KR20240083151A - 식물로부터 인유두종 바이러스 유사 입자의 생산 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물로부터 인유두종 바이러스 유사 입자를 생산하는 기술에 관한 것으로, 더 상세하게는 엽록체 전이 펩타이드의 아미노산 길이를 조절하고, 그 N-말단에 SUMO 단백질을 위치시킨 후 HPV L1 단백질을 융합시킴으로써 식물의 엽록체에서 인유두종 바이러스 유사 입자를 효과적으로 생산하는 기술에 관한 것이다. 본 발명에 따른 HPV L1 재조합 단백질 생산 시스템은 HPV L1 재조합 단백질을 식물의 엽록체로 효과적으로 이동시키는 동시에 엽록체로의 이동을 위해 융합되어 있던 엽록체 전이 펩타이드가 엽록체 이동 후 완전히 제거돌 수 있으며, HPV L1 재조합 단백질의 식물 세포 내 발현량을 향상시키면서도 체내 투여시 자연적 바이러스와 거의 동일하게 면역반응을 유도하는 바이러스 유사 입자 형태로 제조할 수 있다는 장점을 갖는다.
Description
본 발명은 식물로부터 인유두종 바이러스 유사 입자를 생산하는 기술에 관한 것으로, 더 상세하게는 엽록체 전이 펩타이드의 아미노산 길이를 조절하고, 그 N-말단에 SUMO 단백질을 위치시킨 후 HPV L1 단백질을 융합시킴으로써 식물의 엽록체에서 인유두종 바이러스 유사 입자를 효과적으로 생산하는 기술에 관한 것이다.
인간유두종 바이러스(human papilloma virus, HPV)에 의해 발생하는 자궁경부암은 효과적인 백신으로 예방이 가능하다고 알려져 있다. 대표적으로는 주요 캡시드 단백질인 HPV L1 단백질을 백신으로 이용할 수 있는데, HPV L1 단백질은 게놈 DNA가 없는 바이러스 유사 입자(VLP)로 제조할 수 있으며, 이는 자연적 바이러스(natural virus)와 거의 동일한 형태로 면역반응을 유도한다는 것이 알려져 있다 (Chabeda et al. 2018).
이에, 다양한 세포에서 HPV L1 재조합 단백질을 발현시키고 이를 VLP로 제조하여 백신으로 개발하고자 하는 시도가 있어 왔다. 예컨대, 최근 효모 및 곤충 발현 시스템을 이용하여 HPV L1 VLP를 성공적으로 생산하고, 이를 Gardasil 및 Cervarix라는 백신으로 상용화하였으며 (Jorma Paavonen et al. 2007; Keith S Reisinger et al. 2007), 상기 백신은 자궁경부암을 예방하는 효능이 입증되었다.
그러나 VLP를 생산하기 위해서는 복잡한 공정이 요구되어 상기 백신을 생산하는데 값비싼 비용이 요구되고, 따라서 극빈국과 개발도상국에서는 이들 백신을 광범위하게 사용하는데 한계가 있어 왔다. 이에, 이러한 생산 비용 문제를 해결하기 위해서는 경제적인 HPV L1 VLP의 생산 시스템이 필요한 실정이다.
바이오 의약품용 재조합 단백질을 생산하기 위한 다양한 발현 시스템 중 최근 식물을 이용한 발현 시스템이 각광받고 있는데, 식물 세포에서 재조합 단백질은 소포체, 액포, 오일-바디, 세포외 공간, 엽록체 등 다양한 세포 소기관에 축적되도록 할 수 있다. 그러나, 목적하는 재조합 단백질의 종류와 그 구조적 특성에 따라 최적의 세포 소기관은 다를 수 있어, 재조합 단백질에 따라 다양한 세포 소기관을 스크리닝하고 최적의 세포 소기관을 선별하여 재조합 단백질이 효과적으로 축적되도록 함으로써 재조합 단백질의 생산 수율을 높일 수 있다. 특히, VLP를 유도할 때에는 목적하는 재조합 단백질의 구조체 형성이 세포 소기관에 따라 달라질 수 있으므로, 목적하는 재조합 단백질에 적합한 최적의 세포 소기관을 선별하는 것이 특히 중요하다.
다양한 세포 소기관 중 엽록체는 식물 세포에 많은 수로 존재하며, 식물 세포에서 액포 다음으로 넓은 세포 내 공간을 차지하고 있어 재조합 단백질이 축적되고 저장되는데 매우 유리하다. 이미 여러 연구 그룹이 HPV16 L1 단백질을 성공적으로 엽록체로 이동시켜 VLP 및 캡소머로 조립하였으며, 이를 백신으로 마우스에 주입한 결과 중화 항체가 유도되는 것을 확인하였다(J Maclean et al. 2007; Fernandez-San Millan A et al. 2008; Pineo CB et al. 2013; Paulina N Naupu et al. 2020).
재조합 단백질을 엽록체로 이동시키기 위해서는 엽록체 전이 펩타이드를 재조합 단백질에 융합시킬 수 있는데, 엽록체 전이 펩타이드(chloroplast transit peptide)는 단백질의 N-말단에서 기능하는 엽록체로의 이동 신호로, 소포체, 핵, 퍼옥시좀(peroxisome) 등으로 이동하는 단백질들이 가지는 이동 신호에 비해 상대적으로 길이가 긴 특징을 가진다. 재조합 단백질의 N-말단에 엽록체 전이 펩타이드를 융합시키면 재조합 단백질은 엽록체로 이동된 후, 상기 전이 펩타이드의 N-말단은 절단되어 분해된다. 구체적으로, 앞선 연구에서는 RbcS 유래 전이 펩타이드의 N-말단으로부터 59개 아미노산 잔기를 C-말단에 22 아미노산 잔기가 결실된 HPV16 L1의 (HPV16 L1d22) 단백질에 융합함으로써 식물에서 HPV16 L1d22 재조합 단백질을 발현시키고 엽록체에서 HPV16 L1d22 재조합 단백질이 형성하는 VLP를 생산한 바 있으나, 상기 HPV16 L1d22 재조합 단백질은 엽록체에 이동된 후, 전이 펩타이드의 N-말단이 분해되었지만, 여전히 전이 펩타이드 C-말단 5개의 아미노산 잔기는 재조합 단백질에 융합되어 있는 것으로 확인되었다. (Maryam Zahin et al. PLoS One. 2016; 11(8): e0160995.)
이와 같이 HPV L1 재조합 단백질에 전이 펩타이드 유래의 아미노산 잔기가 융합되어 잔존하는 경우, 상기 HPV16 L1 단백질을 자궁경부암 백신으로 인체에 주입시 의도치 않은 면역 반응을 유도할 수 있는 문제점이 있다.
한편, 엽록체 전이 펩타이드가 융합되는 재조합 단백질을 엽록체로 효율적으로 이동시키기 위해서는 엽록체로 이동하여 절단되는 부위에서 확장되는 추가 서열을 필요로 한다. 그러나, 절단되는 부위에서 확장되는 추가 서열은 앞서 설명한 바와 같이 엽록체 전이 펩타이드가 절단되어 분해되더라도 엽록체 전이 펩타이드 일부 아미노산 잔기가 재조합 단백질에 융합되어 잔존하게 된다. 따라서, HPV L1 재조합 단백질을 엽록체로 효율적으로 이동시키면서도, 엽록체로 이동된 후 전이 펩타이드가 완전히 제거된 HPV L1 단백질 생산 시스템을 개발할 필요성이 요구되었다.
이에 본 발명에서는 상기 기술적 과제를 해결할 수 있는 HPV16 L1 단백질 생산 시스템을 개발하고자 예의 노력한 결과, 엽록체 전이 펩타이드의 아미노산 길이를 조절하고, 그 N-말단에 SUMO 단백질을 위치시킨 후 HPV16 L1 단백질을 융합시키는 경우, HPV16 L1 단백질을 식물의 엽록체로 효과적으로 이동시키는 동시에 전이 펩타이드가 완전히 제거됨과 동시에 C-말단의 아미노산 결손이 없는 원래의 HPV16 L1 단백질과 동일한 단백질 효과적으로 생산할 수 있으며 상기 단백질은 효율적으로 VLP를 형성함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Aleyo Chabeda et al., Papillomavirus Res. 2018 Jun;5:46-58.
Jorma Paavonen et al., Lancet. 2007 Jun 30;369(9580):2161-2170.
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Maryam Zahin et al. PLoS One. 2016; 11(8): e0160995.
