MX2010011938A

MX2010011938A - Vacuna para toxina bacteriana.

Info

Publication number: MX2010011938A
Application number: MX2010011938A
Authority: MX
Inventors: Kazutoshi Sawada; Kazuya Yoshida; Takeshi Matsui
Original assignee: Idemitsu Kosan Co
Priority date: 2008-05-02
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2010-12-01
Also published as: CN102016034B; JP5360727B2; ES2691985T3; US8846052B2; KR101540496B1; DK2287300T3; ES2686780T3; DK2728004T3; AR071232A1; JPWO2009133882A1; US20110231960A1; EP2728004A3; EP2287300A1; TWI460270B; CN103626876B; EP2287300A4; EP2287300B1; WO2009133882A1; CN103626876A; KR20110009197A

Abstract

El objetivo se dirige a producir una proteína de toxina bacteríana tal como la proteína de toxina Shiga con alta eficiencia al utilizar una célula de planta. Una proteína de toxina bacteriana tal como la proteína de toxina Shiga se puede producir en una célula de planta al transformar la célula de planta con una construcción de DNA que comprende DNA que codifica una proteína híbrida compuesta de proteínas de toxina bacteriana enlazadas en tándem por la vía de un péptido que tiene cualquiera de las siguientes propiedades características (A) y (B) : (A) el número de residuos de aminoácidos es 12 a 30; y (B) el contenido de prolina es 20 a 35%.

Description

VACUNA PARA TOXINA BACTERIANA Campo Técnico La presente invención se relaciona a una proteina híbrida utilizada para vacunas para enfermedades causadas por toxinas bacterianas tales como toxinas Shiga, toxinas de cólera y toxinas termo-inestables de Escherichia coli, y una construcción de DNA para producir la proteína híbrida.

Técnica Antecedente Las toxinas Shiga (Stxs, verotoxinas) son exotoxinas proteínicas producidas por Escherichia coli enterohemorrágica de especies de Escherichia coli patogénicas. Las toxinas Shiga causan enteritis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico, encefalopatía y los similares.

Las toxinas Shiga se clasifican ampliamente en Stxl y Stx2, cada una de las cuales además se clasifica en subclases. Un ejemplo de la Stx2 incluye Stx2e que causa enfermedad de edema de los cerdos. La enfermedad de edema de los cerdos se conoce que ocurre frecuentemente en cerdos pequeños de una o dos semanas después del destetamiento . Una fatalidad debido a la infección con la bacteria de la enfermedad de edema es de 50 a 90%, que es extremadamente alta.

Además, las toxinas de cólera (CTs) son exotoxinas proteínicas producidas por Vibrio cholerae. Las CTs se conocen que causan diarrea severa y emesis.

Todavía adicionalmente, las toxinas termo-inestables (LTs) de Escherichia coli son endotoxinas proteinicas producidas por Escherichia coli enterotoxigénica . Las LTs se conocen que causan diarrea y emesis.

Las toxinas bacterianas, Stxs, LTs y CTs todas se' conocen que incluyen un pentámero de subunidad B involucrado en la adhesión a las células y un monómero de subunidad A que tiene una toxicidad. Las LTs y la CTs también se conocen que son estructuralmente y funcionalmente similares.

Como un método para prevenir las enfermedades causadas por esas toxinas bacterianas, se conocen métodos de administración de una vacuna por una inyección o un rocío nasal y la administración de la vacuna oralmente.

Por ejemplo, se conoce una tecnología donde una proteína Stx2e atenuada se produce utilizando Escherichia coli recombinante y se administra a los cerdos por una inyección (Documento no de Patente 1) . Sin embargo, por ejemplo, una cantidad de la proteína Stx2e atenuada producida por la Escherichia coli recombinante no es suficiente y la administración de la vacuna por una inyección requiere trabajo humano. Esto ha sido un problema.

