JP5641205B2 - 糖鎖修飾が抑制された改変Ｓｔｘ２ｅタンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、志賀毒素（Ｓｔｘ）２ｅにより引き起こされるブタ浮腫病のワクチンに用いることができる免疫原性タンパク質の植物を用いた生産技術に関する。
Ｓｔｘ２ｅは、腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia coli）が産生するタンパク質性外毒素であり、ブタ浮腫病を引き起こす。ブタ浮腫病は、離乳後１〜２週の子豚に高発生し、その致死率は、５０〜９０％と極めて高い。Ｓｔｘ２ｅは、細胞への付着に関与するＢサブユニット５量体と毒性を持つＡサブユニット１量体からなることが知られている。
従来、ワクチンなどに用いられる医療用タンパク質は、微生物、昆虫細胞、動物細胞等を用いて生産されてきた。Ｓｔｘ２ｅタンパク質は、例えば、従来、無毒化したＳｔｘ２ｅタンパク質を組換え大腸菌を用いて生産させ、注射によりブタに投与する技術が知られている（非特許文献１）。
しかしながら、このような方法は、注射の労力がかかるなど高コストであることなどから、この方法を代替、補完する技術が求められていた。このような技術の一つとして、植物を用いてワクチンを生産し、ワクチン生産植物を家畜に経口投与することが検討されている。
しかしながら、このような方法は、注射の労力がかかるなど高コストであることなどから、この方法を代替、補完する技術が求められていた。このような技術の一つとして、植物を用いてワクチンを生産し、ワクチン生産植物を家畜に経口投与することが検討されている。
このような背景において、本発明者らは、Ｓｔｘ２ｅ等の細菌毒素タンパク質を、トランスジェニック技術を用いて植物に効率よく生産させる技術の開発を行ってきた（特許文献１、２）。
特許文献１には、植物由来の分泌シグナルペプチドがアミノ末端に付加されたＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'−非翻訳領域（ＡＤＨ５’ＵＴＲ）を用いて発現させることにより、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質をレタス等の植物に効率良く生産させ、植物体に高濃度で蓄積させる技術が開示されている。
特許文献２には、２つ又は３つのＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を特定のペプチドを介してタンデムに連結したタンパク質を植物に生産させ、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を、植物体に高濃度で蓄積させる技術が開示されている。
特許文献１には、植物由来の分泌シグナルペプチドがアミノ末端に付加されたＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'−非翻訳領域（ＡＤＨ５’ＵＴＲ）を用いて発現させることにより、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質をレタス等の植物に効率良く生産させ、植物体に高濃度で蓄積させる技術が開示されている。
特許文献２には、２つ又は３つのＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を特定のペプチドを介してタンデムに連結したタンパク質を植物に生産させ、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を、植物体に高濃度で蓄積させる技術が開示されている。
ところで、真核生物において、糖鎖修飾（グリコシル化、糖鎖付加）はタンパク質の翻訳後修飾の重要な過程の一つである。糖鎖修飾によりタンパク質に付加される糖鎖としては、Ｏ−結合型糖鎖及びＮ−結合型糖鎖が知られる。このうち、Ｎ−結合型糖鎖は、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2からなる共通のトリマンノシルコア構造を有するが、植物に由来するＮ−結合型糖鎖のコア糖鎖部分には、動物型には認められない植物特有のα−１，３−フコース修飾、β−１，２−キシロース修飾が存在する。このような植物特有の修飾は、動物の生体内に投与した際に、アレルゲンになる可能性が指摘されている。このような背景において、植物により生産されるタンパク質のフコース修飾を減少、抑制する方法として、ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物形質転換用ベクターを、植物体もしくは植物細胞に導入して該植物の形質転換を行うなどの技術が報告されている（特許文献３）。また、植物により生産されるタンパク質のα−１，３−フコース修飾、β−１，２−キシロース修飾を抑制する技術として、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して植物細胞を形質転換する技術が報告されている（特許文献４）。
一般に、Ｎ−結合型糖鎖はＡｓｎ−Ｙ-Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＹはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）という一次配列中のＡｓｎ残基に付加されるといわれている(非特許文献２)。
また、酵母や昆虫細胞においては、Ｎ−結合型糖鎖が、Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは任意のアミノ酸を示す。）配列中のＡｓｎ残基に付加されるという報告がある(非特許文献３〜５)。
また、酵母や昆虫細胞においては、Ｎ−結合型糖鎖が、Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは任意のアミノ酸を示す。）配列中のＡｓｎ残基に付加されるという報告がある(非特許文献３〜５)。
Makino et al., Microbial Pathogenesis, vol. 31, Number 1, pp. 1-8(08), 2001
Lerouge et al., Plant Molecular Biology, vol. 38, pp. 31-48, 1998
Sato et al., J. Biochem. vol. 127, pp. 65-72, 2000
Wang et al., Yang P, J. Dairy Sci. vol. 91, pp. 4466-4476, 2008
Borisov et al., Anal. Chem., vol. 81, pp. 9744-9754, 2009
本発明者らは、これまでの研究で（特許文献１、２参照）、高効率で植物にＳｔｘ２ｅ
Ｂサブユニットタンパク質を生産させることに成功しているが、生産の目的とするＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質と共に、これより分子量が僅かに大きい分子量のタンパク質も生産されていることを発見した。
本発明者らは、この分子量の大きいタンパク質について解析した結果、該タンパク質は、Ｎ−結合型糖鎖を有していることを発見した。さらに、本発明者らは、該タンパク質の糖鎖修飾部位について更に検索を行った結果、これまで酵母や昆虫細胞における糖鎖修飾部位として報告されており、植物における糖鎖修飾部位としては報告されていない部分アミノ酸配列Ａｓｎ（アスパラギン）−Ｘ−Ｃｙｓ（システイン）（Ｘは、任意のアミノ酸を示す。）のＡｓｎ残基に、糖鎖が結合していることを発見した。
Ｂサブユニットタンパク質を生産させることに成功しているが、生産の目的とするＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質と共に、これより分子量が僅かに大きい分子量のタンパク質も生産されていることを発見した。
本発明者らは、この分子量の大きいタンパク質について解析した結果、該タンパク質は、Ｎ−結合型糖鎖を有していることを発見した。さらに、本発明者らは、該タンパク質の糖鎖修飾部位について更に検索を行った結果、これまで酵母や昆虫細胞における糖鎖修飾部位として報告されており、植物における糖鎖修飾部位としては報告されていない部分アミノ酸配列Ａｓｎ（アスパラギン）−Ｘ−Ｃｙｓ（システイン）（Ｘは、任意のアミノ酸を示す。）のＡｓｎ残基に、糖鎖が結合していることを発見した。
植物に生産させたＳｔｘ２ｅタンパク質を、家畜の経口ワクチンに応用することを考えると、植物により生産されるタンパク質は、本来の抗原、すなわち、大腸菌により産生されるタンパク質に近い、糖鎖が付加されていない構造を有するものが望ましいと考えられる。
特に、植物特有のα−１，３−フコース、β−１，２−キシロースを有する糖鎖は、上述の通り、家畜においてアレルゲンとなる可能性があること、さらには、ワクチンに糖鎖修飾を有するタンパク質が混在すると、本来期待するＳｔｘ２ｅ免疫原性の低下や品質の均一性の低下が起こる可能性もあることから、糖鎖修飾は回避することが望ましい。
特に、植物特有のα−１，３−フコース、β−１，２−キシロースを有する糖鎖は、上述の通り、家畜においてアレルゲンとなる可能性があること、さらには、ワクチンに糖鎖修飾を有するタンパク質が混在すると、本来期待するＳｔｘ２ｅ免疫原性の低下や品質の均一性の低下が起こる可能性もあることから、糖鎖修飾は回避することが望ましい。
そこで、本発明は、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を、植物を用いて生産する技術において、糖鎖修飾が抑制されたタンパク質を生産する方法を提供すること、併せて、該方法に用いるＤＮＡや組換えベクターを提供することを課題とする。
また、本発明は、上記方法により生産される新規なタンパク質、これを含む植物、及び
この新規なタンパク質や植物を利用したブタ浮腫病ワクチンを提供することを課題とする。
また、本発明は、上記方法により生産される新規なタンパク質、これを含む植物、及び
この新規なタンパク質や植物を利用したブタ浮腫病ワクチンを提供することを課題とする。
本発明者らは、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質（本明細書において、「Stx2eB」ともいう。）に含まれるＡｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは、任意のアミノ酸を示す。）からなる部分配列を改変することで、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質の糖鎖修飾を抑制することができることを明らかにし、本発明を完成させた。
すなわち、上記の課題を解決する本発明は、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示す、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質をコードする、ＤＮＡである。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の下記の部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質
Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは、任意のアミノ酸を示す。）
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の前記部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ、下記の部分アミノ酸配列を含まない、Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有する改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質
Ａｓｎ−Ｘ１−Ｃｙｓ（Ｘ１は、Ｐｒｏ又はＡｓｐ以外のアミノ酸を示す。）
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の下記の部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質
Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは、任意のアミノ酸を示す。）
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の前記部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ、下記の部分アミノ酸配列を含まない、Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有する改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質
Ａｓｎ−Ｘ１−Ｃｙｓ（Ｘ１は、Ｐｒｏ又はＡｓｐ以外のアミノ酸を示す。）
上記ＤＮＡを植物細胞内で発現させることで、糖鎖修飾が抑制されたタンパク質を植物に生産させることが可能となる。
本発明の好ましい形態では、前記部分アミノ酸配列の改変は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位のアミノ酸の、Ｓｅｒへの置換である。また、他の好ましい形態では、前記部分アミノ酸配列の改変は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５７位のアミノ酸の、Ａｌａへの置換である。
本発明のＤＮＡの好ましい形態は、２つ又は３つの、上記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）に示す、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質が、それぞれ、下記の特徴（ｘ）及び（ｙ）を有するペプチドを介してタンデムに連結された、ハイブリッドタンパク質をコードする、ＤＮＡである。
（ｘ）アミノ酸の個数が１２〜３０個
（ｙ）Ｐｒｏの含有率が２０〜３５％
前記部分アミノ酸配列の改変の好ましい形態は、上述したとおりである。
（ｘ）アミノ酸の個数が１２〜３０個
（ｙ）Ｐｒｏの含有率が２０〜３５％
前記部分アミノ酸配列の改変の好ましい形態は、上述したとおりである。
特許文献２に示されるとおり、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を特定のペプチドでタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞内で発現させることにより、植物細胞内に、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を効率よく蓄積させることが可能となる。このことは、糖鎖が付加されたＳｔｘ２ｅ Ｂタンパク質の蓄積量が大きくなることを意味する。従って、上記技術において、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を、本発明の改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質に置換すれば、糖鎖修飾が抑制されたタンパク質を植物に効率よく生産させることが可能となる。
本発明の好ましい形態では、前記ＤＮＡは、アミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチド（S.P.）が付加された、前記（Ａ）又は（Ｂ）の改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質、若しくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードする。また、他の好ましい形態では、前記ＤＮＡは、カルボキシル末端に小胞体残留ペプチド又は液胞移行シグナルペプチドが付加された、前記タンパク質をコードする。
当該形態により、上記タンパク質の植物への効率的な蓄積を実現することが可能となる
。
当該形態により、上記タンパク質の植物への効率的な蓄積を実現することが可能となる
。
本発明は、上述したＤＮＡを含む組換えベクター、及び該組換えベクターで形質転換された形質転換植物細胞又は形質転換植物を提供する。また、本発明は、該形質転換植物から得られる種子を提供する。
また、本発明は、上記の形質転換植物細胞若しくは形質転換植物を原料とする、ブタ浮腫病ワクチンを提供する。
本発明は、上記のＤＮＡを、植物細胞内で発現させることを含む、Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有するタンパク質の生産方法を提供する。
当該方法により、植物を用いたＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質の生産における特有の問題である糖鎖修飾を抑制することが可能となる。
当該方法により、植物を用いたＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質の生産における特有の問題である糖鎖修飾を抑制することが可能となる。
また、本発明は、上記の（Ａ）又は（Ｂ）の改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質、若しくは上記のハイブリッドタンパク質、及び該タンパク質を含む植物を提供する。
本発明の形質転換植物細胞又は形質転換植物、本発明の植物に含まれるタンパク質は糖鎖修飾が抑制されているので、該植物を動物の経口ワクチンの原料として使用した場合に、家畜におけるアレルギー反応を抑制することが可能となることが期待される。
本発明者らは、植物細胞で生産されるＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質について、これまで植物に関しては報告のなかったタイプの糖鎖修飾部位（部分アミノ酸配列）を発見した。そして、この糖鎖修飾部位のアミノ酸配列を人為的に改変することで、タンパク質が糖鎖修飾を受けないよう制御することに成功した。
すなわち、本発明のＤＮＡを植物細胞内で発現させることで、糖鎖修飾が抑制された改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を植物に生産させることが可能となる。このようにして得られた改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質は、アレルゲン性の抑制に寄与する。また、このようなタンパク質は、期待する免疫原性、或いは品質の均一性に寄与することも期待される。
すなわち、本発明のＤＮＡを植物細胞内で発現させることで、糖鎖修飾が抑制された改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を植物に生産させることが可能となる。このようにして得られた改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質は、アレルゲン性の抑制に寄与する。また、このようなタンパク質は、期待する免疫原性、或いは品質の均一性に寄与することも期待される。
また、本発明者らが既に開発している、植物細胞にＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を高生産させる技術を応用した本発明の好ましい形態では、植物への目的タンパク質の効率よい蓄積と、アレルゲン性の抑制を両立することが可能となる。
以下、本発明を実施するための形態を、より詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有するタンパク質をコードする。
本発明において、「Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有する」とは、ブタに投与した場合に抗Ｓｔｘ２ｅ抗体を誘導することを意味する。
本発明の一形態では、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の下記の部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質である。
Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは、任意のアミノ酸を示す。）
本発明のＤＮＡは、Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有するタンパク質をコードする。
本発明において、「Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有する」とは、ブタに投与した場合に抗Ｓｔｘ２ｅ抗体を誘導することを意味する。
本発明の一形態では、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の下記の部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質である。
Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは、任意のアミノ酸を示す。）
