CN118147166A

CN118147166A - Fto基因在提高乳管数量上的应用

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Publication number: CN118147166A
Application number: CN202410564881.3A
Authority: CN
Inventors: 胡斌; 龙翔宇; 杨那; 秦云霞; 阳江华
Original assignee: Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences; Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences; Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2024-05-09
Filing date: 2024-05-09
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2044-05-09
Also published as: CN118147166B

Abstract

本发明提供了FTO基因、或者含有FTO基因编码区的重组载体、或者含有所述重组载体的宿主菌在增加莴苣乳管数量、使莴苣花期提前、花期缩短等中的应用，所述FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明首次将FTO基因转化到莴苣中，能够使莴苣花期提前、花期缩短，显著增加莴苣乳管数量、横截面面积和莴苣胶乳总固形物含量，还能显著提高莴苣叶片中叶绿素含量，具有良好的应用前景。

Description

FTO基因在提高乳管数量上的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种FTO基因在提高乳管数量上的应用。

背景技术

早期的橡胶是取自橡胶树、橡胶草等植物的胶乳，加工后制成的具有弹性、绝缘性、不透水和空气的材料。橡胶为高弹性的高分子化合物，分为天然橡胶与合成橡胶二种。天然橡胶是从橡胶树、橡胶草等植物中提取胶质后加工制成;合成橡胶则由各种单体经聚合反应而得。美国华盛顿州立大学的科学家公布一项研究结果,带刺野莴苣(一种常见的杂草)具有与橡胶相关联的遗传密码区域,可作为天然胶乳的一个潜在来源。因此，提高莴苣的产胶能力对于提高莴苣的经济价值和解决我国天然橡胶严重依赖进口的需求问题具有重要的意义。莴苣属自交作物，生长周期短、莴苣胶乳中橡胶烃分子量较高（等于或优于橡胶树橡胶烃分子量），后代遗传稳定，且遗传转化技术成熟，在提高莴苣经济附加值及产胶替代植物新品种创制方面具有非常好的遗传改良潜力。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种FTO基因在提高乳管数量上的应用。

本发明第一个方面是提供FTO基因、或者含有FTO基因编码区的重组载体、或者含有所述重组载体的宿主菌在增加莴苣（Lactuca sativa L）乳管数量中的应用，所述FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其中，所述重组载体的原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pXCS-HAStrep载体。

本发明第二个方面是提供FTO基因、或者含有FTO基因编码区的重组载体、或者含有所述重组载体的宿主菌在使莴苣花期提前和/或使莴苣花期缩短中的应用，所述FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明第三个方面是提供FTO基因、或者含有FTO基因编码区的重组载体、或者含有所述重组载体的宿主菌在增加莴苣乳管数量、以及使莴苣花期提前和/或使莴苣花期缩短中的应用，所述FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明第四个方面是提供FTO基因、或者含有FTO基因编码区的重组载体、或者含有所述重组载体的宿主菌在增加莴苣乳管数量、以及提高莴苣叶片中叶绿素含量中的应用，所述FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明第五个方面是提供FTO基因、或者含有FTO基因编码区的重组载体、或者含有所述重组载体的宿主菌在使莴苣花期提前和/或使莴苣花期缩短、以及提高莴苣叶片中叶绿素含量中的应用，所述FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明第六个方面是提供FTO基因、或者含有FTO基因编码区的重组载体、或者含有所述重组载体的宿主菌在增加莴苣乳管数量、使莴苣花期提前和/或使莴苣花期缩短、以及提高莴苣叶片中叶绿素含量中的应用，所述FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明第七个方面是提供FTO基因、或者含有FTO基因编码区的重组载体、或者含有所述重组载体的宿主菌在增加莴苣乳管数量、以及提高莴苣胶乳总固形物含量中的应用，所述FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明第八个方面是提供FTO基因、或者含有FTO基因编码区的重组载体、或者含有所述重组载体的宿主菌在增加莴苣乳管数量、使莴苣花期提前和/或使莴苣花期缩短、以及提高莴苣胶乳总固形物含量中的应用，所述FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

莴苣的乳管是初生乳管，不会产生次生乳管，因此乳管是在莴苣生长发育进程中形成的，乳管的数量与莴苣生长发育直接相关。转FTO基因刺激了植株的生长发育，导致莴苣花期提前以及花期缩短，说明转FTO基因加速了植物的生长发育过程，所以有利于形成更多的乳管。本发明首次将FTO基因转化到莴苣中，能够使莴苣花期提前、花期缩短，显著增加莴苣乳管数量，还能显著提高莴苣胶乳总固形物含量和莴苣叶片中叶绿素含量，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为转基因莴苣苗期照片。

