质、储存蛋白质、移动蛋白质、防御蛋白质及报告蛋白组成的组中的一种以上。
在本发明的一实施例中，作为上述目标蛋白使用了甲状旁腺激素(PTH，parathyroid hormone)或瘦素(Leptin)。但是，本发明的目标蛋白并不限制于瘦素或甲状旁腺激素。本发明还可利用于如人生长激素、胰高血糖素样肽-1(GLP1)、Exendin-4等各种小的肽性的激素等的大量表达。这样表达的蛋白质，可通过在与核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基的融合部位导入特定蛋白质分解位点，来从核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基分离后进行单纯纯化。
并且，本发明的蛋白标签基因为了分离纯化蛋白质，只要是能够区分开的标签即可，而不受限制。具体地，蛋白标签可以为选自由Av i标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、免疫球蛋白-Fc标签、CTB标签、Softag1标签、Softag3标签、链球菌标签、TC标签、V5标签、VSV标签及Xpress标签组成的组中的一种以上。
本发明还提供包含上述基因构建体的重组表达载体。
术语“重组”是指细胞复制异种核酸、表达上述核酸或被肽、异种的肽或异种的核酸编码的蛋白质的细胞。重组细胞能够以正义或反义形态中的一种来表达在上述细胞的天然形态下未被发现的基因、或基因片段。并且，重组细胞可表达在天然状态的细胞中所发现的基因，但上述基因是被变形的，是借助人为的手段再导入细胞内的。
在本发明中，上述核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因序列可插入于重组表达载体内。术语“重组表达载体”指细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞或其他载体。大体，只要任何质粒及载体可在宿主内进行复制及稳定化就可以使用。上述表达载体的重要特性在于，具有复制原点、启动子、标记基因及翻译调节因素(translationcontrol element)。
包含核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因序列及适当的转录/翻译调节信号的表达载体，可通过本领域技术人员公知的方法来构建。上述方法包括试管内重组脱氧核糖核酸(DNA)技术、脱氧核糖核酸合成技术及生物体内重组技术等。
上述脱氧核糖核酸序列为了引导信使核糖核酸(mRNA)的合成，可有效地与表达载体内的适当的启动子相连接。作为用于在植物细胞内表达编码本发明的上述脱氧核糖核酸片段及目标蛋白的基因的适当的载体有基于pUC19的质粒或Ti质粒载体。
本发明的重组载体的优选例为当存在于如根癌土壤杆菌等适当的宿主中时，可使其本身的一部分、是可使所谓T区域转移到植物细胞的Ti质粒载体。其他类型的Ti质粒载体利用于用将当前的植物细胞或杂种脱氧核糖核酸适当插入于植物的基因组内的可生产出新植物的原生质体来使杂种脱氧核糖核酸序列转移。Ti质粒载体的尤其优选的形态如EP0120516B1号及美国专利第4940838号中所记载的所谓的二元(binary)载体。可利用于将本发明的脱氧核糖核酸导入植物宿主中的其他适当的载体可选自来源于双链植物病毒(例如，CaMV)及单链病毒、双生病毒等的病毒载体，例如，非完全性植物病毒载体。尤其，这种载体的使用当难以适当转化植物宿主时可有利。
作为上述适当的载体例并不限定于此，但是，优选地，使用326G FP或pCAMBIA类的二元载体，本领域技术人员可选择使用可在植物细胞内表达本发明的上述脱氧核糖核酸片段及编码目标蛋白的基因的任何载体。
更具体地，上述重组载体为以使用于蛋白质表达的现有的载体为基本骨架，提高启动子、目标蛋白的表达量的本发明的上述脱氧核糖核酸片段及编码目标蛋白的基因依次以能够启动的方式相连接的重组表达载体。
并且，表达载体作为翻译开始部位可包含核糖体结合部位及转录终止子。
优选地，表达载体可包含一个以上的选择性标记。上述标记作为具有以常规的化学方法进行选择的特性的核酸序列，从未转化细胞区分已转化的细胞的所有基因都可属于此。作为其例包括：除草剂抗性基因，如草甘膦(glyphosate)或膦丝菌素(phosphinothricin)；抗生素耐性基因，如卡那徽素(kanamycin)、G418、博来霉素(Bleomyci n)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol)；aadA基因等，但并不限定于此。
在本发明的重组载体中，启动子可以为CaMV 35S、肌动蛋白、泛素、pEMU、MAS、组蛋白启动子、Clp启动子，但并不限定于此。术语“启动子”指从结构基因至脱氧核糖核酸上游的区域，并指为了开始转录与核糖核酸聚合酶结合的脱氧核糖核酸分子。“植物启动子”为可在植物细胞中可开始转录的启动子。“组成型(constitutive)启动子”是在大部分的环境条件及发达状态或细胞分化下具有活性的启动子。由于转化体的选择可在各种阶段借助各种组织来实现，因此，优选地，在本发明中可用组成型启动子。因此，对组成型启动子的选择并不限制。
在本发明的重组载体中，可使用常规的终止子，作为其例包括胭脂碱合酶(NOS)、水稻淀粉酶RAmy1A终止子、菜豆蛋白终止子、根癌土壤杆菌的真蛸碱(Octopine)基因的终止子、大肠杆菌的rrnB1/B2终止子等，但并不限定于此。据悉，对于终止子的必要性，通常这种区域能增加植物细胞中的转录的可靠性及效率。因此，优选地，在本发明中使用终止子。
作为可使本发明的载体在原核细胞稳定且连续性克隆及表达的宿主细胞，可利用本领域中公知的任何宿主细胞，例如，如大肠杆菌(E.coli)JM109、大肠杆菌BL21、大肠杆菌RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776、大肠杆菌W3110、枯草芽孢杆菌、苏云金杆菌等芽孢杆菌属菌株及如鼠伤寒沙门氏菌、灵杆菌及各种假单胞菌等肠内菌科菌株等。