配列番号１は、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質（GenBank Accession No. AAQ63639）の成熟領域（ペリプラズムへの分泌シグナルペプチドを除く、Ａｌａ１９〜Ａｓｎ８７）のアミノ酸配列を示す。なお、配列番号１に示すアミノ酸配列の５５位〜５７位は、上記GenBank Accession No. AAQ63639に示されるアミノ酸配列の７３位〜７５位に対応する。また、配列番号２に、配列番号１で示されるＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を示す。
本明細書において、単に「Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質」、「Stx2eB」という場合には、上記成熟領域のアミノ酸配列からなるＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を指す。
本明細書において、単に「Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質」、「Stx2eB」という場合には、上記成熟領域のアミノ酸配列からなるＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を指す。
５５位〜５７位の前記の部分アミノ酸配列の改変は、当該配列が失われるような改変であればよく、例えば、５５位及び／又は５７位のアミノ酸の置換、５５位〜５７位の何れかのアミノ酸の欠失、５５位〜５７位のアミノ酸間へのアミノ酸の挿入などが挙げられる。
改変は、改変によるタンパク質の立体構造の変化が小さくなるように行うことが好ましい。
例えば、５５位のＡｓｎを他のアミノ酸に置換する場合には、Ａｓｎと同じ親水性のアミノ酸であるＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕに置換することが挙げられる。中でも、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒに置換することが好ましく、更にはＳｅｒに置換することが好ましい。Ｓｅｒが特に好ましい理由は、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットに類似するＳｔｘ２ Ｂサブユニットが、上記５５位に相当する位置にＳｅｒを持つことから見て、置換による立体構造の変化を小さくすることができると考えられるからである。配列番号３に、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位のＡｓｎがＳｅｒに置換されたアミノ酸配
列を示す。
また、例えば、５７位のＣｙｓを他のアミノ酸に置換する場合には、Ｃｙｓと同じ親水性のアミノ酸であるＴｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎや、疎水性アミノ酸のうち側鎖の小さなＧｌｙやＡｌａが挙げられる。配列番号４に、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５７位のＣｙｓがＡｌａに置換されたアミノ酸配列を示す。
例えば、５５位のＡｓｎを他のアミノ酸に置換する場合には、Ａｓｎと同じ親水性のアミノ酸であるＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕに置換することが挙げられる。中でも、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒに置換することが好ましく、更にはＳｅｒに置換することが好ましい。Ｓｅｒが特に好ましい理由は、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットに類似するＳｔｘ２ Ｂサブユニットが、上記５５位に相当する位置にＳｅｒを持つことから見て、置換による立体構造の変化を小さくすることができると考えられるからである。配列番号３に、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位のＡｓｎがＳｅｒに置換されたアミノ酸配
列を示す。
また、例えば、５７位のＣｙｓを他のアミノ酸に置換する場合には、Ｃｙｓと同じ親水性のアミノ酸であるＴｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎや、疎水性アミノ酸のうち側鎖の小さなＧｌｙやＡｌａが挙げられる。配列番号４に、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５７位のＣｙｓがＡｌａに置換されたアミノ酸配列を示す。
本発明の他の形態では、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の前記部分アミノ酸配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは、任意のアミノ酸を示す。））が改変されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ、下記の部分アミノ酸配列を含まない、Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有する改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質である。
Ａｓｎ−Ｘ１−Ｃｙｓ（Ｘ１は、Ｐｒｏ又はＡｓｐ以外のアミノ酸を示す。）
Ａｓｎ−Ｘ１−Ｃｙｓ（Ｘ１は、Ｐｒｏ又はＡｓｐ以外のアミノ酸を示す。）
すなわち、上記の（Ａ）に示す改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質の変異型タンパク質であっても、他の部分に上記部分アミノ酸配列からなる糖鎖修飾部位を含まないものであれば、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質となり得る。ここで、Kornfeld et al., Ann. Rev. Biochem., 1985, 54: 631-664には、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒにおけるＸがＰｒｏ又はＡｓｐの場合には、糖鎖付加効率が低いことが記載されている。これと同様に、Ａｓｎ−Ｘ１−Ｃｙｓにおいても、Ｘ１が、Ｐｒｏ又はＡｓｐの場合には、糖鎖付加効率が低いことが予測される。従って、前記変異型タンパク質は、Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ、又はＡｓｎ−Ａｓｐ−Ｃｙｓの部分アミノ酸配列は含んでいてもよい場合がある。
上記（Ｂ）に示す改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質の説明において、「数個」とは、好ましくは２〜１０個、更に好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、（Ｂ）に示す改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位又は５７位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質であってもよい。
また、（Ｂ）に示す改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位又は５７位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質であってもよい。
本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、上記で説明した改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質以外の構造を含んでいてもよい。すなわち、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質に、種々のペプチドを付加したタンパク質も、その付加によりＳｔｘ２ｅ免疫原性が失われない限り、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質に含まれる。
また、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、一般的なＮ−結合型糖鎖の修飾部位であると報告されているＡｓｎ−Ｙ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＹはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）からなるアミノ酸配列を含まないことが好ましい。但し、後述の実施例において示すとおり、下記に説明する、２つ又は３つのＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質が特定のペプチドを介してタンデムに連結されたハイブリッドタンパク質においては、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＳｅｒはＮ−結合型糖鎖の修飾部位とならないため、少なくとも該配列は含んでいてもよいことが分かっている。
例えば、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質として、特許文献２に記載される２つ又は３つのＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質が、下記の特定のペプチドを介してタンデムに連結されたハイブリッドタンパク質において、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質の少なくとも一つを、上述した改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質に置換した構造のハイブリッドタンパク質が挙げられる。
本発明の好ましい形態では、本発明のＤＮＡは、２つ又は３つのＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質が全て改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質に置換した構造のハイブリッドタンパク質をコードする。
本発明の好ましい形態では、本発明のＤＮＡは、２つ又は３つのＳｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質が全て改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質に置換した構造のハイブリッドタンパク質をコードする。
すなわち、本発明の好ましい形態では、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、２つ又は３つの、上記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）の改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質が、それぞれ、下記の特徴（ｘ）及び（ｙ）を有するペプチドを介してタンデムに連結された、ハイブリッドタンパク質である。
（ｘ）アミノ酸の個数が１２〜３０個
（ｙ）Ｐｒｏ（プロリン）の含有率が２０〜３５％
（ｘ）アミノ酸の個数が１２〜３０個
（ｙ）Ｐｒｏ（プロリン）の含有率が２０〜３５％
前記ペプチドのアミノ酸の個数は、好ましくは１２〜２５個、さらに好ましくは１２〜２２個である。また、前記ペプチドのプロリンの含有率は、好ましくは、２０〜２７％、さらに好ましくは、２０〜２５％である。
また、前記ペプチドにおいて、プロリンは、好ましくは２つ置き、又は３つ置きに配置される。但し、この場合でも、ペプチドの末端においては、プロリン以外のアミノ酸が、５つ以内、好ましくは４つ以内の範囲で連続していてもよい。
また、前記ペプチドにおいて、プロリンは、好ましくは２つ置き、又は３つ置きに配置される。但し、この場合でも、ペプチドの末端においては、プロリン以外のアミノ酸が、５つ以内、好ましくは４つ以内の範囲で連続していてもよい。
また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、セリン、グリシン、アルギニン、リジン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン及びアスパラギン酸の合計含有率は、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、セリン、グリシン及びアスパラギンの合計含有率は、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、セリン及びグリシンの合計含有率は、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。これは、これらのアミノ酸を多く含むペプチドは、二次構造（ベータシート構造やヘリックス構造）をとりにくいためである。
一方、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、アラニン、メチオニン及びグルタミン酸の合計含有率は、好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。これは、これらのアミノ酸を多く含むペプチドは、ヘリックス構造をとりやすいためである。また、前記ペプチドにおいては、プロリン以外のアミノ酸のうち、トリプトファン、ロイシン、イソロインシン、チロシン、フェニルアラニン及びバリンの合計含有率は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下である。これは、これらのアミノ酸を多く含むペプチドは、ベータシート構造及びヘリックス構造をとりやすいためである。
前記ペプチドは、好ましくは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（PG12スペーサー）、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（PG12ver2スペーサー）、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（PG17スペーサー）、又は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（PG22スペーサー）から選ばれる。
前記ペプチドは、好ましくは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（PG12スペーサー）、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（PG12ver2スペーサー）、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（PG17スペーサー）、又は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（PG22スペーサー）から選ばれる。
また、上記ハイブリッドタンパク質は、さらにそのＣ末端に前記ペプチドが付加されていることが好ましい。
本発明のＤＮＡがコードするハイブリッドタンパク質は、例えば、配列番号９や１０で表されるアミノ酸配列を有する。配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つの改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質（５５位の置換）が、PG12スペーサーを介してタンデムに連結されている。配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つの改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパ
ク質（５５位の置換）が、PG12スペーサーを介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にPG12スペーサーが連結されている。このようなハイブリッドタンパク質は、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質として、上述した配列番号１に示すアミノ酸配列における５７位が置換されたものであるものであってもよい。
前記PG12スペーサーなどのペプチドを、改変Ｓｔｘ２ｅＢタンパク質を連結するためのリンカーとして使用することにより、改変Ｓｔｘ２ｅＢタンパク質の植物細胞への蓄積レベルが増大する（特許文献２参照）。
本発明のＤＮＡがコードするハイブリッドタンパク質は、例えば、配列番号９や１０で表されるアミノ酸配列を有する。配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つの改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質（５５位の置換）が、PG12スペーサーを介してタンデムに連結されている。配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つの改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパ
ク質（５５位の置換）が、PG12スペーサーを介してタンデムに連結され、さらにそのＣ末端にPG12スペーサーが連結されている。このようなハイブリッドタンパク質は、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質として、上述した配列番号１に示すアミノ酸配列における５７位が置換されたものであるものであってもよい。
前記PG12スペーサーなどのペプチドを、改変Ｓｔｘ２ｅＢタンパク質を連結するためのリンカーとして使用することにより、改変Ｓｔｘ２ｅＢタンパク質の植物細胞への蓄積レベルが増大する（特許文献２参照）。
また、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質の構造以外に、例えば、Ｓｔｘ２ｅ Ａサブユニットタンパク質の構造を含んでいてもよい。すなわち、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質とＳｔｘ２ｅ Ａサブユニットタンパク質とのハイブリッドタンパク質であってもよい。但し、Ｓｔｘ２ｅ Ａサブユニットタンパク質を用いる場合には、無毒化することが好ましい。
また、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、その末端に、例えば、分泌シグナルペプチド小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等のシグナルペプチドが付加されていてもよい。これにより、タンパク質を発現させる植物種に応じて、タンパク質の蓄積レベルを最適化することも可能となる（特許文献１参照）。
本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、例えば、アミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加されている。
分泌シグナルペプチドは、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)、アカバナ科（Onagraceae）に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)、マツヨイグサ属（Oenothera）等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)、コマツヨイグサ（Oenothera laciniata）等に由来する。
また、好ましくはタバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼ（β-D-glucan exohydrolase）、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。
前記分泌シグナルペプチドとしては、例えば、タバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼに由来する、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドが挙げられる。
分泌シグナルペプチドは、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)、アカバナ科（Onagraceae）に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)、マツヨイグサ属（Oenothera）等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)、コマツヨイグサ（Oenothera laciniata）等に由来する。
また、好ましくはタバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼ（β-D-glucan exohydrolase）、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。
前記分泌シグナルペプチドとしては、例えば、タバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼに由来する、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドが挙げられる。