Además, el método de administración de la vacuna oralmente atrae atención incrementada en términos de reducir el trabajo en un campo criadero de ganado. En tal contexto, una tecnología donde la proteína de toxina bacteriana se produce por las plantas utilizando una tecnología transgénica ha estado siendo desarrollada. Por ejemplo, se ha descrito una planta transgénica que contiene DNA que codifica una subunidad B de proteína LT (LTB) y que expresa el DNA (Documentos de Patente 1 y 2) . También se ha descrito una planta transgénica que expresa DNA que codifica la proteína LT o la proteína CT (Documento de Patente 3) . Sin embargo, ha existido un problema de que la cantidad de la proteína producida no es suficiente en esas tecnologías. Se ha reportado un ejemplo de producción de la LTB en Lactuca sativa (Documento no de Patente 2) . En este estudio, un gen de la subunidad B de proteína LT que incluye codones modificados se expresa en la Lactuca sativa utilizando tanto un promotor de RNA 35S de virus de mosaico de coliflor (CaMV35S) que es un promotor expresado altamente en una planta y la secuencia Kozak que es un aumentador. -Como resultado, se ha reportado que la subunidad B de proteína LT se acumula en una cantidad de aproximadamente 2.0% en masa de una proteína soluble total de la Lactuca sativa. Sin embargo, este grado de la proteína acumulada -se cree que es insuficiente para prevenir de manera eficiente una enfermedad bacteriana al utilizar la planta transgénica. Esto es, es necesario producir eficientemente y acumular la proteína de toxina bacteriana objetivo en células de planta.

Los inventores de la presente invención encontraron que la proteina Stx2e podría ser producida eficientemente en una planta tal como la Lactuca sativa y acumulada en una alta concentración en el cuerpo de la planta al expresar la proteína Stx2e donde se ha adicionado un péptido de señal secretoria derivado de una planta a su amino terminal, utilizando una región 5' -no traducida (ADH 5'-UTR) de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta, y presentaron la Patente (Documento de Patente 4).

[Documento de Patente 1] JP 10-507916 A [Documento de Patente 2] JP 2000-166411 A [Documento de Patente 3] JP 2002/533068 A [Documento de Patente 4] O 2009/004842 Al [Documento no de Patente 1] Makino y colaboradores, Microbial Pathogenesis , Volumen 31, Número 1, Julio 2001, pp . 1-8(08) [Documento no de Patente 2] Kim y colaboradores, Protein Expression and Purification, Volumen 51, Número 1, Enero 2006, pp. 22-27 (06) .' Breve Descripción de la Invención Es un objetivo de la presente invención producir más eficientemente una proteína Stx y otras proteínas de toxina bacteriana que tienen una conformación similar a la misma utilizando células de planta.

A través de la producción de una proteína híbrida en la cual dos o tres proteínas de toxina bacteriana tales como Stx2e y CT se enlazan en tándem a través de un péptido que tiene una secuencia particular en células de planta, los inventores de la presente invención han conseguido acumular la proteina de toxina bacteriana en una alta concentración en las células de planta y completaron la presente invención.

