TWI460270B - Bacterial Toxin Vaccine - Google Patents

Bacterial Toxin Vaccine Download PDF

Info

Publication number
TWI460270B
TWI460270B TW098114432A TW98114432A TWI460270B TW I460270 B TWI460270 B TW I460270B TW 098114432 A TW098114432 A TW 098114432A TW 98114432 A TW98114432 A TW 98114432A TW I460270 B TWI460270 B TW I460270B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
dna
stx2eb
protein
seq
hybrid protein
Prior art date
Application number
TW098114432A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201005093A (en
Inventor
Kazutoshi Sawada
Kazuya Yoshida
Takeshi Matsui
Original Assignee
Idemitsu Kosan Co
Nat Univ Corp Nara Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Idemitsu Kosan Co, Nat Univ Corp Nara Inst filed Critical Idemitsu Kosan Co
Publication of TW201005093A publication Critical patent/TW201005093A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI460270B publication Critical patent/TWI460270B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/25—Shigella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/517—Plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Description

細菌毒素疫苗
本發明係關於使用於由志賀毒素、霍亂毒素、大腸桿菌易熱性毒素等之細菌毒素所引起疾病之疫苗之雜交體蛋白質、及用以產生該雜交體蛋白質之DNA結構物。
志賀毒素(Stx，腸毒素)係病原性大腸菌中之腸管出血性大腸菌(enterohemorrhagic Escherichia coli)生產的蛋白質性外毒素。志賀毒素引起出血性腸炎、溶血性尿毒症症候群、腦症等。
志賀毒素係大致分為Stx1及Stx2，進一步再各分為亞型。作為Stx2時可舉例如引起豬浮腫症之Stx2e。已知豬浮腫症係好發於離乳後1~2週的仔豬。因浮腫病菌感染的致死率極高，為50~90%。
另外，霍亂毒素(CT)係Vibrio cholerae生產的蛋白質性外毒素。已知CT引起激烈的下痢或嘔吐。
另外，大腸桿菌易熱性毒素(LT)係毒素原性大腸菌(enterotoxigenic Escherichia coli)生產的蛋白質性內毒素。已知LT引起下痢或嘔吐。
已知Stx、LT、CT中任一種細菌毒素皆由五聚體之參與附著於細胞之B次單元及單體之具有毒性之A次單元而成。另外，已知LT及CT係結構上、機能上類似。
作為預防此等細菌毒素疾病之方法，已知藉由注射或經鼻噴射而投予、或經口投予疫苗之方法。
已知例如使用將無毒化Stx2e蛋白質重組之大腸菌而使產生，藉由注射投予豬之技術(非專利文獻1)。然而，有所謂的藉由重組大腸菌之無毒化Stx2e蛋白質之生產量並不充足之問題或藉由注射投予疫苗耗費勞力等之問題。
另外，就減輕勞力之觀點，於畜產領域，有關經口投予疫苗之方法的關心逐漸升高。於如此背景下，進行開發使用基因轉殖技術，使植物生產細菌毒素蛋白之技術。例如記載關於含編碼LT蛋白質之B次單元(LTB)之DNA，表現該DNA之基因轉殖植物(專利文獻1、專利文獻2)。另外，記載關於表現編碼LT蛋白質或CT蛋白質之DNA之基因轉殖植物(專利文獻3)。然而，此等技術有蛋白質產量不足之問題。另外，揭示使萵苣生產LTB例(非專利文獻2)。此研究中，將改變密碼之LT蛋白質B次單元之基因，使用植物高表現促進子之花椰菜嵌紋病毒(Mosaic Virus)35S RNA促進子(CaMV35S)及增強子(enhancer)之Kozak序列，使於萵苣內表現。揭示該結果係LT蛋白質之B次單元係蓄積萵苣總可溶性蛋白質之約2.0質量%。然而，認為此程度之蛋白質蓄積量係不足以利用基因轉殖植物有效率地進行防治細菌病。亦即，必須有效率地使目的之細菌毒素蛋白質於植物細胞內生產、蓄積。
本發明者等係藉由使用植物來源之乙醇去氫酶(alcohol dehydrogenase)基因之5’-非編碼區(ADH5’UTR)，使加成植物來源之分泌訊號胜肽於胺基末端之Stx2e蛋白質表現，發現使萵苣等植物有效地生產Stx2e蛋白質，可高濃度蓄積於植物體，進行申請專利(專利文獻4)。
專利文獻1：特表平10-507916號公報
專利文獻2：特開2000-166411號公報
專利文獻3：特表2002-533068號公報
專利文獻4：國際公開第2009/004842號手冊
非專利文獻1：Makino et al.,Microbial Pathogenesis,Volume 31,Number 1,July 2001,pp.1-8(08)非專利文獻2：Kim et al.,Protein Expression and Purification,Volume 51,Number 1,Jan 2006,pp.22-27(06)
本發明係使用植物細胞有效率地生產Stx蛋白質、及類似其之具有高次結構之其他細菌毒素蛋白質為課題。
本發明者等使植物細胞生產藉由特定序列之胜肽，串聯2個或3個Stx2e、CT等之細菌毒素蛋白質之雜交體蛋白質的結果，成功地使細菌毒素蛋白質高濃度蓄積於植物細胞內，完成本發明。
亦即，本發明係如下所述。
(1)2個或3個之志賀毒素蛋白質、霍亂毒素蛋白質或大腸桿菌易熱性毒素蛋白質係分別藉由具有下述特徵(A)及(B)之胜肽所串聯之雜交體蛋白質，
(A)胺基酸個數為12~30個；
(B)脯胺酸之含有率為20~35%。
(2)(1)記載之雜交體蛋白質，其中前述胜肽係進一步具有下述特徵(C)，
(C)脯胺酸係隔2個胺基酸、或3個胺基酸所配置。
(3)(2)記載之雜交體蛋白質，其中前述胜肽係由序列號碼2、82或84所表示之胺基酸序列而成。
(4)(3)記載之雜交體蛋白質，其中2個志賀毒素蛋白質、霍亂毒素蛋白質或大腸桿菌易熱性毒素蛋白質係藉由序列號碼2所表示之胺基酸序列所成之胜肽所串聯。
(5)(1)~(4)中任一項記載之雜交體蛋白質，其中志賀毒素蛋白質係志賀毒素蛋白質的B次單元。
(6)(1)~(5)中任一項記載之雜交體蛋白質，其中志賀毒素蛋白質係Stx2e蛋白質。
(7)(1)~(4)中任一項記載之雜交體蛋白質，其中霍亂毒素蛋白質係霍亂毒素蛋白質的B次單元。
(8)(4)記載之雜交體蛋白質，其具有序列號碼10、12、14或16所表示之胺基酸序列。
(9)(3)記載之雜交體蛋白質，其具有序列號碼86、88、90、92、94、96、98或100所表示之胺基酸序列。
(10)(1)~(9)中任一項記載之雜交體蛋白質，其中於胺基末端加成源自植物之分泌訊號胜肽。
(11)(10)記載之雜交體蛋白質，其中於羧基末端加成內質網(Endoplasmic Reticulum)殘留訊號胜肽。
(12)(1)~(9)中任一項記載之雜交體蛋白質，其中於胺基末端加成葉綠體移動訊號胜肽。
(13)含編碼(1)~(12)中任一項記載之雜交體蛋白質之DNA之DNA結構物。
(14)(13)記載之DNA結構物，其含具有序列號碼9、11、13或15所表示之鹼基序列之DNA。
(15)(13)記載之DNA結構物，其含具有序列號碼85、87、89、91、93、95、97或99所表示之鹼基序列之DNA。
(16)(13)~(15)中任一項記載之DNA結構物，其中編碼雜交體蛋白質之DNA係鍵結於可表現之源自植物之乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區(non-coding region)。
(17)(16)記載之DNA結構物，其中前述源自植物之乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區係源自菸草。
(18)(17)記載之DNA結構物，其具有以序列號碼24~29中任一個所表示之鹼基序列。
(19)(17)記載之DNA結構物，其具有以序列號碼101~111中任一個所表示之鹼基序列。
(20)含(13)~(19)中任一項記載之DNA結構物之重組載體。
(21)以(20)記載之重組載體所轉型之轉型株。
(22)(21)記載之轉型株，其中轉型株係轉型植物細胞或轉型植物。
(23)由(21)或(22)記載之轉型株所得之種子。
(24)由序列號碼2、82或84所表示之胺基酸序列而成之胜肽。
用以實施發明之最佳型態
本發明之雜交體蛋白質係2個或3個之志賀毒素(Stx)蛋白質、霍亂毒素(CT)蛋白質或大腸桿菌易熱性毒素(LT)蛋白質係分別藉由具有下述特徵(A)及(B)之胜肽所串聯。
(A)胺基酸個數為12~30個；
(B)脯胺酸之含有率為20~35%。
志賀毒素(Stx)係分為1型(Stx1)及2型(Stx2)。分別分類Stx1為a~d之亞型，Stx2為a~g之亞型。志賀毒素蛋白質係由1個毒性本體之A次單元及5個參與侵入腸管黏膜之B次單元而成。
其中，已知例如Stx2e為豬浮腫病毒素，該A次單元(Stx2eA)係以序列號碼4之胺基酸序列表示，B次單元(Stx2eB)係以序列號碼6之胺基酸序列表示。
Stx2eA及Stx2eB係必須可投予豬而引起免疫反應，亦可分別於序列號碼4或序列號碼6所表示之胺基酸序列中取代、缺失、插入或加成1個或數個胺基酸。前述「數個」係於例如Stx2eA中，以2~30個為宜，以2~20個尤佳，以2~10個更好，Stx2eB中，以2~10個為宜，以2~5個尤佳，以2~3個更好。
另外，Stx2eA及Stx2eB亦可分別為具有與序列號碼4或序列號碼6所表示胺基酸序列之相同性，以85%以上為宜，以90%以上尤佳，以95%以上更好，並且可投予豬而引起免疫反應者。
霍亂毒素(CT)蛋白質係由1個毒性本體之A次單元(CTA)及5個以序列號碼8之胺基酸序列所表示之參與侵入腸管黏膜之B次單元(CTB)而成。
CTB係必須可投予動物而引起免疫反應，亦可分別於序列號碼8所表示之胺基酸序列中取代、缺失、插入或加成1個或數個胺基酸。前述「數個」係以2~10個為宜，以2~5個尤佳，以2~3個更好。
另外，CTB亦可為具有與序列號碼8所表示之胺基酸序列之相同性，以85%以上為宜，以90%以上尤佳，以95%以上更好，並且可投予動物而引起免疫反應者。
大腸桿菌易熱性毒素(LT)係由1個毒性本體之A次單元及5個參與侵入腸管黏膜之次單元而成。
本說明書中，總稱志賀毒素、霍亂毒素、大腸桿菌易熱性毒素為「細菌毒素」。
前述胜肽之胺基酸個數係以12~25個為宜，以12~22尤佳。另外，前述胜肽之脯胺酸之含有率係以20~27%為宜，以20~25%尤佳。
另外，關於前述胜肽，脯胺酸係隔2個胺基酸、或3個胺基酸所配置為宜。但是，即使此時，亦可於胜肽末端，鍵結5個以內，以4個以內為宜之範圍之脯胺酸以外的胺基酸。
另外，關於前述胜肽，脯胺酸以外的胺基酸中，絲胺酸、甘胺酸、精胺酸、賴胺酸、蘇胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組織胺酸及天冬胺酸之合計含有率係以70%以上為宜，以80%以上尤佳，以90%以上更好。另外，關於前述胜肽，脯胺酸以外的胺基酸中，絲胺酸、甘胺酸及天冬醯胺之合計含有率係以70%以上為宜，以80%以上尤佳，以90%以上更好。另外，關於前述胜肽，脯胺酸以外的胺基酸中，絲胺酸及甘胺酸之合計含有率係以70%以上為宜，以80%以上尤佳，以90%以上更好。此乃因含有許多此等胺基酸之胜肽不易形成二次結構(β-摺板(β-sheet)結構或螺旋結構)。
另一方面，關於前述胜肽，脯胺酸以外的胺基酸中，丙胺酸、甲硫胺酸及麩胺酸之合計含有率係以30%以下為宜，以20%以下尤佳，以10%以下更好。此乃因含有許多此等胺基酸之胜肽容易形成螺旋結構。另外，關於前述胜肽，脯胺酸以外的胺基酸中，色胺酸、白胺酸、異白胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸及纈胺酸之合計含有率係以20%以下為宜，以10%以下尤佳，以5%以下更好。此乃因含有許多此等胺基酸之胜肽容易形成β-摺板結構及螺旋結構。
前述胜肽係適合選自由序列號碼2所表示之胺基酸序列而成之胜肽(PG12)、由序列號碼82所表示之胺基酸序列而成之胜肽(PG17)、或由序列號碼84所表示之胺基酸序列而成之胜肽(PG22)。
本發明之雜交體蛋白質係可為2個或3個之A次單元及B次單元之雜交體蛋白質，藉由前述胜肽所串聯，亦可為2個或3個之A次單元藉由前述胜肽所串聯，亦可為2個或3個之B次單元藉由前述胜肽所串聯。但是，本發明之雜交體蛋白質含A次單元時係以A次單元經無毒化為宜。本發明之雜交體蛋白質係2個或3個之B次單元藉由前述胜肽所串聯為宜。另外，本發明之雜交體蛋白質係2個B次單元藉由PG12所串聯為宜。
另外，本發明之雜交體蛋白質係以進一步於該C端加成前述胜肽為宜。尤其，本發明之雜交體蛋白質係於該C端加成PG12為宜。
本發明之雜交體蛋白質係具有例如序列號碼10、12、14、16、86、88、90、92、94、96、98或100所表示之胺基酸序列。具有序列號碼10所表示之胺基酸序列之雜交體蛋白質係2個Stx2eB藉由PG12所串聯。具有序列號碼12所表示之胺基酸序列之雜交體蛋白質係2個CTB藉由PG12所串聯。具有序列號碼14所表示之胺基酸序列之雜交體蛋白質係2個Stx2eB藉由PG12所串聯，進一步於該C端鍵結PG12。具有序列號碼16所表示之胺基酸序列之雜交體蛋白質係2個CTB藉由PG12所串聯，進一步於該C端鍵結PG12。具有序列號碼86所表示之胺基酸序列之雜交體蛋白質係3個Stx2eB分別藉由PG12所串聯。具有序列號碼88所表示之胺基酸序列之雜交體蛋白質係3個Stx2eB分別藉由PG12所串聯，進一步於該C端鍵結PG12。具有序列號碼90所表示之胺基酸序列之雜交體蛋白質係2個Stx2eB藉由PG17所串聯，進一步於該C端鍵結PG12。具有序列號碼92所表示之胺基酸序列之雜交體蛋白質係2個Stx2eB藉由PG22所串聯，進一步於該C端鍵結PG12。具有序列號碼94所表示之胺基酸序列之雜交體蛋白質係3個CTB分別藉由PG12所串聯。具有序列號碼96所表示之胺基酸序列之雜交體蛋白質係3個CTB分別藉由PG12所串聯，進一步於該C端鍵結PG12。具有序列號碼98所表示之胺基酸序列之雜交體蛋白質係2個CTB分別藉由PG17所串聯，進一步於該C端鍵結PG12。具有序列號碼100所表示之胺基酸序列之雜交體蛋白質係2個CTB藉由PG22所串聯，進一步於該C端鍵結PG12。
