CN115708480A

CN115708480A - 一种创制菠萝突变体的ems离体诱变方法

Info

Publication number: CN115708480A
Application number: CN202211687252.7A
Authority: CN
Inventors: 戴小红; 陈晶晶; 李栋梁; 井敏敏; 陈志辉; 马朝明; 顾帅磊; 王禄利
Original assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Current assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Priority date: 2022-12-27
Filing date: 2022-12-27
Publication date: 2023-02-24
Anticipated expiration: 2042-12-27
Also published as: CN115708480B

Abstract

本发明公开了一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，属于菠萝育种技术领域。本发明以菠萝叶基、黄白化苗茎段为外植体经诱导分化、增殖继代培养获得离体诱变材料，然后经EMS诱变处理、诱变处理后的恢复培养与分化诱导、M0群体幼苗的壮苗与生根、炼苗与移栽、表型观测与突变体筛选，创制了菠萝突变体。本发明提供的EMS离体诱变方法可以获取大量菠萝离体诱变材料，便于规模化开展菠萝人工诱变，提高诱变效率，诱导产生多种类型表型变异，获得表型变异丰富的M0突变群体，构建突变体库，有助于推动菠萝新种质创制与功能基因研究，为菠萝优异性状基因挖掘与应用、新品种选育提供材料支撑。

Description

一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法

技术领域

本发明涉及菠萝育种技术领域，特别是涉及一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法。

背景技术

菠萝(Ananas comosus)是凤梨科(Bromeliaceae)凤梨属的一种具有重要经济价值的热带水果，因其香气诱人、风味独特而深受消费者喜爱。我国菠萝种植面积在2019年已突破6万公顷，产量达170多万吨。菠萝产业已成为我国广东、海南、广西、云南等热区农业的支柱产业之一。

我国菠萝产业存在较突出的品种同质化问题，以主产区广东徐闻为例，目前主栽品种仍为传统品种‘巴厘’，除了‘金钻’、‘金菠萝’等少数品种外，能够在一定范围内替代‘巴厘’的优良品种寥寥无几。究其原因，菠萝传统育种工作耗时耗力，获得可利用的有效遗传变异、培育新品种的周期长，因此利用诱变技术人工诱发遗传变异是创制新种质、选育新品种的重要手段。

甲基磺酸乙酯(EMS)是目前在作物诱变育种中应用最广泛、应用效果最好的一种化学诱变剂，EMS的诱变效应具有效率高、范围广的特点，较之其它的化学诱变剂，EMS诱变产生点突变的频率较高，染色体畸变相对较少，且多为显性突变体，易于进行突变体的筛选。目前普遍采用EMS处理种子的方法创制突变体，成功先例如水稻(CN105695477A)、小麦(CN109729972A)、油菜(CN110578015A)等，但对于菠萝而言，因其具有自交不亲和特性，一般没有种子，故需选择芽、愈伤组织等其它器官或组织进行EMS诱变处理。目前有关菠萝EMS诱变的相关研究报道十分鲜见，仅有黄俊生等(黄俊生,孔德赛,黄峰.EMS诱变菠萝愈伤组织选择抗性突变体的研究[J],热带作物学报,1995,16(12,增刊):1-6)报道用0.25-0.75％EMS浓度和10h诱变处理时间可以对菠萝愈伤组织进行有效诱变，但其研究止步于细胞水平的抗性筛选，并没有获得突变再生植株，至今也没有其他人开展进一步研究的报道，说明目前的菠萝EMS诱变相关研究存在一定局限性，用于创制突变体的菠萝EMS离体诱变方法体系还需进一步探索并完善。

发明内容

本发明的目的是提供一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法便于多批次大批量进行菠萝EMS诱变，以提高创制获得突变种质的几率，为选育具有经济价值的菠萝新品种以及开展菠萝功能基因研究提供所需的大量突变体。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，包括：

以菠萝叶基、黄化苗茎段为外植体，诱导培养获取愈伤组织，将所述愈伤组织再经增殖继代培养获取离体诱变材料；所述离体诱变材料浸入浓度为0.5～0.8％的EMS溶液中进行诱变处理5～8h，经恢复培养后获取存活的愈伤组织，之后经诱导分化、壮苗与生根、炼苗与移栽以及表型突变筛选，获得菠萝突变体。

