JP2020000120A - レタスユビキチンプロモーターを含む組換えタンパク質発現用遺伝子構築物 - Google Patents
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Abstract
Description
35Sプロモーターを用いた場合には、後代で遺伝子のサイレンシング(目的タンパク質の生産量の低下)が起こることが報告されている(非特許文献1〜3)。したがって、後代種子を用いて安定的に外来遺伝子を発現させるためにはサイレンシングを回避する技術が必要であった。
また、35Sプロモーター含む遺伝子発現用カセットを遺伝子組換えレタスに組み込んだ場合、後代種子の採種量が著しく少なくなることが分かり、当該レタスの商業化のためには採種効率を大幅に向上させる課題があった。
さらに、35Sプロモーターを用いた場合には、高光強度条件下で発現が低下することが報告されている(非特許文献4)。一般に、高光強度で植物の生育が促進されるため、高光強度条件下でも発現が低下しない発現システムの構築が課題であった。
そこで、本発明は、遺伝子組換え植物の成熟種子を効率的に採種すること、遺伝子サイレンシングを回避すること、及び高光強度でも目的とする外来遺伝子の発現が低下しない発現システムを構築すること、を課題とする。
[1] レタスユビキチンプロモーターとシロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2(HSP18.2)ターミネーターを含む、組換えタンパク質発現用遺伝子構築物。
[2]レタスユビキチンプロモーターが、配列番号1の塩基配列を含むDNA、又は配列番号1の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、植物細胞内でプロモーターとして機能するDNAである、[1]に記載の遺伝子構築物。
[3]シロイヌナズナHSP18.2ターミネーターが、配列番号2の塩基配列を含むDNA、又は配列番号2の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、植物細胞内でターミネーターとして機能するDNAである、[1]又は[2]に記載の遺伝子構築物。
[4]さらに、翻訳エンハンサー配列を含む、[1]〜[3]のいずれかに記載の遺伝子構築物。
[5]目的タンパク質をコードするDNAを含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の遺伝子構築物。
[6]目的タンパク質が、細菌毒素タンパク質及び/又はウイルス由来タンパク質である、[5]に記載の遺伝子構築物。
[7]目的タンパク質が、2つ以上のタンパク質の融合タンパク質である、[5]又は[6]に記載の遺伝子構築物。
[8]融合タンパク質が、2つ以上のタンパク質がペプチドリンカーで連結された融合タンパク質である、[7]に記載の遺伝子構築物。
[9]目的タンパク質が分泌シグナルペプチドを含む、[5]〜[8]のいずれかに記載の遺伝子構築物。
[10]目的タンパク質がペプチドタグを含む、[5]〜[9]のいずれかに記載の遺伝子構築物。
[11]目的タンパク質が小胞体残留シグナルペプチドを含む、[5]〜[10]のいずれかに記載の遺伝子構築物。
[12] [1]〜[11]のいずれかに記載の遺伝子構築物を含む、ベクター。
[13] [1]〜[11]のいずれかに記載の遺伝子構築物、又は[12]に記載のベクターで形質転換された、遺伝子組換え植物。
[14]レタスである、[13]に記載の遺伝子組換え植物。
[15] [13]又は[14]に記載の遺伝子組換え植物から得られる種子。
[16] [13]又は[14]に記載の遺伝子組換え植物であって、目的タンパク質を発現する遺伝子組換え植物を栽培する工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
[17]栽培を300〜600 PPFDの光強度下で行う、[16]に記載の目的タンパク質の製造方法。
[18]レタスユビキチンプロモーターに発現可能に連結された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子構築物で形質転換され、目的タンパク質を発現する遺伝子組換え植物を300〜600 PPFDの光強度下で栽培する工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
[19]目的タンパク質を発現する遺伝子組換え植物において、該植物から得られる成熟種
子の量を増加させる方法であって、レタスユビキチンプロモーターに発現可能に連結された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子構築物を用いて植物を形質転換し、該形質転換植物を栽培することを特徴とする方法。
[20]前記形質転換植物は水耕栽培により栽培される、[19]に記載の方法。