并且，将本发明的载体转化到真核细胞的情况下，作为宿主细胞可利用酵母(酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae))、昆虫细胞、人细胞(例如，CHO细胞株(中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary))、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN及MDCK细胞株)及植物细胞等。优选地，宿主细胞为植物细胞，上述植物可选自粮食作物类，包括水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、小豆、燕麦、高粱；蔬菜作物类，包括拟南芥、白菜、萝卜、辣椒、草莓、西红柿、西瓜、黄瓜、甘蓝、甜瓜、南瓜、葱、洋葱、胡萝卜；特用作物类，包括人参、烟草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生、油菜；果树类，包括苹果树、梨树、枣树、桃子、葡萄、柑橘、柿子、李子、杏、香蕉；花卉类，包括玫瑰、康乃馨、菊花、百合、郁金香。
在宿主细胞为原核细胞的情况下，向宿主细胞内输送本发明的载体的方法可借助CaCl2方法、哈纳汉方法(Hanahan,D.,J.Mol.Biol.,166:557-580(1983))及电穿孔方法等来实施。并且，在宿主细胞为真核细胞的情况下，可借助显微注射法、碳酸钙沉淀法、电穿孔法、脂质体介导转染法、DEAE-葡聚糖处理法及基因轰炸等来向宿主细胞内注入载体。
为了实现本发明的又一目的，本发明提供利用上述重组表达载体进行转化且高表达目标蛋白的转化植物体。
根据本发明的优选的再一实施例，上述植物可选自粮食作物类，包括水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、小豆、燕麦、高粱；蔬菜作物类，包括拟南芥、白菜、萝卜、辣椒、草莓、西红柿、西瓜、黄瓜、甘蓝、甜瓜、南瓜、葱、洋葱、胡萝卜；特用作物类，包括人参、烟草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生、油菜；果树类，包括苹果树、梨树、枣树、桃子、葡萄、柑橘、柿子、李子、杏、香蕉；花卉类，包括玫瑰、康乃馨、菊花、百合、郁金香。
为了实现本发明的又一目的，本发明提供高表达目标蛋白的转化植物体的制备方法，上述高表达目标蛋白的转化植物体的制备方法包括：制备重组表达载体的步骤；以及将上述重组表达载体导入植物体的步骤。
在将上述植物表达载体导入植物细胞或植物体的步骤中，可使用选自由借助土壤杆菌-介导的方法、基因枪轰击法、超声波处理法、电穿孔法及聚乙二醇-介导性转化方法组成的组中的一种。在本发明的一实施例中，在拟南芥原生质体的转化中使用聚乙二醇-介导性转化方法，而且在拟南芥转化体的制备中使用借助土壤杆菌-介导的方法。
为了实现本发明的又一目的，本发明提供利用借助重组载体转化的植物来大量生产目标蛋白的方法。
具体地，生产本发明的目标蛋白的方法包括：步骤(a)，制备上述重组表达载体；步骤(b)，通过将上述重组表达载体导入植物来制备转化植物体；步骤(c)，培养上述转化植物体；以及步骤(d)，从上述转化植物体或培养液分离纯化目标蛋白。
在生产本发明的目标蛋白的方法中，上述植物可以为缺失存在于基因组中的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的植物。
从上述被转化的植物细胞生产目标蛋白的方法，可利用本发明的重组载体转化植物细胞后，培养一段时间以使目标蛋白表达，然后从被转化的细胞中获取。此时，对于表达上述目标蛋白的方法，只要是本领域中公知的方法就均可使用。
在上述方法中，利用拟南芥制备转化体，但并不限定于此，且从双子叶植物或单子叶植物中分离的原生质体均可使用于本发明中。
为了实现本发明的又一目的，本发明提供包含与目标蛋白及目标蛋白的5’末端相结合的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段的融合蛋白质。
本发明的融合蛋白质的特征在于，通过形成500～800kD的巨大复合体来对消化器官内的蛋白质分解酶具有抗性。
为了实现本发明的又一目的，本发明提供包含核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段与目标蛋白的5’末端相结合的融合蛋白质作为有效成分的口服给药用药学剂型组合物。
为了实现本发明的又一目的，本发明提供包含表达核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段与目标蛋白的5’末端相结合的融合蛋白质的转化植物体作为有效成分的口服给药用药学剂型组合物。
在本发明的优选一实施例中，上述核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段可以为由序列2表示的氨基酸序列。
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，本发明的范围并不限定于此，这是对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。
实施例1.制备重组表达载体
本发明人作为表达载体使用了以能够启动的方式相连接(35S启动子)-(核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因)-(目标蛋白基因)-(HA标签)的基因构建体(图1)。在表达载体中克隆编码目标蛋白的基因后，若使其表达在植物细胞中，则以融合有核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基的状态表达，且向叶绿体移动并蓄积。