さらに、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、そのカルボキシル末端に、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等のシグナルペプチドが付加されていてもよい。ここで、「付加」とは、シグナルペプチドが、前記ハイブリッドタンパク質のカルボキシル末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。
本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、そのカルボキシル末端に、好ましくは、小胞体残留シグナルペプチドが付加されている。小胞体残留シグナルペプチドとしてはＨＤＥＬ配列（配列番号１２）を含む小胞体残留シグナルペプチドが挙げられる。
本発明のＤＮＡがコードするタンパク質は、そのカルボキシル末端に、好ましくは、小胞体残留シグナルペプチドが付加されている。小胞体残留シグナルペプチドとしてはＨＤＥＬ配列（配列番号１２）を含む小胞体残留シグナルペプチドが挙げられる。
液胞移行シグナルペプチドとしては、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)、アカバナ科（Onagraceae）に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)、セイヨウワサビ属（Armoracia）、マツヨイグサ属（Oenothera）等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)、セイヨウワサビ(Armoracia rusticana)、コマツヨイグサ（（Oenothera laciniata））等に由来する。また、好ましくは、キチナーゼに由来する
。また、好ましくは、セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイムに由来する。
。また、好ましくは、セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイムに由来する。
本発明のＤＮＡの塩基配列は、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質の翻訳量が増大するように、該タンパク質を構成するアミノ酸を示すコドンを適宜改変することも好ましい。
コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (2004)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、ＧＣ含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
例えば、ＧＣ含量が高いコドンを選択した配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡを、本発明のＤＮＡとして用いることができる。
コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (2004)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、ＧＣ含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
例えば、ＧＣ含量が高いコドンを選択した配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡを、本発明のＤＮＡとして用いることができる。
本発明のＤＮＡの好ましい形態では、改変Ｓｔｘ２ｅタンパク質、若しくは上記のハイブリッドタンパク質のコード領域のＤＮＡは、エンハンサーに発現可能に連結されている。ここで、「発現可能」とは、本発明のＤＮＡが適切なプロモーターを含むベクターに挿入され、該ベクターが適切な宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞内で上記タンパク質が生産されることをいう。また、「連結」とは、２つのＤＮＡが直接結合している場合も、他の塩基配列を介して結合している場合も含む概念である。
エンハンサーとしては、Ｋｏｚａｋ配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域が挙げられる。特に好ましくは、上記タンパク質をコードするＤＮＡが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域に発現可能に連結されている。
エンハンサーとしては、Ｋｏｚａｋ配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域が挙げられる。特に好ましくは、上記タンパク質をコードするＤＮＡが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域に発現可能に連結されている。
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域とは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写開始点から、翻訳開始点（ＡＴＧ、メチオニン）の前までの塩基配列を含む領域をいう。該領域は、翻訳量増大機能を有している。「翻訳量増大機能」とは、構造遺伝子にコードされた情報が、転写後、翻訳されてタンパク質が産生される際に、翻訳により産生されるタンパク質量を増大させる機能をいう。前記領域は、植物に由来すればよいが、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)、アカバナ科（Onagraceae）に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)、マツヨイグサ属（Oenothera）等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)、コマツヨイグサ（Oenothera laciniata）等に由来する。
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域としては、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域（NtADH5'UTR）である、配列番号１４で表される塩基配列からなる領域が挙げられる。
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域としては、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域（NtADH5'UTR）である、配列番号１４で表される塩基配列からなる領域が挙げられる。
植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼを高発現している植物培養細胞のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から単離することができる（特開２００３−７９３７２号公報参照）。また、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域等、その塩基配列が確定しているものについては、化学合成、又は該領域の５’及び３’末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲなどにより合成することもできる。また、塩基配列が確定している前記領域の一部をプローブとして用いることにより、他の植物のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域を探索し、これを単離することもできる。
また、配列番号１４の塩基配列で表されるような前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域は、翻訳量増大機能を保持している限り、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有していてもよい。前記「数個」としては、好ましくは２〜１０
個、さらに好ましくは２〜５個、特に好ましくは２〜３個である。
また、前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域と好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上の同一性を有し、かつ翻訳量増大機能を保持しているＤＮＡを使用してもよい。
個、さらに好ましくは２〜５個、特に好ましくは２〜３個である。
また、前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域と好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上の同一性を有し、かつ翻訳量増大機能を保持しているＤＮＡを使用してもよい。
前記領域が目的とする翻訳量増大機能を有するか否かについては、例えばタバコ培養細胞においてＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としたトランジェントアッセイ、染色体に組み込ませた形質転換細胞でのアッセイ等により確認することができる。
このような塩基配列として、ＡＴＧ近傍配列改変型タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域（配列番号１５）を用いることができる。
本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号１６〜１８に表される塩基配列を有する。
配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡは、ＡＴＧ近傍配列改変型タバコ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域（NtADH5'UTRmod、配列番号１５）に、２つの改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質（５５位の置換）をPG12スペーサーを介してタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡである。
配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡは、ＡＴＧ近傍配列改変型タバコ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域（NtADH5'UTRmod、配列番号１５）に、２つの改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質（５５位の置換）をPG12スペーサーを介してタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡである。
配列番号１７で表される塩基配列を有するＤＮＡは、NtADH5'UTRmodに、２つの改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質（５５位の置換）を、PG12スペーサーを介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡである。
配列番号１８で表される塩基配列を有するＤＮＡは、NtADH5'UTRmodに、２つのＳｔｘ２ｅＢ サブユニットタンパク質（５５位の置換）を、PG12スペーサーを介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを付加し、カルボキシル末端にPG12スペーサーを連結し、さらにそのカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡである。
上記で説明した、本発明のＤＮＡは、一般的な遺伝子工学的手法により作製することができ、必要な場合は、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質をコードするＤＮＡに、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域、植物由来の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、小胞体残留シグナルペプチドをコードするＤＮＡなどのＤＮＡを、それぞれ、適当な制限酵素により切断し、適当なリガーゼで連結すればよい。
また、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質と他のタンパク質のハイブリッドタンパク質や改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を、上記特定のペプチドを介してタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを合成する場合には、各タンパク質をコードするＤＮＡを終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結すればよい。例えば、２つの改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を、上記特定のペプチドを介してタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１３に示す改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質をコードするＤＮＡと、配列番号５に示すPG12スペーサーとを終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結することにより、合成することができる。
また、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質と他のタンパク質のハイブリッドタンパク質や改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を、上記特定のペプチドを介してタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを合成する場合には、各タンパク質をコードするＤＮＡを終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結すればよい。例えば、２つの改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質を、上記特定のペプチドを介してタンデムに連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１３に示す改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質をコードするＤＮＡと、配列番号５に示すPG12スペーサーとを終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結することにより、合成することができる。
改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質をコードするＤＮＡは、適当なプライマーを用いてＰＣＲにより合成することができる。例えば、実施例において説明するＳｔｘ２
ｅ Ｂサブユニットタンパク質をコードするＤＮＡの合成において、用いるプライマーの塩基配列を目的のアミノ酸配列をコードするように変更すればよい。
また、実施例において示すように、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを鋳型に用い、適当なプライマーを用いて、インバースＰＣＲを行うことにより、目的のアミノ酸に対応するコドンを規定するように塩基置換することができる。
ｅ Ｂサブユニットタンパク質をコードするＤＮＡの合成において、用いるプライマーの塩基配列を目的のアミノ酸配列をコードするように変更すればよい。
また、実施例において示すように、Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを鋳型に用い、適当なプライマーを用いて、インバースＰＣＲを行うことにより、目的のアミノ酸に対応するコドンを規定するように塩基置換することができる。
本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを含むことを特徴とする。本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡが、ベクターが導入される植物細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されていればよい。ベクターは、植物ゲノムに安定的に遺伝子を組み込むためのバイナリープラスミドＤＮＡや、ウィルスＤＮＡ等が挙げられる。前者のベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましく、市販のプラスミドとして、例えば、ｐＲＩ９０９、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等を用いることもできる。ウィルスＤＮＡとしては、例えばpTB2(Donson et al., 1991)等を用いることができる（Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of
a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci.(1991) 88: 7204-7208を参照。）
a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci.(1991) 88: 7204-7208を参照。）
組換えベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される植物細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（Odell et al．1985 Nature 313：810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al．1991 Plant Cell 3：1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al．1993 Plant Mol．Biol．23：567）等が好ましく用いられる。また、ベクター内で用いられるターミネーターも、同様にベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、ノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター、シロイヌナズナheat shock protein 18.2 遺伝子のターミネーター(HSP-T)等が好ましく用いられる。
本発明の組換えベクターは、例えば以下のようにして作製することができる。
まず、本発明のＤＮＡを適当な制限酵素で切断又はＰＣＲによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入する。
まず、本発明のＤＮＡを適当な制限酵素で切断又はＰＣＲによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入する。
本発明の形質転換植物細胞又は形質転換植物は、本発明の組換えベクターで形質転換されていることを特徴とする。
形質転換の対象となる植物細胞及び植物の種類は、特に制限されないが、ナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)、アカバナ科（Onagraceae）、アカザ科（Chenopodiaceae）に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)、マツヨイグサ属（Oenothera）等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)、コマツヨイグサ（Oenothera laciniata）等が好ましく用いられる。
形質転換の対象となる植物細胞及び植物の種類は、特に制限されないが、ナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)、アカバナ科（Onagraceae）、アカザ科（Chenopodiaceae）に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)、マツヨイグサ属（Oenothera）等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)、コマツヨイグサ（Oenothera laciniata）等が好ましく用いられる。
本発明の形質転換植物細胞は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明の組換えベクターを植物細胞に導入することにより作製することができる。例えば、アクロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、エレクトロポレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci.
tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki）などの方法を用いることが可能である。
本発明の組換えベクターを植物細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって本発
明の形質転換植物細胞を選抜することができる。また、選抜した形質転換植物細胞を培養することにより、目的とするタンパク質を生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換植物細胞の種に応じて適宜選択することができる。
また、選抜した形質転換植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することで、本発明の形質転換植物を得ることができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に目的とするタンパク質を蓄積させることができる。植物体を再生する方法としては、例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら（Theor．Appl．Genet 78：594（1989））の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99：12（1971））の方法が挙げられる。
tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki）などの方法を用いることが可能である。
本発明の組換えベクターを植物細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって本発
明の形質転換植物細胞を選抜することができる。また、選抜した形質転換植物細胞を培養することにより、目的とするタンパク質を生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換植物細胞の種に応じて適宜選択することができる。
また、選抜した形質転換植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することで、本発明の形質転換植物を得ることができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に目的とするタンパク質を蓄積させることができる。植物体を再生する方法としては、例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら（Theor．Appl．Genet 78：594（1989））の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99：12（1971））の方法が挙げられる。
レタスの場合は0.1 mg /ｌのNAA(ナフタレン酢酸)、0.05 mg/ｌのBA(ベンジルアデニン)および0.5 g/ｌのpolyvinylpyrrolidoneを含むMS培地でシュートの再生が可能であり、再生したシュートを0.5 g/lのpolyvinylpyrrolidoneを含む1/2 MS培地で培養することで発根が可能である。
また、本発明の種子は、上記のようにして再生した植物体から種子を採取することにより得ることができる。本発明の種子は適当な方法で播種し栽培することにより、前記改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質、若しくはハイブリッドタンパク質を生産する植物体を生産することができ、このような植物体も、本発明の形質転換植物に含まれる。
本発明のブタ浮腫病ワクチンは、本発明の形質転換植物細胞若しくは形質転換植物を原料とすることを特徴とする。本発明のブタ浮腫病ワクチンは、上記の改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質やハイブリッドタンパク質を生産する形質転換植物そのものとすることもできるが、形質転換植物細胞や形質転換植物を乾燥、粉砕するなどして、他の成分と共に加工することにより製造することもできる。また、本発明のブタ浮腫病ワクチンには、上記タンパク質の免疫原性を高めるアジュバントを配合することもできる。一般的には、安全性を考慮して水酸化アルミニウムなどがアジュバントとして用いられる。
本発明のブタ浮腫病の防除方法は、本発明のブタ浮腫病ワクチンをブタに投与することを特徴とする。本発明のブタ浮腫病ワクチンによる免疫は、浮腫病の発生率が高い子豚に対して行うことが好ましい。免疫の方法としては、本発明のブタ浮腫病ワクチンを母豚に投与して、母豚が産生した抗体を、乳汁により子豚に与える方法、本発明ブタ浮腫病ワクチンを子豚に投与し、子豚を直接免疫する方法等が挙げられる。
本発明のブタ浮腫病ワクチンをブタに投与する方法としては、ブタの飼料に本発明のブタ浮腫病ワクチンを混合してブタに与える方法、ブタに点鼻する方法などが挙げられる。
本発明のブタ浮腫病ワクチンをブタに投与する方法としては、ブタの飼料に本発明のブタ浮腫病ワクチンを混合してブタに与える方法、ブタに点鼻する方法などが挙げられる。
以下、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明する。
［試験例１］Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質の翻訳後修飾の解析
Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質（Stx2eB、配列番号１）の翻訳後修飾を解析するため、Stx2e B組換えベクター（ベクターType 1）で、シロイヌナズナ培養細胞、レタス子葉断片を形質転換し、形質転換体に蓄積したタンパク質を解析した。
（１）ベクターType 1の構築
２つのStx2eBをコードするＤＮＡが、PG12スペーサー（配列番号５）をコードするＤＮＡを介して連結されたＤＮＡを含むベクターType 1を以下のようにして作製した。上記ＤＮＡのデザインを図１（ａ）に示す。
［試験例１］Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質の翻訳後修飾の解析
Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質（Stx2eB、配列番号１）の翻訳後修飾を解析するため、Stx2e B組換えベクター（ベクターType 1）で、シロイヌナズナ培養細胞、レタス子葉断片を形質転換し、形質転換体に蓄積したタンパク質を解析した。
（１）ベクターType 1の構築
２つのStx2eBをコードするＤＮＡが、PG12スペーサー（配列番号５）をコードするＤＮＡを介して連結されたＤＮＡを含むベクターType 1を以下のようにして作製した。上記ＤＮＡのデザインを図１（ａ）に示す。
ベクターの作製手法を以下に示す。
まず始めに、配列番号２に示す塩基配列に基づいて、ＧＣ含量が高くなるように、Stx2eBをコードするコドン改変ＤＮＡをデザインした（配列番号１９）。次に、この配列番号
１９に示す塩基配列に基づいて、下記の６種類の塩基配列を有するプライマーを作製した。
Stx2eB Ａ：配列番号２０
Stx2eB Ｂ：配列番号２１
Stx2eB Ｃ：配列番号２２
Stx2eB Ｄ：配列番号２３
Stx2eB Ｅ：配列番号２４
Stx2eB Ｆ：配列番号２５
まず始めに、配列番号２に示す塩基配列に基づいて、ＧＣ含量が高くなるように、Stx2eBをコードするコドン改変ＤＮＡをデザインした（配列番号１９）。次に、この配列番号
１９に示す塩基配列に基づいて、下記の６種類の塩基配列を有するプライマーを作製した。
Stx2eB Ａ：配列番号２０
Stx2eB Ｂ：配列番号２１
Stx2eB Ｃ：配列番号２２
Stx2eB Ｄ：配列番号２３
Stx2eB Ｅ：配列番号２４
Stx2eB Ｆ：配列番号２５
上記で作製したプライマーを使用し、以下の手順でPCRを行い、Stx2eBをコードするコドン改変型のＤＮＡを合成した。すなわち、プライマーＡとＢ、ＣとＤ、ＥとＦの組み合わせで1st PCRを行い、それぞれ92bp（Ａ＋Ｂ）、78bp（Ｃ＋Ｄ）、86bp（Ｅ＋Ｆ）の遺伝子断片を合成した。次にＡ＋ＢとＣ＋Ｄの組み合わせで2nd PCRを行い、153bp（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）の遺伝子断片を合成した。最後にＡ＋Ｂ＋Ｃ＋ＤとＥ＋Ｆの組み合わせで3rd PCRを行い、最終的に210bpの遺伝子を合成した。反応条件は最終容量が25μlとなるよう、10 pmol オリゴヌクレオチド、0.2mM dNTP、pfu DNA polymerase buffer、0.3U pfu DNA polymeraseを添加し、94℃, 5分間加熱した後、94℃, 1分間、56℃または60℃, 1分間、72℃, 1分間の加熱処理を25または30サイクル行い、最後に72℃で5分間加熱した。2nd PCR、3rd PCRには、それぞれ、1st PCR、2nd PCR後の反応液1μlをテンプレートとして使用した。得られたＤＮＡ断片をpUC118のHincIIサイトに導入した(plasmid 1)。
ATG近傍配列改変型タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'非翻訳領域（NtADH 5’UTRmod、配列番号１５）を、ADH-221(Sato et. al., J. Biosci. Bioeng., vol. 98, pp. 1-8, 2004参照)を鋳型として、ADH XbaIKpnI-F プライマー（配列番号２６）及びADHmod NsiI-R プライマー（配列番号２７）を用いたPCR により増幅した。β-D glucan exohydrolase(GenBank Accession No. AB017502)の分泌シグナルペプチド（S.P.、配列番号１１）をコードするＤＮＡ領域(配列番号２８)を、タバコゲノムＤＮＡを鋳型にして、βD NsiI-F プライマー（配列番号２９）およびβD BamHI-R プライマー（配列番号３０）を用いて増幅した。得られたNtADH 5'UTRmod および分泌シグナルペプチドの各ＤＮＡ断片をNsiI (TOYOBO社製)で処理し、ligation high (TOYOBO社)を用いてライゲーションした後、末端を平滑化してpBluescript II SK (Stratagene社製)のEcoRV ギャップにクローニングした（plasmid 2）。
続いて、plasmid 2をNsiI で処理し、T4 DNA polymerase (TOYOBO社製)で末端を平滑化した後セルフライゲーションして、NtADH 5'UTRmodの開始コドン(atg)と分泌シグナルペプチドの開始コドンが一致するように連結した（plasmid 3）。
続いて、plasmid 2をNsiI で処理し、T4 DNA polymerase (TOYOBO社製)で末端を平滑化した後セルフライゲーションして、NtADH 5'UTRmodの開始コドン(atg)と分泌シグナルペプチドの開始コドンが一致するように連結した（plasmid 3）。
次に、NtADH 5'UTRmod 断片および分泌シグナルペプチドの連結ＤＮＡを、plasmid 3 を鋳型として用い、ADH XbaIKpnI-F プライマー（配列番号２６）とβD BamHI-R プライマー（配列番号３０）を用いて増幅した。得られたDNA 断片を、KpnI とBamHI で処理し、plasmid 1のKpnI-BamHI ギャップに挿入した(plasmid 4)。
続いて、小胞体残留シグナル（配列番号１２）付加のために、HDEL-Fプライマー(配列番号３１)とHDEL-Rプライマー(配列番号３２)をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化し、アルカリフォスファターゼ(AP)(TaKaRa社)で脱リン酸化処理したplasmid 4のBglIIギャップに挿入した(plasmid 5)。
Ｓｔｘ２ｅＢ検出用のペプチドタグとして、ＨＡタグを付加した。ＨＡタグの付加のために、HA-F プライマー(配列番号３３)とHA-R プライマー(配列番号３４) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化ＨＡ断片を、plasmid 5のBglIIギャップに挿入した(plasmid 6)。