图2为转基因莴苣胶乳总固形物含量。

图3为转基因莴苣乳管切片。

图4为转基因莴苣乳管相对面积。

图5为转基因莴苣叶片中叶绿素含量。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：基因扩增及载体构建

人工合成FTO基因序列（如SEQ ID No:1所示），以此为模板，以F:CACTTGGCTCCCTTATCTGAC和R: CGTTGTATGCTGCTCTGCTCTTA为引物，进行PCR扩增。反应体系如表1所示。将上述反应液短暂离心，放置PCR仪中进行扩增。扩增程序为：预变性95℃，5min；变性95℃，15s；退火55℃，30s；延伸72℃，1min；最终延伸72℃，10min；反应程序最终保持在16℃，共35个循环。PCR反应反应结束后，配置 2%小孔径的琼脂糖凝胶电泳对 PCR产物进行检测，如条带大小与预期结果无异，配置 0.7%大孔径的琼脂糖凝胶电泳，采用DNA 凝胶回收试剂盒(Omega，D2500-02)对产物进行回收，获得FTO基因。

表1 扩增FTO基因的 PCR 反应体系

试剂	体积
		PrimeSTAR Max Premix（2×）	25 μL
上游引物（10μM）	1 μL
		下游引物（10μM）	1 μL
模板	1 μL(<200ng)
		ddH₂O	Up to 50 μL

通过同源重组技术将目的基因构建到过表达载体上，重组体系如表2所示。根据ClonExpress® II One Step Cloning Kit试剂盒说明书，将目的基因和pXCS-HAStrep载体按照摩尔比1:4比例混合，37℃孵育2h。取100μL感受态细胞Top10，将上述的反应产物按照不超过感受态细胞体积的1/10加入感受态细胞中，轻轻弹打混匀，放置冰上25min；置于42℃水浴锅中进行热激60s，迅速转移至冰上（切勿晃动）2min；加入不含抗生素的LB液体培养基900μL，于37℃摇床200rpm培养45~60min；室温10000rpm离心1min，弃900μL上清液体，剩余的液体吹打重悬菌体，涂布含有氨苄抗性的LB平板上，37℃倒置培养12-16h。通过菌落PCR和测序确定表达载体是否成功构建，最后通过质粒提取获得正确质粒。

表2 同源重组体系

组分	体积
		基因片段（80ng/μL）	*（>1μL）
载体片段（150ng/μL）	*（>1μL）
		5×CE II Buffer	2μL
Exnase II	1μL
		ddH₂O	Up to 10 μL

实施例2：转基因植株构建

根据农杆菌感受态细胞操作说明书，将把测序正确的菌提取质粒转化农杆菌，获得阳性克隆菌用于构建转基因植株，侵染操作如下：

1、将收集到的莴苣种子进行分拣，放入离心管中浸泡10min，筛去干瘪的种子以及其他杂质；

2、于超净台中，将筛选后的种子使用无菌水：消毒液（蓝月亮漂白剂）=1:1的消毒液，消毒处理8~10min，消毒完成后使用无菌水清洗5次，每次5min，使表面消毒剂完全去除；

3、将消毒完成后的莴苣种子，接种于MS+20g·L^-1 Sucrose+7g·L^-1 Agar，pH-6.0，的培养基上，于培养室中暗培养2d，2d后继续进行光照培养，培养温度为25±2°C，光照强度45 μmol·m^-2·s^-1，光照周期16h·d^-1，光照培养3d后可进行侵染；

4、将制备好的阳性克隆，接种至选择培养基（LB+50 mg·L^-1RFP+10 mg·L^-1Kanamycin+15 g·L^-1 Agar，pH-7.0）上，于培养箱中28°C培养36~48 h；

5、挑选新鲜的阳性克隆菌落，接种于50 mL LB液体培养基中（或10mL LB液体培养基中添加50 μL阳性农杆菌溶液），28 °C，200 rpm，培养菌液至浑浊状，检测菌液OD值，当OD值在0.8~1.0时，可用于配制侵染液；

6、将OD值达标后的菌液，3000 rpm，离心10min，弃上清，使用30 mL 1x MS+100 μMACE重悬；

7、选取子叶完全生长开的莴苣幼苗，将幼苗取出后，于子叶中部，垂直于叶轴切下，于子叶基部切除下胚轴部分，将处理好的外植体，放置于MS培养基中过渡，待切取15份外植体后，统一放入侵染液中侵染10min，每个处理重复4次，侵染结束后，使用无菌滤纸吸干多余侵染液；（PS：因外植体较为脆弱，此步骤全程应避免外植体被风干。）