[21]前記植物から得られる成熟種子の量は植物の一株(個体)あたりの成熟種子数である、[19]又は[20]に記載の方法。
[22]前記植物から得られる成熟種子の量は植物の一集合花あたりの成熟種子数である、[19]又は[20]に記載の方法。
レタスユビキチンプロモーターは、レタスゲノム配列においてレタスユビキチン遺伝子の転写開始点よりも上流に存在し、レタスユビキチン遺伝子の発現を誘導する配列を意味するが、例えば、米国生物工学情報センター(NCBI; National Center for Biotechnology Information)が提供する塩基配列データベースであるGenBankにアクセションNO.AB500086.1で登録されている配列又はその一部を含むDNAが挙げられる。
また、配列番号1の塩基配列を含むDNAが挙げられるが、植物体内でプロモーター活性を有するDNAである限りにおいて、配列番号1の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、挿入及び/又は付加された塩基配列を有するDNAでもよい。ここで、「1又は複数の塩基」とは、例えば、1〜50個、1〜30個、1〜10個、又は1〜5個の塩基を意味する。このようなDNAには、配列番号1の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、植物体内でプロモーター活性を有するDNAが含まれる。
シロイヌナズナHSP18.2ターミネーターは、シロイヌナズナゲノム配列においてHSP18.2遺伝子の終止コドンよりも下流に存在し、HSP18.2遺伝子の転写を終結させる配列を意味するが、例えば、配列番号2の塩基配列を含むDNAが挙げられる。ただし、植物体内でターミネーター活性を有するDNAである限りにおいて、配列番号2の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、挿入及び/又は付加された塩基配列を有するDNAでもよい。ここで、「1又は複数の塩基」とは、例えば、1〜50個、1〜30個、1〜10個、又は1〜5個の塩基を意味する。このようなDNAには、配列番号2の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、植物体内でターミネーター活性を有するDNAが含まれる。なお、ストリンジェントな条件は上述した通りである。HSP18.2ターミネーターには核マトリクス結合ドメイン(matrix attachment region, MAR)が含まれると推定され、効率よく転写終結が起こると考えられる。
(3’側)にシロイヌナズナHSP18.2ターミネーターを含むものであればよいが、目的タンパク質をコードする遺伝子(目的遺伝子)をUBQプロモーターとHSP18.2ターミネーターの間に配置するために、該プロモーターと該ターミネーターの間にマルチクローニングサイト(複数の制限酵素認識配列を含む部位)を含むことが好ましい。
目的タンパク質の種類は宿主細胞で発現しうるものであれば特に制限されないが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、血液タンパク質、酵素、抗原、抗体、転写因子、受容体又はそれらの部分ペプチドなどが挙げられる。タンパク質の由来は特に制限されず、例えば、ヒトなどの哺乳動物由来でもよいし、植物由来でもよいし、細菌や酵母由来でもよい。
た、豚繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)ウイルスのGlycoprotein 5 (GP5)のウイルス外領域(ectGP5)でもよい(国際公開WO2016/021276号パンフレット)。
志賀毒素(Stx)は、浮腫病の原因となる腸管出血性大腸菌(EHEC, STEC)が産生するタンパク質性毒素で、1型(Stx1)及び2型(Stx2)に分けられる。Stx1は、a〜dのサブクラスに、Stx2はa〜gのサブクラスにそれぞれ分類される。毒性本体であるAサブユニット1分子と腸管粘膜への結合に働くBサブユニット5分子からなるホロ毒素で、真核細胞のリボソームに作用して、タンパク質合成を阻害する働きを持つ。
この中では、Stx2eのBサブユニット(Stx2eB)が好ましく、Stx2eBは、例えば、配列番号4のアミノ酸配列で表され、Stx2eBをコードする塩基配列は配列番号3で表される。また、Stx2eBは、Asn73(すなわち、配列番号4のアミノ酸配列の55位のAsn残基)がSer残基に置換されている変異型でもよい。野生型のStx2eBはこのAsn残基においてN−結合型の糖鎖修飾を受けるが、この変異体はN−結合型の糖鎖修飾を受けない。
また、Stx2eBは、配列番号4のアミノ酸配列と、好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の同一性を有し、かつブタや鶏等の動物に投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