본 발명은 식물로부터 인유두종 바이러스 유사 입자를 효율적으로 생산할 수 있는 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 엽록체 전이 펩타이드, (ii) SUMO 단백질, 및 (iii) HPV16 L1 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 DNA 컨스트럭트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 DNA 컨스트럭트는 5' UTR; 및/또는 UBQ10 intron 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 DNA 컨스트럭트는 P19 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (i) 엽록체 전이 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 1 내지 60번째 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 제1 DNA 컨스트럭트; 및 SUMO protease를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 DNA 컨스트럭트를 포함하는, DNA 컨스트럭트 쌍을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 제1 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제1 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터; 및 SUMO protease를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제2 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터;가 도입되어 있는 식물세포를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 식물세포는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 구성된 군으로부터 선택되는 식물로부터 유래된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 식물세포에서 HPV16 L1 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 식물세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 식물세포를 파쇄하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 배양된 식물세포를 파쇄하여 수득된 총 가용성 단백질 추출물을 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 총 가용성 단백질 추출물을 포함하는 헤파린 친화성 크로마토그래피용 로딩 버퍼는 0.3M 내지 0.8M의 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제 후 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HPV16 L1 재조합 단백질은 바이러스-유사 입자로 자가-조립(self-assemble)되어 생산되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 제1 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제1 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터; 및 SUMO protease를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제2 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터;가 도입되어 있는 형질전환 식물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환 식물은 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 형질전환 식물에서 HPV16 L1 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 형질전환 식물을 생장시키는 단계; 및
(b) 상기 식물로부터 분리된 조직을 파쇄하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 식물로부터 분리된 조직을 파쇄하여 수득된 총 가용성 단백질 추출물을 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 총 가용성 단백질 추출물을 포함하는 헤파린 친화성 크로마토그래피용 로딩 버퍼는 0.3M 내지 0.8M의 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제 후 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HPV16 L1 재조합 단백질은 바이러스-유사 입자로 자가-조립(self-assemble)되어 생산되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 생산된 HPV16 L1 재조합 단백질을 포함하는 HPV16 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 HPV L1 재조합 단백질 생산 시스템은 HPV16 L1 재조합 단백질을 식물의 엽록체로 효과적으로 이동시키는 동시에 엽록체로의 이동을 위해 융합되어 있던 엽록체 전이 펩타이드가 엽록체 이동 후 완전히 제거될 수 있으며, HPV16 L1 재조합 단백질의 식물 세포 내 발현량을 향상시키면서도 체내 투여시 자연적 바이러스와 거의 동일하게 면역반응을 유도하는 바이러스 유사 입자 형태로 제조할 수 있다는 장점을 갖는다.
도 1은 애기장대의 RbcS 유전자의 N-말단 부위의 길이에 따른 엽록체로의 이동 효율을 확인하고자 다양한 길이 (54, 60, 70 및 79개의 아미노산 잔기)의 N-말단 단편을 green fluorescent protein (GFP)의 N-말단에 융합되도록 재조합 유전자를 구축하고 이를 애기장대의 원형질체에 도입하여 엽록체로의 이동 효율을 확인한 결과이다. 항-마우스-GFP 항체을 이용하여 GFP-융합 단백질의 processed form 및 precursor form을 검출하였다.
도 2는 본 발명에 따른 HPV16 L1 재조합 단백질을 식물에서 발현시키기 위해 제작된 다양한 재조합 DNA 컨스트럭트를 나타낸다.
도 3은 아그로박테리움-매개 침투 방법으로 N. benthamiana 잎 조직에 도 2에서 제작된 재조합 DNA 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터를 형질전환하고, 잎 조직 추출물로부터 19㎍의 총 가용성 단백질을 SDS/PAGE로 전개한 후, CBB 염색 또는 항-HPV16 L1 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 한 결과이다.
도 4는 헤파린 친화성 크로마토그래피를 이용하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 발현하는 N. benthamiana의 잎 조직으로부터 확보한 총 수용성 단백질 추출물로부터 헤파린 친화성 레진(affinity resin)을 이용하여 숙주 단백질의 오염 없이 HPV16 L1 단백질을 분리 정제하기 위한 조건을 확인하기 위해서 총 수용성 단백질 추출물의 NaCl 농도를 변화시키면서 HPV16 L1 단백질이 헤파린 친화성 레진에 결합하도록 한 후 헤파린 친화성 레진에 결합된 단백질을 0.8 M NaCl 농도로 유리하여 SDS-PAGE로 전개한 후 CBB (coomassie brilliant blue) 염색 (왼쪽) 또는 항 HPV16 L1 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅 (오른쪽)으로 확인한 결과이다. M, 단백질 크기 스탠다드; lane 1, 총단백질 추출물; lane 2, 총단백질 추출물을 2mM Phytate and 2mM CaCl2을 처리한 후 확보한 단백질 추출물; lane 3-6, 각각 0.33M, 0.4M, 0.5M 및 0.65M NaCl 농도로 처리한 추출물의 비결합 단백질 분획; Lane 7-10, 각각 0.33M, 0.4M, 0.5M, 0.65M로 처리한 후 0.8M NaCl로 유리한 HPV16 L1 단백질 분획.
도 5는 헤파린 친화성 크로마토그래피 이후 크기 배제 크로마토그래피를 추가로 진행하여 HPV16 L1 단백질을 정제한 각 분획에 따른 (A) 흡광도 및 (B) SDS/PAGE로 전개한 후 항-HPV16 L1 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 N. benthamiana 형질전환 식물체에서 HPV16 L1 재조합 단백질의 VLP를 분리 정제한 후 이를 음성 염색하여 (A) 150,000 및 (B) 250,000의 배율에서 투과 전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 (A) 형질전환 식물체 유래 정제된 HPV16 L1 재조합 단백질 VLP 또는 (B) 형질전환 식물체 유래 정제 후 해체된(disassembled) HPV16 L1 재조합 단백질로 플레이트를 코팅하고, PBS, PBS(vehicle, 대조군)를 마우스에 2회 피하주사 후 분리된 혈청, 10㎍의 형질전환 식물체 유래 정제된 HPV16 L1 재조합 단백질 VLP를 마우스에 2회 피하주사 후 분리된 혈청으로 ELISA 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 HPV16 L1 재조합 단백질을 식물에서 발현시키기 위해 제작된 다양한 재조합 DNA 컨스트럭트를 나타낸다.
도 3은 아그로박테리움-매개 침투 방법으로 N. benthamiana 잎 조직에 도 2에서 제작된 재조합 DNA 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터를 형질전환하고, 잎 조직 추출물로부터 19㎍의 총 가용성 단백질을 SDS/PAGE로 전개한 후, CBB 염색 또는 항-HPV16 L1 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 한 결과이다.
도 4는 헤파린 친화성 크로마토그래피를 이용하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 발현하는 N. benthamiana의 잎 조직으로부터 확보한 총 수용성 단백질 추출물로부터 헤파린 친화성 레진(affinity resin)을 이용하여 숙주 단백질의 오염 없이 HPV16 L1 단백질을 분리 정제하기 위한 조건을 확인하기 위해서 총 수용성 단백질 추출물의 NaCl 농도를 변화시키면서 HPV16 L1 단백질이 헤파린 친화성 레진에 결합하도록 한 후 헤파린 친화성 레진에 결합된 단백질을 0.8 M NaCl 농도로 유리하여 SDS-PAGE로 전개한 후 CBB (coomassie brilliant blue) 염색 (왼쪽) 또는 항 HPV16 L1 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅 (오른쪽)으로 확인한 결과이다. M, 단백질 크기 스탠다드; lane 1, 총단백질 추출물; lane 2, 총단백질 추출물을 2mM Phytate and 2mM CaCl2을 처리한 후 확보한 단백질 추출물; lane 3-6, 각각 0.33M, 0.4M, 0.5M 및 0.65M NaCl 농도로 처리한 추출물의 비결합 단백질 분획; Lane 7-10, 각각 0.33M, 0.4M, 0.5M, 0.65M로 처리한 후 0.8M NaCl로 유리한 HPV16 L1 단백질 분획.