8、将完成侵染后的外植体，接种至共培养培养基（1/2MS+10 g·L^-1 Sucrose+6g·L^-1 Agar+100 μM ACE）中，暗培养2d，培养温度25±2 °C；

9、2天后，将完成共培养的外植体，接种至愈伤组织诱导培养基（MS+20 g·L^-1Sucrose+0.2 mg·L^-1NAA+0.2 mg·L^-16-BA+7g·L^-1 Agar+50 mg·L^-1Kanamycin +62.5mg·L^-1Cefotaxime，pH-6.0）上，将切口处轻轻插入培养基中，每个外植体之间间隔1.5cm，每培养2周更换一次培养基，期间去除污染、褐化的外植体，当外植体出现愈伤组织但未发育成不定芽时，将愈伤组织于外植体分离，用于诱导不定芽；（通常在14天后形成愈伤组织，28天后形成不定芽。）

10、将前期诱导带不定芽的愈伤组织，转移至过渡培养基（MS+20 g·L^-1 Sucrose+0.00125 mg·L^-16-BA+7g·L^-1 Agar +62.5 mg·L^-1Cefotaxime，pH-6.0）上培养2~3周，即长成植株；

11、将莴苣试管苗接种至生根培养基（1/2MS+30 g·L^-1 Sucrose+0.02 mg·L^-1NAA+8g·L^-1 Agar +62.5 mg·L^-1Cefotaxime，pH-6.0）中，培养3周；

12、试管苗生长至7~8 cm后，且生根情况良好，移栽至土壤中，于培养室培养，每周喷施少量叶面肥(N-P-K, 20-8-20)，20 °C，光照周期16h·d^-1，直至收获种子；

13、在幼苗的早期生长期阶段，每两天浇一次稀释过的叶面肥，注意在苗生长期间要留有重充足的空间，避免过密导致虫害的提早发生。在苗高度生长期间需要每天一次叶背面喷水或喷洒杀害红蜘蛛的农药（按照说明书最大倍数稀释）以防止虫害的发生。

14、在幼苗生长期间或者在组培期间进行DNA提取，以验证植株是否属于阳性植株，最终获得转基因株系19-7、23-2、40-1、45-1等（图1，从左至右分别是：野生型植株WT、OE-19-7、OE-23-2、OE-40-1和OE-45-1）。

实施例3：转基因植株的性状和性能

一、转基因植株的花期

取实施例2获得的转基因幼苗于2023年7月14日在培养室播种生长，待花蕾时期每天观察，记录每株植株第一朵花开放时间和第一朵花开花所需要的天数（开花天数），结果如表3（WT是野生型植株，其他编号的是转基因植株）所示。结果表明，与对照组WT相比，转基因植株开花时间提取，开花天数缩短，说明FTO基因能够使莴苣开花提前，花期缩短。

表3基因植株的花期

二、干胶含量测定

莴苣第一朵花开后，用刀片在植株主茎生长状态相似部位进行割胶，用枪头吸取胶乳10ul（吸取胶乳时缓慢吸取，不能产生空气，否则会影响实验结果），称重记录为鲜重，然后80℃烘烤至胶乳发黄，多次称量不变，称重记录为干重。按照干含百分比（总固形物含量）=干重/鲜重×100%进行计算，结果如图2和表4所示。结果显示，转基因植株干含增加，说明FTO基因能够增加胶乳总固形物含量。

表4 干胶含量

样品	干含百分比（总固形物含量）	P值
			OE-19-7	37.81%	0.001
OE-23-2	30.49%	0.091
			OE-40-1	31.70%	0.042
OE-45-1	37.27%	0.009
			WT	23.60%

三、乳管数量

采用油红O染色法进行。原理：胶乳中含量最多的是橡胶粒子，橡胶粒子表面含有大量的脂类物质。油红染料是一种脂溶性偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，能特异性地使组织和细胞内中性甘油三酯、脂质以及脂蛋白等染色。当组织切片放入染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质中，使组织内脂质呈红色。实验操作如下：