藉由將前述PG12、PG17或PG22等之胜肽，作為用以鍵結前述細菌毒素蛋白質之連結子使用，增加該細菌毒素蛋白質對植物細胞的蓄積程度。
本發明之雜交體蛋白質係於該胺基末端加成源自植物之分泌訊號胜肽、或加成葉綠體移動訊號胜肽為宜。在此，所謂「加成」係包含前述分泌訊號胜肽直接鍵結，亦可藉由其他胜肽鍵結於藉由前述胜肽鍵結之2個或3個前述細菌毒素蛋白質之胺基末端之概念。
分泌訊號胜肽係以源自屬於茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)之植物為宜，以屬於菸草屬(Nicotiana)、擬南芥屬(Arabidopsis)、萵苣屬(Lactuca)等之植物尤佳，以菸草(Nicotiana tabacum)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、鹿角萵苣(Lactuca sativa)等更好。
另外，以源自菸草之β-D-葡聚醣外水解酶(β-D-glucan exohydrolase)、菸草之38kDa過氧化酶(GenBank ACCESSION D42064)為宜。
作為前述分泌訊號胜肽，可舉例如源自菸草之β-D-葡聚醣外水解酶，具有序列號碼18所表示之胺基酸序列之胜肽。
作為葉綠體移動訊號胜肽，可舉例如源自萵苣Rbcs(rubiscosmol次單元)(GenBank Accession D14001)之葉綠體移動訊號胜肽(基因轉殖胜肽，T.P.，序列號碼79)。另外，編碼源自萵苣Rbcs葉綠體移動訊號胜肽之DNA鹼基序列係例如以序列號碼80表示。本說明書中，亦稱於胺基末端加成葉綠體移動訊號胜肽之雜交體蛋白質為葉綠體型(Chl)之雜交體蛋白質，亦稱編碼該葉綠體型之雜交體蛋白質之DNA結構物為葉綠體型之DNA結構物。葉綠體型之雜交體蛋白質，有效率地蓄積於尤其菸草等之葉綠體發達之植物。
另外，亦稱於胺基末端皆未加成分泌訊號胜肽、葉綠體移動訊號胜肽之雜交體蛋白質為細胞質型(Cyt)之雜交體蛋白質，亦稱編碼該細胞質型之雜交體蛋白質之DNA結構物為細胞質型之DNA結構物。關於細胞質型之雜交體蛋白質，尤其以3個細菌毒素之B次單元係藉由前述胜肽所串聯為宜。
另外，本發明之雜交體蛋白質亦可於該羧基末端加成內質網殘留訊號胜肽、液胞移動訊號胜肽等之訊號胜肽。在此，所謂「加成」係包含訊號胜肽直接鍵結，亦可藉由其他胜肽鍵結於前述雜交體蛋白質之羧基末端之概念。本說明書中，亦稱於胺基末端加成分泌訊號，且於羧基末端加成內質網殘留訊號胜肽之雜交體蛋白質為內質網型(ER)之雜交體蛋白質，亦稱編碼該內質網型之雜交體蛋白質之DNA結構物為內質網型之DNA結構物。內質網型之雜交體蛋白質尤其有效率地蓄積於萵苣等。
本發明之雜交體蛋白質係於該羧基末端加成內質網殘留訊號胜肽為宜。內質網殘留訊號胜肽係可列舉含KDEL序列(序列號碼19)、HDEL序列(序列號碼20)、KDEF序列(序列號碼21)或HDEF序列(序列號碼22)之內質網殘留訊號胜肽。
液胞移動訊號胜肽係以源自屬於茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)之植物為宜，以屬於菸草屬(Nicotiana)、擬南芥屬(Arabidopsis)、辣根屬(Armoracia)等之植物尤佳，以菸草(Nicotiana tabacum)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、辣根(Armoracia rusticana)等更好。另外，源自幾丁質酶(Chitinase)為宜。源自菸草幾丁質酶之液胞移動訊號胜肽之胺基酸序列係以序列號碼76表示。另外，編碼源自菸草幾丁質酶之液胞移動訊號胜肽之DNA鹼基序列係例如以序列號碼75表示。
另外，以源自辣根過氧化酶Cla同工酶為宜。辣根過氧化酶Cla同工酶之液胞移動訊號胜肽之胺基酸序列係以序列號碼78表示。另外，編碼源自辣根過氧化酶Cla同工酶之液胞移動訊號胜肽之DNA鹼基序列係例如以序列號碼77表示。本說明書中，亦稱於胺基末端加成分泌訊號，且於羧基末端加成液胞移動訊號胜肽之雜交體蛋白質為液胞型(Vac)之雜交體蛋白質，亦稱編碼該液胞型之雜交體蛋白質之DNA結構物為液胞型之DNA結構物。
本發明之雜交體蛋白質係可化學合成，亦可基因工程生產。關於基因工程的生產方法係如後所述。
本發明之DNA結構物係含編碼本發明之雜交體蛋白質之DNA為特徵。
亦即，本發明之DNA結構物係含編碼2個或3個之毒素蛋白質之DNA，藉由編碼前述胜肽之DNA所串聯之DNA。編碼前述胜肽之DNA係例如以序列號碼1(PG12)、序列號碼81(PG17)、序列號碼83(PG22)所表示。編碼細菌毒素蛋白質之DNA，可舉例如編碼Stx2eA之DNA(序列號碼3)、編碼Stx2eB之DNA(序列號碼5)或編碼CTB之DNA(序列號碼7)。編碼前述胜肽之DNA及編碼細菌毒素蛋白質之DNA係終止密碼除外，合併讀取架構(reading frame)所鍵結。
編碼細菌毒素蛋白質之DNA係例如可依據序列號碼3、5、7之鹼基序列，藉由一般基因工程的手法而得。具體上，藉由各生產細菌毒素之細菌，依據常法調製cDNA資料庫，使用基於上述鹼基序列製作的探針，由該資料庫選擇所需之選殖品(Clone)。另外，以上述鹼基序列為基礎進行化學合成，亦可以上述鹼基序列之5’及3’末端之鹼基序列為引子，以基因體DNA為模版，藉由PCR等合成。
編碼本發明之雜交體蛋白質之DNA係例如序列號碼9、11、13、15、85、87、89、91、93、95、97或99所表示。
編碼雜交體蛋白質之DNA亦可因應使生產該蛋白質之寄主細胞，適當地改變表示構成雜交體蛋白質之胺基酸的密碼，增大雜交體蛋白質之編碼量。
改變密碼的方法係可參考例如Kang et al.(2004)的方法。另外，列舉選擇於寄主細胞中使用頻率高的密碼、選擇GC含量高的密碼、選擇於寄主細胞之家管基因(housekeeping gene)中使用頻率高的密碼之方法。
另外，編碼雜交體蛋白質之DNA，亦可為與具有序列號碼9、11、13、15、85、87、89、91、93、95、97或99之鹼基序列，於嚴格條件(stringent condition)下進行雜交之DNA。所謂「嚴格條件」係指所謂的形成特異雜交，不形成非特異雜交之條件。可舉例如相同性高之二個DNA彼此，以具有80%以上的相同性為宜，以90%以上尤佳，以95%以上更好的2個DNA進行雜交，更重要的是相同性低之2個DNA不進行雜交之條件。例如2×SSC(330mM NaCl，30mM檸檬酸)，可列舉42℃，以0.1×SSC(330mM NaCl，30mM檸檬酸)，60℃為宜。
本發明之DNA結構物中，編碼前述雜交體蛋白質之DNA係鍵結於可表現之增強子為宜。在此，所謂「可表現」係指插入本發明之DNA結構物於含適當促進子之載體，將該載體導入於適當的寄主細胞時，寄主細胞內生產前述雜交體蛋白質。另外，所謂「鍵結」係包含2個DNA直接鍵結，亦包含藉由其他鹼基序列鍵結之概念。
增強子係可列舉Kozak序列或源自植物之乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區。編碼前述雜交體蛋白質之DNA係鍵結於可表現之源自植物之乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區尤佳。
所謂乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區係指含自編碼乙醇去氫酶基因之轉譯開始點至編碼開始點(ATG，甲硫胺酸)之前之鹼基序列之區域。該區域係具有編碼量增大機能。所謂「編碼量增大機能」係指結構基因所編碼的訊息係經轉譯後，經編碼而產生蛋白質時，增大藉由編碼所產生的蛋白質量的機能。前述區域係以源自植物為宜，以源自屬於茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)之植物為宜，以屬於菸草屬(Nicotiana)、擬南芥屬(Arabidopsis)、萵苣屬(Lactuca)等之植物尤佳，以菸草(Nicotiana tabacum)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、鹿角萵苣(Lactuca sativa)等更好。
作為前述乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區，例如以源自菸草(Nicotiana tabacum)之乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區(NtADH5’UTR)之序列號碼23所表示之鹼基序列而成的區域尤佳。
源自植物之乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區係例如可單離自高表現乙醇去氫酶之植物培養細胞之乙醇去氫酶基因(參考特開2003-79372號公報)。另外，關於確認菸草之乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區等之該鹼基序列係進行化學合成，或亦可以該區域之5’及3’末端之鹼基序列為引子，以基因體DNA為模版，藉由PCR等合成。另外，亦可藉由使用鹼基序列確定之部份前述區域作為探針，搜尋其他植物之乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區，將此單離。
另外，如序列號碼23之鹼基序列所表示之前述乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區係只要保持編碼量增大機能，亦可有1個或數個鹼基之取代、缺失、插入或加成。前述「數個」係以2~10個為宜，以2~5個尤佳，以2~3個更好。
另外，亦可使用具有與前述乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區之相同性，以85%以上為宜，以90%以上尤佳，而且保持編碼量增大機能之DNA。
關於前述區域是否具有目的之編碼量增大機能，例如可由菸草培養細胞中GUS(β-葡萄糖醛酸苷酵素(β-glucuronidase))基因或螢光酶(Luciferase)基因作為報導基因(Reporter Gene)之基因轉殖分析、組入染色體之轉型細胞之分析等確認。
本發明之DNA結構物係具有例如序列號碼24~29、序列號碼101~111中任一種所表示之鹼基序列。
具有序列號碼24所表示之鹼基序列之DNA結構物係於源自菸草之乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區(NtADH5’UTR，序列號碼23)，鍵結編碼藉由PG12串聯2個Stx2eB蛋白質之雜交體蛋白質之DNA(序列號碼9)之DNA結構物。另外，具有序列號碼25所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG12串聯2個CTB蛋白質之雜交體蛋白質之DNA(序列號碼11)於NtADH5’UTR之DNA結構物。
具有序列號碼26所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG12串聯2個Stx2eB蛋白質，於胺基加成分泌訊號胜肽，於羧基末端加成內質網殘留訊號胜肽之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。另外，具有序列號碼27所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG12串聯2個CTB蛋白質，於胺基末端加成分泌訊號胜肽，於羧基末端加成內質網殘留訊號胜肽之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。
具有序列號碼28所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG12串聯2個Stx2eB蛋白質，於胺基末端加成分泌訊號胜肽，於羧基末端鍵結PG12，進一步於該羧基末端加成內質網殘留訊號胜肽之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。另外，具有序列號碼29所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG12串聯2個CTB蛋白質，於胺基末端加成分泌訊號胜肽，於羧基末端鍵結PG12，進一步於該羧基末端加成內質網殘留訊號胜肽之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。
具有序列號碼101所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG12串聯2個Stx2eB蛋白質，於羧基末端鍵結PG12之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。
具有序列號碼102所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG17串聯2個Stx2eB蛋白質，於胺基末端加成分泌訊號胜肽，於羧基末端鍵結PG12，進一步於該羧基末端加成內質網殘留訊號胜肽之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。另外，具有序列號碼103所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG22串聯2個Stx2eB蛋白質，於胺基末端加成分泌訊號胜肽，於羧基末端鍵結PG12，進一步於該羧基末端加成內質網殘留訊號胜肽之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。
具有序列號碼104所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG12串聯2個Stx2eB蛋白質，於胺基末端加成葉綠體移動訊號胜肽，於羧基末端鍵結PG12之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。