La presente invención es como sigue. (1) una proteina híbrida, en la cual dos o tres de proteínas de toxina Shiga, proteínas de toxina de cólera o proteínas de toxina termo-inestable de Escherichia coli cada una se enlazan en tándem a través de un péptido que tiene las siguientes características (A) y (B) : (A) el número de aminoácidos es 12 a 30; y (B) el contenido de prolina es 20 a 35%; (2) la proteína híbrida de acuerdo con el Párrafo (1), en la cual el péptido además tiene la siguiente característica (C) : (C) la prolina es distribuida cada dos o tres aminoácidos ; (3) la proteína híbrida de acuerdo con el Párrafo (2), en la cual el péptido tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 82 u 84; (4) la proteína híbrida de acuerdo con el , Párrafo (3) , en la cual dos de las proteínas de toxina Shiga, proteínas de toxina de cólera o proteínas de toxina termo-inestable de Escherichia coli se enlazan en tándem a través del péptido -que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2; (5) la proteína híbrida de acuerdo con cualquiera de los Párrafos (1) a (4), en la cual las proteínas de toxina Shiga son subunidades B de proteína de toxina Shiga; (6) la proteína híbrida de acuerdo con cualquiera de los Párrafos (1) a (5), en la cual las proteínas de toxina Shiga son proteínas Stx2e, (7) la proteína híbrida de acuerdo con cualquiera de los Párrafos (1) a (4), en la cual las proteínas de toxina de cólera son subunidades B de proteína de toxina de cólera; (8) la proteína híbrida de acuerdo con el Párrafo (4), que incluye una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10, 12, 14 "o 16; (9) la proteína híbrida de acuerdo con el Párrafo (3), que incluye una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 o 100; (10) la proteína híbrida de acuerdo con cualquiera de los Párrafos (1) a (9), en la cual un péptido de señal secretoria derivado de una planta se adiciona a su amino terminal; (11) la proteína híbrida de acuerdo con el Párrafo (10), en la cual un - péptido de señal de retención de retículo endoplásmico se adiciona a su carboxilo terminal; (12) la proteína hí-brida de acuerdo con cualquiera de los Párrafos (1) a (9), en la cual un péptido de señal de transito de cloroplasto se adiciona a su amino terminal; (13) una construcción de DNA, que incluye DNA que codifica la proteina híbrida de acuerdo con cualquiera de los Párrafos (1) a (12); (14) la construcción de DNA de acuerdo con el Párrafo (13), que incluye DNA que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 9, 11, 13 o 15; (15) la construcción de DNA de acuerdo con el Párrafo (13), que incluye DNA que incluye una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 85, 87, 89, 91, 93 95, 97 o 99; (16) la construcción de DNA de acuerdo con cualquiera de los Párrafos (13) a (15), en la cual el DNA que codifica una proteína híbrida se enlaza operablemente ' a una región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta; (17) la construcción de DNA de acuerdo con el Párrafo (16), en la cual la región 5' -no traducida del gen de alcohol deshidrogenasa derivado de la planta se deriva de Nicotiana tabacum; (18) una construcción de DNA de acuerdo con el Párrafo (17), que incluye una secuencia de bases representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 24 a 29; (19) una construcción de DNA de acuerdo con el Párrafo (17), que incluye una secuencia de bases representada por cualquiera de las SEQ. ID NOS: 101 a 111; (20) un vector recombinante, que incluye la construcción de DNA de acuerdo con cualquiera de los Párrafos (13) a (19); (21) un transformante transformado con el vector recombinante de acuerdo con el Párrafo (20); (22) un transformante de acuerdo con el Párrafo (21), en el cual el transformante es una célula de planta transformada o una planta transformada; \ (23) - una semilla, que se obtiene del transformante de acuerdo con el Párrafo (21) o (22); y (24) un péptido, que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, 82 u 84.