도 5는 헤파린 친화성 크로마토그래피 이후 크기 배제 크로마토그래피를 추가로 진행하여 HPV16 L1 단백질을 정제한 각 분획에 따른 (A) 흡광도 및 (B) SDS/PAGE로 전개한 후 항-HPV16 L1 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 N. benthamiana 형질전환 식물체에서 HPV16 L1 재조합 단백질의 VLP를 분리 정제한 후 이를 음성 염색하여 (A) 150,000 및 (B) 250,000의 배율에서 투과 전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 (A) 형질전환 식물체 유래 정제된 HPV16 L1 재조합 단백질 VLP 또는 (B) 형질전환 식물체 유래 정제 후 해체된(disassembled) HPV16 L1 재조합 단백질로 플레이트를 코팅하고, PBS, PBS(vehicle, 대조군)를 마우스에 2회 피하주사 후 분리된 혈청, 10㎍의 형질전환 식물체 유래 정제된 HPV16 L1 재조합 단백질 VLP를 마우스에 2회 피하주사 후 분리된 혈청으로 ELISA 분석한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 HPV16 L1 단백질을 식물 (N. benthamiana) 잎세포의 엽록체에서 발현하여 HPV16 L1 단백질 VLP를 생산하기 위한 기술을 개발하였다. 선행 연구에서는 식물에서 HPV16 L1d22 단백질을 N. benthamiana에서 발현시키고 엽록체에 축적 및 저장시키고자 RbcS 단백질의 N-말단 59개의 아미노산으로 구성된 전이 펩타이드를 사용한 결과, 전이 펩타이드 유래 잔기가 HPV16 L1d22 단백질에 융합되어 남아 있는 형태로 VLP를 형성하는 것을 확인하였다. 이 경우, 전이 펩타이드 유래 잔기는 체내 주입하는 경우 에피토프로 작용할 가능성이 있다. 한편, HPV16 L1 단백질에 융합되어 남아 있는 전이 펩타이드 유래 잔기를 제외한 전이 펩타이드를 이용하는 경우, HPV16 L1 단백질의 엽록체로의 이동 효율이 낮아지는 문제점이 있다.
이에, 본 발명에서는 엽록체 전이 펩타이드의 아미노산 길이를 60개 이상으로 조절하고, 그 N-말단에 SUMO 단백질을 위치시킨 후 HPV16 L1 단백질을 융합시키고 SUMO 단백질을 SUMO 특이적 프로테아제인 bdSENP1을 이용하여 단백질 가수분해 절단(proteolytic cleavage)함으로써 HPV16 L1 단백질을 식물의 엽록체로 효과적으로 이동시키는 동시에 전이 펩타이드가 완전히 제거된 HPV16 L1 단백질 효과적으로 생산하도록 하였다. 또한, HPV16 L1 유전자 발현을 증진시키고자 5' UTR에 번역 강화 서열(translational enhancing sequence)이 위치하도록 하였으며, 이의 5' 업스트림 부위(upstream region)에 UBQ10 인트론을 포함하여 재조합 유전자 컨스트럭트를 구축하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (i) 엽록체 전이 펩타이드(Chloroplast transit peptide), (ii) SUMO 단백질, 및 (iii) HPV16 L1 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 DNA 컨스트럭트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 DNA 컨스트럭트는 HPV16 L1 재조합 단백질을 식물에서 생산하기 위한 DNA 컨스트럭트인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 HPV16 L1 재조합 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 엽록체 전이 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 1 내지 60번째 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
예컨대, 상기 엽록체 전이 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는 상기 엽록체 전이 펩타이드는 엽록체로의 이동 효율을 추가로 강화시키고자 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 70개 이상, 더 바람직하게는 80개 이상의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 SUMO 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 본 기술분야의 통상의 기술자가 다양한 생물로부터 유래된 SUMO 도메인과 이를 절단할 수 있는 SUMO protease로 적절히 변경하여 사용할 수 있음은 자명할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 DNA 컨스트럭트는 5' UTR; 및/또는 UBQ10 인트론 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 5' UTR 서열은 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 UBQ10 인트론 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 DNA 컨스트럭트는 P19 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 P19 단백질은 서열번호 10의 아미노산 잔기로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 HPV16 L1 재조합 단백질이 엽록체로 이동 후 엽록체 전이 펩타이드를 완전히 제거하기 위하여, 상기 제1 DNA 컨스트럭트; 및 SUMO protease를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 DNA 컨스트럭트를 포함하는, DNA 컨스트럭트 쌍을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 SUMO protease는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 제1 DNA 컨스트럭트; 상기 제2 DNA 컨스트럭트; 및 P19 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 DNA 컨스트럭트를 포함하는, DNA 컨스트럭트(constructs)를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열의 상동성과는 무관하게, 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 효소를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 단편 또한 단편의 길이와는 무관하게, 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 효소를 코딩하는 유전자를 의미한다.
또한, 본 발명의 유전자의 발현산물인 단백질의 아미노산 서열이 해당 효소의 역가 및 활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 미생물 등 생물자원들로부터 확보될 수 있으며, 그러한 다른 생물자원으로부터 확보한 단백질 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
따라서, 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 갖는 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리펩타이드란 아미노산 서열의 상동성과는 무관하게, 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 폴리펩타이드의 단편 또한 단편의 길이와는 무관하게, 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 단백질은 그 일부 아미노산이 치환될 수 있는데, 본 출원의 아미노산 치환은 비 보존 치환(non-conserved substitutions)일 수 있다. 상기 비 보존 치환은, 예를 들어, 특정 측쇄 크기 또는 특정 특성 (예를 들어, 친수성)을 갖는 아미노산 잔기를 상이한 측쇄 크기 또는 상이한 특성 (예를 들어, 소수성)을 갖는 아미노산 잔기로 대체하는 것과 같은 비 보존 방식으로, 표적 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 변경하는 것을 포함할 수 있다.
상기 아미노산 치환은 또한 보존된 치환(conserved substitutions)일 수 있다. 상기 보존된 치환은, 예를 들어, 특정 측쇄 크기 또는 특정 특징 (예를 들어, 친수성)을 갖는 아미노산 잔기를 동일하거나 유사한 측쇄 크기 또는 동일하거나 유사한 특성 (예: 여전히 친수성)을 갖는 아미노산 잔기로 대체하는 것과 같이, 보존된 방식으로 표적 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 변경하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 보존된 치환은 일반적으로 생산된 단백질의 구조 또는 기능에 큰 영향을 미치지 않는다. 본 출원에서, 융합 단백질의 돌연변이인 아미노산 서열 변이체, 이의 단편, 또는 하나 이상의 아미노산이 치환된 이의 변이체는 단백질의 구조 또는 기능을 현저하게 변화시키지 않는 보존된 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
예를 들어, 다음 그룹 각각에서 아미노산 간의 상호 치환(mutual substitutions)은 본 출원에서 보존적 치환으로 간주될 수 있다:
비극성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌.
극성 측쇄를 갖는 비하전 아미노산 그룹: 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민.
극성 측쇄를 갖는 음전하 아미노산 그룹: 아스파르트산 및 글루탐산.
양전하를 띤 염기성 아미노산 그룹: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘.
페닐을 갖는 아미노산 그룹: 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신.
본 발명에 포함된 단백질, 폴리펩티드 및/또는 아미노산 서열은 또한 적어도 다음 범위를 포함하는 것으로 이해될 수 있다: 상기 단백질 또는 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 기능을 갖는 변이체 또는 상동체(homologues).
본 발명에서, 상기 변이체는 상기 단백질 및/또는 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 생성된 단백질 또는 폴리펩티드 일 수 있다. 예를 들어, 상기 기능적 변이체는 적어도 1 개의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입, 예를 들어 1-30, 1-20 또는 1-10, 대안적으로, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의한 아미노산 변화를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 기능적 변이체는 변화 (예를 들어, 치환, 결실 또는 첨가) 전에 상기 단백질 또는 상기 폴리펩티드의 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 수 있다. 예를 들어, 상기 기능적 변이체는 변경 전에 상기 단백질 또는 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성의 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 100 % 이상을 보유할 수 있다.
본 발명에서, 상기 상동체(homologue)는 상기 단백질 및/또는 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 약 80 % (예를 들어, 적어도 약 85 %, 약 90 %, 약 91 %, 약 92 %, 약 93 %, 약 94 %, 약 95 %, 약 96 %, 약 97 %, 약 98 %, 약 99 % 이상) 서열 상동성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드 일 수 있다.