在本发明的一实施例中，作为目标蛋白使用了甲状旁腺激素，表达载体的制备方法如下。以拟南芥基因组脱氧核糖核酸为模板，利用由“XbaI-核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基N末端序列(XbaI-RbcS N-termianl sequence)”构成的正向引物(序列6)和由“BamHI-核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基C末端序列(BamHI-RbcS C-terminal sequence)”构成的逆向引物(序列7)进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增了核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因。并且，以版含有甲状旁腺激素的质粒脱氧核糖核酸为模板，利用由“BamHI-甲状旁腺激素N末端序列(BamHI-PTH N-termianl sequence)”构成的正向引物(序列8)和“XhoI-stop codon-HA C末端序列(XhoI-stop codon-HA C-t erminal sequence)”构成的逆向引物(序列9)进行聚合酶链式反应，扩增了融合有HA-标签的甲状旁腺激素基因。将分别利用XbaI/BamHI(第一次聚合酶链式反应产物)及BamHI/XhoI(第二次聚合酶链式反应产物)切割上述被扩增的聚合酶链式反应产物并进行纯化。通过将这两个聚合酶链式反应产物克隆在利用XbaI/XhoI切割的326GFP(拟南芥生物资源中心，俄亥俄州立大学，美国俄亥俄州(Arabidopsis Bi ological Resource Center，Ohio State University，Ohio，USA))质粒内花椰菜花叶病毒35S启动子(序列3)与胭脂碱合酶终止子之间来制备表达载体核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基：甲状旁腺激素：HA。
实施例2.比较核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合载体的蛋白质表达效果
利用聚乙二醇-介导性转化方法将在上述实施例1中制备的表达载体导入从拟南芥叶分离的原生质体来制备转化体后，用蛋白质印迹分析方法比较由此表达的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合蛋白质的量。
具体地，将30μg的细胞溶液与十二烷基硫酸钠(SDS)试样缓冲液混合加热，且在10％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶进行电泳。将分离的蛋白质移动至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并用5％的脱脂乳(skim milk)阻止移动。然后，与抗血球凝集素(anti-H A)抗体(稀释1：1000)一同进行反应，并与辣根过氧化物酶(HRP，horseradishperoxidase)相结合的第二抗体进行反应。然后用制造商的方法处理ECL溶液。
实施例3.分析在植物细胞内根据核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合的蛋白 质的表达量
为了确认根据核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合的蛋白质的表达量的增加，使用了在甲状旁腺激素：血球凝集素(HA)的上部设置核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基全部基因(full-length，序列1)的质粒基因，作为对照组使用了代替核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基全部基因将核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基转运肽(RbcS transitpeptide，序列10)设置于甲状旁腺激素：血球凝集素(HA)的上部的质粒基因。用聚乙二醇-介导性转化方法将这些基因导入从拟南芥的叶分离的原生质体培养24小时后，通过收集、溶解原生质体来定量后，进行了蛋白质印迹分析。
其结果，如图2所示，与作为对照组的融合核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基转运肽的甲状旁腺激素：血球凝集素(HA)的表达相比，在拟南芥原生质体中融合核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基全部基因的甲状旁腺激素：血球凝集素(HA)的表达更高。由此可知，若使用核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因作为融合伙伴，则具有提高目标蛋白的表达量的效果。
实施例4.比较分析在野生型植物和缺失核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因 的植物中根据核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合的蛋白质的表达量
为了分析在缺失核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的植物中核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合蛋白质的表达量，将缺失核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的突变拟南芥作为宿主细胞使用。