具有序列號碼105所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼分別藉由PG12串聯3個Stx2eB蛋白質，於羧基末端鍵結PG12之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。
具有序列號碼106所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼分別藉由PG12串聯3個Stx2eB蛋白質，於胺基末端加成分泌訊號胜肽，於羧基末端鍵結PG12，進一步於該羧基末端加成內質網殘留訊號胜肽之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。
具有序列號碼107所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼分別藉由PG12串聯3個Stx2eB蛋白質，於胺基末端加成葉綠體移動訊號胜肽，於羧基末端鍵結PG12之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。
具有序列號碼108所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG12串聯2個CTB蛋白質，於羧基末端鍵結PG12之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。
具有序列號碼109所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG17串聯2個CTB蛋白質，於胺基末端加成分泌訊號胜肽，於羧基末端鍵結PG12，進一步於該羧基末端加成內質網殘留訊號胜肽之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。另外，具有序列號碼110所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG22串聯2個CTB蛋白質，於胺基末端加成分泌訊號胜肽，於羧基末端鍵結PG12，進一步於該羧基末端加成內質網殘留訊號胜肽之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。
具有序列號碼111所表示之鹼基序列之DNA結構物係鍵結編碼藉由PG12串聯2個CTB蛋白質，於胺基末端加成葉綠體移動訊號胜肽，於羧基末端鍵結PG12之雜交體蛋白質之DNA於NtADH5’UTR之DNA結構物。
本發明之DNA結構物係可由一般的基因工程手法製作，分別由適當的限制酵素切斷源自植物之乙醇去氫酶基因之5，-非編碼區、編碼源自植物之分泌訊號胜肽之DNA、編碼葉綠體移動訊號胜肽之DNA、及編碼細菌毒素蛋白質之DNA、編碼內質網殘留訊號胜肽之DNA等之各DNA，以適當的連接酶(ligase)鍵結而可建構。
本發明之重組載體係含本發明之DNA結構物為特徵。本發明之重組載體係只要可將編碼本發明之雜交體蛋白質之DNA插入載體內，可於載體所導入之寄主細胞中表現即可。載體係只要可於寄主細胞中進行複製即可，並無特別限制，可舉例如質體DNA、病毒DNA等。另外，載體係以含藥劑耐性基因等之篩選標示基因(selection marker gene)為宜。質體DNA係自大腸桿菌或農桿菌(Agrobacterium)由鹼萃取法(Birnboim,H.C.& Doly,J.(1979)Nucleic acid Res7：1513)或其變法等而可調製。另外，亦可使用市售之質體，例如pBI221、pBI121、pBI101、pIG121Hm等。病毒DNA係可使用例如pTB2(Donson et al.,1991)等(參考Donson J.,Kerney CM.,HilfME.,Dawson WO.Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector.Proc.Natl.Acad.sci.(1991)88：7204-7208。)
載體內所使用之促進子係可因應導入載體之寄主細胞而適當選擇。例如適合使用花椰菜嵌紋病毒35S促進子(Odell et al.1985 Nature 313：810)、水稻之肌動蛋白促進子(actin promoter)(Zhang et al.1991 Plant Cell 3：1155)、玉黍蜀之泛素(ubiquitin)促進子(Cornejo et al.1993 Plant Mol.Biol.23：567)等。另外，載體內所使用之終結子(terminator)亦可同樣地因應導入載體之寄主細胞而適當選擇。適合使用例如Nopalin合成酵素基因轉譯終結子、花椰菜嵌紋病毒35S終結子等。
本發明之重組載體係可如下述製作。
首先，將本發明之DNA結構物，以適當的限制酵素切斷或由PCR加成限制酵素部位，插入於載體之限制酵素部位或多重複製位置(multi-cloning site)。
本發明之轉型株係具有以本發明之重組載體所轉型為特徵。轉型所使用之寄主細胞可為真核細胞及原核細胞中任一種。
真核細胞係適合使用植物細胞，其中屬於菊科(Asteraceae)、茄科、十字花科、藜科(Chenopodiaceae)之植物細胞適合使用。另外，屬於萵苣屬(Lactuca)之植物細胞，其中以鹿角萵苣(Lactuca sativa)細胞適合使用。使用萵苣細胞作為寄主細胞時，載體可使用花椰菜嵌紋病毒35S RNA促進子等。
原核細胞係可使用大腸桿菌(Escherichia coli)、農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)等。
本發明之轉型株係可藉由使用一般基因工程的方法，導入本發明之載體於寄主細胞而製作。例如可使用利用農桿菌之導入方法(Hood,et al.,1993,Transgenic,Res.2：218,Hiei,et.al.,1994 Plant J.6：271)、電洞法(electroporation)(Tada,et al.,1990,Theor.Appl.Genet.80：475)、聚乙二醇法(Lazzeri,et al.,1991,Theor.Appl.Genet.81：437)、粒子槍(Particle gun)法(Sanford,et al.,1987,J.Part.Sci.tech.5：27)、聚陽離子法(Ohtsuki)等之方法。
導入本發明之載體於寄主細胞後，藉由篩選標示基因之表現型可篩選本發明之轉型株。另外，藉由培養經篩選的轉型株，可生產前述細菌毒素蛋白質。培養用的培養基及條件係可因應轉型株的種類而適當選擇。
另外，寄主細胞為植物細胞時，可藉由依據常法培養經篩選的植物細胞，使植物體再生，可蓄積前述細菌毒素蛋白質於植物細胞內或植物細胞之細胞膜外。例如雖因植物細胞的種類而異，馬鈴薯時可列舉Visser等(Theor.Appl.Genet 78：594(1989))之方法，菸草時可列舉Nagata及Takebe(Planta 99：12(1971))之方法。
萵苣時，以含0.1mg/l之NAA(萘乙酸)、0.05mg/l之BA(苯甲基腺苷)及0.5g/l之polyvinylpyrrolidone(聚乙烯吡咯烷酮)之MS培養基，莖葉可再生，以含0.5g/l之聚乙烯吡咯烷酮之1/2MS培養基培養已再生的莖葉，將可長根。
另外，本發明之種子係可藉由自如上述之再生植物體採取種子而得。藉由以適當的方法播種栽培本發明之種子，可成為生產前述細菌毒素蛋白質之植物體，如此之植物體亦包含於本發明之轉型株。
 實施例 <1>暫時性表現實驗 (1)Stx2eB暫時性表現載體之建構
如下述製作含鍵結編碼Stx2e蛋白質之B次單元(Stx2eB)之DNA(序列號碼5)於菸草乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區(NtADH5’ UTR)之DNA結構物之載體。載體之設計如圖1表示。
1×Stx2eB(PG12)係表示含鍵結編碼PG12之DNA於編碼Stx2eB之DNA的DNA之DNA結構物。2×Stx2eB(PG12)係表示含以編碼PG12之DNA作為間隔區鍵結2個編碼Stx2eB之DNA的DNA之DNA結構物。
另外，亦製作將3個編碼Stx2eB之DNA，以編碼PG12之DNA作為間隔區鍵結之DNA結構物之3×Stx2eB(PG12)，以及將4個編碼Stx2eB之DNA，以編碼PG12之DNA作為間隔區鍵結之DNA結構物之4×Stx2eB(PG12)。
具體的方法如下所示。
使用Kozak-stx2eb-F引子(序列號碼30)及stx2eb-R引子(序列號碼31)，進行PCR，將編碼Stx2eB之成熟區域(對周邊胞質(periplasm)之分泌訊號胜肽除外，Ala19~Asn87)之DNA片段，進行增幅。將所得之DNA片段，於pBluescript Ⅱ SK之EcoRV間隙進行選殖。將所得之質體以HindⅢ切斷，以T4 DNA polymerase(聚合酶)處理後，進行自行黏合(self-ligation)，將HindⅢ位置轉換成Nhe I位置(質體1)。
如下所述，插入Stx2eB於植物細胞中暫時性表現用載體之pBI221(Clontech公司)之多重複製位置(MCS)。
為導入Sal I、Kpn I及Sma I位置於MCS，煉合SalKpnSma-F(序列號碼32)及SalKpnSma-R(序列號碼33)後，使用T4 polynucleotide kinase(T4 PNK，T4聚核苷酸激酶)(TaKaRa公司)進行磷酸化，插入於pB I 221之Sac I間隙(質體2)。以Xba I及Kpn I自質體1切出Stx2eB片段，插入質體2，配置於花椰菜嵌紋病毒35S RNA促進子(35S pro.)及Nopalin合成酵素基因轉譯終結子(NOS-T)之間(質體3)。
將菸草乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區(NtADH5’UTR，序列號碼23)，以ADH-221(Sato et.al.,2004(參考下述))為模版，藉由使用ADH Xba I-F引子(序列號碼34)及ADH Nsi I-R引子(序列號碼35)之PCR進行增幅。將編碼β-D-葡聚醣外水解酶(β-D-glucan exohydrolase)(GenBank ACCESSION AB017502)之分泌訊號胜肽(序列號碼18)之DNA區域(序列號碼17)，以菸草基因組DNA為模版，使用βD Nsi I-F引子(序列號碼36)及βD BamH I-R引子(序列號碼37)，進行增幅。將所得之NtADH5’UTR及分泌訊號胜肽之各DNA片段，以Nsi I(TOYOBO公司製)進行處理，使用Ligation High(TOYOBO公司)進行鍵結後，使末端平滑化，於pBluescript Ⅱ SK(Stratagene公司製)之EcoRV間隙進行選殖(質體4)。
Satoh et al.,The 5’-untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant.J.Biosci.Bioeng.(2004)98,1-8
將質體4以Nsi I處理，以T4 DNA polymerase(TOYOBO公司製)，使末端平滑化後，進行自行黏合，鍵結NtADH之開始密碼(atg)及分泌訊號胜肽之開始密碼，使其一致(質體5)。
鍵結NtADH 5’UTR片段及分泌訊號胜肽之DNA，使用質體5為模版，藉由使用ADH Xba I-F引子(序列號碼34)及βD BamH I-R引子(序列號碼35)進行增幅。將所得之DNA片段，以Xba I及 BamH I進行處理，插入質體3之Xba I-BamH I間隙(質體6)。
為加成內質網殘留訊號胜肽(序列號碼38)，煉合HDEL-F引子(序列號碼39)及HDEL-R引子(序列號碼40)後，以T4 PNK進行磷酸化，插入於以鹼性磷酸酶(AP,Alkaline Phosphatase)(TaKaRa公司)進行去磷酸化處理之質體6之BgⅢ間隙(質體7)。
作為Stx2eB檢測用之胜肽標籤(peptide tag)係加成HA標籤。為加成HA標籤，煉合HA-F引子(序列號碼41)及HA-R引子(序列號碼42)，以T4 PNK進行磷酸化。插入所得之磷酸化HA片段於質體7之BgⅢ間隙(質體8)。
插入PG12間隔區(序列號碼2)於Stx2eB及HA標籤之間。煉合PG12-F引子(序列號碼43)及PG12-R引子(序列號碼44)後，以T4 PNK進行磷酸化。插入所得之磷酸化DNA片段於質體8之BgⅢ間隙(1×Stx2eB(PG12))。
使用BamH I及BgⅢ，自1×Stx2eB(PG12)切出2eB-PG12片段，插入於1×Stx2eB(PG12)之BamH I間隙(2×Stx2eB(PG12))。另外，使用BamH I及BgⅢ，自1×Stx2eB(PG12)切出Stx2eB-PG12片段，插入於2×Stx2eB(PG12)之BamH I間隙(3×Stx2eB(PG12))。另外，使用BamH I及BgⅢ，自2×Stx2eB(PG12)切出2×(Stx2eB-PG12)片段，插入於2×Stx2eB(PG12)之BamH I間隙(4×Stx2eB(PG12))。
(2)CTB暫時性表現載體之建構
如下製作含編碼CT蛋白質之B次單元(CTB)之DNA係鍵結於菸草乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區之DNA結構物(2×CTB(PG12))之載體。
製作編碼CTB之成熟區域(對周邊胞質(periplasm)之分泌訊號胜肽除外，Thr22~Asn124)(序列號碼8)之DNA(序列號碼7)。首先，製作如下述之10種引子。
CTB1：序列號碼45
CTB2：序列號碼46
CTB3：序列號碼47
CTB4：序列號碼48
CTB5：序列號碼49
CTB6：序列號碼50
CTB7：序列號碼51
CTB8：序列號碼52
CTB9：序列號碼53
CTB10：序列號碼54
使用上述合成之引子，以Kang et al.(2004)記載之條件，進行PCR。亦即，組合CTB1及CTB2、CTB3及CTB4、CTB5及CTB6、CTB7及CTB8、CTB9及CTB10，進行PCR，分別合成72bp(1+2)、74bp(3+4)、67bp(5+6)、82bp(7+8)、68bp(9+10)之DNA片段。接著，組合CTB1+2及CTB3+4、CTB3+4及CTB5+6、CTB5+6及CTB7+8、CTB7+8及CTB9+10，進行2nd PCR，合成135bp(1+2+3+4)、132bp(3+4+5+6)、138bp(5+6+7+8)及141bp(7+8+9+l0)之DNA片段。接著，組合CTB1+2+3+4與CTB3+4+5+6、及CTB5+6+7+8與CTB7+8+9+10，進行3rd PCR，合成194bp(1+2+3+4+5+6)及198bp(5+6+7+8+9+10)之DNA片段。最後，組合CTB1+2+3+4+5+6與CTB5+6+7+8+9+10，進行PCR，合成加成BamH I位置及BgⅢ位置於315bp之CTB編碼區域之DNA片段。