优选的是，愈伤诱导培养基包括以下浓度组分：MS+2.0～3.0mg/L 6-BA+2.0～2.5mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D+30.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，愈伤诱导条件为：25～27℃暗培养30～40d。

优选的是，增殖继代培养基包括以下浓度组分：MS+3.0～5.0mg/L 6-BA+1.0～2.0mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，增殖继代培养条件为：25～27℃暗培养20～40d。

优选的是，0.5～0.8％的EMS溶液以0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)为溶剂，EMS溶液配制、诱变处理均在室温、无菌条件下进行，诱变处理期间保持搅拌或振荡状态，诱变结束后用5％硫代硫酸钠溶液处理10～15min以终止反应。

优选的是，恢复培养采用增殖继代培养基，经25～27℃暗培养20d后，对存活的愈伤进行诱导分化；诱导分化培养基包括以下浓度组分：MS+2.0～3.0mg/L 6-BA+1.0mg/LNAA+0～1.0mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，诱导分化条件为：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1200～2000lx，培养温度为25～27℃，培养时间为30～40d。

优选的是，将分化获得的M0群体幼苗转接到增殖继代培养基上进行壮苗培养，待幼苗长至5cm高后转接到生根培养基中诱导生根；其中，生根培养基包括以下浓度组分：1/2MS+2.5～5.0mg/L IBA+0～2.5mg/L NAA+15.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，壮苗与生根培养条件为：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1200～2000lx，培养温度为25～27℃，培养时间为20～30d。

优选的是，移栽育苗基质为：泥炭与蚯蚓粪按照体积比7～9∶1～3混合，加入多菌灵或百菌清粉剂混合均匀制备而成。

优选的是，表型突变包括但不限于叶片失绿、叶片出现条纹或彩带、叶刺变异以及叶形或株型变异等。

本发明公开了以下技术效果：

(1)利用本发明提供的菠萝EMS离体诱变方法，克服了菠萝芽等其它诱变材料受产生条件、数量、种植场地等因素影响的局限性，全年可开展多批次大批量的菠萝EMS离体诱变，大大提高了创制获得菠萝突变体的几率。

(2)利用本发明提供的菠萝EMS离体诱变方法，可以在较短时间内获得多个具有明显表型变异且遗传背景一致的突变个体，并能够通过离体增殖、扩繁的方式较稳定地遗传、保存变异性状，可用于显性遗传突变的创制、重要性状的遗传解析、功能基因的挖掘以及新品系的选育等领域。

(3)利用本发明提供的菠萝EMS离体诱变方法，可以获得完整的EMS诱变再生植株，便于移栽后进行田间表型性状跟踪观测，进一步明确其突变性状。

(4)利用本发明提供的菠萝EMS离体诱变方法，可以获得大量突变体，突变性状包括但不限于叶片失绿、叶片出现条纹(或彩带)、叶刺变异、叶形或株型变异等，有利于创建菠萝突变体库，并开展较大规模的菠萝种质创新，且成本较低，应用性较好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为EMS处理后菠萝愈伤组织的相对转绿率和相对分化率；

图2为菠萝叶片失绿突变体与野生型的对比图，其中A为野生型，B、C、D为叶片失绿突变体；

图3为菠萝叶片条纹突变体与野生型的对比图，其中A为野生型，B、C、D为叶片条纹突变体；

图4为菠萝叶刺突变体与野生型的对比图，其中A为野生型的植株(左)与叶片局部(右，有叶刺)；B为叶刺突变体的植株(左)与叶片局部(右，无叶刺)；

图5为菠萝叶形或株型突变体与野生型的对比图，其中A为野生型，B、C、D、E为叶形或株型突变体。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

下述实施例中，实验材料为菠萝品种‘巴厘’、‘MD-2’(金菠萝)，前者植株、果实均为中等偏小型，叶片有刺，无条纹或彩带；后者植株、果实均为中等，叶片无刺，无条纹或彩带。如未特别说明，下述实施例中所用试剂均为市购，包括：EMS(甲基磺酸乙酯，Sigma)、硫代硫酸钠(西陇)、二水合磷酸二氢钠(沪试)、十二水合磷酸氢二钠(沪试)、MS培养基(百思)、1/2MS培养基(百思)、6-BA(伯奥)、NAA(伯奥)、2,4-D(伯奥)、ZT(索莱宝)、蔗糖(西陇)、卡拉胶(CSBF)。