본 발명에서, 상기 상동성은 일반적으로 둘 이상의 서열 간의 유사성(similarity), 유의성(analogousness) 또는 연관성(association)을 지칭한다. "서열 상동성 백분율(percent of sequence homology)"은 동일한 핵산 염기 (예: A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기 (예 : Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 존재하는 위치의 수를 결정하는 비교 창에서 정렬된 두 서열을 비교하는 방식에 의해 계산될 수 있으며, 비교 창(즉, 윈도우 사이즈)의 일치하는 위치의 수를 제공하기 위하여 일치하는 위치의 수를 총 위치 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 상동성의 백분율을 제공한다. 서열 상동성의 백분율을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계에 알려진 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 당업자는 비교되는 전장 서열 내에서 또는 표적 서열 영역 내에서 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 상기 상동성은 또한 다음 방법에 의해 결정될 수 있다: FASTA 및 BLAST. FASTA 알고리즘은 예를 들어 W. R. Pearson and D. J. Lipman's "Improved Tool for Biological Sequence Comparison", Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 2444-2448, 1988; 및 D, J. Lipman and W. R. Pearson's "Fast and Sensitive Protein Similarity Search", Science, 227:1435-1441, 1989에 개시되어 있고, BLAST 알고리즘에 대한 설명은 S. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers and D. Lipman, "A Basic Local Alignment Search Tool", Journal of Molecular Biology, 215: 403-410, 1990를 참조하길 바란다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 제1 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제1 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터; 및 SUMO protease를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제2 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터;가 도입되어 있는 식물세포를 제공한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 제1 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제1 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터; SUMO protease를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제2 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터; 및 P19 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제3 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터;가 도입되어 있는 식물세포를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 식물세포는 HPV16 L1 재조합 단백질을 생산하기 위한 용도로 사용될 수 있으며, 상기 식물세포는 HPV16 L1 재조합 단백질을 VLP 형태로 생산할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식물세포는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 구성된 군으로부터 선택되는 식물로부터 유래된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다. 본 발명에서는 통상적으로 식물체의 형질전환에 사용되는 binary vector가 사용되었다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합 벡터 내에 포함되게 된다. 재조합 벡터는 식물세포 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하는 것이 바람직하다. 상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 식물 또는 식물세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 한편, "형질감염(transfection)"은 DNA를 숙주 세포에 도입하여 숙주 세포 내에서 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 시스템 내에서 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터 및 발현 조절 서열 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 벡터의 복제수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현 또한 고려되어야만 한다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, double enhancer CaMV, MacT, CsVMV, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, HSP18.2 터미네이터, 담배 (Nicotiana tabacum) 익스텐신의 인트로 제거 터미네이터, protease 인히비터 II 터미네이터, RD19B 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 식물세포는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물로부터 유래된 식물세포인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
일부 양태로서, 상기 식물세포는 Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum 또는 Arabidopsis thaliana로부터 유래된 것을 특징으로 할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 상기 식물세포를 이용하여 효과적으로 HPV16 L1 재조합 단백질 생산하는 방법을 개발하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 식물세포에서 HPV16 L1 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 식물세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 식물세포를 파쇄하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 배양된 식물세포를 파쇄하여 수득된 총 가용성 단백질 추출물을 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 상기 총 가용성 단백질 추출물을 포함하는 헤파린 친화성 크로마토그래피용 로딩 버퍼는 0.3M 내지 0.8M의 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
예컨대, 본 발명에 있어서, HPV16 L1 재조합 단백질의 순수 분리 정제 목적의 헤파린 친화성 크로마토그래피를 수행하기 위한, 상기 총 가용성 단백질 추출물의 최종 농도로서 0.33M 내지 0.65M의 염화나트륨(NaCl), 예를 들어, 0.50 내지 0.65M의 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것을 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제 후 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 헤파린 친화성 크로마토그래피의 추출 단계에서는 0.7 내지 0.9, 바람직하게는 0.75 내지 0.85M, 예컨대, 약 0.8M의 염화나트륨을 포함하는 버퍼로 추출하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 HPV16 L1 재조합 단백질은 바이러스-유사 입자로 자가-조립(self-assemble)되어 생산되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 제1 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제1 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터; 및 SUMO protease를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제2 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터;가 도입되어 있는 형질전환 식물에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 제1 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제1 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터; 상기 제2 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제2 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터; 및 P19 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제3 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터;가 도입되어 있는 형질전환 식물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환 식물은 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환 식물은 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
예컨대, 상기 쌍자엽 식물은 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 및 샐러리로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
일부 양태로서, 상기 형질전환 식물은 Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum 또는 Arabidopsis thaliana 인 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 형질전환 식물에서 HPV16 L1 재조합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다:
(a) 상기 형질전환 식물을 생장시키는 단계; 및
(b) 상기 식물로부터 분리된 조직을 파쇄하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 식물로부터 분리된 조직을 파쇄하여 수득된 총 가용성 단백질 추출물을 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 상기 총 가용성 단백질 추출물을 포함하는 헤파린 친화성 크로마토그래피용 로딩 버퍼는 0.3M 내지 0.8M의 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제 후 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 HPV16 L1 재조합 단백질은 바이러스-유사 입자로 자가-조립(self-assemble)되어 생산되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서, HPV16 L1 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 벡터를 통해 형질전환 식물 또는 식물세포에서 일시적으로 발현 (transient Expression)되거나, 안정적 형질전환 (stable transformation)될 수 있다.
HPV16 L1 재조합 단백질을 코딩하는 유전자가 형질전환 식물 또는 식물세포에서 일시적 발현되는 것 이외에도, 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 형질전환 식물 또는 식물세포 게놈에 도입되어 염색체상 인자로서 존재함으로써 안정적으로 형질전환될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 목적 단백질을 타겟으로 하는 유전자를 식물 게놈 염색체에 삽입하여서 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.
본 발명에 있어서, HPV16 L1 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터의 도입 또는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 염색체 삽입은, 식물 세포들의 집단 (population)에, 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 함유하는 아그로박테리움을 첨가하여 공동배양시킴으로써 수행될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 공동배양은 암조건에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 공동배양은 식물 세포와 상기 HPV16 L1 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 아그로박테리움의 배양물을 교반하며 배양하는 것으로, 이후 정치배양 (stationary culture) 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이와 같이, HPV16 L1 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 벡터를 통해 식물 세포 중에서 일시적으로 발현 (transient Expression)되거나, 안정적 형질전환 (stable transformation)될 수 있다.
상기 정치배양은 배양 배지를 교반하지 않고 용기를 정치한 상태에서 배양하는 방법으로, 본원에서는 교반없이 침적하는 것과 혼용하여 사용될 수 있다.
상기 정치배양은 단 회 또는 간헐적 배양 형태로 포함될 수 있다. 단회의 정치배양이 포함되는 경우, 예를 들어 식물 세포와 아그로박테리움의 배양물을 교반하며 공동배양하고, 정치배양한 후 다시 교반배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. 간헐적 정치 배양이 포함되는 경우, 식물 세포와 아그로박테리움의 배양물을 교반하며 공동배양 하고, 정치배양한 후 다시 교반하며 공동배양하는 배양 형태가 수 내지 수십 회 반복될 수 있다.
이때, 상세하게는 상기 배양은 상기 식물세포와 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 함유하는 아그로박테리움의 배양물을 1분 내지 48시간 교반하며 공동배양한 다음, 1분 내지 96시간 정치배양한 후 다시 1 내지 10일간 교반배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. 공동배양을 위해 첨가되는 아그로박테리움의 OD600는 0.00001 내지 2.0일 수 있다.
아그로박테리움의 OD600가 너무 낮으면, 일시적 발현을 위한 형질전환 감염률이 낮아지는 문제가 있고, 너무 높으면 숙주세포의 생존률이 급격하게 감소하는 문제가 있다. 따라서, 상기 정의된 범위의 OD600를 가지는 아그로박테리움을 첨가하여 공동배양하는 것이 바람직하다.
이 때, 아그로박테리움은 통상적으로 식물 형질전환을 위하여 사용되는 아그로박테리움을 사용할 수 있으며, 예시적으로 Agrobacterium tumefaciens 또는 Agrobacterium rhizogenes를 사용할 수 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 식물세포 또는 상기 형질전환 식물로부터 상기 방법에 의해 생산된 HPV16 L1 재조합 단백질을 포함하는 HPV16 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 자궁경부암 백신 조성물인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 백신 조성물에서 상기 HPV16 L1 재조합 단백질은 바이러스-유사 입자로 자가-조립(self-assemble)되어 포함되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 상기 바이러스-유사입자 또는 이의 농축액을 포함하는 형태이거나, 상기 식물세포 자체 또는 식물세포의 건조 분말 형태 또는 상기 형질전환 식물의 건조 분말 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기 백신 조성물은 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 백신 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 제제화할 경우에는 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제가 함께 사용될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. RbcS 유래 trainsit peptide 길이에 따른 표적화 효율 검증
다양한 길이의 RbcS transit peptide는 표 1에 표시된 PF-1/PR-2, PF1/PR-3, 또는 PF-1/PR-4 프라이머쌍을 이용하여 Arabidopsis의 RbcS cDNA를 주형으로 PCR 증폭하였으며, 이들은 제한효소 XbaI 및 XhoI를 이용하여 자른 후 XbaI과 Sal1 제한 효소로 자른 p326-GFP 벡터 (Jin, J.B et al., Plant Cell(2001), 13, 1511-1526)에 라이게이션하였다.
상기 제조된 발현벡터를 애기장대 잎에서 분리한 원형질체에 PEG-매개성 형질전환 방법으로 도입하였다. 동일한 부피의 40% PEG(polyethylene glycol)-3350 용액(Sigma), 0.5M 만니톨 및 100mM CaCl2을 사용하여 상기 클로닝된 플라스미드 5 μg을 2 x 106개의 원형질체 세포에 도입하고 15분 동안 배양한 후 원형질체를 W5 용액 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM glucose, and 1.5 mM Mes-KOH, pH 5.6)의 2배 용량과 1mL의 배양액으로 2회 세척하고 1mL의 배양액에 재현탁한 후, 28℃의 명조건(녹화 원형질체) 및 암조건(황화 원형질체)에서 밤새도록 배양하였다. 원형질체 배양에 사용된 플레이트는 5% FBS로 미리 코팅하였다.