大腸菌性下痢症は、毒素原性大腸菌(ETEC)が生産するタンパク質性毒素LTが原因であり、LTは大腸菌易熱性毒素とも呼ばれる。LTは、毒性本体であるAサブユニット1分子とBサブユニット5分子からなるホロ毒素である。LTのAサブユニット(LTA)は細胞質内に侵入し、細胞内cAMP濃度を上昇させ、細胞膜クロライドチャネルを活性化することで腸管内への水の漏出すなわち下痢の病態を引き起こす。LTのBサブユニット(LTB)は無毒であり、LT毒素と腸管細胞との接着に関与する。
この中ではLTBが好ましく、LTBは、例えば、配列番号6のアミノ酸配列で表され、LTBをコードする塩基配列は配列番号5で表される。また、LTBは、配列番号6で表されるアミノ酸配列と、85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の同一性を有し、かつブタや鶏等の動物に投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
LTBには糖鎖が付加されていてもよい。例えば、LTBの90位(すなわち、配列番号6の90位)のAsn残基にN−結合型の糖鎖が付加される。一方、配列番号6の90位がSer残基に置換された変異型LTBはN−結合型の糖鎖修飾を受けない。
コレラ毒素(CT)タンパク質は、毒性本体である1つのAサブユニット(CTA)と、腸管粘膜への侵入へ関与する5つのBサブユニット(CTB)からなる。
この中ではCTBが好ましく、CTBは、例えば、配列番号8のアミノ酸配列で表され、CTBをコードする塩基配列は配列番号7で表される。また、CTBは、配列番号8で表されるアミノ酸配列と、85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の同一性を有し、かつブタや鶏等の動物に投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
2つ以上のタンパク質の融合タンパク質としては、2つ以上の異種タンパク質の融合タンパク質でもよいし、2つ以上の同種タンパク質の融合タンパク質でもよい。
例えば、志賀毒素2eのBサブユニット(Stx2eB)、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット(LTB)及びコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される2以上の毒素Bサブユニットの融合タンパク質を含む。これらの毒素タンパク質から選択される2種以上の異種タンパク質の融合タンパク質とすることで、複数の毒素に対するワクチンとすることができる。
また、これらの細菌毒素タンパク質と上記ウイルス由来のタンパク質の融合タンパク質でもよい。毒素タンパク質とウイルス由来のタンパク質の融合タンパク質とすることで、細菌毒素とウイルスに対するワクチンとすることができる。
ペプチドリンカーのアミノ酸の個数は、例えば5〜30個、好ましくは10〜25個、さらに好ましくは10〜22個、より好ましくは12〜22個である。また、ペプチドリンカーにおけるプロリンの含有率が好ましくは20〜27%、より好ましくは、20〜25%である。ペプチドリンカーにおいて、プロリンは、好ましくは2つ置き、又は3つ置きに(2又は3個の他のアミノ酸を挟んで)配置される。プロリンの間に配置されるアミノ酸は、好ましくは、グリシン、セリン、アルギニンから選択される。但し、ペプチドの一方又は両方の末端においては、プロリン以外のアミノ酸が、5つ以内、好ましくは4つ以内の範囲で付加されていてもよい。このような好ましいペプチドリンカーは、例えば、国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。また、国際公開WO 2017/115853号パンフレットに記載されたペプチドリンカーも好ましく用いることができる。
より具体的には、分泌シグナルペプチドは、タバコのβ-Dグルカンエキソヒドロラーゼに由来し、配列番号14で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドが挙げられる。タバコのβ-DグルカンエキソヒドロラーゼをコードするDNAの塩基配列は、例えば配列番号13で表される。
好ましい小胞体残留シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されているが、HDEL配列(配列番号15)を利用することができる。
液胞移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
葉緑体移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び