具体地，从野生型拟南芥和缺失核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的突变拟南芥的叶中分别分离原生质体，用聚乙二醇-介导性转化方法将融合核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基全部基因(序列1)的甲状旁腺激素：血球凝集素(HA)基因导入原生质体后，培养24小时，然后通过收集、溶解原生质体且进行定量来进行蛋白质印迹分析。
其结果，如图3所示，与野生型拟南芥相比，在缺失核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的突变体中融合核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基全部基因的甲状旁腺激素：血球凝集素(HA)的表达更高。由此可知，通过利用在缺失核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的突变体中使核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合蛋白质表达的方法，来可有效地提高目标蛋白的表达量。
实施例5.制备表达核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合蛋白质的转化植物体
制备了借助核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合来提高目标蛋白的表达的转化植物体。植物体转化用质粒的制备如下。首先，以包含瘦素的质粒脱氧核糖核酸为模板，利用由“BamHI-瘦素N-末端序列(BamHI-leptin N-termianl sequence)”构成的正向引物(序列12GGATCCATGTGCTGGAGACCCCTG)和由“XhoI-stop codon-HA C-末端序列(XhoI-stopcodon-HA C-terminal sequence)”构成的逆向引物(序列13ctcgagtcaggaagcgtaatctggaacatcgtatgggtaagcccgggggcattcagg gctaacatccaac)进行聚合酶链式反应，扩增了融合有HA-标签的瘦素基因。用BamHI/XhoI切割上述扩增的聚合酶链式反应产物并进行纯化后，通过克隆在用BamHI/XhoI切割的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基：甲状旁腺激素(PTH)：血球凝集素(HA)质粒脱氧核糖核酸来制备核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基：瘦素：血球凝集素(HA)。
在上述制备的重组载体中切割包含核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基：瘦素：血球凝集素(HA)的区域，利用XbaI和EcoRI限制酶在pCAMBIA1300载体的多克隆位点克隆35S启动子-核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基：瘦素：血球凝集素(HA)：NOS终止子形态的基因构建体，从而制备了转化用重组载体。然后，利用土壤杆菌-介导转化方法将上述所制备的转化用重组载体制备成已转化的植物体。此时，作为制备的转化用载体的基本载体的pCABIA1300通过潮霉素耐性检查利用本发明的方法筛选了已转化的植物体。并且，作为利用耐性检查筛选的植物体，通过蛋白质印迹找出蛋白质表达得好的品系，来确保了第一代转化(图4)，在第二代转化中，利用潮霉素耐性检查选出了“死亡个体：存活个体”的比率为1：3的清楚的品系，通过在这些品系中，将第三代转化中均存活的个体选定为同性(homo)来维持品系，进而确保了已转化的植物体品系。如图4所示，从转化体1至转化体5、8及11中观察到多个带，从而确认了目标蛋白(核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基：瘦素：血球凝集素(HA))的高表达。
实施例6.核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合蛋白质的胃蛋白酶抗性效果
如上述实施例5制备核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基-FL：瘦素：血球凝集素(HA)的转化植物体，并利用其在体外(in vitro)调查了对胃蛋白酶的抗性。
具体地，在温室培养该转化植物体4周左右后，收获叶子进行冷冻干燥后，研成粉末状态来制备。各取10mg的此粉末形态的转化植物体与pH为2.0的缓冲液相混合后，处理0ng/μl、200ng/μl、400ng/μl浓度的胃蛋白酶，在37℃的条件下反应30分钟。然后，为了降低胃蛋白酶的活性，将试样在冰里放置10分钟左右来降低温度，并处理pH为8.8的1.5M的Tris缓冲液来提高pH，从而再一次降低胃蛋白酶的活性。然后，用超声波处理(sonication)法粉碎细胞，并与缓冲液相混合加热10分钟后，在14000rpm的条件下去除残留物。然后，定量对应于100μg的试样，并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺和蛋白质印迹。作为用于比较根据处理胃蛋白酶的融合蛋白质的抗性的对照组使用了作为ER蛋白质的免疫球蛋白重链结合蛋白质(BiP)(分子伴侣结合蛋白(chapheron binding protein))、作为形成复合蛋白质的叶绿体蛋白质的叶绿素a-b结合蛋白质(chlorophyll a-b binding protein，Lhcb4)。其结果，如图5所示，将融合核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基全部基因的瘦素(无复发活存-瘦素(RFL-Leptin))的情况下，与免疫球蛋白重链结合蛋白质相比，在与用高浓度处理的胃蛋白酶的反应中示出高的分解抗性，且具有与形成另一复合体的叶绿素a-b结合蛋白质类似的分解抗性。