將上述製作之DNA片段，以BamH I及BgⅢ處理，插入於質體8之BamH I-BgⅢ間隙(質體9)。
插入PG12間隔區(序列號碼2)於CTB及HA標籤之間。煉合PG12-F引子(序列號碼43)及PG12-R引子(序列號碼44)，以T4 PNK進行磷酸化。插入所得之磷酸化DNA片段於質體9之BgⅢ間隙(1×CTB(PG12))。
使用BamH I及BgⅢ，自1×CTB(PG12)切出CTB-PG12片段，插入於1×CTB(PG12)之BamH I間隙(2×CTB(PG12))。
(3)使用萵苣原生質體之暫時性表現實驗
將盆栽萵苣(Lactuca sativa)(綠浪,green wave)葉，將約1g以手術刀切碎成邊0.5cm程度，製作葉片盤(leaf disk)。浸漬葉片盤於500mM甘露糖醇，振盪1小時。浸漬葉片盤於50ml之原生質體化酵素溶液(1.0%之纖維素RS(Yakult總公司)、0.25%之macerozyme R-10(Yakult總公司)、400mM甘露糖醇、8ml CaCl2 、及5mM Mes-KOH，pH5.6)，於室溫振盪2小時。將原生質體懸濁液通過100μm及40μm之網眼，去除葉片盤。將原生質體以60g離心5分鐘，使原生質體沈澱。再度懸濁原生質體於含167 mM甘露糖醇及133ml CaCl2 之水溶液，以40g離心5分鐘。再度懸濁原生質體於含333 mM甘露糖醇及66.7ml CaCl2 之水溶液，以40g離心5分鐘。懸濁原生質體於W5溶液(154mM NaCl、125mM CaCl2 、5mM KCl、2mM Mes-KOH，pH5.6)，於冰上靜置1小時。將原生質體懸濁液以40g離心5分鐘，懸濁於MaMg溶液(400mM甘露糖醇、15mM MgCl2 、及4mM Mes-KOH，pH5.6)，使原生質體濃度成為2×106 個/ml。
將上述製作之各Stx2eB暫時性表現載體、CTB暫時性表現載體，分別與120μl之原生質體懸濁液混合後，加入140μl之PEG溶液(400mM甘露糖醇、100mM Ca(NO3 )2、及40% PEG)，溫和地混合，培養7分鐘。以約20分鐘添加1ml之W5溶液於原生質體懸濁液。於藉由離心而沈澱之原生質體，添加1ml之以4：1比率混合400mM甘露糖醇及W5溶液之溶液。於藉由離心而沈澱之原生質體，添加1ml之含1%蔗糖、400mM甘露糖醇及0.3mM卡苯尼西林(carbenicillin)之LS培養基，於暗處25℃培養24小時。
(4)西方點墨分析
於藉由離心而沈澱之原生質體，加入30μl之SDS-sample緩衝溶液(4%(w/v)SDS、20%(w/v)丙三醇、0.05%(w/v)溴酚藍(Bromophenol blue)、300mM β-硫氫乙醇、125mM Tris-HCl，pH6.8)，以95℃，2分鐘熱變性，作為試料。使用15%丙烯醯胺凝膠，分離蛋白質後，使用電子轉移(electro transfer)裝置，於PVDF膜(Hybond-P；Amersham公司)上標繪蛋白質。使用抗HA抗體(No.11 867 423 001,Roche)，檢測出Stx2eB及CTB。
(a)Stx2eB鍵結數量的影響
結果如圖2表示。
使1×Stx2eB(PG12)表現時，於約8.5kDa的位置檢測出訊號。使2×Stx2eB(PG12)表現時，於約17 kDa的位置檢測出與使1×Stx2eB(PG12)表現時相同程度的訊號。使3×Stx2eB(PG12)表現時，於約26kDa的位置檢測出比使1×Stx2eB(PG12)表現時較小的訊號。此等係任一種皆與自DNA結構物之設計確定的分子量一致。另外，使4×Stx2eB(PG12)表現時，特異的訊號係於最低檢測濃度以下。
由以上結果顯示，使2×Stx2eB(PG12)及3×Stx2eB(PG12)表現時，可生產鍵結複數的Stx2eB蛋白質之雜交體蛋白質。
另外，上述各DNA結構物，因為各含1分子之HA標籤(參考圖1)，認為使2×Stx2eB(PG12)表現時係蓄積相當於使1×Stx2eB(PG12)表現時約2倍的Stx2eB蛋白質之蛋白質。亦即，可知藉由編碼PG12之DNA鍵結編碼2個Stx2eB蛋白質之DNA時，可極有效率地生產Stx2eB蛋白質。
另一方面，可知藉由編碼PG1之DNA鍵結編碼3個Stx2eB蛋白質之DNA、編碼4個Stx2eB蛋白質之DNA時，Stx2eB蛋白質之生產係1個Stx2eB蛋白質的同等以下。
另外，判定於本實驗製作之於羧基末端加成PG12之Stx2eB蛋白質(1×Stx2eB(PG12))，與未加成此之Stx2eB蛋白質相比較，蛋白質之蓄積程度有偏高的趨勢。藉此，認為本發明之雜交體蛋白質係以羧基末端加成PG12為適合的型態。
(b)CTB鍵結數量的影響
結果如圖3表示。
使1×CTB(PG12)表現時，於約20kDa的位置檢測出訊號。使2×CTB(PG12)表現時，於約33kDa及約35kDa的位置檢測出比使1×CTB(PG12)表現時大的訊號。
由上述結果顯示，使2×CTB(PG12)表現時，可生產鍵結2個CTB蛋白質之雜交體蛋白質。此等係任一種皆與自DNA結構物之設計斷定的分子量一致。
另外，上述各DNA結構物，因為各含1分子之HA標籤，認為使2×CTB(PG12)表現時係蓄積相當於使1×CTB(PG12)表現時的2倍更多的CTB蛋白質之蛋白質。亦即，可知將編碼2個CTB蛋白質之DNA，藉由編碼PG12之DNA進行鍵結時，可極有效率地生產CTB蛋白質。
(5)Stx2eB之局部集中存在
為分析細胞中Stx2eB之局部集中存在，製作Stx2eB與黃色螢光蛋白質YFP之雜交體蛋白質之暫時性表現載體。載體之設計如圖4所示。1×Stx2eB(PG12)-YFP係表示鍵結編碼1個Stx2eB蛋白質之DNA及編碼YFP之DNA之DNA結構物。2×Stx2eB(PG12)-YFP係表示鍵結編碼藉由PG12鍵結2個Stx2eB蛋白質之雜交體蛋白質之DNA及編碼YFP之DNA之DNA結構物。另外，亦製作使用RS(Arg Ser)取代PG12作為間隔區之2×Stx2eB(RS)-YFP。
以下係表示具體方法。
首先，將YFP的DNA片段，以pEYFP(Clontech)為模版，使用YFP-F引子(序列號碼55)及YFP-R引子(序列號碼56)，藉由PCR進行增幅。將所得之DNA片段，以BamH I及BgⅢ處理，插入於質體8之BamH I-BgⅢ間隙(ER-YFP)。
使用BamH I及BgⅢ，自質體1切出Stx2eB片段，插入前述1×Stx2eB(PG12)之BamH I間隙(2×Stx2eB(RS))。
自1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(RS)及2×Stx2eB(PG12)，使用BamH I-BgⅢ，分別切出Stx2eB-PG12片段、2×(Stx2eB-RS)片段及2×(Stx2eB-PG12)片段，插入ER-YFP之BamH I間隙(1×Stx2eB(PG12)-YFP、2×Stx2eB(RS)-YFP及2×Stx2eB(PG12)-YFP)。
另一方面，作為內質網可視化用之載體，製作內質網局部集中存在型之紅色螢光蛋白質(mRFP，Campbell R.E.et al.(2002)(參考下述))之表現載體。使用mRFP-F引子(序列號碼57)及mRFP-R引子(序列號碼58)進行PCR。以BamH I及BgⅢ處理所得之DNA片段，插入於質體8之BamH I-BgⅢ間隙(ER-mRFP)。
Campbell R.E.et al.,A monomeric red fluorescent protein(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.99：7877-7882將前述Stx2eB的表現載體與mRFP表現載體，與上述方法同樣地操作，導入於菸草培養細胞(BY2)之原生質體，使用共軛焦顯微鏡觀察(LSM510,Zeiss)觀察。
結果如圖5及6表示。
圖5係表示Stx2eB-YFP雜交體蛋白質局部集中存在。使2×Stx2eB(PG12)-YFP表現時，Stx2eB-YFP雜交體蛋白質係觀察到100個/細胞程度成顆粒狀局部集中存在。使1×Stx2eB(PG12)-YFP及2×Stx2eB(RS)-YFP表現時，未觀察到顆粒。
圖6中最左列的影像A係表示於某原生質體中mRFP局部集中存在。mRFP局部集中存在係反映內質網的位置。中列的影像B係表示同一個原生質體中Stx2eB-YFP雜交體蛋白質局部集中存在。最右列的影像係影像A及影像B的合成影像。由合成影像可知，Stx2eB-YFP雜交體蛋白質係於內質網成顆粒狀局部集中存在。
(6)小胞運輸(Vesicular transport)機能的影響
調查2×Stx2eB(PG12)之蓄積及凝聚係於蛋白質編碼後哪個過程中發生。
使2×Stx2eB(PG12)-YFP與擬南芥之小胞運輸調節蛋白質ARF1、或該負性優勢(dominant negative)突變體ARF1(Q71L)(ARF1DN)共同表現。另外，藉由ARF1DN共同表現，作為阻礙輸送蛋白質至高基氏體(Golgi vesicles)之報導基因(Reporter gene)，進行液胞型GFP(vacuole-GFP)及各ARF1之共同表現。各ARF1之表現載體之建構係如下進行。另外，液胞型GFP表現載體之製作係可參考下述文獻進行。
Di Sansebastiano et.al.,Specific accumulation of GFP in a non-acidic vacuolar compartment via a C-terminal propetide-mediated sorting pathway.Plant J.(1998)15,449-457
作為小胞運輸調節蛋白質，建構擬南芥ARF1(GenBank Accession No.M95166)及該負性優勢突變體ARF1(Q71L)(Masaki Takeuchi et al.,2002(參考下述))之表現載體。以自擬南芥幼植物體調製之cDNA為模版，使用ARF1-F載體(序列號碼59)及ARF1-R引子(序列號碼60)，進行PCR。將所得之DNA片段於pBluescript(Stratagene)之EcoRV間隙，進行次選殖(subclone)。另外，使用ARFQL-F引子(序列號碼61)及ARFQL-R引子(序列號碼62)，進行PCR，取代第71個麩胺酸殘基成白胺酸殘基。將所得之各個ARF1片段於暫時性表現用載體pB I 221，進行次選殖。
將經製作之各載體，以與上述相同的方法，導入於菸草培養細胞之原生質體，使各蛋白質共同表現，調查2×Stx2eB(PG12)之局部集中存在。
結果如圖7表示。
使2×Stx2eB(PG12)-YFP與ARF1共同表現時，與ARF1(Q71L)共同表現時，皆與使2×Stx2eB(PG12)-YFP單獨表現時同樣地觀察到顆粒。另一方面，與ARF1(Q711)共同表現時，抑制自內質網移出液胞型GFP。藉此推測顆粒的形成係不依賴自內質網至高基氏體的小胞運輸過程。
<2>使用菸草培養細胞之轉型實驗 (1)轉型用載體之建構
與上述同樣地操作，製作1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(PG12)、3×Stx2eB(PG12)、4×Stx2eB(PG12)。
進一步，以下述方法製作使用RS(Arg Ser)、PG7(序列號碼63)或SG12(序列號碼64)取代PG12作為間隔區之DNA結構物、2×Stx2eB(RS)、2×Stx2eB(PG7)、2×Stx2eB(SG12)。
插入PG7間隔區(序列號碼63)於前述質體8之Stx2eB與HA標籤之間。煉合PG7-F引子(序列號碼65)及PG7-R引子(序列號碼66)，以T4 PNK進行磷酸化。插入所得之磷酸化DNA片段於質體8之BgⅢ間隙(質體10)。
另外，插入SG12間隔區(序列號碼64)於Stx2eB及HA標籤之間。煉合SG12-F引子(序列號碼67)及SG12-R引子(序列號碼68)，以T4 PNK進行磷酸化。插入所得之磷酸化DNA片段於質體8之BgⅢ間隙(質體11)。
使用BamH I及BgⅢ，自質體1切出Stx2eB片段，插入於1×Stx2eB(PG12)之BamH I間隙(2×Stx2eB(RS))。使用BamH I及BgⅢ，自質體10切出Stx2eB-PG7片段，插入於1×Stx2eB(PG12)之BamH I間隙(2×Stx2eB(PG7))。使用BamH I及BgⅢ，自質體11切出Stx2eB-SG12片段，插入於1×Stx2eB(PG12)之BamH I間隙(2×Stx2eB(SG12))。
為使用植物之安定轉型株，進行生產Stx2eB，將前述各Stx2eB之DNA結構物於轉型用載體進行次選殖(載體之設計參考圖1)。使用Xba I及Sac I，插入1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(PG12)、3×Stx2eB(PG12)、4×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(RS)、2×Stx2eB(PG7)及2×Stx2eB(SG12)於PB I 121(Clontech公司)，配置於花椰菜嵌紋病毒35S RNA促進子(35S pro.)及Nopalin合成酵素基因轉譯終結子(NOS-T)之間。
(2)菸草培養細胞之轉型
將製作之轉型用載體，使用電洞法導入於農桿菌(Agrobacterium tumefacience EHA105)。將100μl之於5ml之含100mg/l之卡那黴素(kanamycin)之LB培養基，於28℃培養2晚之農桿菌培養液、及5~10ml之培養第4天之菸草培養細胞(Nicotiana tabacum,cv BY2)之懸濁液，放入培養皿混合，於25℃暗處下靜置共存培養2晚。為除去農桿菌，將培養皿中之培養液移至15ml之離心管進行離心(1000rpm，5分鐘，4℃)，除去上清液。放入改變LS培養基，進行離心分離(1000rpm，5分鐘，4℃)，洗淨細胞。重複此洗淨操作4次，除去農桿菌。將剩餘的BY2細胞置於放入卡那黴素(100mg/l)之改變LS瓊脂培養基，於25℃黑暗下靜置培養。將約2-3週後癒合組織(callus)化細胞移至新培養皿，選擇增殖的選殖品(Clone)。
(3)使用西方點墨分析之Stx2eB蛋白質之半定量