Breve Descripción de los Dibujos En los dibujos acompañantes: La FIG. 1 es una vista que ilustra un diseño de los vectores de expresión de Stx2eB, en la cual una flecha denota un sitio de iniciación de traducción, y un triángulo invertido denota un sitio que es segmentado después de la transducción; La FIG. 2 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulada obtenida en un experimento de expresión transiente utilizando protoplastos de Lactuca sativa; La FIG. 3 es una fotografía que ilustra los niveles de CTB acumulada obtenida en un experimento de expresión transiente utilizando los protoplastos de Lactuca sativa; La FIG. 4 es una vista que ilustra un diseño de construcciones de DNA que codifican una proteína de fusión Stx2eB-YFP en la cual una flecha denota un sitio de iniciación de transducción, y un triángulo invertido denota un sitio que es segmentado después de la traducción; La FIG. 5 es una fotografía que ilustra la localización de la proteína de fusión Stx2eB-YFP obtenida en un experimento de expresión transiente utilizando protoplastos de célula de tabaco cultivados; La FIG. 6 es una fotografía que ilustra la localización de la proteína de fusión Stx2eB-YFP obtenida en un experimento de expresión transiente utilizando los protoplastos de célula de tabaco cultivados; La FIG. 7 en una fotografía que ilustra la localización de la GFP de tipo vacuola y la proteína de fusión de Stx2eB-YFP en co-expresión de ARFlp T y ARFlpDN obtenido en un experimento de expresión transiente utilizando los protoplastos de célula de tabaco cultivados; La FIG. 8 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulada obtenida en un experimento de transformación utilizando las células de tabaco cultivadas (BY2) , en la cual un número en cada franja denota un número de clon; La FIG. 9 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulada obtenida en un experimento de transformación utilizando las células de tabaco cultivadas (BY2), en la cual un número en cada franja denota el número de clon; La FIG. 10 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulada obtenida en un experimento de transformación utilizando las células de tabaco cultivadas (BY2) , en la cual el número en cada franja denota el número de clon; La FIG. 11 es una gráfica que ilustra los niveles de Stx2eB acumulada obtenida en un experimento de transformación utilizando las células de tabaco cultivadas (BY2), en la cual cada número denota el número de clon; La FIG. 12 es una gráfica que ilustra una relación entre los niveles de mRNA de la Stx2eB y los niveles de Stx2eB acumulada; La FIG. 13 es una vista que ilustra el diseño de construcciones de DNA que codifican Stx2eB, en el cual A, B y C denotan los diseños de un tipo de retículo endoplásmico, un tipo de citoplasma y un tipo de cloroplasto de las construcciones de DNA, respectivamente; La FIG. 14 es una vista que ilustra el diseño de las construcciones de DNA que codifican CTB, en la cual A, B y C denotan los diseños de un tipo de retículo endoplásmico, un tipo de citoplasma y un tipo de cloroplasto de las construcciones de DNA, ' respectivamente; La FIG. 15' es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulada obtenida en un experimento de expresión transiente utilizando los protoplastos de Lactuca sativa; La FIG. 16 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulada obtenidos en un experimento de expresión transiente utilizando los protoplastos de Lactuca sa tiva ; La FIG. 17 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulada obtenida en un experimento de transformación 'Utilizando las células de tabaco cultivadas (BY2) , en el cual el número en cada franja denota el número de clon; La FIG. 18 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulada obtenida en un experimento de transformación utilizando un cuerpo de planta de tabaco, en la cual el número en cada franja denota el número de clon; La FIG. 19 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulada obtenida en un experimento de transformación utilizando el cuerpo de planta de tabaco, en la cual el número en cada franja denota el número de clon; La FIG. 20 es una vista que ilustra el diseño de las construcciones de DNA que codifican Stx2eB; La FIG. 21 es una vista que ilustra el diseño de las construcciones de DNA que codifican CTB; La FIG. 22 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulada obtenida en un experimento de transformación utilizando la células de tabaco cultivadas ( BY2 ) ; y La FIG. 23 es una fotografía que ilustra los niveles de CTB acumulada obtenida en un experimento de transformación utilizando las células de tabaco cultivadas (BY2) .

Descripción de las Modalidades En una proteína híbrida de la presente invención, dos o tres de proteínas de toxina Shiga (Srx) , proteínas de toxina de cólera (CT) o proteínas de toxina termo-inestable (LT) de Escherichia coli cada una se enlazan en tándem a través de un péptido que tiene las siguientes características (A) y (B) : (A) el número de aminoácidos es 12 a 30; y (B) el contenido de prolina es 20 a 35%; Las toxinas Shiga (Stxs) se clasifican en tipo 1 (Stxl) y tipo 2 (Stx2) . La Stxl además se clasifica en subclases a a d, y la Stx2 además se clasifica en subclases a a g, respectivamente. La toxina Shiga incluye una subunidad A que es un cuerpo principal de toxina y cinco subunidades B involucradas en la invasión en la mucosa intestinal.

De esas, por ejemplo, Stx2e se conoce como una toxina de enfermedad de edema de cerdos, y su subunidad A (Stx2eA) se representa por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y su subunidad B (Stx2eB) se representa por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

En Stx2eA y Stx2eB, uno o varios aminoácidos pueden ser sustituidos, suprimidos, insertados o adicionados en las secuencias de aminoácidos representadas por la SEQ ID NO: 4 o 6 mientras que puedan causar una respuesta inmune mediante_ la administración a los cerdos. Por ejemplo, el término "varios" significa el número de preferencia de 2 a 30, más de preferencia de 2 a 20, y todavía más de preferencia de 2 a 10, en Stx2eA, y significa el número de preferencia de 2 a 10, más de preferencia de 2 a 5, y todavía más de preferencia de 2 a 3, en Stx2eB.