在上述确认了根据按浓度处理核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合蛋白质的分解抗性，接着，通过对400ng/μl的胃蛋白酶反应时间多样地设置成30分钟、1小时、2小时来确认了是否分解。其结果，如图6所示，虽然反应时间延长，但是依然具有与其他蛋白质不同的分解抗性。
实施例7.核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基-瘦素的消化管内的稳定性确认
为了测定在消化管内核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基-FL：瘦素：血球凝集素(HA)蛋白质的稳定性，强制移植于小鼠后，从胃和小肠中获取食物后进行蛋白质印迹。
具体地，在液体氮下冷冻干燥转化有核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基-FL：瘦素：血球凝集素(HA)的植物体的叶后，研成粉末状态来制备。将其悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)，为了精确地调节在消化管中的时间利用区(zoned)直接向C57BL/6小鼠(n＝5)的胃给药80mg(以叶(leaf)的干重为准)/个体。给药30分钟后，从胃和小肠中获取食物加入RIPA裂解缓冲液(RIPA lysis buffer)，进行超声波粉碎。通过离心(14000xg)去除细胞残留物，并通过考马斯亮蓝(Bradford)蛋白质定量，来将20μg的蛋白装入于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶来进行了蛋白质印迹。利用血球凝集素(HA)抗体，确认核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基-FL：瘦素：血球凝集素(HA)的存在。
其结果，如图7所示，当从胃中回收食物时，在大部分的个体中检测出了原有分子量的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基-FL：瘦素：血球凝集素(HA)。同时间，与胃相比，在小肠中看似进一步进行了消化，但检测出了原有分子量的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基-FL：瘦素：血球凝集素(HA)。由此可确认，当口服给药融合有核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基的目标蛋白时，在消化管内能够稳定的存在而不会被消化酶分解。
实施例8.确认核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合蛋白质的核酮糖二磷酸羧 化酶复合体形成
为了确认在上述实施例中制备的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基-FL：瘦素：血球凝集素(HA)与瘦素基因融合无关是否仍然形成核酮糖二磷酸羧化酶复合体(rubiscocomplex)，进行了蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Blue-Native PAGE)(polyacrylamidegel electro phoresis)。
蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析为确认聚合体形态的蛋白质的方法，具体地经由如下过程。在温室培养转化植物体4周左右后，收获叶子进行冷冻干燥，然后研成粉末状态来制备。分别取10mg的此形态的转化植物体与Bis-Tris缓冲液相混合后，用超声波粉碎打碎细胞进行定量，然后添加作为非离子洗涤剂(non-ionic detergent)的正十二烷基β-D-麦芽糖苷(n-Dodecyl-β-D-maltoside)来进行溶解。随后，与考马斯亮蓝G(coomassiebrilliant blue-G250，CBB-G)相混合后，在4～16％的浓度梯度的Blue-Native凝胶中进行电泳后，与上述实施例相同的方法进行了蛋白质印迹。
其结果，如图8所示，可以确认融合蛋白质形成核酮糖二磷酸羧化酶复合体。
实施例9.确认在其他目标蛋白中核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合蛋白质 的核酮糖二磷酸羧化酶复合体形成
如上述实施例8中确认，为了进一步明确确定融合有核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基的目标蛋白能形成核酮糖二磷酸羧化酶复合体，对除瘦素以外的其他目标蛋白进行了确认。
具体地，在上述核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基-瘦素：血球凝集素(HA)重组载体中，去除瘦素：血球凝集素(HA)部分，重组融合有exendin-4(序列14)与GM1结合肽(G15)(序列16)的脱氧核糖核酸片段(RFeEx4fG15)。以聚乙二醇–介导性转化方法将制备的重组载体导入在拟南芥叶中分离的原生质体，且利用蛋白质印迹分析方法确认了24小时之后表达的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基融合蛋白质的量。其结果，如图9所示，可以确认目的融合蛋白质(R FeEx4fG15)过表达成预期的大小(29kD)。