回收平板培養基培養的菸草培養細胞於離心管，每1mg的細胞重量，添加1μl之SDS-sample buffer。以95℃，2分鐘熱變性，作為電泳用試料。使用15%丙烯醯胺凝膠，分離蛋白質後，使用電子轉移裝置，於PVDF膜(Hybond-P；Amersham)上標繪蛋白質。使用抗HA抗體(No.11 867 423 001,Roche)，檢測Stx2eB蛋白質。製作已知濃度之附有HA標籤之Stx2eB之稀釋系列，裝填於凝膠，以訊號強度為依據，製作校正曲線，算出各試料中Stx2eB蛋白質之質量。
以下係表示結果。
(a)Stx2eB之鍵結數量的影響
結果如圖8及9表示。
使1×Stx2eB(PG12)表現時，於約10kDa及約17kDa的位置檢測出訊號。確定分別為切斷訊號胜肽之Stx2eB、及未切斷訊號胜肽之Stx2eB。使2×Stx2eB(PG12)表現時，於約19kDa的位置檢測出與使1×Stx2eB(PG12)表現時相同程度的訊號。使3×Stx2eB(PG12)表現時，於約26kDa的位置檢測出比使1×Stx2eB(PG12)表現時小的訊號。任一種皆與自DNA結構物之設計確定的分子量一致。另外，使4×Stx2eB(PG12)表現時，特異的訊號係於最低檢測濃度以下(數據未揭示)。
藉此可知，2×Stx2eB(PG12)比1×Stx2eB(PG12)或3×Stx2eB(PG12)之Stx2eB蓄積高。
(b)間隔區的影響
結果如圖10及11表示。
由相當於Stx2eB之訊號強度，Stx2eB之蓄積程度係使用PG12為間隔區時最多。接著，使用PG7及SG12時為相同程度地多。另外，使用RS時最少。由此可知，2個Stx2eB之間之間隔區長度及胺基酸序列對2×Stx2eB之蛋白質之蓄積程度造成影響。
(4)即時PCR(real-time PCR)之mRNA之定量
調查轉譯程度對蛋白質之蓄積程度造成的影響。
自上述所得之各轉型BY2細胞，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)，調製RNA。進行DNase處理後，使用Transcriptor Reverse Transcriptase(Roche)，進行轉譯。SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)，進行即時PCR。Stx2eB mRNA之定量係使用將含各對比間共同的序列之NtADH5’UTR及訊號胜肽之區域進行增幅之引子組(序列號碼69及序列號碼70)。使用UBQ-F引子(序列號碼71)及UBQ-R引子(序列號碼72)，定量BY2泛素基因之表現量，修正Stx2eB基因之mRNA程度。另外，1×Stx2eB(PG12)mRNA程度係以定量值為1/2算出。
結果如圖12表示。
每mRNA之Stx2eB蛋白質之蓄積程度係使2×Stx2eB(PG12)表現之細胞比使2×Stx2eB(RS)或1×Stx2eB(PG12)表現之細胞大的趨勢。藉此可知，間隔區之相異不僅對轉譯程度造成影響，亦對編碼程度或編碼後之蛋白質安定性造成影響。另外，合併考量2×Stx2eB蛋白質成顆粒狀局部集中存在之結果時，認為間隔區係對編碼後蛋白質的安定性造成影響者。
<3>暫時性表現實驗 (1)Stx2eB暫時性表現載體之建構
以上述<1>(1)之方法，建構1×Stx2eB(PG12)、2×Stx2eB(PG12)、3×Stx2eB(PG12)、4×Stx2eB(PG12)之暫時性表現載體(圖13-A)。以下將此等載體分別稱為ER-1×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-3×Stx2eB(PG12)、ER-4×Stx2eB(PG12)。另外，「ER」係指內質網型。
另外，以下述方法建構含細胞質型(Cyt)之DNA結構物之暫時性表現載體(圖13-B)、及含葉綠體型(Chl)之DNA結構物之表現載體(圖13-C)。另外，此等DNA結構物係使儘可能接近於內質網型之雜交體蛋白質之結構之雜交體蛋白質表現為目的，設計成含編碼內質網殘留訊號胜肽之DNA。但是，因為該DNA結構物係不含編碼分泌訊號胜肽之DNA，所以於所生產之雜交體蛋白質中，內質網殘留訊號胜肽係不能發揮該機能(蛋白質對內質網之殘留)。
將NtADH5’UTR片段，使用ADH Xba I-F引子(序列號碼34)及ADH BamH I-R引子(序列號碼112)，藉由PCR進行增幅，以Xba I及BamH I處理所得之DNA片段。插入NtADH5’-UTR之Xba I-BamH I片段於ER-1×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-3×Stx2eB(PG12)及ER-4×Stx2eB(PG12)之各Xba I-BamH I間隙，製作細胞質型Stx2eB載體之Cyt-1×Stx2eB(PG12)、Cyt-2×Stx2eB(PG12)、Cyt-3×Stx2eB(PG12)及Cyt-4×Stx2eB(PG12)。
將NtADH5’-UTR片段，使用ADH Xba I-F引子(序列號碼34)及ADH Nsi I-R引子(序列號碼35)，藉由PCR進行增幅。將編碼源自萵苣Rbcs(rubiscosmol次單元)(GenBank ACCESSION D14001)之葉綠體移動訊號胜肽(基因轉殖胜肽，T.P.)之DNA片段(序列號碼80)，以萵苣葉cDNA為模版，使用TP Nsi I-F引子(序列號碼113)及TP BamH I-R引子(序列號碼114)，藉由PCR進行增幅。將所得之NtADH5’-UTR及分泌訊號胜肽之各DNA片段，以Nsi I(TOYOBO公司製)進行處理，使用Ligation High(TOYOBO公司)進行鍵結後，使末端平滑化，於pBluescript Ⅱ SK(Stratagene公司製)之EcoRV間隙進行選殖(質體12)。將質體12以Nsi I處理，以T4 DNA polymerase(TOYOBO公司製)，使末端平滑化後，進行自行黏合，融合NtADH之開始密碼及Rbcs之開始密碼，使其一致(質體13)。使用Xba I及BamH I，自質體13切出NtADH5’-UTR-T.P.融合片段，插入於ER-1×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-3×Stx2eB(PG12)及ER-4×Stx2eB(PG12)之各Xba I-BamH I間隙，製作葉綠體型Stx2eB載體之Chl-1×Stx2eB(PG12)、Chl-2×Stx2eB(PC12)、Chl-3×Stx2eB(PG12)及Chl-4×Stx2eB(PG12)。
(2)CTB暫時性表現載體之製作
以上述<1>(2)之方法，建構1×CTB(PG12)、2×CTB(PG12)之暫時性表現載體(圖14-A)。以下將此等載體分別稱為ER-1×CTB(PG12)、ER-2×CTB(PG12)。
另外，以下述方法建構含細胞質型(Cyt)之DNA結構物之暫時性表現載體(圖14-B)、及含葉綠體型(Chl)之DNA結構物之表現載體(圖14-C)。
使用BamH I及BgⅢ，自ER-1×CTB(PG12)切出CTB-PG12片段，插入於上述<3>(1)製作之Cyt-1×Stx2eB(PC12)之BamH I-BgⅢ間隙及Chl-1×Stx2eB(PG12)之BamH I-BgⅢ間隙，製作細胞質型及葉綠體型之1×CTB(PG12)(Cyt-1×CTB(PG12)、Chl-1×CTB(PG12))。
接著，使用BamH I及BgⅢ，自ER-2×CTB(PG12)切出2×(CTB-PG12)片段，插入於Cyt-1×St×2eB(PG12)之BamH I-BgⅢ間隙及Chl-1×Stx2eB(PG12)之BamH1-BgⅢ間隙，製作細胞質型及葉綠體型之2×CTB(PG12)(Cyt-2×CTB(PG12)、Chl-2×CTB(PG12))。
(3)暫時性表現實驗及西方點墨分析
與上述<1>(3)同樣地操作，使用萵苣之原生質體，進行暫時性表現實驗。接著，與<1>(4)同樣地操作，檢測出Stx2eB、CTB。
(a)Stx2eB鍵結數量的影響
結果如圖15表示。
使ER-1×Stx2eB(PG12)表現時，於約10kDa的位置檢測出訊號。使ER-2×Stx2eB(PG12)表現時，於約19kDa的位置檢測出比使ER-1×Stx2eB(PG12)表現時大的訊號。使ER-3×Stx2eB(PG12)表現時，於約27kDa的位置檢測出比使ER-1×Stx2eB(PG12)表現時大的訊號。此等係任一種皆與自DNA結構物之設計確定的分子量一致。另外，使ER-4×Stx2eB(PG12)表現時，特異的訊號係於最低檢測濃度以下。
使Cyt-1×Stx2eB(PG12)表現時，特異的訊號係於最低檢測濃度以下。使Cyt-2×Stx2eB(PG12)表現時，於約20kDa的位置檢測出訊號。使Cyt-3×Stx2eB(PG12)表現時，於約30kDa的位置檢測出訊號。此等係任一種皆與自DNA結構物之設計確定的分子量一致。另外，使Cyt-4×Stx2eB(PG12)表現時，特異的訊號係於最低檢測濃度以下。
使Chl-1×Stx2eB(PG12)表現時，於約14kDa的位置檢測出些微訊號。使Chl-2×Stx2eB(PG12)表現時，於約22 kDa的位置檢測出與使ER-3×Stx2eB(PG12)表現時相同程度的訊號。使Chl-3×Stx2eB(PG12)表現時，於約30kDa的位置檢測出與使Chl-2×Stx2eB(PG12)表現時相同程度的訊號。此等係任一種皆與自DNA結構物之設計確定的分子量一致。另外，使Chl-4×Stx2eB(PG12)表現時，於約34kDa的位置檢測出些微訊號。
上述各DNA結構物，因為各含1分子之HA標籤(參考圖13)，使編碼2個Stx2eB之DNA表現時，使編碼3個Stx2eB之DNA表現時係分別蓄積相當於使編碼1個Stx2eB之DNA表現時的約2倍、約3倍的Stx2eB蛋白質之蛋白質。
因此，判定使內質網型(ER)、細胞質型(Cyt)、葉綠體型(Chl)中任一種DNA結構物表現時，使藉由間隔區串聯2個或3個Stx2eB之蛋白質表現時比使1個Stx2eB之蛋白質表現時，可有效率地蓄積Stx2eB。
(b)CTB之鍵結數量的影響
結果如圖16表示。
使ER-1×CTB(PG12)表現時，於約17kDa的位置檢測出訊號。使ER-2×CTB(PG12)表現時，於約28kDa及約30kDa的位置檢測出比使ER-1×Stx2eB(PG12)表現時大的訊號。此等係任一種皆與自DNA結構物之設計確定的分子量一致。
使Cyt-1×CTB(PG12)表現時，於約14kDa的位置檢測出些微訊號。使Cyt-2×CTB(PG12)表現時，於約26kDa的位置檢測出與使ER-2×CTB(PG12)表現時相同程度的訊號。此等係任一種皆與自DNA結構物之設計確定的分子量一致。
使Chl-1×CTB(PG12)表現時，於約14kDa的位置檢測出訊號。使Chl-2×CTB(PG12)表現時，於約26kDa的位置檢測出與使ER-2×CTB(PG12)表現時相同程度的訊號。此等係任一種皆與自DNA結構物之設計確定的分子量一致。
由以上判定，使內質網型(ER)、細胞質型(Cyt)、葉綠體型(Chl)中任一種DNA結構物表現時，使藉由間隔區串聯2個CTB之蛋白質表現時比使1個CTB之蛋白質表現時，可有效率地蓄積CTB。
<4>使用菸草培養細胞之轉型實驗 (1)轉型用載體之建構
使用上述所製作之ER-2×Stx2eB(PG12)、Cyt-1×Stx2eB(PG12)、Cyt-2×Stx2eB(PG12)、Cyt-3×Stx2eB(PG12)，進行轉型實驗。
製作轉型用載體係與上述<2>(1)的方法同樣地進行。
(2)菸草培養細胞之轉型及西方點墨分析
轉型實驗及西方點墨分析係與上述<2>(2)、(3)之方法同樣地進行。
結果如圖17表示。
使ER-2×Stx2eB(PG12)表現時，於約19kDa、21kDa及23kDa的位置檢測出訊號。使Cyt-1×Stx2eB(PG12)表現時，特異的訊號係於最低檢測濃度以下。使Cyt-2×Stx2eB(PG12)表現時，於約19kDa的位置檢測出訊號。使Cyt-3×Stx2eB(PG12)表現時，於約27kDa的位置檢測出比使Cyt-2×Stx2eB(PG12)表現時大的訊號。
由以上判定對於菸草培養細胞之轉型株，使藉由間隔區串聯2個或3個Stx2eB之蛋白質表現時比使1個Stx2eB之蛋白質表現時，可有效率地蓄積Stx2eB。另外，對於菸草培養細胞之轉型株，使細胞質型之DNA結構物表現時，尤其使藉由間隔區串聯3個Stx2eB之蛋白質表現時，可有效率地蓄積Stx2eB。
另外，判定對於菸草培養細胞之轉型株，使內質網型之DNA結構物表現時比使細胞質型之DNA結構物表現時，可有效率地蓄積Stx2eB。
<5>使用菸草植物體之轉型實驗 (1)轉型用載體之建構
使用上述所製作之ER-2×Stx2eB(PG12)、Chl-1×Stx2eB(PG12)、Chl-2×Stx2eB(PG12)、Chl-3×Stx2eB(PG12)，進行轉型實驗。
製作轉型用載體係與上述<2>(1)之方法同樣地進行。
(2)菸草植物體之轉型
使用上述所製作之載體，由下述方法進行菸草植物體之轉型。
將菸草植物體(Nicotiana tabacum L.cv.Petit habana SR1)的種子殺菌，接種於MS培養基。將無菌菸草的葉部，不含葉脈，切成1×1cm程度的大小，使葉的背面朝上，放置於加入滅菌水之培養皿，注入上述<2>(2)所得之以含100mg/l之卡那黴素之LB培養基培養2晚之農桿菌懸濁液於培養皿，浸漬3~5分鐘。取出葉片，以滅菌Kimtowel拭取多餘的菌液，放置於癒合組織形成培養基，以25℃培養。於2~3日後，農桿菌於培養基上變得可見時，將葉片移至50ml試管，以滅菌水洗淨5次後，放置於癒合組織形成培養基(含100mg/l之卡那黴素、250mg/l之卡苯尼西林)，以25℃培養1~2週。葉片變得比最初圓、或表面產生凹凸時，移至莖葉形成培養基(含100mg/l之卡那黴素、250mg/l之卡苯尼西林)。進一步於4~6週後，切取莖葉部份發達的莖葉，移至根形成培養基(含100mg/l之卡那黴素、250mg/l之卡苯尼西林)，以25℃培養直至發現長根。將植物體成長至某程度大小者，進行盆栽栽種。
(3)西方點墨分析
對上述製作之基因重組菸草植物體的葉，進行採樣，每1mg質量，添加1μl之SDS-sample buffer。以95℃，2分鐘熱變性，作為電泳試料。用15%丙烯醯胺凝膠，分離蛋白質後，使用電子轉移裝置，於PVDF膜(Hybond-P；Amersham)上標繪蛋白質。使用抗HA抗體(No.11 867 423 001,Roche)，檢測Stx2eB蛋白質。
結果如圖18及19表示。
於ER-2×Stx2eB(PG12)、Chl-1×Stx2eB(PG12)、Chl-2×Stx2eB(PG12)、Chl-3×Stx2eB(PG12)轉型之植物體，可得到高效率蓄積Stx2eB之選殖品。另外，關於葉綠體型之DNA結構物，使藉由間隔區串聯2個或3個Stx2eB之蛋白質表現時比使1個Stx2eB之蛋白質表現時，判定可以高機率得到有效率地蓄積Stx2eB之複製品。