형질전환체를 제조한 후, 24시간 배양하고 원형질체를 수집, 용해하여 정량하고 이로부터 발현되는 RbcS 융합 단백질의 양을 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 분석 방법으로 비교하였다. 구체적으로, 세포 용해액으로부터 단백질 30㎍을 SDS 시료 버퍼와 혼합하여 가열하였고, 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동하였다. 분리된 단백질을 PVDF 막에 이동시키고, 5% 스킴 밀크(skim milk)로 블로킹하였다. 이후 생쥐 유래의 anti-GFP 단일 항체 (1 : 1000 희석; Clontech Laboratories)와 함께 반응시켰고, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시켰다. 이후 ECL 용액을 제조사의 지침에 따라 처리하였다.
그 결과, 도 1에서와 같이 54개의 아미노산 잔기를 갖는 transit peptide와 융합된 GFP 단백질은 전혀 엽록체로 이동하지 못하였으나, 60개 아미노산 잔기를 갖는 transit peptide와 융합된 GFP 단백질은 대부분 엽록체로 이동하고, 일부의 융합 단백질만이 엽록체로 이동하지 못한 채 precursor form으로 남아 있었다. 한편, 각각 70개 및 79개 아미노산 잔기를 갖는 transit peptide와 융합된 GFP 단백질은 모두 엽록체로 이동하여 processed form만이 확인되었다.
이와 같은 결과로부터, 재조합 단백질의 엽록체로의 효과적인 이동을 위하여 엽록체 transit peptide의 N-말단으로부터 적어도 60개 아미노산이 필요하고, 특히 70개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 엽록체 transit peptide는 융합단백질을 완전히 엽록체로 이동시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2. HPV16 L1 재조합 단백질 발현 벡터의 구축
HPV16 L1 단백질에 엽록체 transit peptide가 융합되어 발현되도록 DNA 컨스트럭트를 제작하여 식물에 도입하면, HPV16 L1 재조합 단백질을 엽록체에 축적시켜 생산할 수 있다(Maryam Zahin et al. PLoS One. 2016; 11(8): e0160995). 그러나 HPV16 L1 재조합 단백질이 엽록체로 이동하는 과정에서 엽록체 transit peptide가 잘려 나가지만 엽록체 transit peptide C-말단의 일부 아미노산 잔기는 여전히 HPV16 L1 재조합 단백질에 융합되어 있는 것으로 나타났다 (Maryam Zahin et al. PLoS One. 2016; 11(8): e0160995.)
이처럼 HPV16 L1 재조합 단백질의 N-말단에 엽록체 transit peptide 유래 일부 아미노산 잔기가 남아 있으면, HPV16 L1 재조합 단백질의 VLP 형성에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 이는 HPV16 L1과 무관한 면역반응을 유도하는 에피토프로 작용할 수 있다. 따라서, 식물에서 HPV16 L1 재조합 단백질을 생산하기 위해서는 HPV16 L1 재조합 단백질이 엽록체로 이동하는 효율을 극대화하는 동시에, 외인성(exogenenous) 아미노산 잔기 없는 정확한(authentic) HPV16 L1 재조합 단백질을 생산할 수 있는 시스템을 개발할 필요가 있었다.
이를 위하여, 본 발명에서는 SUMO domain과 SUMO-specific protease인 bdSENP1을 이용하고자 하였다.
2-1. pMacT19-SR-16 벡터
먼저 MacT promoter는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열(화학적 합성, 바이오니아, 한국)을 주형으로 하여 PF-5/PR-6 프라이머 쌍으로 PCR을 증폭하고 PstI 과 XbaI 제한효소로 절단한 후, 이를 동일한 제한효소로 절단한 pCBM3-bdSUMO-hIL6 binary 벡터 (Islam Md. R. et al., Plant Biotechnol. J. (2018), 10.1111/pbi.13040)에 라이게이션하였다.
이후, 양 말단에 SpeI 및 XhoI 제한효소를 가지도록 증폭된 HPV16-L1 유전자(중앙대 김진홍 교수 제공)를 SpeI 및 XhoI 제한효소로 절단한 후, SpeI 및 XhoI 제한효소로 절단한 상기 MacT 프로모터가 도입된 벡터에 라이게이션 하여 pMacT:BiP:CBM3:bdSUMO:HPV16-L1을 구축하였다.
HPV16 L1을 엽록체로 표적화하기 위하여 BiP:CBM3 domain을 RbcS transit peptide로 치환하고자 하였다. 이를 위하여 루비스코 복합체(rubisco complex)의 작은 서브유닛인 RbcS (RbcS, accession number, AY065101)의 transit peptide를 사용하고자 하였으며, 이 RbcS transit peptide는 Arabidopsis의 RbcS cDNA를 주형으로 PF-12/PR-13 프라이머쌍으로 PCR 증폭하고 XbaI 및 XmaI 제한효소로 절단한 후, 상기 pMacT:BiP:CBM3:bdSUMO:HPV16-L1 벡터를 동일한 제한 효소로 절단한 후 라이게이션하므로써 BiP:CBM3를 RbcS transit peptide로 치환한 pMacT:RbcS:bdSUMO:HPV16-L1를 구축하였다. 이때 RbcS transit peptide의 증폭에 사용된 PF12 primer에 M17 5' UTR 서열이 포함되도록 프라이머를 디자인하였다.
마지막으로 RD29B 터미네이터는 서열 번호 13(화학적 합성, 바이오니아, 한국)을 주형으로 하여 PF-14/PR15 프라이머 쌍으로 PCR 증폭하고 제한효소 XhoI과 EcoR1로 절단한 후, pMacT:RbcS:bdSUMO:HPV16-L1 벡터를 동일한 제한효소로 절단하고 HPV16-L1 유전자 3' 말단에 위치하도록 라이게이션함으로써 pMacT19-SR-16를 구축하였다. .
2-2. pMacIN19-SR16 벡터
한편, HPV16 L1 재조합 유전자 컨스트럭트의 5' 업스트림 부위(upstream region)에 Arabidopsis UBQ10의 인트론(intron)을 삽입하기 위하여, MacT-UBQ10 인트론 융합 DNA 단편을 Arabidopsis의 gDNA 및 MacT promoter를 주형으로 각각 PF-5/PR-7 및 PF-8/PR-9 프라이머 쌍을 이용하여 오버랩(overlap) PCR을 수행하여 융합 증폭한 후 제한효소 Pst1과 XbaI을 이용하여 절단하고, 상기 pMacT19-SR-16 벡터에서 MacT 프로모터를 제한효소 Pst1과 XbaI로 제거한 후, 제거된 위치에 MACT-UBQ10의 인트론(intron) 융합 단편을 삽입하여 pMacIN19-SR16 벡터를 구축하였다.
2-3. pP19 벡터
gene silencing suppressor 유전자인 P19을 발현시키기 위하여 P19 유전자는 화학적으로 합성하였으며 (바이오니아, 대전, 대한민국), 이를 주형으로 PF-10/PR-11 프라이머 쌍으로 PCR 증폭하고, XbaI 및 XhoI 제한효소로 절단한 후, pCAMPIA1300 벡터(addgene)를 XbaI 및 XhoI 제한효소로 절단하고 35S 프로모터와 Nos-터미네이터 사이에 위치하도록 삽입하였다. P38은 바이러스 유사 입자를 생성하여, 본 발명을 통해 생산하고자 하는 HPV16 L1의 분리 정제를 방해하기 때문에, 이러한 방해작용을 하지 않는 gene silencing suppressor인 P19를 사용하였다.
2-4. pBdSENP1:HA 벡터
마지막으로, SUMO-specific protease인 BdSENP1가 엽록체에 표적화되어 발현되도록 애기장대 RbcS의 N-말단 부위 1-80 아미노산(즉, transit peptide)을 암호화하는 DNA 단편 (RbcSN80)을 상기와 같이 PF12/PR18 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하고, BdSENP1는 pRSET-bdSENP1 (Islam Md. R. et al., Plant Biotechnol. J. (2018), 10.1111/pbi.13040)을 주형으로 PF16/PR17 프라이머 쌍을 이용하여 BdESNP1:HA 형태로 증폭하고 이를 각각 XbaI 및 BamH1 또는 BamH1 및 XhoI으로 절단하고, 35S promoter와 Nos-terminator가 있는 pCAMBIA1300 벡터 (addgene)를 XbaI과 Xho1으로 절단한 후 삽입하여 pBdSENP1:HA 발현 벡터를 구축하였다. 이때 PR17 primer에 HA 서열을 포함하도록 프라이머를 디자인하였다.