EMS溶液配制方法：配制0.1mol/L，pH＝7.0的PBS(磷酸缓冲液)，高温灭菌后备用；在超净台内用一次性无菌注射器吸取EMS原液，经0.22μm过滤器过滤灭菌，然后以无菌PBS为溶剂，按v﹕v分别加入一定量的无菌EMS原液，配制成相应浓度的EMS处理液。随配随用。

实施例1利用EMS离体诱变方法创制菠萝突变体

(1)离体诱变材料的获得

以‘MD-2’(金菠萝)的黄化苗茎段为外植体，在愈伤诱导培养基上诱导35d获得愈伤组织，将愈伤组织转接到增殖/继代培养基上增殖/继代培养20～40d，增殖/继代5次后，挑选质量较好的愈伤组织切割成3～5mm³的小块，转入增殖/继代培养基上预培养38d后用作EMS离体诱变材料。愈伤组织诱导、增殖/继代的培养条件均为暗培养，培养温度为25～27℃。

愈伤诱导培养基：MS+3.0mg/L 6-BA+2.5mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D+30.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶(pH调至5.8，下同)；

增殖/继代培养基：MS+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶。

(2)EMS诱变处理

挑选同一批次且生长较为一致的‘MD-2’(金菠萝)愈伤组织，浸入浓度为0.8％的EMS溶液中进行诱变处理，处理时间为5.5小时，期间放置在磁力搅拌器上以2000r/min转速搅拌，处理结束后用5％硫代硫酸钠溶液处理15min以终止反应。

(3)恢复培养

将经过诱变处理后的‘MD-2’(金菠萝)愈伤组织用无菌水冲洗10次，在滤纸上吸干水分后，接种到增殖/继代培养基中恢复培养20天，从中挑选存活的愈伤组织进行分化诱导。恢复培养条件为暗培养，培养温度为25～27℃。

(4)分化诱导

将经恢复培养后存活的愈伤组织转入分化培养基中诱导分化40天，获得M0群体幼苗。分化诱导条件为：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1200～2000lx，培养温度为25～27℃。

分化培养基：MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶。

实施例2

(1)离体诱变材料的获得

以‘巴厘’的幼嫩叶基为外植体，在愈伤诱导培养基上诱导30d获得愈伤组织，将愈伤组织转接到增殖/继代培养基上增殖/继代培养20～40d，增殖/继代3次后，挑选质量较好的愈伤组织切割成3～5mm³的小块，转入增殖/继代培养基上预培养22d后用作EMS离体诱变材料。愈伤组织诱导、增殖/继代的培养条件均为暗培养，培养温度为25～27℃。

愈伤诱导培养基：MS+2.0mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D+30.0g/L蔗糖+7.5g/L卡拉胶；

增殖/继代培养基：MS+3.5mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+7.5g/L卡拉胶。

(2)EMS诱变处理

挑选同一批次且生长较为一致的‘巴厘’愈伤组织，浸入浓度为0.6％的EMS溶液中进行诱变处理，处理时间为6小时，期间放置在磁力搅拌器上以1800r/min转速搅拌，处理结束后用5％硫代硫酸钠溶液处理12min以终止反应。

(3)恢复培养

将经过诱变处理后的‘巴厘’愈伤组织用无菌水冲洗8次，在滤纸上吸干水分后，接种到增殖/继代培养基中恢复培养20天，从中挑选存活的愈伤组织进行分化诱导。恢复培养条件为暗培养，培养温度为25～27℃。

(4)分化诱导

将经恢复培养后存活的愈伤组织转入分化培养基中诱导分化35天，获得M0群体幼苗。分化诱导条件为：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1200～2000lx，培养温度为25～27℃。

分化培养基：MS+2.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+7.5g/L卡拉胶。

实施例3

(1)离体诱变材料的获得

以‘MD-2’(金菠萝)的幼嫩叶基为外植体，在愈伤诱导培养基上诱导40d获得愈伤组织，将愈伤组织转接到增殖/继代培养基上增殖/继代培养20～40d，增殖/继代3次后，挑选质量较好的愈伤组织切割成3～5mm³的小块，转入增殖/继代培养基上预培养21d后用作EMS离体诱变材料。愈伤组织诱导、增殖/继代的培养条件均为暗培养，培养温度为25～27℃。