另外，使ER-2×Stx2eB(PG12)表現時之訊號係於約15kDa、約19 kDa及約22kDa的位置檢測出。使Chl-1×Stx2eB(PG12)表現時的訊號，於約12kDa的位置檢測出。使Chl-2×Stx2eB(PG12)表現時的訊號，於約19kDa的位置檢測出。使Chl-3×Stx2eB(PG12)表現時的訊號，於約27kDa的位置檢測出。此等係任一種皆與自DNA結構物之設計確定的分子量一致。
<6>使用菸草培養細胞之轉型實驗 (1)Stx2eB轉型用載體之建構
以上述<1>(1)之方法，製作ER-2×Stx2eB(PG12)。ER-2×Stx2eB(PG17)、ER-2×Stx2eB(PG22)係由下述方法製作。DNA結構物之設計如圖20表示。
煉合PG7-F引子(序列號碼65)及PG7-R引子(序列號碼66)，以T4 PNK進行磷酸化。插入所得之磷酸化DNA片段於<1>(1)得到之ER-1×Stx2eB(PG12)之BgⅢ間隙(質體14)。
另外，煉合PG12-F引子(序列號碼43)及PG12-R引子(序列號碼44)，以T4 PNK進行磷酸化。插入所得之磷酸化DNA片段於ER-1×Stx2eB(PG12)之BgⅢ間隙(質體15)。
使用BamH I及BgⅢ，自質體14切出Stx2eB-PG17片段，插入於ER-1×Stx2eB(PG12)之BamH I間隙(2×Stx2eB(PG17))。使用BamH I及BgⅢ，自質體15切出Stx2eB-PG22片段，插入於ER-1×Stx2eB(PG12)之BamH I間隙(ER-2×Stx2eB(PG22))。
為使用植物之安定轉型株，進行生產Stx2eB，將前述各Stx2eB之DNA結構物於轉型用載體進行次選殖。亦即，使用Xba I及Sac I插入ER-2×Stx2eB(PG12)、ER-2×Stx2eB(PG17)、ER-2×Stx2eB(PG22)於pB I 121(Clontech公司)，配置於花椰菜嵌紋病毒35S RNA促進子(35S pro.)及Nopalin合成酵素基因轉譯終結子(NOS-T)之間。
(2)CTB轉型用載體之建構
以上述<1>(2)之方法，製作ER-2×CTB(PG12)。ER-2×CTB(PG17)、ER-2×CTB(PG22)係由下述方法製作。各DNA結構物之設計如圖21表示。
煉合PG7-F引子(序列號碼65)及PG7-R引子(序列號碼66)，以T4 PNK進行磷酸化。插入所得之磷酸化DNA片段於<1>(2)得到之ER-1×CTB(PG12)之BgⅢ間隙(質體16)。煉合PG12-F引子(序列號碼43)及PG12-R引子(序列號碼44)，以T4 PNK進行磷酸化。插入所得之磷酸化DNA片段於ER-1×CTB(PG12)之BgⅢ間隙(質體17)。
使用BamH I及BgⅢ，自質體16切出CTB-PG17片段，插入於ER-1×CTB(PG12)之BamH I間隙(ER-2×CTB(PG17))。使用BamH I及BgⅢ，自質體17切出CTB-PG22片段，插入於ER-1×CTB(PG12)之BamH I間隙(ER-2×CTB(PG22))。
為使用植物之安定轉型體，進行生產CTB，將前述各CTB之DNA結構物於轉型用載體進行次選殖。亦即，使用Xba I及Sac I插入於ER-2×CTB(PG12)、ER-2×CTB(PG17)、ER-2×CTB(PG22)於pB I 121(Clontech公司)，配置於花椰菜嵌紋病毒35S RNA促進子(35S pro.)及Nopalin合成酵素基因轉譯終結子(NOS-T)之間。
(3)轉型實驗及西方點墨分析
轉型實驗及西方點墨分析係以<2>(2)、(3)之方法進行。
(a)間隔區長度對Stx2eB串聯時的影響結果如圖22表示。
使ER-2×Stx2eB(PG17)、ER-2×Stx2eB(PG22)表現時係檢測出與使ER-2×Stx2eB(PG12)表現時相同程度的訊號。藉此可判定PG17、PG22中任一種皆顯示與PG12相同效果。
另外，使ER-2×Stx2eB(PG12)表現時，於約19kDa及約22kDa的位置檢測出訊號，使ER-2×Stx2eB(PG17)表現時，於約19kDa及約22kDa的位置檢測出訊號，使ER-2×Stx2eB(PG22)表現時，於約20kDa及約23kDa的位置檢測出訊號。此等係任一種皆與自DNA結構物之設計確定的分子量一致。
(b)間隔區長度對CTB串聯時的影響
結果如圖23表示。
使ER-2×CTB(PG17)、ER-2×CTB(PG22)表現時係檢測出與使ER-2×CTB(PG12)表現時相同程度的訊號。藉此可判定PG17、PG22中任一種皆顯示與PG12相同效果。
另外，使ER-2×CTB(PG12)表現時，於約32kDa、34kDa及36kDa的位置檢測出訊號，使ER-2×CTB(PG17)表現時，於約32kDa、34kDa及36kDa的位置檢測出訊號，使ER-2×CTB(PG22)表現時，於約32kDa、34kDa及36kDa的位置檢測出訊號。此等係任一種皆與自DNA結構物之設計確定的分子量一致。
產業上利用性
本發明之雜交體蛋白質係安定性高，以高程度蓄積於植物細胞內。另外，使用本發明之DNA結構物，使植物生產本發明之雜交體蛋白質，將可有效率地生產志賀毒素、霍亂毒素、大腸桿菌易熱性毒素之經口疫苗。
本發明係可使植物對誘導免疫性表現充份程度的細菌抗原。本發明係對動物以基因轉殖植物為食餌，可以低成本賦予動物對細菌抗原之免疫。例如有效地開發豬浮腫病疫苗、霍亂疫苗。
[圖1]係表示Stx2eB表現載體之設計圖。圖中，→係表示編碼開始點，▽係表示編碼後切斷部位。
[圖2]係表示使用萵苣原生質體之暫時性表現實驗所得之Stx2eB之蓄積程度照片。
[圖3]係表示使用萵苣原生質體之暫時性表現實驗所得之CTB之蓄積程度照片。
[圖4]係表示編碼Stx2eB-YFP之融合蛋白質之DNA結構物之設計圖。圖中，→係表示編碼開始點，▽係表示編碼後切斷部位。
[圖5]係表示使用菸草培養細胞原生質體之暫時性表現實驗所得之Stx2eB-YFP之融合蛋白質局部集中存在的照片。
[圖6]係表示使用菸草培養細胞原生質體之暫時性表現實驗所得之Stx2eB-YFP之融合蛋白質局部集中存在的照片。
[圖7]係表示使用菸草培養細胞原生質體之暫時性表現實驗所得之ARF1pWT及ARF1pDN共同表現時之液胞型GFP、及Stx2eB-YFP之融合蛋白質局部集中存在的照片。
[圖8]係表示使用菸草培養細胞(BY2)之轉型實驗所得之Stx2eB之蓄積程度照片。各行的數字係表示選殖號碼。
[圖9]係表示使用菸草培養細胞(BY2)之轉型實驗所得之Stx2eB之蓄積程度照片。各行的數字係表示選殖號碼。
[圖10]係表示使用菸草培養細胞(BY2)之轉型實驗所得之Stx2eB之蓄積程度照片。各行的數字係表示選殖號碼。
[圖11]係表示使用菸草培養細胞(BY2)之轉型實驗所得之Stx2eB之蓄積程度圖。各數字係表示選殖號碼。
[圖12]係表示Stx2eB之mRNA程度及Stx2eB之蓄積程度之關係圖。
[圖13]係表示編碼Stx2eB之DNA結構物之設計圖。表示A係內質網體、B係細胞質型、C係葉綠體型之DNA結構物之設計圖。
[圖14]係表示編碼CTB之DNA結構物之設計圖。表示A係內質網體、B係細胞質體、C係葉綠體型之DNA結構物之設計圖。
[圖15]係表示使用萵苣原生質體之暫時性表現實驗所得之Stx2eB之蓄積程度照片。
[圖16]係表示使用萵苣原生質體之暫時性表現實驗所得之CTB之蓄積程度照片。
[圖17]係表示使用菸草培養細胞(BY2)之轉型實驗所得之Stx2eB之蓄積程度照片。各行的數字係表示選殖號碼。
[圖18]係表示使用菸草植物體之轉型實驗所得之Stx2eB之蓄積程度照片。各行的數字係表示選殖號碼。
[圖19]係表示係表示使用菸草植物體之轉型實驗所得之Stx2eB之蓄積程度照片。各行的數字係表示選殖號碼。
[圖20]係表示編碼Stx2eB之DNA結構物之設計圖。
[圖21]係表示編碼CTB之DNA結構物之設計圖。
[圖22]係表示使用菸草培養細胞(BY2)之轉型實驗所得之Stx2eB之蓄積程度照片。
[圖23]係表示使用菸草培養細胞(BY2)之轉型實驗所得之CTB之蓄積程度照片。
<110> IDEMITSU KOSAN Co.,Ltd. <120> 細菌毒素疫苗 <130> 0800224-8334 <150> JP 2008-120573 <151> 2008-05-02 <160> 114 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA <400> 1<210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成胜肽 <400> 2<210> 3 <211> 959 <212> DNA <213> 大腸桿菌 <400> 3 <210> 4 <211> 304 <212> PRT <213> 大腸桿菌 <400> 4 <210> 5 <211> 210 <212> DNA <213> 大腸桿菌 <400> 5<210> 6 <211> 69 <212> PRT <213> 大腸桿菌 <400> 6<210> 7 <211> 312 <212> DNA <213> 霍亂弧菌 <400> 7<210> 8 <211> 103 <212> PRT <213> 霍亂弧菌 <400> 8<210> 9 <211> 453 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 9 <210> 10 <211> 150 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成蛋白質 <400> 10<210> 11 <211> 657 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 11<210> 12 <211> 218 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成蛋白質 <400> 12 <210> 13 <211> 489 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 13<210> 14 <211> 162 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成蛋白質 <400> 14 <210> 15 <211> 693 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 15<210> 16 <211> 230 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成蛋白質 <400> 16 <210> 17 <211> 72 <212> DNA <213> 菸草 <400> 17<210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> 菸草 <400> 18<210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成胜肽 <400> 19<210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成胜肽 <400> 20<210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成胜肽 <400> 21<210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成胜肽 <400> 22<210> 23 <211> 91 <212> DNA <213> 菸草 <400> 23<210> 24 <211> 547 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 24<210> 25 <211> 751 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 25<210> 26 <211> 637 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 26<210> 27 <211> 841 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 27<210> 28 <211> 667 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 28<210> 29 <211> 871 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 29<210> 30 <211> 38 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 30<210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 31<210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 32<210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 33<210> 34 <211> 41 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 34<210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 35<210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 36<210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 37<210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成胜肽 <400> 38<210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 39<210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 40<210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 41<210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 