并且，为了确认目的融合蛋白质(RFeEx4FG15)是否形成核酮糖二磷酸羧化酶复合体，利用上述方法将重组载体导入原生质体后进行了蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。其结果，如图10所示，确认原来29kD的融合蛋白质为大于CBB(coomassie brilliant blue)中480kD附近的带(核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶复合体)的更大的蛋白质复合体，这指目的融合蛋白质能正常形成核酮糖二磷酸羧化酶复合体。由此可确认，与目标蛋白种类无关，当将本发明的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基片段使用成融合搭档时，可稳定地形成核酮糖二磷酸羧化酶复合体。
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aggatcttga tttatataaa catgttcaaa atgttatctg agtggtttgt aacatgtggt 540
ttgtatagca cggatttgtg taccgtgagc acggtaactc acccggatac tatgatggac 600
ggtactggac aatgtggaag cttcccttgt tcggttgcac cgactccgct caagtgttga 660
aggaagtgga agagtgcaag aaggagtacc ccaatgcctt cattaggatc atcggattcg 720
acaacacccg tcaagtccag tgcatcagtt tcattgccta caagccacca agcttcaccg 780
gt 782
<210> 2
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> rbcS
<400> 2
Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala
1 5 10 15
Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ser Ile Thr Ser
35 40 45
Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Met Gln Val Trp Pro Pro Ile
50 55 60
Gly Lys Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp
65 70 75 80
Ser Glu Leu Ala Lys Glu Val Asp Tyr Leu Ile Arg Asn Lys Trp Ile
85 90 95
Pro Cys Val Glu Phe Glu Leu Glu His Gly Phe Val Tyr Arg Glu His
100 105 110
Gly Asn Ser Pro Gly Tyr Tyr Asp Gly Arg Tyr Trp Thr Met Trp Lys
115 120 125
Leu Pro Leu Phe Gly Cys Thr Asp Ser Ala Gln Val Leu Lys Glu Val
130 135 140
Glu Glu Cys Lys Lys Glu Tyr Pro Asn Ala Phe Ile Arg Ile Ile Gly
145 150 155 160
Phe Asp Asn Thr Arg Gln Val Gln Cys Ile Ser Phe Val Ala Tyr Lys
165 170 175
Pro Pro Ser Phe Thr Gly
180
<210> 3
<211> 835
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 35S promoter
<400> 3
agattagcct tttcaatttc agaaagaatg ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg 60
cagcaggtct catcaagacg atctacccga gcaataatct ccaggaaatc aaataccttc 120
ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ctgcatcaag aacacagaga 180
aagatatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc 240
acaaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttccc actgaatcaa 300
aggccatgga gtcaaagatt caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg 360
aacagttcat acagagtctc ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg 420
tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 480
gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 540
cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 600
atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 660
atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 720
agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 780
cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagaga acacg 835
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HA tag
<400> 4
tacccatacg atgttccaga ttacgct 27
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HA tag
<400> 5
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> XbaI-RbcS N-termianl sequence F primer
<400> 6
tctagaatgg cttcctctat gctctcttc 29
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> BamHI-RbcS C-terminal sequence R primer
<400> 7
ggatcctacc ggtgaagctt ggtgg 25
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> BamHI-PTH N-termianl sequence F primer
<400> 8
ggatccaatc tgtgagtgaa atacagctta tgc 33
<210> 9
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> XhoI-stop codon-HA C-terminal sequence R primer
<400> 9
ctcgagtcag gaagcgtaat ctggaacatc gtatgggtaa gcccggggct gggatttagc 60
tttagttaat acattc 76
<210> 10
<211> 240
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> rbcS transit peptide
<400> 10
atggcttcct ctatgctctc ttccgctact atggttgcct ctccggctca ggccactatg 60
gtcgctcctt tcaacggact taagtcctcc gctgccttcc cagccacccg caaggctaac 120
aacgacacta cttccatcac aagcaacggc ggaagagtta actgcatgca ggtgtggcct 180
ccgattggaa agaagaagtt tgagactctc tcttaccttc ctgaccttac cgattccggg 240
<210> 11
<211> 80
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> rbcS transit peptide
<400> 11
Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala
1 5 10 15
Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ser Ile Thr Ser
35 40 45
Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Val Trp Pro Pro Ile Gly Lys
50 55 60
Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Gly
65 70 75 80
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> BamHI-leptin N-termianl sequence F primer
<400> 12
ggatccatgt gctggagacc cctg 24
<210> 13
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> XhoI-stop codon-HA C-terminal sequence R primer
<400> 13
ctcgagtcag gaagcgtaat ctggaacatc gtatgggtaa gcccgggggc attcagggct 60
aacatccaac 70
<210> 14
<211> 117
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Exendin-4
<400> 14
catggtgaag gaacatttac cagtgacttg tcaaaacaga tggaagagga ggcagtgcgg 60
ttatttattg agtggcttaa gaacggagga ccaagtagcg gggcacctcc gccatcg 117
<210> 15
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Exendin-4
<400> 15
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> G15
<400> 16
aggtcttcta ctaagcctcc tctttctcct cttggt 36
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> G15
<400> 17
Arg Ser Ser Thr Lys Pro Pro Leu Ser Pro Leu Gly