愈伤诱导培养基：MS+2.5mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D+30.0g/L蔗糖+8.0g/L卡拉胶；

增殖/继代培养基：MS+5.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+8.0g/L卡拉胶。

(2)EMS诱变处理

挑选同一批次且生长较为一致的‘MD-2’(金菠萝)愈伤组织，浸入浓度为0.6％的EMS溶液中进行诱变处理，处理时间为6小时，期间放置在磁力搅拌器上以2000r/min转速搅拌，处理结束后用5％硫代硫酸钠溶液处理15min以终止反应。

(3)恢复培养

将经过诱变处理后的‘MD-2’(金菠萝)愈伤组织用无菌水冲洗10次，在滤纸上吸干水分后，接种到增殖/继代培养基中恢复培养20天，从中挑选存活的愈伤组织进行分化诱导。恢复培养条件为暗培养，培养温度为27℃。

(4)分化诱导

将经恢复培养后存活的愈伤组织转入分化培养基中诱导分化30天，获得M0群体幼苗。

分化培养基：MS+3.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+1.0mg/L ZT+30.0g/L蔗糖+8.0g/L卡拉胶。

分化培养30～40d后，对本发明实施例1～3和对比例1～3中经EMS诱变处理的菠萝愈伤组织的转绿率和分化率进行统计，并计算其相对转绿率和相对分化率，计算公式如下：

相对转绿率(％)＝实施例(或对比例)转绿率/实施例(或对比例)对照转绿率×100；

相对分化率(％)＝实施例(或对比例)分化率/实施例(或对比例)对照分化率×100。

对比例1

与实施例2的区别在于：‘巴厘’离体诱变材料的预培养时间为20d；EMS处理浓度为0.4％，处理时间为4.0h；其余步骤均相同。

对比例2

与实施例2的区别在于：‘巴厘’离体诱变材料的预培养时间为25d；EMS处理浓度为0.8％，处理时间为4.0h；其余步骤均相同。

对比例3

与实施例1的区别在于：‘MD-2’(金菠萝)离体诱变材料的预培养时间为20d；EMS处理浓度为0.4％，处理时间为8.0h；其余步骤均相同。

结果如图1所示，实施例1～3的相对转绿率和相对分化率均显著低于对比例1～3。3个实施例的平均相对转绿率为72.37％，平均相对分化率为54.11％，说明实施例所采用的EMS浓度和处理时间较为适宜；3个对比例的平均相对转绿率为92.95％，平均相对分化率为83.65％，与对照相比降幅不大，尤其相对分化率远高于50％，说明对比例所采用的EMS浓度与处理时间的组合并非获得较理想的EMS诱变效果所需的适宜条件。

将上述实施例1～3以及对比例1～3分化得到的M0群体幼苗继续进行如下培养：

(1)壮苗与生根

将分化获得的M0群体幼苗转接到增殖/继代培养基上进行壮苗培养，待幼苗长至5cm高后转接到生根培养基上诱导生根。

生根培养基：1/2MS+2.5～5.0mg/L IBA+0～2.5mg/L NAA+15.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶。(优选1/2MS+3.0mg/L IBA+2.0mg/L NAA+15.0g/L蔗糖+7.0g/L卡拉胶)。

(2)炼苗与移栽

将生根幼苗在自然光温环境中炼苗1周，取出洗去附在根上的培养基，移栽到装有育苗基质的21孔穴盘或10cm小方盆中，缓苗1～2周后移入温室中培养，待苗达到出圃标准后换大盆移栽或定植到大田中。