Además, Stx2eA y Stx2eB pueden ser aquellas que tienen una identidad de preferencia 85% o más, más de preferencia 90% o más, y todavía más de preferencia 95% o más a las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: ' 4 y 6 y que son capaces de causar la respuesta inmune mediante la administración al cerdo.

La toxina de cólera (CT) incluye una subunidad A (CTA) que es el cuerpo principal de la toxina y cinco subunidades B (CTB) representadas por la SEQ ID NO: 8 e involucradas en la invasión en la -mucosa intestinal.

En CTB, uno o varios aminoácidos pueden ser substituidos, suprimidos, insertados o adicionados en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8 mientras que CTB pueda causar la repuesta inmune mediante la administración a los animales. El término "varios" significa de preferencia de 2 a 10, más de preferencia 2 a 5, y todavía más de preferencia 2 a 3.

Además, CTB puede ser aquellas que tienen una identidad de preferencia 85% o más, más de preferencia 90% o más, y todavía más de preferencia 95% o más a la secuencia de aminoácidos representadas por la SEQ ID NO: 8, y que es capaz de causar la respuesta inmune mediante la administración a los animales.

La proteína de toxina termo-inestable (LT) de Escherichia coli incluye una subunidad A que es el cuerpo principal de la toxina y cinco subunidades involucradas en la invasión en la mucosa intestinal.

La toxina Shiga, la toxina de cólera y la toxina termo-inestable de Escherichia coli también son colectivamente referidas como "toxinas bacterianas" en la presente.

El número de los aminoácidos en el péptido es de preferencia 12 a 25 y más de preferencia 12 a 22. El contenido de prolina en el péptido es de preferencia 20 a 27% y más de preferencia 20 a 25%.

Además, la prolina se distribuye de preferencia cada dos o tres residuos en el péptido. Pero, en este caso, los aminoácidos diferentes a prolina pueden ser consecutivos dentro de 5 residuos y de preferencia 4 residuos en la terminal del péptido.

Además, el contenido total de serina, glicina, arginina, lisina, treonina, glutamina, asparagina, histidina y ácido aspártico en los aminoácidos diferentes a la prolina es de preferencia 70% o más, más de preferencia 80% o más, y todavía más de preferencia 90% o más en el péptido. Además, en contenido total de serina, glicina y asparagina en los aminoácidos diferentes a la prolina es de preferencia 70% o más, o más de preferencia 80% o más, y todavía más de preferencia 90% o más en el' péptido. Todavía adicionalmente, el contenido total de serina y glicina en los aminoácidos diferentes a la prolina es de preferencia 70% o más, más de preferencia 80% o más, y todavía más de preferencia 90% o más en el péptido. Esto es debido a que el péptido que contiene esos aminoácidos abundantemente es difícil que forme una estructura secundaria (estructura de ß-lámiña y estructura de hélice) .

.Mientras tanto, el contenido total de alanina, metionina y ácido glutámico en los aminoácidos diferentes a la prolina es de preferencia 30% o menos, más de preferencia 20% o menos y' todavía más de preferencia 10% o menos en el péptido. Esto es debido a que el péptido que contiene esos aminoácidos abundantemente fácilmente forma la estructura de hélice. El contenido total de triptofano, leucina, isoleucina, tirosina, fenilalanina y valina en los aminoácidos diferentes a la prolina e,s de preferencia 20% o menos, más de preferencia 10% o . menos y todavía más de preferencia 5% o menos en el péptido. Esto es debido a. que el péptido que contiene esos aminoácidos de manera abundante fácilmente forma la estructura de ß-lámina y la estructura de hélice.