1、莴苣第一朵花开后，取相同位置的茎，立即用FAA溶液固定（FAA：甲醛-醋酸-乙醇，3.5：10：50），抽真空后过夜。

2、截取部分组织用清水洗涤，采用震动切片机进行切片，切片厚度80μm-100μm。

3、将切好的材料于60%异丙醇浸洗，30s。

4、油红染色10min（油红：饱和油红O原液按3：2（油红O：蒸馏水）加入蒸馏水，混匀，室温放置5-10分钟，过滤后避光保存，使用时放置室温即可。

5、染色结束之后用60%异丙醇分化至间质清晰，蒸馏水清洗。

6、放置载玻片上，镜检。

结果如图3所示（分别是：WT、OE-19-7、OE-23-2、OE-40-1和OE-45-1）。莴苣的乳管是初生乳管，不会产生次生乳管，因此呈中心往外放射性的形态。而选择统计对象时，是按照竖排选择，也就是选择的统计对象每一列均包含了整个栽培过程中形成的乳管，乳管的发育时期也能够保持一致。因此，在同样的发育阶段，横切面中乳管分布的面积越大，说明乳管的数量越多。为了便于比较，在计算乳管分布面积时，在图片上设置统一的标尺（图3各图片的右下角），根据标尺的长度计算选取的乳管的相对面积。因此通过计算获得的相对面积可以直接反映乳管数量的变化。

从图3中可直接看出，与WT相比，转基因植株的乳管的横截面区域相对增大，乳管数量明显增多。利用ImageJ软件对WT、OE-19-7、OE-23-2、OE-40-1和OE-45-1放射性乳管相对面积进行统计，每个株系统计5排乳管细胞，即5个重复。对获得的相对面积进行统计学分析，结果如图4所示。以上结果说明FTO基因能够增加莴苣乳管相对面积和乳管数量。

四、叶绿素含量

原理：根据叶绿素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在特定波长下测定叶绿素提取物的吸光值，然后利用公式计算出样品中叶绿素的含量。具体操作如下：

1.取莴苣第一朵花开后新鲜叶片，擦干后去中脉，剪碎，混匀。

2.用分析天平称取0.06g左右的叶片到2ml离心管中，每个编号的样品分成三份为三个技术重复，每管加入抽提Buffer（抽提Buffer配制：（体积比）乙醇：丙酮：H2O =4.5：4.5：1） 2ml，parafilm封口，4℃下避光抽提12h。

3.以抽提Buffer为空白，使用紫外分光光度计DU640在波长645和663下测定叶绿素提取物的吸光值。

4.结果分析：

根据Arnon（1949）法的公式加以修正计算叶绿素含量：

叶绿素a=(12.72A663-2.59A645)×v/w/1000

叶绿素b=(22.88A645-4.67A663)×v/w/1000

叶绿素总含量=叶绿素a+叶绿素b

结果如图5和表5所示，转基因莴苣叶片中叶绿素含量明显高于对照组，具有显著性差异，说明FTO基因能够增加莴苣叶片中叶绿素含量。

表5 叶绿素含量

五、莴苣分子量测定

原理：本实验使用凝胶渗透色谱法( GPC)测量分子量，这=该方法是目前最主流的测量方法。经过测试可获得数均分子质量Mn、重均分子质量Mw，粘均分子质量Mη 等数据。高分子溶液以一定流速通过多孔的凝胶色谱柱时，高分子会不断重复“扩散进入凝胶微孔，再被流动相带出微孔”这一过程。分子越小，越容易渗透进入凝胶微孔。大分子颗粒由于其体积较大，不容易进入较小的微孔，经过一定时间的淋洗，大分子与小分子逐渐拉开距离，样品按照从大到小的顺序流出，通过GPC 仪器连接的紫外或示差折光浓度检测器，得到随时间变化的高分子浓度分布图。具体操作如下：

1、取新鲜胶乳滴入1ml丙酮中，置于摇床上摇动，过夜

2、弃丙酮，于通风橱中挥发残留的丙酮，加入800ml四氢呋喃，置于摇床上摇晃三天

3、将样品进行过滤，将过滤液体转移新的上样瓶中，确保液体清澈易流动。

4、上机测定。

结果如表6所示，与WT相比，转基因后的植株的Mw不会下降，应用性不会降低，说明FTO基因转入莴苣不会在乳胶应用方面产生负效应。

表6

样品	Mw	分散系数
			WT	1013894.5	2.58
OE-19-7	1026205	2.07
			OE-23-2	833874	1.94
OE-40-1	1042912.5	1.67
			OE-45-1	1132728.5	1.89

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.FTO基因、或者含有FTO基因编码区的重组载体、或者含有所述重组载体的宿主菌在增加莴苣乳管数量中的应用，所述FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.FTO基因、或者含有FTO基因编码区的重组载体、或者含有所述重组载体的宿主菌在使莴苣花期提前和/或使莴苣花期缩短中的应用，所述FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。