Stx2eBとHAタグの間にPG12スペーサー(配列番号５)を挿入するため、PG12-F プライマー(配列番号３５)とPG12-R プライマー(配列番号３６)をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 6のBglIIギャップに挿入した(plasmid 7)。
Stx2eBをコードするＤＮＡとPG12スペーサーをコードするＤＮＡが連結したDNA断片（1×Stx2eB-PG12）をBamHI-BglIIを用いてplasmid 7から切り出し、plasmid 7のBglIIギャップに挿入した(plasmid 8)。
カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター（35S pro．）断片を、35S XbaI-F プライマー(配列番号３７)と35S SmaIKpnI-R プライマー(配列番号３８)を用いてPCR増幅し、pRI909 (TaKaRa Bio Inc.)のXbaI-KpnIサイトに挿入した(plasmid 9)。
シロイヌナズナheat shock protein 18.2 遺伝子のターミネーター領域(HSP-T)断片を、HSPT-SacI-F プライマー(配列番号３９)とHSPT-SpeIEcoRI-Rプライマー(配列番号４０)を用いてPCR増幅し、plasmid 9のSacI-EcoRIギャップに挿入した(plasmid 10)。
NtADH5'UTRmod-S.P.-2×(Stx2eB-PG12)-HA-HDELに相当するDNA断片をKpnI-SacIを用いてplasmid 8から切り出し、plasmid 10のKpnI-SacIギャップに挿入し、２つのStx2eBがPG12スペーサーを介してタンデムに連結されたハイブリッドタンパク質2×Stx2eB-PG12をコードするＤＮＡを含むベクターType 1を得た（図１（ａ））。
シロイヌナズナheat shock protein 18.2 遺伝子のターミネーター領域(HSP-T)断片を、HSPT-SacI-F プライマー(配列番号３９)とHSPT-SpeIEcoRI-Rプライマー(配列番号４０)を用いてPCR増幅し、plasmid 9のSacI-EcoRIギャップに挿入した(plasmid 10)。
NtADH5'UTRmod-S.P.-2×(Stx2eB-PG12)-HA-HDELに相当するDNA断片をKpnI-SacIを用いてplasmid 8から切り出し、plasmid 10のKpnI-SacIギャップに挿入し、２つのStx2eBがPG12スペーサーを介してタンデムに連結されたハイブリッドタンパク質2×Stx2eB-PG12をコードするＤＮＡを含むベクターType 1を得た（図１（ａ））。
（２）形質転換実験
（ｉ）形質転換アグロバクテリウムの作製
作製したベクターType 1を、エレクトロポレーション法を用いて、Agrobacterium tumefacience EHA105（Hood et al., Transgenic Res., vol. 2, pp. 208-218, 1993参照)に導入した。
EHA105の単一コロニーを 5 mlのYEB培地(Bacto-peptone 5 g/l, Beaf extract 5 g/l, Yeast extract 1 g/l, sucrose 5 g/l, MgSO4・7H2O 0.5 g/l)に植菌し、28 ℃で1晩振盪培養した。この培養液を、500 mlのYEP培地に植菌し、600 nmにおける濁度が0.5になるまで28 ℃で振盪培養した。培養液を遠心分離 (5000 rpm, 10分, 4 ℃ ;BECKMAN JLA-10,500ローター)により集菌して上清を捨て、菌体を洗浄するため 500 ml の滅菌水を加えて懸濁し、再度遠心分離 (5000 rpm, 10分, 4 ℃; BECKMAN JLA-10,500ローター) により集菌して上清を捨てた。この操作を 2 回繰り返した後、沈殿に20 ml の冷却した滅菌 10% glycerol を加えて懸濁した。ナルゲンチューブに移し遠心分離 (5000 rpm, 10 min, 4℃ BECKMAN JLA-10,500ローター) により集菌して上清を捨てた。沈殿に3 mlの冷却した滅菌10% Glycerolを加えて懸濁し、40 μlずつ1.5 ml微小遠心管に分注して、液体窒素で凍結させてから-80 ℃で保存した。
コンピテントセルを氷中で解凍後、1〜2 μlのベクターType 1溶液を加え、氷令した2 mmキュベットに移した。エレクトロポレーター（BIO RAD、Gene Pulser）により電気パルス（2.5 KV、25 μF、400 Ω）を与え、組換えベクターを導入した。1 mlのSOC培地を加え、28 ℃で1時間振盪培養した後、スピンダウンして上清を大部分除き、残った培地に菌体を懸濁して適当な抗生物質を含む LB 寒天培地上に広げ、30 ℃で2晩培養した。
（ｉ）形質転換アグロバクテリウムの作製
作製したベクターType 1を、エレクトロポレーション法を用いて、Agrobacterium tumefacience EHA105（Hood et al., Transgenic Res., vol. 2, pp. 208-218, 1993参照)に導入した。
EHA105の単一コロニーを 5 mlのYEB培地(Bacto-peptone 5 g/l, Beaf extract 5 g/l, Yeast extract 1 g/l, sucrose 5 g/l, MgSO4・7H2O 0.5 g/l)に植菌し、28 ℃で1晩振盪培養した。この培養液を、500 mlのYEP培地に植菌し、600 nmにおける濁度が0.5になるまで28 ℃で振盪培養した。培養液を遠心分離 (5000 rpm, 10分, 4 ℃ ;BECKMAN JLA-10,500ローター)により集菌して上清を捨て、菌体を洗浄するため 500 ml の滅菌水を加えて懸濁し、再度遠心分離 (5000 rpm, 10分, 4 ℃; BECKMAN JLA-10,500ローター) により集菌して上清を捨てた。この操作を 2 回繰り返した後、沈殿に20 ml の冷却した滅菌 10% glycerol を加えて懸濁した。ナルゲンチューブに移し遠心分離 (5000 rpm, 10 min, 4℃ BECKMAN JLA-10,500ローター) により集菌して上清を捨てた。沈殿に3 mlの冷却した滅菌10% Glycerolを加えて懸濁し、40 μlずつ1.5 ml微小遠心管に分注して、液体窒素で凍結させてから-80 ℃で保存した。
コンピテントセルを氷中で解凍後、1〜2 μlのベクターType 1溶液を加え、氷令した2 mmキュベットに移した。エレクトロポレーター（BIO RAD、Gene Pulser）により電気パルス（2.5 KV、25 μF、400 Ω）を与え、組換えベクターを導入した。1 mlのSOC培地を加え、28 ℃で1時間振盪培養した後、スピンダウンして上清を大部分除き、残った培地に菌体を懸濁して適当な抗生物質を含む LB 寒天培地上に広げ、30 ℃で2晩培養した。
（ｉｉ）レタス安定形質転換体の作製
レタス(Lactuca sativa L. cv. green wave)の種子を表面殺菌した後、0.8% アガーで固形化した3% スクロースを含む1/2 MS培地に播いた。25 ℃、16時間明期−８時間暗期の条件で培養し、発芽させた。子葉を0.5 cm角程度の大きさに切断して断片を作製し、これを1% (w/v) のTween 20を含むMS液体培地12 mlに浮かべた。光学密度（O.D.）が0.1程度になるまで培養したアグロバクテリウムの培養液3 mlと、終濃度 100 μM のアセトシリンゴンを添加し、10 分間静置した。余分な液をふき取った子葉を、選抜培地(0.05 mg/l
BA, 0.1 mg/l NAA, 0.5 g/l PVP, 50 mg/l カナマイシン、250 mg/l セフォタキシムを含むMS培地を0.8% アガーで固形化した培地)に静置した。25 ℃、16時間明期−８時間暗期の条件で培養し、１週間ごとに新しい選抜培地にのせかえた。４−８週間後に得られた再分化個体を、発根培地(0.5 g/l PVP、50 mg/l カナマイシン、250 mg/l セフォタキシムを含むMS培地を0.8 %アガーで固形化した培地)に移植した。
レタス(Lactuca sativa L. cv. green wave)の種子を表面殺菌した後、0.8% アガーで固形化した3% スクロースを含む1/2 MS培地に播いた。25 ℃、16時間明期−８時間暗期の条件で培養し、発芽させた。子葉を0.5 cm角程度の大きさに切断して断片を作製し、これを1% (w/v) のTween 20を含むMS液体培地12 mlに浮かべた。光学密度（O.D.）が0.1程度になるまで培養したアグロバクテリウムの培養液3 mlと、終濃度 100 μM のアセトシリンゴンを添加し、10 分間静置した。余分な液をふき取った子葉を、選抜培地(0.05 mg/l
BA, 0.1 mg/l NAA, 0.5 g/l PVP, 50 mg/l カナマイシン、250 mg/l セフォタキシムを含むMS培地を0.8% アガーで固形化した培地)に静置した。25 ℃、16時間明期−８時間暗期の条件で培養し、１週間ごとに新しい選抜培地にのせかえた。４−８週間後に得られた再分化個体を、発根培地(0.5 g/l PVP、50 mg/l カナマイシン、250 mg/l セフォタキシムを含むMS培地を0.8 %アガーで固形化した培地)に移植した。
（ｉｉｉ）シロイヌナズナ培養細胞の形質転換
シロイヌナズナ培養細胞は、100 mlの改変LS培地を入れた300 mlのフラスコを連続明期、22 ℃で振盪培養した。１週間ごとに、2 mlの懸濁培養液を新しい改変LS培地に植え継いだ。カナマイシン100 mg/l を含む5 mlのLB培地で28 ℃、2晩培養したアグロバテリウム培養液500 μlと終濃度100 μMのアセトシリンゴンを、培養4日目のシロイヌナズナ培養細胞懸濁液 100 mlに添加し、２日間振盪培養した。アグロバクテリウムを除くため、培養液を 50 mlの遠心管に移して遠心(500 rpm, 5分, 25 ℃)し、上清を取り除いた。250
mg/lのカルベニシリンを含む改変LS培地を入れて遠心分離(500 rpm, 5分, 25 ℃)し、細胞を洗浄した。この操作を4回繰り返し、アグロバクテリウムを除いた培養細胞を250 mg/lのカルベニシリンを含む改変LS培地 100 mlに添加し、２日間振盪培養した。培養液を 50 mlの遠心管に移して遠心(500 rpm, 5分, 25 ℃)し、上清を一部取り除いて細胞濃度を1/2 v/v程度に調整した。250 mg/lのカルベニシリンと40 mg/l のカナマイシンを含む改変
LS寒天培地にまき、22 ℃、連続明期下に静置して培養した。約2-3週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているクローンを選択した。250 mg/lのカルベニシリンと40 mg/lのカナマイシンを含む改変LS培地に移し、継代培養を行った。
シロイヌナズナ培養細胞は、100 mlの改変LS培地を入れた300 mlのフラスコを連続明期、22 ℃で振盪培養した。１週間ごとに、2 mlの懸濁培養液を新しい改変LS培地に植え継いだ。カナマイシン100 mg/l を含む5 mlのLB培地で28 ℃、2晩培養したアグロバテリウム培養液500 μlと終濃度100 μMのアセトシリンゴンを、培養4日目のシロイヌナズナ培養細胞懸濁液 100 mlに添加し、２日間振盪培養した。アグロバクテリウムを除くため、培養液を 50 mlの遠心管に移して遠心(500 rpm, 5分, 25 ℃)し、上清を取り除いた。250
mg/lのカルベニシリンを含む改変LS培地を入れて遠心分離(500 rpm, 5分, 25 ℃)し、細胞を洗浄した。この操作を4回繰り返し、アグロバクテリウムを除いた培養細胞を250 mg/lのカルベニシリンを含む改変LS培地 100 mlに添加し、２日間振盪培養した。培養液を 50 mlの遠心管に移して遠心(500 rpm, 5分, 25 ℃)し、上清を一部取り除いて細胞濃度を1/2 v/v程度に調整した。250 mg/lのカルベニシリンと40 mg/l のカナマイシンを含む改変