El péptido de preferencia se selecciona del péptido (PG12) que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, el péptido (PG17) que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82 y el péptido (PG22) que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8 .

En la proteína híbrida de la presente invención, dos o tres proteínas híbridas de la subunidad A y la subunidad B se pueden enlazar en tándem a través del péptido anterior, o dos o tres subunidades A se pueden enlazar en tándem a través del péptido, o dos o tres subunidades B se pueden enlazar en tándem a través del péptido. Cuando la proteína híbrida contiene la subunidad A, la subunidad A de preferencia es atenuada. En la proteína híbrida de la presente invención, de preferencia dos o tres subunidades B se enlazan en tándem a través del péptido. En la proteína híbrida de la presente invención, de preferencia dos subunidades B se enlazan en tándem a través de PG12.

Además, en la proteína híbrida de¦ la presente invención, el péptido de preferencia se adiciona a su C terminal. PG12 particularmente de preferencia se adiciona a su C terminal en la proteína híbrida de la presente invención .

La proteína híbrida de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 y 100, por ejemplo. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10, dos St'x2eBs se enlazan en tándem a través de PG12. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12, dos CTBs se enlazan en tándem a través de PG12. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 14, dos Stx2eBs se enlazan en tándem a través de PG12 y además PG12 se enlaza al C terminal de la misma. En la proteína híbrida que tiene. la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 16, dos CTBs se enlazan en tándem a través de PG12 y además PG12 se enlaza al C terminal de la misma. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 86, tres Stx2eBs cada una se enlazan en tándem a través de PG12. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 88, tres Stx2eBs cada una se enlazan en tándem a través de PG12 y además PG12 se enlaza al C terminal de la misma. En la proteina híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 90, dos Stx2eBs se enlazan en tándem a través de PG17 y además PG12 se enlaza al C terminal de la misma. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 92, dos Stx2eBs se enlazan en tándem a través de PG22 y además PG12 se enlaza al C terminal de la misma. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 94, tres CTBs cada una se enlazan en tándem a través de PG1.2. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 96, tres CTBs cada una se enlazan en tándem a través de PG12 y además PG12 se enlaza al C terminal de la misma. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 98, dos CTBs se enlazan en tándem a través de PG17 y además PG12 se enlaza al C terminal de la misma. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 100, dos CTBs se enlazan en tándem a través de PG22 y además PG12 se enlaza al C terminal de la misma.

Al utilizar el péptido tal como PG12, PG17 o PG22 como un enlazador para enlazar las proteínas de toxina bacteriana, se incrementa el nivel de la proteína de toxina bacteriana acumulada en la célula de planta.

En la proteína híbrida de la presente invención, un péptido de señal secretoria derivado de una planta o un péptido de señal de transito de cloroplasto de preferencia se adiciona a su amino terminal. Aquí, el termino "adición" es un concepto que incluye tanto el caso donde el péptido de señal secretoria se enlaza directamente al amino terminal de las dos o tres proteínas de toxina bacteriana enlazadas a través del péptido como el caso donde el péptido de señal secretoria se enlaza a la misma a través de otro péptido.

El péptido de señal secretoria se deriva de preferencia de una planta que pertenece a la familia Solanaceae, Brassicacae o Asteraceae, además de preferencia una planta que pertenece al género Nicotiana, Arabidopsis, Lactuca, etc., y más de preferencia Nicotiana tabacum o Arabidopsis thaliana, Lactuca sativa, etc.

Por otra parte, de preferencia se deriva de una ß- D-glucan exohidrolasa de Nicotiana tabacum o una peroxidasa de 38-kDa de Nicotiana tabacum (GenBank Acceso D42064).

Un ejemplo del péptido de señal secretoria incluye un péptido que se deriva de una ß-D-glucan exohidrolasa de Nicotiana tabacum y tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 18.