42<210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 43<210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 44<210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 45<210> 46 <211> 39 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 46<210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 47<210> 48 <211> 40 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 48<210> 49 <211> 32 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 49<210> 50 <211> 45 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 50<210> 51 <211> 45 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 51<210> 52 <211> 43 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 52<210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 53<210> 54 <211> 45 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 54<210> 55 <211> 31 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 55<210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 56<210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 57<210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 58<210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 59<210> 60 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 60<210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 61<210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 62<210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成胜肽 <400> 63<210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成胜肽 <400> 64<210> 65 <211> 15 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 65<210> 66 <211> 15 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 66<210> 67 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 67<210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 68<210> 69 <211> 25 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 69<210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 70<210> 71 <211> 22 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 71<210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 72<210> 73 <211> 700 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 73<210> 74 <211> 904 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 74 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> 菸草 <400> 75<210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> 菸草 <400> 76<210> 77 <211> 45 <212> DNA <213> 辣根 <400> 77<210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> 辣根 <400> 78<210> 79 <211> 75 <212> PRT <213> 鹿角萵苣 <400> 79<210> 80 <211> 225 <212> DNA <213> 鹿角萵苣 <400> 80<210> 81 <211> 51 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA <400> 81<210> 82 <211> 17 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成胜肽 <400> 82<210> 83 <211> 66 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工合成DNA <400> 83<210> 84 <211> 22 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成胜肽 <400> 84<210> 85 <211> 696 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 85<210> 86 <211> 231 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成蛋白質 <400> 86 <210> 87 <211> 732 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 87<210> 88 <211> 243 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成蛋白質 <400> 88<210> 89 <211> 504 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 89 <210> 90 <211> 167 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成蛋白質 <400> 90<210> 91 <211> 519 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 91<210> 92 <211> 172 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成蛋白質 <400> 92<210> 93 <211> 1002 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 93<210> 94 <211> 333 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成蛋白質 <400> 94 <210> 95 <211> 1038 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 95 <210> 96 <211> 345 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成蛋白質 <400> 96 <210> 97 <211> 708 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 97<210> 98 <211> 235 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成蛋白質 <400> 98<210> 99 <211> 723 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 99 <210> 100 <211> 240 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 人工合成蛋白質 <400> 100 <210> 101 <211> 583 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 101<210> 102 <211> 682 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 102 <210> 103 <211> 697 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 103<210> 104 <211> 805 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 104 <210> 105 <211> 826 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 105<210> 106 <211> 910 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 106 <210> 107 <211> 1048 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 107<210> 108 <211> 787 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 108 <210> 109 <211> 886 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 109<210> 110 <211> 901 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 110<210> 111 <211> 1009 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成DNA結構 <400> 111<210> 112 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 112<210> 113 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 113<210> 114 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> 人工合成引子 <400> 114

Claims (19)

  1. .一種雜交體蛋白質(hybrid protein)，其特徵係含有2個或3個之Stx2e蛋白質的B次單元、霍亂毒素蛋白質或大腸桿菌易熱性毒素蛋白質的B次單元之雜交體蛋白質，且該等毒素蛋白質係分別連結於具有下述特徵(A)、(B)、(C)及(D)之胜肽：(A)胺基酸個數為12~30個；(B)脯胺酸之含有率為20~35%；(C)脯胺酸係隔2個胺基酸、或3個胺基酸所配置；(D)前述胜肽中，脯胺酸以外的胺基酸中，絲胺酸及甘胺酸之合計含有率係70%以上。
  2. 如申請專利範圍第1項之雜交體蛋白質，其中前述胜肽係由序列號碼2、82或84所表示之胺基酸序列組成。
  3. 如申請專利範圍第2項之雜交體蛋白質，其中2個Stx2e蛋白質的B次單元、霍亂毒素蛋白質或大腸桿菌易熱性毒素蛋白質的B次單元係藉由序列號碼2所表示之胺基酸序列組成之胜肽所串聯。
  4. 如申請專利範圍第1項之雜交體蛋白質，其具有序列號碼10、12、14或16所表示之胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第1項之雜交體蛋白質，其具有序列號碼86、88、90、92、94、96、98或100所表示之胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之雜交體蛋白質，其中於胺基末端加成源自植物之分泌訊號胜肽。
  7. 如申請專利範圍第6項之雜交體蛋白質，其中於羧基末端加成內質網(Endoplasmic Reticulum)殘留訊號胜肽。
  8. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之雜交體蛋白質，其中於胺基末端加成葉綠體移動訊號胜肽。
  9. 一種DNA結構物，其特徵係含編碼如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之雜交體蛋白質之DNA。
  10. 如申請專利範圍第9項之DNA結構物，其含具有序列號碼9、11、13或15所表示之鹼基序列之DNA。
  11. 如申請專利範圍第9項之DNA結構物，其含具有序列號碼85、87、89、91、93、95、97或99所表示之鹼基序列之DNA。
  12. 如申請專利範圍第9項至第11項中任一項之DNA結構物，其中編碼雜交體蛋白質之DNA係以可表現的方式鍵結於源自植物之乙醇去氫酶(alcohol dehydrogenase)基因之5’-非編碼區(non-coding region)。
  13. 如申請專利範圍第12項之DNA結構物，其中前述源自植物之乙醇去氫酶基因之5’-非編碼區係源自菸草。