클로닝에 사용된 프라이머 서열은 표 1과 같다.
| Primer | Sequence 5'-3' |
| PF-1 | 35S-Seq: TTTCAGAAAGAATGCTAACC |
| PR-2 | XhoI-RbcS_54-R: CCG CTCGAG gttaactcttccgccgtt |
| PR-3 | XhoI-RbcS_60-R: CCG CTCGAG aggccacacctgcatgca |
| PR-4 | XhoI-RbcS_70-R: CCG CTCGAG gagagtctcaaacttcttc |
| PF-5 | PstI-MacT-F: GGG ctgcagagagatctcctttgcccc |
| PR-6 | XbaI-MacT-R: GGG tctagaaacgatttggtgtatcg |
| PR-7 | Intr-MacT-overlapping-R: aaggaacacagaaatttaccttgaacgatttggtgtatcg |
| PF-8 | MacT-Intr-overlapping-F: cgatacaccaaatcgttcaaggtaaatttctgtgttcctt |
| PR-9 | XbaI-Intr-R :GGG tctagaatctgttaatcagaaaaactcagattaatcgacaaattcgatcgcacaaactagaaactaacacca gaactagatag |
| PF-10 | XbaI-P19: GGG tctagaatggaacgagctatacaaggaaac |
| PR-11 | XhoI-P19: GGG ctcgagttactcgctttctttttcgaa |
| PF-12 | XbaI-M17UTR-RbcS-F: GGG tctagaggcgtgtgtgtgtgttaaagaatggcttcctctatgctctct |
| PR-13 | XmaI-RbcS-R: GGG cccggggggaatcggtaaggtcagg |
| PF-14 | XhoI-Rd29B-F: GGG ctcgagaattttactcaaaat |
| PR-15 | EcoRI- Rd29B-R: GGG aattcatttttgtttgaact |
| PF-16 | BamHI-BdSENP1-F: GGG ggatccccattcgttccgcttacc |
| PR-17 | RBdSENP1-HA-XhoI: GGG ctcgagctatgcataatctggaacatcatatgggtatccagccttcaaatcaagtat |
| PR-18 | BamHI-RbcS-R: GGGGGATCCCTGGGAATCGGTAAGGTCAGG |
실시예 3. 형질전환 식물체의 제작 및 HPV16 L1 발현량 비교
실시예 2에서 구축된 재조합 단백질 발현 벡터를 당해 분야에 공지된 방법으인 아그로박테리움-매개 형질전환 방법을 이용하여 N. benthamiana 잎에 도입하였다.
구체적으로, 형질전환은 (i) pMacT19-SR-16 단독 발현, (ii) pMacT19-SR-16와 pP19 공동 발현, (iii) pMacT19-SR-16, pP19, pBdSENP1:HA 공동 발현, (iv) pMacIN19-SR-16 단독 발현, (v) pMacIN19-SR-16와 pP19 공동 발현, (vi) pMacIN19-SR-16, pP19, pBdSENP1:HA 공동 발현의 6 가지 실험군으로 진행하였고, Mock 대조군으로는 동량의 빈 벡터(empty vector)를 형질전환하였다.
형질전환 후 5일째 N. benthamiana 잎 조직을 세포 용해액(50mM Tris-HCl, pH7.2, 200mM NaCl, 0.1% Triton X-100)으로 용해시키고, 시료 로딩 버퍼와 혼합하여 10분간 가열한 후, 14,000 rpm에서 원심분리하여 잔여물을 제거하고 상등액, 즉, 총 가용성 단백질(total soluble protein)을 수득하였다. 이후, 단백질 18 μg에 해당하는 시료를 정량하여 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동하고, Coomassie brillent blue (CBB) 염색 용액 (CBB, 0.1%; 메탄올, 50%; 빙초산, 10%)으로 20분 염색하였다. 염색 후, 40% 메탄올, 10% 빙초산을 포함한 세척 용액으로 탈색하였으며, 염색된 단백질은 LAS3000 이미징 시스템(Fuji, 일본)를 이용하여 발현 수준을 비교하였다. 또한, 웨스턴 블랏팅을 위해, 10% SDS-PAGE 겔에서 분리된 단백질을 PVDF 막에 이동시키고, 5% 스킴 밀크(skim milk)로 블로킹하였다. 이후 rabbit anti-HPV16 L1 항체(1:10000 희석, 중앙대 김홍진 교수, 실험실 제작) 와 함께 반응시켰고, 고추냉이 퍼옥시데이즈(HRP, horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시켰다. 이후 ECL 용액을 제조사의 방법대로 처리하였다.
그 결과, 도 3에서와 같이 pMacT19-SR-16 단독 발현과 비교하여 pP19이 공동 발현된 경우 HPV16 L1 재조합 단백질의 발현량이 현저히 증가하였으며, 5' 업스트림 부위에 UBQ10의 인트론을 삽입하고 개시 코돈 앞에 5'UTR을 포함하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 발현시킨 경우 발현량을 추가로 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 한편, HPV16 L1 재조합 단백질 발현 벡터를 bdSENP1와 공동 발현시킨 경우, transit peptide로부터 유래된 잔여 아미노산 잔기 없는 약 55 kD의 cleaved form HPV16 L1 재조합 단백질이 생성되는 반면, bdSENP1을 공동 발현시키지 않은 경우에는, HPV16 L1 단백질에 transit peptide로부터 유래된 아미노산 잔기가 융합되어 있는 non-cleaved form의 HPV16 L1 재조합 단백질이 확인되었다.
실시예 4. HPV16 L1 분리 및 정제
실시예 3에서는 transit peptide로부터 유래된 아미노산이 완전히 절단된 cleaved form의 HPV16 L1 재조합 단백질이 고발현되어 생산될 수 있음을 확인하였으며, 이하에서는 이렇게 고발현되어 세포 내에 존재하는 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 효율을 향상시키고자 하였다.
이를 위하여, 실시예 3 형질전환 식물체에서 형질전환 4일 후 N. benthamiana 잎 조직을 세포 용해액(50mM Tris-HCl, pH7.2, 200mM NaCl, 0.1% Triton X-100)으로 용해시키고 총 가용성 단백질을 수득하였다. 이를 3중 접힌 게이지 천을 통과시켜 여과시키고, 여과된 균질액을 2mM phytate (Sigma-Aldrich) 및 2mM CaCl2로 처리한 후, 14,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 확보하였다.
각각 0.33M, 0.4M, 0.5M, 또는 0.65M의 NaCl 농도를 갖도록 상등액에 NaCl을 추가한 후, 이 단백질 추출액들을 헤파린 친화성 수지(POROS™50 HE Heparin Affinity Resin, Cat. No. 4333410) 12.5mg으로 채워진 컬럼을 통과 시켜서 HPV16 L1 재조합 단백질이 헤파린 친화성 수지에 결합하도록 유도하였다. 이어서, 상기 컬럼을 300mM NaCl이 포함된 PBS (20mL)로 여러 번 세척하고, 0.8M NaCl이 포함된 PBS를 이용하여 헤파린 친화성 수지에 결합된 HPV16 L1 재조합 단백질을 1ml씩 10개 분획으로 유리시켰다. 이후, 유리된 각 분획을 실시예 3과 동일한 방식으로 SDS/PAGE 후 Coomassie brillent blue 염색 또는 항-HPV16 L1 항체로 웨스턴 블랏팅 분석하였다.
그 결과, 도 4에서와 같이 총 가용성 단백질 추출물을 최종 0.5M 또는 0.65M의 NaCl 농도로 조정하였을 때, 헤파린 수지에 비특이적 결합을 감소시키고, 0.8M NaCl을 포함하는 PBS를 이용하여 유리(elution)시켰을 때, 다른 단백질의 오염(contamination)을 방지하고 높은 함량의 HPV16 L1 재조합 단백질을 분리해 낼 수 있었다.
이후, HPV16 L1 재조합 단백질을 더 순수하게 정제하기 위해서 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 헤파린 친화성 수지로 정제된 분획을 취합하여 Superdex 컬럼(Hitrap, GE Healthcare Life Sciences, USA)에 로딩하고 PBS, pH 7.2, 0.01% Tween 20를 이동상으로 전개시켰다. 분획을 컬럼에서 0.5mL/min로 1ml 분획씩 4시간 동안 수집하고, 280 nm에서의 흡광도는 분광광도계로 측정하였고 HPV16 L1 재조합 단백질은 실시예 3과 동일한 방식으로 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏팅 분석하였다.