1 5 10

Claims (22)

1.一种核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因片段，其特征在于，提高由序列1表示的目标蛋白的表达量。
2.一种用于高表达目标蛋白的基因构建体，其特征在于，以能够使如下的基因启动的方式依次连接如下的基因：
(a)核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因；以及
(b)编码目标蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的用于高表达目标蛋白的基因构建体，其特征在于，上述核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因为由序列1表示的多核苷酸。
4.根据权利要求2所述的用于高表达目标蛋白的基因构建体，其特征在于，上述目标蛋白为选自由抗原、抗体、抗体片段、结构蛋白质、调节蛋白质、转录因子、毒蛋白、激素、激素类似物、细胞因子、酶、酶抑制剂、转运蛋白、受体、受体的片段、生物防御诱导物质、储存蛋白质、移动蛋白质、防御蛋白质及报告蛋白组成的组中的一种以上的蛋白质。
5.根据权利要求2所述的用于高表达目标蛋白的基因构建体，其特征在于，上述基因构建体还包含位于核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的5’末端的启动子基因。
6.根据权利要求5所述的用于高表达目标蛋白的基因构建体，其特征在于，上述启动子选自来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、来源于花椰菜花叶病毒的19S核糖核酸启动子、植物的肌动蛋白启动子及泛素蛋白质启动子。
7.根据权利要求2所述的用于高表达目标蛋白的基因构建体，其特征在于，上述基因构建体还包含位于编码目标蛋白的基因的3’末端的蛋白标签基因。
8.根据权利要求7所述的用于高表达目标蛋白的基因构建体，其特征在于，上述蛋白标签为选自由Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、免疫球蛋白-Fc标签、CTB标签、Softag1标签、Softag3标签、链球菌标签、TC标签、V5标签、VSV标签及Xpress标签组成的组中的一种。
9.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2至8中任一项所述的用于高表达目标蛋白的基因构建体。
10.一种高表达目标蛋白的转化植物体，其特征在于，利用权利要求9所述的重组表达载体进行转化。
11.根据权利要求10所述的高表达目标蛋白的转化植物体，其特征在于，上述植物选自：粮食作物类，包括水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、小豆、燕麦、高粱；蔬菜作物类，包括拟南芥、白菜、萝卜、辣椒、草莓、西红柿、西瓜、黄瓜、甘蓝、甜瓜、南瓜、葱、洋葱、胡萝卜；特用作物类，包括人参、烟草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生、油菜；果树类，包括苹果树、梨树、枣树、桃子、葡萄、柑橘、柿子、李子、杏、香蕉；以及花卉类，包括玫瑰、康乃馨、菊花、百合、郁金香。
12.一种高表达目标蛋白的转化植物体的制备方法，其特征在于，包括：
制备权利要求9所述的重组表达载体的步骤；以及
将上述重组表达载体导入植物体的步骤。
13.根据权利要求12所述的转化植物体的制备方法，其特征在于，在将上述重组表达载体导入植物体的步骤中，使用选自由基于土壤杆菌-介导的方法、基因枪轰击法、碳化硅晶须法、超声波处理法、电穿孔法及聚乙二醇-介导性转化方法组成的组中的一种以上。
14.一种目标蛋白的生产方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，制备根据权利要求9所述的重组表达载体；
步骤(b)，通过将上述重组表达载体导入植物来制备转化植物体；
步骤(c)，培养上述转化植物体；以及
步骤(d)，从上述转化植物体或培养液分离纯化目标蛋白。
15.根据权利要求14所述的目标蛋白的生产方法，其特征在于，上述植物为缺失存在于基因组中的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因的植物。
16.一种融合蛋白质，其特征在于，包含与目标蛋白及目标蛋白的5’末端相结合的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白质，其特征在于，上述核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段为由序列2表示的氨基酸序列。
18.根据权利要求16所述的融合蛋白质，其特征在于，上述融合蛋白质为500～800kD的巨大复合体。
19.根据权利要求16所述的融合蛋白质，其特征在于，上述融合蛋白质对消化酶具有抗性。
20.一种口服给药用药学剂型组合物，其特征在于，包含核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段与目标蛋白的5’末端相结合的融合蛋白质作为有效成分。
21.一种口服给药用药学剂型组合物，其特征在于，包含表达核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段与目标蛋白的5’末端相结合的融合蛋白质的转化植物体作为有效成分。
22.根据权利要求20或21所述的口服给药用药学剂型组合物，其特征在于，上述核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基肽片段为由序列2表示的氨基酸序列。
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