国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’-非翻訳領域としては、例えばタバコ(Nicotiana tabacum)由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’-非翻訳領域(NtADH5'UTR)(配列番号16)を用いることができ、翻訳開始点上流3塩基を改変したNtADH5'UTR領域(NtADHmod 5'UTR)(配列番号17)を用いることでさらに高翻訳が期待できる。
ト、不定胚、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。
本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型等を指標として形質転換体を選抜することができる。選抜した植物細胞を常法(例えば、Toki et al. (1995) Plant Physiol. 100:1503-1507)に従って培養することにより、植物体を再生することができる。
なお、高光強度下においても目的遺伝子の発現低下が起こりにくいという効果は、レタスユビキチンプロモーター単独でも発揮されうるので、高光強度下(例えば、300〜600 PPFD)で栽培を行って目的タンパク質を生産させる態様においては、形質転換植物を得るために使用される遺伝子構築物はレタスユビキチンプロモーターに発現可能に連結された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子構築物であればよく、該遺伝子構築物はシロイヌナズナHSP18.2ターミネーター以外のターミネーターを含んでもよい。
なお、遺伝子組換え植物の成熟種子の採種量が増加するという効果は、レタスユビキチンプロモーター単独でも発揮されうるので、本発明の一態様においては、形質転換植物を得るために使用される遺伝子構築物はレタスユビキチンプロモーターに発現可能に連結された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子構築物であればよく、該遺伝子構築物はシロイヌナズナHSP18.2ターミネーター以外のターミネーターを含んでもよく、ター
ミネーターを含んでいなくともよい。すなわち、本発明の一態様においては、目的タンパク質を発現する遺伝子組換え植物において、該植物から得られる成熟種子の量を増加させる方法であって、レタスユビキチンプロモーターに発現可能に連結された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子構築物を用いて植物を形質転換し、該形質転換植物を栽培することを特徴とする方法が提供される。ここで、成熟種子の採種量の指標としては、植物の一株(個体)あたりの成熟種子数(成熟種子数/株(個体))、植物の一集合花あたりの成熟種子数(成熟種子数/集合花)などが挙げられる。
カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター(CaMV 35S pro.)又はレタスユビキチンプロモーター(LsUBQ pro.)を用いて細菌毒素タンパク質どうし、又は細菌毒素タンパク質とウイルス由来タンパク質をペプチドタグで連結した融合タンパク質発現用遺伝子構築物を作製した。
その構築図を図1に示す。
5'UTR)、分泌シグナルペプチド(SP)及びHSPT878を融合した遺伝子発現カセットを構築した(UBQ:: LTB-NAectG)。また、UBQ:: LTB-Stx2eBにさらにNAectGとEUectG(欧州型PRRSウイルスの中和エピトープ)を融合した遺伝子発現カセットを構築した(UBQ:: LTB-Stx2eB-NAectG-EUectG)。
非特許文献(Matsui et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009 Volume 73, Issue 7
Pages 1628-1634)に従って実施した。
大塚A処方を用いた水耕栽培を行った。メタルハライドランプを16時間明期-8時間暗期の周期で照射した。二酸化炭素濃度は1000 ppm、温度は22.5℃で栽培した。
後代安定発現
2連結したStx2eBタンパク質を35Sプロモーターを用いて組換えレタスで発現した。当該レタスではワクチンタンパク質が高蓄積することは報告済みである(Matsui et al., Transgenic Res. 2011 Aug;20(4):735-48.)。得られた組換えレタスのうち、組換え遺伝子をシングルコピーで保有する系統を選抜し、後代でホモ化した。優良系統(21-5)の後代の、各世代でのワクチン蓄積量を図2に示す。その結果、35Sプロモーターを用いた組換えレタスでは、世代を経るに従い、ワクチン蓄積量の低下(サイレンシング)が確認された。
35S::Stx2eB-Stx2eB導入レタスの2系統、UBQ::Stx2eB-Stx2eB導入レタスの2系統について、後代種子の成熟種子の採種数を計測した(図4)。その結果、35S::Stx2eB-Stx2eB導入レタスでは両系統とも、野生型よりも有意に成熟種子の採種量が少なくなることが判明した。一方で、UBQ::Stx2eB-Stx2eB導入レタスの2系統では、野生型並みの採種量であった。