LS寒天培地にまき、22 ℃、連続明期下に静置して培養した。約2-3週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているクローンを選択した。250 mg/lのカルベニシリンと40 mg/lのカナマイシンを含む改変LS培地に移し、継代培養を行った。
（３）ＧＰＦ処理
上記で得られた、形質転換されたシロイヌナズナ培養細胞及びレタス子葉断片を液体窒素中で破砕し、湿重量1 gあたり1 mlの10 mM Tris-HCl pH8.0と混合した。得られた混合液を遠心し(15,000 rpm, 20分, 4 ℃)、上清を回収した（ＧＰＦ未処理試料）。回収した上清の一部を、タンパク質からＮ−結合型糖鎖を根本から切断する酵素であるグリコペプチダーゼＦ（GPF、TaKaRa Bio Inc.)で処理した（ＧＰＦ処理試料）。
上記で得られた、形質転換されたシロイヌナズナ培養細胞及びレタス子葉断片を液体窒素中で破砕し、湿重量1 gあたり1 mlの10 mM Tris-HCl pH8.0と混合した。得られた混合液を遠心し(15,000 rpm, 20分, 4 ℃)、上清を回収した（ＧＰＦ未処理試料）。回収した上清の一部を、タンパク質からＮ−結合型糖鎖を根本から切断する酵素であるグリコペプチダーゼＦ（GPF、TaKaRa Bio Inc.)で処理した（ＧＰＦ処理試料）。
（４）ウェスタン解析
上記で得られたＧＰＦ未処理試料、及びＧＰＦ処理試料に、細胞湿重量1mgあたり5 μlとなるようにSDS-sample buffer を加え、95℃で10分間熱変性させ、解析用試料とした。15%アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離後、エレクトロトランスファー装置を用いてPVDFメンブレン(Hybond-P; Amersham 社）上にタンパク質をブロットした。抗HA抗体(No. 11 867 423 001, Roche)を用いて、Stx2eBを検出した。
上記で得られたＧＰＦ未処理試料、及びＧＰＦ処理試料に、細胞湿重量1mgあたり5 μlとなるようにSDS-sample buffer を加え、95℃で10分間熱変性させ、解析用試料とした。15%アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離後、エレクトロトランスファー装置を用いてPVDFメンブレン(Hybond-P; Amersham 社）上にタンパク質をブロットした。抗HA抗体(No. 11 867 423 001, Roche)を用いて、Stx2eBを検出した。
結果を図２に示す。シロイヌナズナ培養細胞およびレタスの安定形質転換体のいずれを用いた場合にも、17 kDa(バンド1), 20 kDa(バンド2), 23 kDa(バンド3)の位置にシグナルが検出された。
タンパク質サンプルを、GPFで処理した後にウェスタン解析を行った場合には、バンド2と3のシグナル強度が減少し、バンド1のシグナル強度が増加した。
このことから、バンド2は2×Stx2eB-PG12における２つのStx2eB-PG12の何れかにN-結合型糖鎖が付加したタンパク質に相当し、バンド3は2×Stx2eB-PG12における２つのStx2eB-PG12の両方にN-結合型糖鎖が付加したタンパク質に相当し、バンド1はN-結合型糖鎖が付加していない2×Stx2eB-PG12であると考えられた。
タンパク質サンプルを、GPFで処理した後にウェスタン解析を行った場合には、バンド2と3のシグナル強度が減少し、バンド1のシグナル強度が増加した。
このことから、バンド2は2×Stx2eB-PG12における２つのStx2eB-PG12の何れかにN-結合型糖鎖が付加したタンパク質に相当し、バンド3は2×Stx2eB-PG12における２つのStx2eB-PG12の両方にN-結合型糖鎖が付加したタンパク質に相当し、バンド1はN-結合型糖鎖が付加していない2×Stx2eB-PG12であると考えられた。
［試験例２］糖鎖修飾部位の探索
次に、Stx2eB-PG12のN-結合型糖鎖修飾部位について、解析した。
（１）Stx2e B組換えベクターの構築
（ａ）ベクターType 1の構築
試験例１の方法でベクターType 1を構築した（図１（ａ））。
（ｂ）ベクターType 2の構築
一般に、N-結合型糖鎖はAsn-Y-Ser/Thr(YはPro以外のアミノ酸を示す。)という配列中のAsn残基に付加されるといわれている(非特許文献２)。Stx2eBのアミノ酸配列中にはこの配列は存在しないが、PG12スペーサーとStx2eBのつなぎ目にはAsn-Arg-Ser(AsnがStx2eBのC末端アミノ酸であり、その後にPG12スペーサーのアミノ酸配列が続く)という配列が存在する。このAsn残基にN-結合型糖鎖が付加されているかどうかを検証するために、このつなぎ目に存在するSer（配列番号５に示すアミノ酸配列の２位）をAlaに置換したPG12ver2スペーサー（配列番号６）を介して２つのStx2eBを連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターType 2を、以下の方法で作製した（図１（ｂ））。
次に、Stx2eB-PG12のN-結合型糖鎖修飾部位について、解析した。
（１）Stx2e B組換えベクターの構築
（ａ）ベクターType 1の構築
試験例１の方法でベクターType 1を構築した（図１（ａ））。
（ｂ）ベクターType 2の構築
一般に、N-結合型糖鎖はAsn-Y-Ser/Thr(YはPro以外のアミノ酸を示す。)という配列中のAsn残基に付加されるといわれている(非特許文献２)。Stx2eBのアミノ酸配列中にはこの配列は存在しないが、PG12スペーサーとStx2eBのつなぎ目にはAsn-Arg-Ser(AsnがStx2eBのC末端アミノ酸であり、その後にPG12スペーサーのアミノ酸配列が続く)という配列が存在する。このAsn残基にN-結合型糖鎖が付加されているかどうかを検証するために、このつなぎ目に存在するSer（配列番号５に示すアミノ酸配列の２位）をAlaに置換したPG12ver2スペーサー（配列番号６）を介して２つのStx2eBを連結したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターType 2を、以下の方法で作製した（図１（ｂ））。
上記で得たベクターType 1を鋳型として、ADH KpnI-F プライマー（配列番号２６）とPG12ver2-Rプライマー(配列番号４１)を用いてPCRを行い、NtADH5'UTRmod-S.P.-2×Stx2eB-PG12ver2に相当するDNA断片を増幅した。得られたDNA断片をKpnIとBglIIで処理し、ベクターType 1のKpnI-BglIIサイトに導入し、２つのStx2eBがPG12ver2スペーサーを介してタンデムに連結されたハイブリッドタンパク質2×Stx2eB-PG12ver2をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを得た（ベクターType 2）。
（ｃ）ベクターType 3の構築
酵母や昆虫細胞においてはAsn-X-CysXは任意のアミノ酸を示す。という配列中のAsn残基にN-結合型糖鎖が付加されるという報告がある(非特許文献３〜５)。Stx2eBの一次配列中にはAsn-Thr-Cysという配列が存在する。
このAsn-Thr-CysへのN-結合型糖鎖付加の有無を検証するために、上記で得たベクターType 2において、Stx2eBに存在するAsn-Thr-Cys配列（配列番号１の５５〜５７位に相当する配列）のAsnをSerに置換したＤＮＡを含むベクターType 3を、以下の方法で作製した（図１（ｃ））。
酵母や昆虫細胞においてはAsn-X-CysXは任意のアミノ酸を示す。という配列中のAsn残基にN-結合型糖鎖が付加されるという報告がある(非特許文献３〜５)。Stx2eBの一次配列中にはAsn-Thr-Cysという配列が存在する。
このAsn-Thr-CysへのN-結合型糖鎖付加の有無を検証するために、上記で得たベクターType 2において、Stx2eBに存在するAsn-Thr-Cys配列（配列番号１の５５〜５７位に相当する配列）のAsnをSerに置換したＤＮＡを含むベクターType 3を、以下の方法で作製した（図１（ｃ））。
下記の要領で、配列番号１に示すStx2eBのアミノ酸配列の55位のAsnをSerに置換した改変Stx2eB（以下、Stx2eBN55S）をコードするＤＮＡ (配列番号１３)を含むベクターを作製した。
まず、上記のplasmid 2を鋳型として用い、Stx2eBN55S-Fプライマー (配列番号４２)とStx2eBN55S-Rプライマー(配列番号４３)を用いてインバースPCRを行い、Stx2eBのアミノ酸配列の55位のAsnを規定するコドンを構成する塩基を置換した(plasmid 11)。
続いて、Stx2eBN55Sの下流にPG12スペーサーを挿入するために、PG12-F プライマー（配列番号３５）とPG12-R プライマー（配列番号３６）をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 11のBglIIギャップに挿入した(plasmid
12)。plasmid 12を鋳型として、Stx2eB Aプライマー（配列番号２０）とPG12ver2-Rプライマー（配列番号４１）を用いてPCRを行い、Stx2eBN55SとPG12スペーサーとのつなぎ目のAsn-Arg-Ser配列のSerを規定する塩基配列をAlaを規定する塩基配列に置換し、得られたDNA断片をpUC118のHincIIサイトに導入した(plasmid 13)。
plasmid 13からBamHIとBglIIを用いてStx2eBN55S-PG12ver2に相当するDNA断片を切り出し、このDNA断片を、plasmid 13のBamHIサイトに挿入して２つのStx2eBN55S-PG12ver2に相当するDNA断片を連結した(plasmid 14)。plasmid 14から、2×Stx2eBN55S-PG12ver2に相当するDNA断片を、BamHIとBglIIを用いて切り出し、ベクターType 1のBamHI-BglIIギャップに挿入した（ベクターType 3）。
まず、上記のplasmid 2を鋳型として用い、Stx2eBN55S-Fプライマー (配列番号４２)とStx2eBN55S-Rプライマー(配列番号４３)を用いてインバースPCRを行い、Stx2eBのアミノ酸配列の55位のAsnを規定するコドンを構成する塩基を置換した(plasmid 11)。
続いて、Stx2eBN55Sの下流にPG12スペーサーを挿入するために、PG12-F プライマー（配列番号３５）とPG12-R プライマー（配列番号３６）をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 11のBglIIギャップに挿入した(plasmid
12)。plasmid 12を鋳型として、Stx2eB Aプライマー（配列番号２０）とPG12ver2-Rプライマー（配列番号４１）を用いてPCRを行い、Stx2eBN55SとPG12スペーサーとのつなぎ目のAsn-Arg-Ser配列のSerを規定する塩基配列をAlaを規定する塩基配列に置換し、得られたDNA断片をpUC118のHincIIサイトに導入した(plasmid 13)。
plasmid 13からBamHIとBglIIを用いてStx2eBN55S-PG12ver2に相当するDNA断片を切り出し、このDNA断片を、plasmid 13のBamHIサイトに挿入して２つのStx2eBN55S-PG12ver2に相当するDNA断片を連結した(plasmid 14)。plasmid 14から、2×Stx2eBN55S-PG12ver2に相当するDNA断片を、BamHIとBglIIを用いて切り出し、ベクターType 1のBamHI-BglIIギャップに挿入した（ベクターType 3）。
（ｄ）ベクターType 4の構築