育苗基质配制方法：将泥炭和蚯蚓粪按照泥炭∶蚯蚓粪(V∶V)＝7～9∶1～3的比例配制，加入适量多菌灵粉剂混合均匀而成。

(3)表型观测与突变体筛选

从愈伤组织分化出苗开始，对M0群体的表型进行跟踪观测，从中筛选具有表型变异的突变单株，获得菠萝EMS突变群体。

对实施例1～3和对比例1～3中由EMS诱变产生的明显表型变异的类型及其数量进行统计，变异率以各变异类型的数量占EMS处理总数的百分比表示，结果见表1。

表1EMS诱变产生的明显表型变异的类型及其变异率

从表1可以看出，利用本发明的EMS离体诱变方法，可以获得较多的明显表型变异类型以及较高的变异率。菠萝愈伤组织经过EMS诱变后出现的明显表型变异类型一般包括叶片失绿(图2)、叶片条纹(或彩带)(图3)、叶刺变异(图4)、叶形或株型变异(图5)等，实施例1～3获得的明显表型变异基本涵盖了上述类型，合计变异率平均为3.73％；对比例1～3获得的明显变异类型则相对较少，合计变异率平均仅为0.85％；实施例的变异率约为对比例的4倍。具体以实施例、对比例中合计变异率最高的实施例2、对比例1为例，虽然二者均以预培养20d左右的巴厘愈伤组织为诱变材料，但在不同EMS浓度和处理时间组合的诱变条件下，二者的诱变效果差异明显：实施例2共诱变处理313个愈伤，获得的明显表型变异个体数为13个，其中叶片失绿变异率2.56％，叶片条纹变异率0.32％，叶刺变异率0.32％，叶形变异率0.64％，株型变异率0.32％，合计变异率4.16％；对比例1共诱变处理210个愈伤，获得的明显表型变异个体数为2个，其叶片失绿变异率为0.48％，叶形变异率0.48％，合计变异率0.96％。

综上，本发明的EMS离体诱变方法有利于获取大量菠萝离体诱变材料、开展多批次大批量的菠萝离体诱变，并提供合理的诱变条件诱导菠萝产生较为丰富的性状变异，且变异率较高，是创制菠萝突变体的适宜方法。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，其特征在于，包括：

以菠萝叶基、黄化苗茎段为外植体，诱导培养获取愈伤组织，将所述愈伤组织经增殖继代培养获取离体诱变材料；所述离体诱变材料浸入浓度为0.5～0.8％的EMS溶液中进行诱变处理5～8h，经恢复培养后获取存活的愈伤组织，之后经诱导分化、壮苗与生根、炼苗与移栽以及表型突变筛选，获得菠萝突变体。

2.如权利要求1所述的创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，其特征在于，愈伤诱导培养基包括以下浓度组分：MS+2.0～3.0mg/L 6-BA+2.0～2.5mg/L NAA+0.5mg/L2,4-D+30.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，愈伤诱导条件为：25～27℃暗培养30～40d。

3.如权利要求1所述的创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，其特征在于，增殖继代培养基包括以下浓度组分：MS+3.0～5.0mg/L 6-BA+1.0～2.0mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，愈伤增殖继代培养条件为：25～27℃暗培养20～40d。

4.如权利要求1所述的创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，其特征在于，诱变处理期间保持搅拌或振荡状态，诱变结束后用5％硫代硫酸钠溶液处理10～15min以终止反应。

5.如权利要求1所述的创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，其特征在于，恢复培养采用增殖继代培养基，经25～27℃暗培养20d后，对存活的愈伤进行诱导分化；诱导分化培养基包括以下浓度组分：MS+2.0～3.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+0～1.0mg/LZT+30.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，诱导分化培养条件为：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1200～2000lx，培养温度为25～27℃，培养时间为30～40d。

6.如权利要求1所述的创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，其特征在于，将分化获得的M0群体幼苗转接到增殖继代培养基上进行壮苗培养，待幼苗长至5cm高后转接到生根培养基中诱导生根；其中，生根培养基包括以下浓度组分：1/2MS+2.5～5.0mg/L IBA+0～2.5mg/L NAA+15.0g/L蔗糖+7.0～8.0g/L卡拉胶，壮苗与生根培养条件为：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1200～2000lx，培养温度为25～27℃，培养时间为20～30d。

7.如权利要求1所述的创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，其特征在于，移栽育苗基质为：泥炭与蚯蚓粪按照体积比7～9∶1～3混合，加入多菌灵或百菌清粉剂混合均匀制备而成。

8.如权利要求1所述的创制菠萝突变体的EMS离体诱变方法，其特征在于，表型突变包括叶片失绿、叶片出现条纹或彩带、叶刺变异、叶形或株型变异。