レタスの栽培においては、高光強度でレタス重量が増加することが報告されている(畑ら, 植物環境工学, 2011, 23 (4):127-36)。一方で、従来技術の35Sプロモーターを用いた場合には、高光強度条件下で発現が低下することが報告されており(Elliott et al., Plant Cell 1989,1:691-8)、高光条件でも活性が低下しないプロモーターを用いることで効率的な組換えタンパク質生産が可能になると考えられた。160 PPFD及び400 PPFDの条件で栽培したレタスにおける、内在性UBQ遺伝子の発現を次世代シーケンサー(Illumina社、HiSeq2500)で調べた結果を表1に示す。
Claims (22)
- レタスユビキチンプロモーターとシロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2(HSP18.2)ターミネーターを含む、組換えタンパク質発現用遺伝子構築物。
- レタスユビキチンプロモーターが、配列番号1の塩基配列を含むDNA、又は配列番号1の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、植物細胞内でプロモーターとして機能するDNAである、請求項1に記載の遺伝子構築物。
- シロイヌナズナHSP18.2ターミネーターが、配列番号2の塩基配列を含むDNA、又は配列番号2の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、植物細胞内でターミネーターとして機能するDNAである、請求項1又は2に記載の遺伝子構築物。
- さらに、翻訳エンハンサー配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
- 目的タンパク質をコードするDNAを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
- 目的タンパク質が、細菌毒素タンパク質及び/又はウイルス由来タンパク質である、請求項5に記載の遺伝子構築物。
- 目的タンパク質が、2つ以上のタンパク質の融合タンパク質である、請求項5又は6に記載の遺伝子構築物。
- 融合タンパク質が、2つ以上のタンパク質がペプチドリンカーで連結された融合タンパク質である、請求項7に記載の遺伝子構築物。
- 目的タンパク質が分泌シグナルペプチドを含む、請求項5〜8のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
- 目的タンパク質がペプチドタグを含む、請求項5〜9のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
- 目的タンパク質が小胞体残留シグナルペプチドを含む、請求項5〜10のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含む、ベクター。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、又は請求項12に記載のベクターで形質転換された、遺伝子組換え植物。
- レタスである、請求項13に記載の遺伝子組換え植物。
- 請求項13又は14に記載の遺伝子組換え植物から得られる種子。
- 請求項13又は14に記載の遺伝子組換え植物であって、目的タンパク質を発現する遺伝子組換え植物を栽培する工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
- 栽培を300〜600 PPFDの光強度下で行う、請求項16に記載の目的タンパク質の製造方法。
- レタスユビキチンプロモーターに発現可能に連結された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子構築物で形質転換され、目的タンパク質を発現する遺伝子組換え植物を300〜600 PPFDの光強度下で栽培する工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
- 目的タンパク質を発現する遺伝子組換え植物において、該植物から得られる成熟種子の量を増加させる方法であって、レタスユビキチンプロモーターに発現可能に連結された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子構築物を用いて植物を形質転換し、該形質転換植物を栽培することを特徴とする方法。
- 前記形質転換植物は水耕栽培により栽培される、請求項19に記載の方法。
- 前記植物から得られる成熟種子の量は植物の一株(個体)あたりの成熟種子数である、請求項19又は20に記載の方法。
- 前記植物から得られる成熟種子の量は植物の一集合花あたりの成熟種子数である、請求項19又は20に記載の方法。
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