典型的なN-結合型糖鎖付加配列であるAsn-Y-Ser/Thr(YはPro以外のアミノ酸を示す。)においては、三番目のSerもしくはThrが重要な働きをすることが示されている。Stx2eBのAsn-Thr-Cys配列へのN-結合型糖鎖付加においても三番目のCysが重要であると予想される
。このことを検証するために、上記で得たベクターType 2において、Stx2eBに存在するAsn-Thr-Cys（配列番号１の５５〜５７位に相当する配列）のCysをAlaに置換したDNAを含むベクターType 4を、以下の方法で作製した（図１（ｄ））。
下記の要領で、配列番号１に示すStx2eBのアミノ酸配列の57位のCysをAlaに置換した改変Stx2eB（以下、Stx2eBC57A）をコードするＤＮＡを含むベクターを作製した。plasmid 2を鋳型として用い、Stx2eBC57A-Fプライマー (配列番号４４)とStx2eBC57A-Rプライマー(配列番号４５)を用いてインバースPCRを行い、57位のCysに相当する塩基を置換した(plasmid 15)。続いて、Stx2eB5C57Aの下流にPG12スペーサーを挿入するために、PG12-F プライマー(配列番号３５)とPG12-R プライマー（配列番号３６）をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 15のBglIIギャップに挿入した(plasmid 16)。Plasmid 16を鋳型として、Stx2eB Aプライマー（配列番号２０）とPG12ver2-Rプライマー（配列番号４１）を用いてPCRを行い、リンカー領域のAsn-Arg-Ser配列をAsn-Arg-Alaに置換し、得られたDNA断片をpUC118のHincIIサイトに導入した(plasmid 17)。
plasmid 17からBamHIとBglIIを用いてStx2eBC57A-PG12ver2に相当するDNA断片を切り出し、このDNA断片を、Plasmid 17のBamHIサイトに挿入して、２つのStx2eBC57A-PG12ver2に相当するDNA断片を連結した（plasmid 18）。plasmid 18から2×Stx2eBC57A-PG12ver2に相当するDNA断片を、BamHIとBglIIを用いて切り出し、ベクターType 1のBamHI-BglIIギャップに挿入した(ベクターType 4)。
典型的なN-結合型糖鎖付加配列であるAsn-Y-Ser/Thr(YはPro以外のアミノ酸を示す。)においては、三番目のSerもしくはThrが重要な働きをすることが示されている。Stx2eBのAsn-Thr-Cys配列へのN-結合型糖鎖付加においても三番目のCysが重要であると予想される
。このことを検証するために、上記で得たベクターType 2において、Stx2eBに存在するAsn-Thr-Cys（配列番号１の５５〜５７位に相当する配列）のCysをAlaに置換したDNAを含むベクターType 4を、以下の方法で作製した（図１（ｄ））。
下記の要領で、配列番号１に示すStx2eBのアミノ酸配列の57位のCysをAlaに置換した改変Stx2eB（以下、Stx2eBC57A）をコードするＤＮＡを含むベクターを作製した。plasmid 2を鋳型として用い、Stx2eBC57A-Fプライマー (配列番号４４)とStx2eBC57A-Rプライマー(配列番号４５)を用いてインバースPCRを行い、57位のCysに相当する塩基を置換した(plasmid 15)。続いて、Stx2eB5C57Aの下流にPG12スペーサーを挿入するために、PG12-F プライマー(配列番号３５)とPG12-R プライマー（配列番号３６）をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化DNA断片を、plasmid 15のBglIIギャップに挿入した(plasmid 16)。Plasmid 16を鋳型として、Stx2eB Aプライマー（配列番号２０）とPG12ver2-Rプライマー（配列番号４１）を用いてPCRを行い、リンカー領域のAsn-Arg-Ser配列をAsn-Arg-Alaに置換し、得られたDNA断片をpUC118のHincIIサイトに導入した(plasmid 17)。
plasmid 17からBamHIとBglIIを用いてStx2eBC57A-PG12ver2に相当するDNA断片を切り出し、このDNA断片を、Plasmid 17のBamHIサイトに挿入して、２つのStx2eBC57A-PG12ver2に相当するDNA断片を連結した（plasmid 18）。plasmid 18から2×Stx2eBC57A-PG12ver2に相当するDNA断片を、BamHIとBglIIを用いて切り出し、ベクターType 1のBamHI-BglIIギャップに挿入した(ベクターType 4)。
（２）一過性発現実験
（ｉ）プロトプラストの作製
シロイヌナズナの培養細胞懸濁液を、40 gで5分間遠心分離して、培養細胞を回収した。回収した培養細胞を50mlのプロトプラスト化酵素溶液 (1.0% cellulose RS (ヤクルト本社), 0.25% macerozyme R-10 (ヤクルト本社), 400mM マンニトール, 8mM CaCl2, and 5mM Mes-KOH, pH 5.6)に浸漬し、室温で約一時間半振盪した。続いて、プロトプラスト懸濁液を60gで5分間遠心し、プロトプラストを沈殿させた。プロトプラストを167mMマンニトールおよび133mM CaCl2を含む水溶液に再懸濁し、40gで5分間遠心した。プロトプラストを333mMマンニトールおよび66.7mM CaCl2を含む水溶液に再懸濁し、40gで5分間遠心した。プロトプラストをW5 solution (154mM NaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl, 2mM Mes-KOH, pH 5.6)に懸濁し、氷上に1時間静置した。プロトプラスト懸濁液を40gで5分間遠心し、プロトプラスト濃度が2×106個/mlになるように、MaMg solution (400mM マンニトール, 15mM MgCl2, and 4mM Mes-KOH, pH 5.6)に懸濁した。
（ｉ）プロトプラストの作製
シロイヌナズナの培養細胞懸濁液を、40 gで5分間遠心分離して、培養細胞を回収した。回収した培養細胞を50mlのプロトプラスト化酵素溶液 (1.0% cellulose RS (ヤクルト本社), 0.25% macerozyme R-10 (ヤクルト本社), 400mM マンニトール, 8mM CaCl2, and 5mM Mes-KOH, pH 5.6)に浸漬し、室温で約一時間半振盪した。続いて、プロトプラスト懸濁液を60gで5分間遠心し、プロトプラストを沈殿させた。プロトプラストを167mMマンニトールおよび133mM CaCl2を含む水溶液に再懸濁し、40gで5分間遠心した。プロトプラストを333mMマンニトールおよび66.7mM CaCl2を含む水溶液に再懸濁し、40gで5分間遠心した。プロトプラストをW5 solution (154mM NaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl, 2mM Mes-KOH, pH 5.6)に懸濁し、氷上に1時間静置した。プロトプラスト懸濁液を40gで5分間遠心し、プロトプラスト濃度が2×106個/mlになるように、MaMg solution (400mM マンニトール, 15mM MgCl2, and 4mM Mes-KOH, pH 5.6)に懸濁した。
（ｉｉ）組換えベクターの導入
上記で作製したベクターType 1、Type 2、Type 3、Type 4を、それぞれ120μlのプロトプラスト懸濁液と混合した後、140μlのPEG solution (400mM マンニトール, 100mM Ca(NO3)2, and 40% PEG)を加えて穏やかに混和し、７分間インキュベートした。約20分間かけて1mlのW5 solutionをプロトプラスト懸濁液に添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、400mM マンニトールとW5 solutionを4:1の割合で混ぜた溶液を1ml添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、1%スクロース、400mM マンニトールおよび0.3mMカルベニシリンを含むLS培地を0.5 ml添加し、暗所25 ℃で24時間培養した。
上記で作製したベクターType 1、Type 2、Type 3、Type 4を、それぞれ120μlのプロトプラスト懸濁液と混合した後、140μlのPEG solution (400mM マンニトール, 100mM Ca(NO3)2, and 40% PEG)を加えて穏やかに混和し、７分間インキュベートした。約20分間かけて1mlのW5 solutionをプロトプラスト懸濁液に添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、400mM マンニトールとW5 solutionを4:1の割合で混ぜた溶液を1ml添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、1%スクロース、400mM マンニトールおよび0.3mMカルベニシリンを含むLS培地を0.5 ml添加し、暗所25 ℃で24時間培養した。
（３）ＧＰＦ処理
上記で得られた、培養細胞を液体窒素中を用いて破砕し、実施例１と同様の方法で、ＧＰＦ処理した。
上記で得られた、培養細胞を液体窒素中を用いて破砕し、実施例１と同様の方法で、ＧＰＦ処理した。
（４）ウェスタン解析
実施例１と同様の方法で、ウェスタン解析を行った。結果を図３、図４に示す。
ベクターType 1を導入した場合は、17 kDa(バンド1)と20 kDa (バンド2)の2本のバンドが検出され、23 kDaのバンドは検出限界以下であった（図３）。タンパク質サンプルをGP
Fで処理した後にウェスタン解析を行った場合、バンド2が消失しバンド1のみが検出された。このことから、一過性発現実験においても2×Stx2eB-PG12にはN-結合型糖鎖が付加されることがわかった。ベクターType 2を発現した場合も、バンド1とバンド2の2本のバンドが検出された（図３）ことから、Stx2eB C末端のAsnは主な修飾部位ではないと考えられる。一方、ベクターType 3を発現した場合にはバンド1のみが検出された（図３）。このことからStx2eBのAsn-Thr-Cys配列中のAsn（配列番号１の５５位）にN-結合型糖鎖が付加されていると考えられる。同時に、Asn-Thr-Cys配列中のAsnをSerに置換することでN-結合型糖鎖付加を回避できることがわかった。また、ベクターType 4を発現した場合には、バンド1のみが検出された(図４)。このことから、三番目のCys残基がN-結合型糖鎖付加において重要であり、同時にこのCysに変異を導入することでN-結合型糖鎖の付加を回避できることがわかった。
実施例１と同様の方法で、ウェスタン解析を行った。結果を図３、図４に示す。
ベクターType 1を導入した場合は、17 kDa(バンド1)と20 kDa (バンド2)の2本のバンドが検出され、23 kDaのバンドは検出限界以下であった（図３）。タンパク質サンプルをGP
Fで処理した後にウェスタン解析を行った場合、バンド2が消失しバンド1のみが検出された。このことから、一過性発現実験においても2×Stx2eB-PG12にはN-結合型糖鎖が付加されることがわかった。ベクターType 2を発現した場合も、バンド1とバンド2の2本のバンドが検出された（図３）ことから、Stx2eB C末端のAsnは主な修飾部位ではないと考えられる。一方、ベクターType 3を発現した場合にはバンド1のみが検出された（図３）。このことからStx2eBのAsn-Thr-Cys配列中のAsn（配列番号１の５５位）にN-結合型糖鎖が付加されていると考えられる。同時に、Asn-Thr-Cys配列中のAsnをSerに置換することでN-結合型糖鎖付加を回避できることがわかった。また、ベクターType 4を発現した場合には、バンド1のみが検出された(図４)。このことから、三番目のCys残基がN-結合型糖鎖付加において重要であり、同時にこのCysに変異を導入することでN-結合型糖鎖の付加を回避できることがわかった。