그 결과, 도 5에서와 같이 HPV16 L1 재조합 단백질이 첫 번째 피크를 구성하는 8 내지 10번 분획에서 확인되었으며, 이들 분획은 HPV16 L1 재조합 단백질의 분자량인 55 kD 보다 대단히 큰 분자량을 갖는 670 kD의 크기로 확인되어, HPV16 L1 재조합 단백질이 단분자 형태가 아닌 복합체를 이루고 있으며, HPV16 L1 재조합 단백질이 VLP를 형성하고 있을 것으로 예상하였다.
실시예 5. VLP 형성 확인
HPV16 L1 재조합 단백질이 VLP를 형성하는지 확인하고자 실시예 4에서 분리 정제된 HPV16 L1 재조합 단백질을 탄소 코팅 그리드(Electron Microscopy Sciences, USA)에 흡수시키고 2% 인텅스텐산(pH 6.8)으로 음성 염색(negatively staining)한 후, 투과 전자 현미경(Phillips CM-12)에 의해 150,000 및 250,000의 최종 배율에서 관찰하였다.
그 결과, 도 6에서와 같이 HPV16 L1 재조합 단백질이 VLP를 형성하는 것을 확인하였다.
실시예 6. HPV16 L1 재조합 단백질 VLP의 면역 반응 확인
분리 정제된 HPV16 L1 재조합 단백질의 농도는 소 혈청 알부민(BSA; Pierce, USA)이 포함된 Bio-Rad Bradford 단백질 분석 시약(Bio-Rad Laboratories, USA)을 사용하여 결정되었다.
BALB/c 마우스(6-8 주령, 효창 사이언스)는 습도, 온도 및 광주기(12:12)가 제어된 특정 병원균이 없는 조건에서 사육하였다. 마우스는 고압 멸균 식품(NIH 31, 6% 지방, Lab Diet 5K52, Purina Mills, St. Louis, MO) 및 산성화된 물(pH 2.8-3.2)을 자유급이하도록 하였다.
식물 HPV16 L1 재조합 단백질 VLP의 과면역 혈청을 수집하기 위해 BALB/c 마우스를 면역화하였다. 구체적으로, 10㎍의 분리 정제된 HPV16 L1 재조합 단백질 VLP 또는 PBS(대조군)는 추가적인 보조제 없이 2주 간격으로 2차례 피하주사하였다. 첫번째 면역 주사 후 42일째 되는 날에 혈액을 채취하여 항체의 생성 여부를 ELISA를 이용하여 확인하였다.
96웰 ELISA 플레이트(Immunolon 2; Dynatech)를 4℃에서 웰당 형질전환 식물체 유래 정제된 HPV L1 재조합 단백질 VLP 400ng을 1X DPBS에 재현탁시키거나, 형질전환 식물체 유래 정제된 HPV L1 재조합 단백질 VLP을 0.2M NaHCO3 로 4℃에서 12 시간 처리하여 해체된(disassembled) HPV L1 재조합 단백질 400ng을 1X DPBS에 재현탁 시킨 후, 플레이트에 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세척 완충액(PBS-T)으로 3회 세척하고 37℃에서 1시간 동안 1XPBS 중 5% BSA(PBSA)로 블로킹하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 코팅된 플레이트를 1% PBSA에 1:4000으로 희석한 수집된 마우스 혈청과 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, 1% PBSA에 1:5000으로 희석한 알칼리성 포스파타제-접합 염소 항-마우스 gG(H+L)(Sigma, USA)와 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 결합되지 않은 2차 항체는 세척하여 제거하고 결합된 항체는 알칼리성 포스파타제 발색 기질(Sigma, USA)로 염색하고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7에서와 같이 HPV L1 재조합 단백질 VLP가 코팅된 플레이트에 대한 HPV16 L1 재조합 단백질 VLP로 면역화시킨 마우스 혈청은 OD450이 2.5로 확인되었고, 해체된(disassembled) HPV L1 재조합 단백질이 코팅된 플레이트에 대한 HPV16 L1 재조합 단백질 VLP로 면역화시킨 마우스 혈청은 OD450이 1.4로 확인되었으며, PBS 자체 또는 PBS로 면역화시킨 마우스 혈청은 의미 있는 OD450이 확인되지 않아, 본 발명에서 제조된 식물 유래 HPV16 L1 재조합 단백질 VLP는 생체 내에서 HPV16 L1 단백질 VLP와 VLP 구조를 형성하지 않는 HPV16 L1 단백질 모두에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 생산할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. 서열정보
서열번호 1: HPV16 L1 아미노산 서열
MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVTPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL
서열번호 2: HPV16 L1 뉴클레오티드 서열
atgagcctgtggctgcccagcgaggccacagtgtacctgcctcccgtgcccgtgagcaaggtggtgagcaccgacgagtacgtggccagaaccaacatctactaccacgccggcaccagcagactgctggccgtgggacacccctacttccccatcaagaagcccaacaataacaagatcctggtgcccaaggtgagcggcctgcagtacagagtgttcagaatccacctgcccgatcccaacaagttcggctttcccgacaccagcttctacaaccccgacacccagagactggtgtgggcctgcgtgggcgtggaggtgggcagaggccagcccctgggcgtgggcatcagcggccatcccctgctgaacaagctggacgacaccgagaacgccagcgcctacgccgccaacgccggcgtggacaacagagagtgcatcagcatggactacaagcagacccagctgtgcctgatcggctgcaagcctcccatcggcgagcactggggcaagggcagcccctgcaccaacgtggccgtgacacccggcgactgccctcccctggagctgatcaacaccgtgatccaggacggcgacatggtggacaccggcttcggcgccatggacttcaccacactgcaggccaacaagagcgaggtgcccctggacatctgcaccagcatctgcaagtaccccgactacatcaagatggtgagcgagccctacggcgacagcctgttcttttacctgagaagagagcagatgttcgtgagacacctgttcaacagagccggcgccgtgggcgagaacgtgcccgacgacctgtacatcaagggcagcggcagcaccgccaacctggccagcagcaactacttccccacacccagcggcagcatggtgaccagcgacgcccagatcttcaacaagccctactggctgcagagagcccagggccacaacaacggcatctgctggggcaaccagctgttcgtgaccgtggtggacaccacaagaagcaccaacatgagcctgtgcgccgccatcagcaccagcgagaccacatacaagaacaccaacttcaaggagtacctgagacacggcgaggagtacgacctgcagttcatcttccagctgtgcaagatcaccctgaccgccgacgtgatgacctacatccacagcatgaacagcaccatcctggaggactggaactttggcctgcagccccctcccggcggcaccctggaggacacctacagattcgtgaccagccaggccatcgcctgccagaagcacacaccccctgcccccaaggaggaccccctgaagaagtacaccttctgggaggtgaacctgaaggagaagttcagcgccgacctggaccagtttcccctgggcagaaagttcctgctgcaggccggcctgaaggccaagcccaagttcaccctgggcaagagaaaggccacacccaccacaagcagcaccagcacaaccgccaagagaaagaagagaaagctgtaa
서열번호 3: RbcSN80 아미노산 서열
MASSMLSSATMVASPAQATMVAPFNGLKSSAAFPATRKANNDITSITSNGGRVNCMQVWPPIGKKKFETLSYLPDLTDSE
서열번호 4: RbcSN80 뉴클레오티드 서열
atggcttcctctatgctctcttccgctactatggttgcctctccggctcaggccactatggtcgctcctttcaacggacttaagtcctccgctgccttcccagccacccgcaaggctaacaacgacattacttccatcacaagcaacggcggaagagttaactgcatgcaggtgtggcctccgattggaaagaagaagtttgagactctctcttaccttcctgaccttaccgattccgaa
서열번호 5: bdSUMO 아미노산 서열
HINLKVKGQD GNEVFFRIKR STQLKKLMNA YCDRQSVDMT AIAFLFDGRR LRAEQTPDEL
EMEDGDEIDA MLHQTGG
서열번호 6: bdSUMO 뉴클레오티드 서열
cacatcaacc tcaaggtcaa gggtcaggac ggcaatgagg tgttcttccg cattaagagg
tctacccagc tgaagaagct gatgaatgcc tactgcgacc gccagtctgt ggacatgact
gccattgcct tcctgtttga tggtcgcagg ctccgtgcag agcagactcc tgacgagctc
gagatggaag atggcgatga gatcgacgcc atgcttcacc agactggagg c
서열번호 7: UBQ10 Intron Sequence
tcaaggtaaatttctgtgttccttattctctcaaaatcttcgattttgttttcgttcgatcccaatttcgtatatgttctttggtttagattctgttaatcttagatcgaagacgattttctgggtttgatcgttagatatcatcttaattctcgattagggtttcatagatatcatccgatttgttcaaataatttgagttttgtcgaataattactcttcgatttgtgatttctatctagttctggtgttagtttctagtttgtgcgatcgaatttgtcgattaatctgagtttttctgattaacagat
서열번호 8: bdSENP1 아미노산 서열
PFVPLTDEDEDNVRHALGGRKRSETLSVHEASNIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLKCHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRRWTTKRKLGYNLIDCDKIFVPIHKDVHWCLAVINIKEKKFQYLDSLGYMDMKALRILAKYLVDEVKDKSGKQIDVHAWKQEGVQNLPLQENGWDCGMFMLKYIDFYSRDMELVFGQKHMSYFRRRTAKEILDLKAG
서열번호 9: bdSENP1 뉴클레오티드 서열
ccattcgttccgcttaccgatgaggacgaagacaacgttagacatgctcttggcggtagaaagagatcagagacgctctctgtgcatgaggcatctaatatcgttataacacgtgaaattctacaatgccttaacgacaaggaatggctcaatgatgaagttattaacctctacctagagcttcttaaggagcgagaacttagggagccaaataaattcttgaagtgccatttcttcaacacatttttttataagaagcttatcaacggcggttacgattacaagagcgtgaggcgatggactactaagcgtaagctgggatacaaccttatcgactgtgacaagattttcgtgcctattcacaaggatgttcactggtgtttggctgtcatcaatataaaggaaaagaagtttcagtatctggattcgctgggttatatggacatgaaggcactccggattcttgccaagtatctcgtggatgaagtaaaggataagagtggaaagcaaattgatgttcacgcgtggaagcaagagggggtccaaaacttgcctcttcaggagaacggatgggattgtggtatgtttatgcttaagtacatcgatttctactccagagatatggagctagtatttgggcagaagcatatgtcatattttagacgcaggactgctaaggagatacttgatttgaaggctggatag