  14. 如申請專利範圍第13項之DNA結構物，其具有以序列號碼24~29中任一個所表示之鹼基序列。
  15. 如申請專利範圍第13項之DNA結構物，其具有以 序列號碼101~111中任一個所表示之鹼基序列。
  16. 一種重組載體，其含如申請專利範圍第9項至第15項中任一項之DNA結構物。
  17. 一種轉型株，其特徵係以如申請專利範圍第16項之重組載體所轉型。
  18. 如申請專利範圍第17項之轉型株，其中轉型株係轉型植物細胞。
  19. 一種胜肽，其特徵係由序列號碼2、82或84所表示之胺基酸序列或與該序列類似性在90%以上的胺基酸序列組成。
TW098114432A 2008-05-02 2009-04-30 Bacterial Toxin Vaccine TWI460270B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008120573 2008-05-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201005093A TW201005093A (en) 2010-02-01
TWI460270B true TWI460270B (zh) 2014-11-11

Family

ID=41255098

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW098114432A TWI460270B (zh) 2008-05-02 2009-04-30 Bacterial Toxin Vaccine

Country Status (11)

Country Link
US (2) US8846052B2 (zh)
EP (2) EP2287300B1 (zh)
JP (1) JP5360727B2 (zh)
KR (1) KR101540496B1 (zh)
CN (2) CN103626876B (zh)
AR (1) AR071232A1 (zh)
DK (2) DK2728004T3 (zh)
ES (2) ES2686780T3 (zh)
MX (1) MX2010011938A (zh)
TW (1) TWI460270B (zh)
WO (1) WO2009133882A1 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103626876B (zh) * 2008-05-02 2016-09-14 出光兴产株式会社 细菌毒素疫苗
WO2011118579A1 (ja) 2010-03-25 2011-09-29 国立大学法人富山大学 形質細胞同定及び単離用蛍光プローブ並びにこのプローブを用いた形質細胞の同定又は単離方法
JP5641205B2 (ja) * 2010-07-13 2014-12-17 出光興産株式会社 糖鎖修飾が抑制された改変Ｓｔｘ２ｅタンパク質
KR20140032394A (ko) * 2011-03-30 2014-03-14 내셔날 유니버시티 코포레이션 유니버시티 오브 토야마 형질 세포 또는 형질아 세포의 선택 방법, 목적 항원 특이적인 항체의 제조 방법, 신규 단일 클론 항체
US9701724B2 (en) * 2012-10-22 2017-07-11 The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Vaccine for preventing porcine edema disease
US9937271B2 (en) * 2013-11-26 2018-04-10 Idemitsu Kosan Co., Ltd. Prevention of Escherichia coli diarrhea
CA2931663A1 (en) * 2013-11-26 2015-06-04 Idemitsu Kosan Co., Ltd. Vaccine against colibacillosis
WO2016021276A1 (ja) * 2014-08-08 2016-02-11 出光興産株式会社 豚繁殖・呼吸障害症候群防除剤
WO2017094793A1 (ja) 2015-11-30 2017-06-08 出光興産株式会社 免疫原性が増強されたワクチン抗原
CN108473979B (zh) 2015-12-28 2022-08-19 出光兴产株式会社 肽标签及包含它的带有标签的蛋白质
JPWO2017217460A1 (ja) * 2016-06-15 2019-04-04 出光興産株式会社 ペプチドリンカーで連結された２以上のタンパク質を含む融合タンパク質
JPWO2018225662A1 (ja) * 2017-06-07 2020-04-09 出光興産株式会社 自然免疫増強剤
WO2020045530A1 (ja) * 2018-08-31 2020-03-05 出光興産株式会社 ペプチドタグを利用したタンパク質の可溶性発現

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005011733A1 (en) * 2003-07-21 2005-02-10 Akzo Nobel N.V. Hybrid toxins comprising shiga-like toxin subunits fused to escherichia coli heat labile enterotoxin subunits and vaccines thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68929405T2 (de) 1988-09-06 2003-02-06 Washington University, St. Louis Orale-immunisierung durch verwendung von transgenen pflanzen
US5525491A (en) * 1991-02-27 1996-06-11 Creative Biomolecules, Inc. Serine-rich peptide linkers
JP3633933B2 (ja) * 1992-07-31 2005-03-30 アカンビス、リサーチ、リミテッド 弱毒化細菌における組換え融合タンパク質の発現
DE69533964T2 (de) 1994-10-24 2006-03-30 The Texas A & M University System, College Station Orale immunisierung durch verwendung von transgenen pflanzen
US6261561B1 (en) 1996-04-19 2001-07-17 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Method of stimulating an immune response by administration of host organisms that express intimin alone or as a fusion protein with one or more other antigens
BR9916515A (pt) 1998-12-22 2001-11-06 Thompson Boyce Plant Res Polinucleotìdeo, vetor de expressão, células de e. coli e de agrobacterium tumefaciens transformadas com o vetor de expressão, célula de planta transgênica, semente de planta transgênica, célula eucariótica transgênica, composição imunogênica, método de evocar uma resposta imune em um animal ou ser humano, planta transgênica, e, adjuvante
AU2001271268A1 (en) * 2000-05-19 2001-12-03 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Hybrid lt-a/ct-b holotoxin for use as an adjuvant
JP4627879B2 (ja) 2000-12-28 2011-02-09 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 植物細胞において遺伝子の高発現能を有する５’−非翻訳領域配列
CN101016332B (zh) * 2007-03-07 2010-12-01 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种抑制志贺毒素的短肽及其用途
JP5279089B2 (ja) 2007-07-03 2013-09-04 出光興産株式会社 ブタ浮腫病ワクチン
CN103626876B (zh) * 2008-05-02 2016-09-14 出光兴产株式会社 细菌毒素疫苗

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005011733A1 (en) * 2003-07-21 2005-02-10 Akzo Nobel N.V. Hybrid toxins comprising shiga-like toxin subunits fused to escherichia coli heat labile enterotoxin subunits and vaccines thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.M. O’Dowd et al., "Novel modifications to the C-terminus of LTB that facilitate site-directed chemical coupling of antigens and the development of LTB as a carrier for mucosal vaccines", Vaccine, 1999, Vol. 17, p.1442~1453. L. Faye et al. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2728004B1 (en) 2018-08-08
MX2010011938A (es) 2010-12-01
EP2287300A4 (en) 2011-06-22
CN103626876B (zh) 2016-09-14
JPWO2009133882A1 (ja) 2011-09-01
US8846052B2 (en) 2014-09-30
CN102016034A (zh) 2011-04-13
DK2287300T3 (en) 2018-09-17
KR20110009197A (ko) 2011-01-27
WO2009133882A1 (ja) 2009-11-05
EP2287300A1 (en) 2011-02-23
ES2691985T3 (es) 2018-11-29
TW201005093A (en) 2010-02-01
CN102016034B (zh) 2014-11-05
EP2287300B1 (en) 2018-06-27
ES2686780T3 (es) 2018-10-19
EP2728004A2 (en) 2014-05-07
EP2728004A3 (en) 2014-07-23
KR101540496B1 (ko) 2015-08-25
AR071232A1 (es) 2010-06-02
US20150133635A1 (en) 2015-05-14
JP5360727B2 (ja) 2013-12-04
DK2728004T3 (en) 2018-11-05
US20110231960A1 (en) 2011-09-22
CN103626876A (zh) 2014-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI460270B (zh) Bacterial Toxin Vaccine
JP5279089B2 (ja) ブタ浮腫病ワクチン
JP5519192B2 (ja) 種子のタンパク質含量を増産させる遺伝子及びその利用方法
US7253341B2 (en) Denaturant stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same, their uses and methods of increasing a specific activity thereof
US20050074763A1 (en) Denaturat stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same and their uses
JP5641205B2 (ja) 糖鎖修飾が抑制された改変Ｓｔｘ２ｅタンパク質
US20090253125A9 (en) Denaturat stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same, their uses and methods of increasing a specific activity thereof
JP2020000120A (ja) レタスユビキチンプロモーターを含む組換えタンパク質発現用遺伝子構築物
JP5845306B2 (ja) 種子のタンパク質含量を増産させる遺伝子及びその利用方法
JP5850079B2 (ja) 種子のタンパク質含量を減少させる遺伝子及びその利用方法
JP5850078B2 (ja) 種子のタンパク質含量を減少させる遺伝子及びその利用方法
WO2024208914A1 (en) Trans-complementary vector system for highly efficient heterologous gene expression in plants
JP2006526984A (ja) ハイブリッド種子における目的産物の安全な産生
Shchelkunov et al. Transplastome plants
JP2004008095A (ja) ヒトインターフェロンβ遺伝子導入植物。