［試験例３］様々な植物細胞を用いた一過性発現実験
イネの培養細胞、タバコの培養細胞、コマツヨイグサの葉から作製したプロトプラストを用いてベクターType 2、ベクターType 3の一過性発現実験を行った。
イネの培養細胞、タバコの培養細胞、コマツヨイグサの葉から作製したプロトプラストを用いてベクターType 2、ベクターType 3の一過性発現実験を行った。
（１）一過性発現実験
（ｉ）プロトプラストの作製
イネの培養細胞、タバコの培養細胞、コマツヨイグサの葉を用いて、試験例２と同様の方法によりプロトプラスト懸濁液を調製した。
（ｉ）プロトプラストの作製
イネの培養細胞、タバコの培養細胞、コマツヨイグサの葉を用いて、試験例２と同様の方法によりプロトプラスト懸濁液を調製した。
（ｉｉ）組換えベクターの導入
上記で作製したベクターType 2、Type 3を、それぞれ120μlのプロトプラスト懸濁液と混合した後、140μlのPEG solution (400mM マンニトール, 100mM Ca(NO3)2, and 40% PEG)を加えて穏やかに混和し、７分間インキュベートした。約20分間かけて1mlのW5 solutionをプロトプラスト懸濁液に添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、400mM マンニトールとW5 solutionを4:1の割合で混ぜた溶液を1ml添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、1%スクロース、400mM マンニトールおよび0.3mMカルベニシリンを含むLS培地を0.5 ml添加し、暗所25 ℃で24時間培養した。
上記で作製したベクターType 2、Type 3を、それぞれ120μlのプロトプラスト懸濁液と混合した後、140μlのPEG solution (400mM マンニトール, 100mM Ca(NO3)2, and 40% PEG)を加えて穏やかに混和し、７分間インキュベートした。約20分間かけて1mlのW5 solutionをプロトプラスト懸濁液に添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、400mM マンニトールとW5 solutionを4:1の割合で混ぜた溶液を1ml添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、1%スクロース、400mM マンニトールおよび0.3mMカルベニシリンを含むLS培地を0.5 ml添加し、暗所25 ℃で24時間培養した。
（２）ウェスタン解析
試験例１と同様の方法で、ウェスタン解析を行った。結果を図５に示す。
いずれの細胞を用いた場合も、ベクターType 2を導入した場合は、17 kDa(バンド1)と20 kDa (バンド2)の2本のバンドが検出されたが、ベクターType 3を発現した場合にはバンド1のみが検出された。このことから、様々な植物種において、Asn-Thr-Cys配列中のAsnにN-結合型糖鎖が付加されており、同時にAsn-Thr-Cys配列中のAsnをSerに置換することでN-結合型糖鎖付加を回避できることがわかった。
試験例１と同様の方法で、ウェスタン解析を行った。結果を図５に示す。
いずれの細胞を用いた場合も、ベクターType 2を導入した場合は、17 kDa(バンド1)と20 kDa (バンド2)の2本のバンドが検出されたが、ベクターType 3を発現した場合にはバンド1のみが検出された。このことから、様々な植物種において、Asn-Thr-Cys配列中のAsnにN-結合型糖鎖が付加されており、同時にAsn-Thr-Cys配列中のAsnをSerに置換することでN-結合型糖鎖付加を回避できることがわかった。
［試験例４］様々な植物細胞を用いた形質転換実験
一過性発現実験においてN-結合型糖鎖の付加が見られなかったベクターType 3の有用性を、シロイヌナズナ培養細胞、レタス子葉断片を用いた形質転換実験で確認した。
一過性発現実験においてN-結合型糖鎖の付加が見られなかったベクターType 3の有用性を、シロイヌナズナ培養細胞、レタス子葉断片を用いた形質転換実験で確認した。
（１）形質転換
試験例１と同様の方法で、シロイヌナズナ培養細胞、レタス子葉断片の形質転換を行った。
試験例１と同様の方法で、シロイヌナズナ培養細胞、レタス子葉断片の形質転換を行った。
（２）ウェスタン解析
試験例１と同様の方法で、ウェスタン解析を行った。結果を図６に示す。
ベクターType 3による形質転換体では、17 kDaのバンド1に相当するシグナルのみが検出された。このことから、形質転換体においても、Stx2eBのAsn-Thr-Cys配列中のAsn（配
列番号１の５５位）をSerに置換することでN-結合型糖鎖付加を回避できることがわかった。
試験例１と同様の方法で、ウェスタン解析を行った。結果を図６に示す。
ベクターType 3による形質転換体では、17 kDaのバンド1に相当するシグナルのみが検出された。このことから、形質転換体においても、Stx2eBのAsn-Thr-Cys配列中のAsn（配
列番号１の５５位）をSerに置換することでN-結合型糖鎖付加を回避できることがわかった。
本発明は、ブタ浮腫病ワクチンの開発に有用である。
Claims (14)
- 下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示す、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の下記の部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質
Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは、任意のアミノ酸を示す）
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の前記部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ、下記の部分アミノ酸配列を含まない、Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有する改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質
Ａｓｎ−Ｘ１−Ｃｙｓ（Ｘ１は、Ｐｒｏ又はＡｓｐ以外のアミノ酸を示す） - ２つ又は３つの、下記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）に示す、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質が、それぞれ、下記の特徴（ｘ）及び（ｙ）を有するペプチドを介してタンデムに連結された、ハイブリッドタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の下記の部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質
Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは、任意のアミノ酸を示す）
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の前記部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ、下記の部分アミノ酸配列を含まない、Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有する改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質
Ａｓｎ−Ｘ１−Ｃｙｓ（Ｘ１は、Ｐｒｏ又はＡｓｐ以外のアミノ酸を示す）
（ｘ）アミノ酸の個数が１２〜３０個
（ｙ）Ｐｒｏの含有率が２０〜３５％ - 前記部分アミノ酸配列の改変が、前記５５位のアミノ酸の、Ｓｅｒへの置換である、請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
- 前記部分アミノ酸配列の改変が、前記５７位のアミノ酸の、Ａｌａへの置換である、請求項１〜３の何れか一項に記載のＤＮＡ。
- アミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加された前記ハイブリッドタンパク質をコードする、請求項２〜４の何れか一項に記載のＤＮＡ。
- カルボキシル末端に小胞体残留ペプチド、又は液胞移行シグナルペプチドが付加された前記ハイブリッドタンパク質をコードする、請求項２〜５の何れか一項に記載のＤＮＡ。
- 請求項１〜６の何れか一項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
- 請求項７に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換植物細胞又は形質転換植物。
- 請求項８に記載の形質転換植物から得られる種子。
- 請求項８に記載の形質転換植物細胞若しくは形質転換植物を原料とする、ブタ浮腫病ワクチン。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡを、植物細胞内で発現させることを含む、
Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有するタンパク質の生産方法。 - 下記の（Ａ）又は（Ｂ）の改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の下記の部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質
Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは、任意のアミノ酸を示す）
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の前記部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ、下記の部分アミノ酸配列を含まない、Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有する改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質
Ａｓｎ−Ｘ１−Ｃｙｓ（Ｘ１は、Ｐｒｏ又はＡｓｐ以外のアミノ酸を示す） - ２つ又は３つの、下記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）に示す、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質が、それぞれ、下記の特徴（ｘ）及び（ｙ）を有するペプチドを介してタンデムに連結された、ハイブリッドタンパク質。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の下記の部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する、改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質
Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは、任意のアミノ酸を示す）
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の５５位〜５７位の前記部分アミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ、下記の部分アミノ酸配列を含まない、Ｓｔｘ２ｅ免疫原性を有する改変Ｓｔｘ２ｅ Ｂサブユニットタンパク質
Ａｓｎ−Ｘ１−Ｃｙｓ（Ｘ１は、Ｐｒｏ又はＡｓｐ以外のアミノ酸を示す）
（ｘ）アミノ酸の個数が１２〜３０個
（ｙ）Ｐｒｏの含有率が２０〜３５％ - 請求項１２に記載のタンパク質又は請求項１３に記載のハイブリッドタンパク質を細胞内に保持する植物。
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