서열번호 10: P19 아미노산 서열
MERAIQGNDAREQANSERWDGGSGGTTSPFKLPDESPSWTEWRLHNDETNSNQDNPLGFKESWGFGKVVFKRYLRYDRTEASLHRVLGSWTGDSVNYAASRFFGFDQIGCTYSIRFRGVSITVSGGSRTLQHLCEMAIRSKQELLQLAPIEVESNVSRGCPEGTQTFEKESE
서열번호 11: P19 뉴클레오티드 서열
atggaacgagctatacaaggaaacgacgctagggaacaagctaacagtgaacgttgggatggaggatcaggaggtaccacttctcccttcaaacttcctgacgaaagtccgagttggactgagtggcggctacataacgatgagacgaattcgaatcaagataatccccttggtttcaaggaaagctggggtttcgggaaagttgtatttaagagatatctcagatacgacaggacggaagcttcactgcacagagtccttggatcttggacgggagattcggttaactatgcagcatctcgatttttcggtttcgaccagatcggatgtacctatagtattcggtttcgaggagttagtatcaccgtttctggagggtcgcgaactcttcagcatctctgtgagatggcaattcggtctaagcaagaactgctacagcttgccccaatcgaagtggaaagtaatgtatcaagaggatgccctgaaggtactcaaaccttcgaaaaagaaagcgagtaa
서열번호 12: MacT 프로모터 서열
agagatctcc tttgccccag agatcacaat ggacgacttc ctctatctct acgatctagt
caggaagttc gacggagaag gtgacgatac catgttcacc actgataatg agaagattag
ccttttcaat ttcagaaaga atgctaaccc acagatggtt agagaggctt acgcagcagg
tctcatcaag acgatctacc cgagcaataa tctccaggag atcaaatacc ttcccaagaa
ggttaaagat gcagtcaaaa gattcaggac taactgcatc aagaacacag agaaagatat
atttctcaag atcagaagta ctattccagt atggacgatt caaggcttgc ttcacaaacc
aaggcaagta atagagattg gagtctctaa aaaggtagtt cccactgaat caaaggccat
ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg gcgaacagtt
catacagagt ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca tggtggagca
cgacacgctt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat
tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat
ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg
cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt
ggattgatgt gacgcaagac gtgacgtaag tatctgagct agtttttatt tttctactaa
tttggtcgtt tatttcggcg tgtaggacat ggcaaccggg cctgaatttc gcgggtattc
tgtttctatt ccaacttttt cttgatccgc agccattaac gacttttgaa tagatacgct
gacacgccaa gcctcgctag tcaaaagtgt accaaacaac gctttacagc aagaacggaa
tgcgcgtgac gctcgcggtg acgccatttc gccttttcag aaatggataa atagccttgc
ttcctattat atcttcccaa attaccaata cattacacta gcatctgaat ttcataacca
atctcgatac accaaatcgt
서열번호 13: RD29B 종결자 서열
aattttactc aaaatgtttt ggttgctatg gtagggacta tggggttttc ggattccggt
ggaagtgagt ggggaggcag tggcggaggt aagggagttc aagattctgg aactgaagat
ttggggtttt gcttttgaat gtttgcgttt ttgtatgatg cctctgtttg tgaactttga
tgtattttat ctttgtgtga aaaagagatt gggttaataa aatatttgct tttttggata
agaaactctt ttagcggccc attaataaag gttacaaatg caaaatcatg ttagcgtcag
atatttaatt attcgaagat gattgtgata gatttaaaat tatcctagtc aaaaagaaag
agtaggttga gcagaaacag tgacatctgt tgtttgtacc atacaaatta gtttagatta
ttggttaaca tgttaaatgg ctatgcatgt gacatttaga ccttatcgga attaatttgt
agaattatta attaagatgt tgattagttc aaacaaaaat
서열 번호 14: M17 5' UTR
ggcgtgtgtgtgtgttaaagaatggcttcctct
서열번호 15:
HA 염기 서열
tacccatatgatgttccagattatgca
서열번호 16: HA 아미노산 서열
YPYDVPDYA
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (20)
- (i) 엽록체 전이 펩타이드(Chloroplast transit peptide), (ii) SUMO 단백질, 및 (iii) HPV16 L1 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 DNA 컨스트럭트.
- 제1항에 있어서, 5' UTR; 및/또는 UBQ10 intron 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1 DNA 컨스트럭트.
- 제1항에 있어서, P19 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1 DNA 컨스트럭트.
- 제1항에 있어서, 상기 (i) 엽록체 전이 펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 1 내지 60번째 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1 DNA 컨스트럭트.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 제1 DNA 컨스트럭트; 및
SUMO protease를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 DNA 컨스트럭트를 포함하는, DNA 컨스트럭트 쌍.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 제1 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제1 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터; 및
SUMO protease를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제2 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터;가 도입되어 있는 식물세포.
- 제6항에 있어서, 상기 식물세포는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 구성된 군으로부터 선택되는 식물로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 식물세포.
- 다음 단계를 포함하는 식물세포에서 HPV16 L1 재조합 단백질을 생산하는 방법:
(a) 제6항의 식물세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 식물세포를 파쇄하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 단계.
- 제8항에 있어서,
상기 (b) 단계는 상기 배양된 식물세포를 파쇄하여 수득된 총 가용성 단백질 추출물을 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 (b) 단계의 상기 총 가용성 단백질 추출물을 포함하는 헤파린 친화성 크로마토그래피용 로딩 버퍼는 0.3M 내지 0.8M의 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 (b)단계는 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제 후 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 HPV16 L1 재조합 단백질은 바이러스-유사 입자로 자가-조립(self-assemble)되어 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 제1 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제1 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터; 및
SUMO protease를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 DNA 컨스트럭트 또는 상기 제2 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터;가 도입되어 있는 형질전환 식물.
- 제13항에 있어서, 상기 형질전환 식물은 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물.
- 다음 단계를 포함하는 형질전환 식물에서 HPV16 L1 재조합 단백질을 생산하는 방법:
(a) 제13항의 형질전환 식물을 생장시키는 단계; 및
(b) 상기 식물로부터 분리된 조직을 파쇄하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 단계.
- 제15항에 있어서,
상기 (b) 단계는 상기 식물로부터 분리된 조직을 파쇄하여 수득된 총 가용성 단백질 추출물을 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 (b) 단계의 상기 총 가용성 단백질 추출물을 포함하는 헤파린 친화성 크로마토그래피용 로딩 버퍼는 0.3M 내지 0.8M의 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 (b)단계는 헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제 후 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제하여 HPV16 L1 재조합 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 HPV16 L1 재조합 단백질은 바이러스-유사 입자로 자가-조립(self-assemble)되어 생산되는 것을 특징으로 하는 방법
- 제15항의 방법에 의해 생산된 HPV16 L1 재조합 단백질을 포함하는 HPV16 백신 조성물.
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Non-Patent Citations (8)
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| Jorma Paavonen et al., Lancet. 2007 Jun 30;369(9580):2161-2170. |
| Keith S Reisinger et al., Pediatr Infect Dis J. 2007 Mar;26(3):201-9 |
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Also Published As
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