Un ejemplo del péptido de señal de tránsito de cloroplasto incluye un péptido de señal de tránsito de cloroplasto (péptido de tránsito, T.P., SEQ ID NO: 79) derivado de Lactuca sativa Rbcs (subunidad pequeña de Rubisco) (GenBank Acceso D14001). Una secuencia de bases de DNA que · codifica el péptido de señal de tránsito de cloroplasto derivado de Lactuca sativa Rbcs es representada por la SEQ ID NO: 80. En la presente, la proteína híbrida que incluye el péptido de señal de tránsito de cloroplasto adicionado a su amino terminal también es referido como una proteína híbrida de tipo cloroplasto (Chl), y una construcción de DNA que codifica la proteína híbrida de tipo cloroplasto (Chl) también es referida como una construcción de DNA de tipo cloroplasto. La proteína híbrida de tipo cloroplasto eficientemente se acumula particularmente en una planta cuyo cloroplasto es desarrollado bien tal como Nicotiana tabacu .

La proteína híbrida en la cual ni el péptido de señal secretoria ni la proteína de señal de tránsito de cloroplasto se adiciona a su amino terminal es referida como una proteína híbrida de tipo citoplasma (Cyt) , y la construcción de DNA que codifica la proteína híbrida de tipo citoplasma es referida como una construcción de DNA de tipo citoplásmico . En la proteína híbrida de tipo citoplasma, particularmente de preferencia tres subunidades B de proteína de toxina bacteriana se enlazan en tándem a través del péptido.

En la proteína híbrida de la presente invención, el péptido de señal tal como un péptido de señal de retención de retículo endoplásmico y un péptido de señal de transporte vacuolar se puede adicionar a su carboxilo terminal. Aquí, el termino "adición" es el concepto que incluye tanto el caso donde el péptido de señal se enlaza directamente al carboxilo terminal de la proteína híbrida como el caso donde el péptido de señal se enlaza a la misma a través de otro péptido. En la presente, la proteína híbrida en la cual el péptido de señal secretoria se adiciona a su amino terminal y el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico se adiciona al carboxilo terminal también es referida como una proteína híbrida de tipo retículo endoplásmico (ER) , y la construcción de DNA que codifica la proteína híbrida de tipo retículo endoplásmico también es referida como una construcción de DNA de tipo retículo endoplásmico. La proteína híbrida de tipo retículo endoplásmico eficientemente se acumula particularmente en una planta tal como la Lactuca sativa.

En la proteína híbrida de la presente invención, el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico de preferencia se adiciona a su carboxilo terminal. Ejemplos del péptido de señal de retención de retículo endoplásmico incluyen un péptido de señal de retención de retículo endoplásmico que incluye la secuencia KDEL (SEQ ID NO: 19), secuencia HDEL (SEQ ID NO: 20), secuencia KDEF (SEQ ID NO: 21) o secuencia HDEF (SEQ ID NO: 22).

El péptido de señal de transporte vacuolar se deriva de referencia de una planta que pertenece a la familia Solanaceae, Brassicaceae o Asteraceae, además de preferencia una planta que pertenece al género Nicotiana , Arabidopsis, Lactuca, etc., y más de preferencia Nicotiana tabacum o Arabidopsis thaliana , Lactuca sativa, etc. Además, el péptido es de preferencia derivado de una quitinasa. La secuencia de aminoácidos de un péptido de señal de transporte vacuolar derivado de una quitinasa de tabaco se representa por la SEQ ID NO: 76. Mientras tanto, la secuencia de bases de DNA que codifica un péptido de señal de transporte vacuolar derivado de una quitinasa de tabaco se representa por la SEQ ID NO: 75, por ejemplo.

Por otra parte, el péptido de preferencia se deriva de una isozima Cía de peroxidasa de rábano picante. La secuencia de aminoácidos de un péptido de señal de transporte vacuolar derivado de una isozima Cía de peroxidasa de rábano picante se representa por la SEQ ID NO: 78. Mientras tanto, la secuencia de bases de DNA que codifica un péptido de señal de transporte vacuolar derivado de una isozima Cía de peroxidasa de rábano picante se representa por la SEQ ID NO: 77, por ejemplo. En la presente, la proteina híbrida en la cual en péptido de señal secretoria se adiciona a su amino terminal, y el péptido de señal de transporte vacuolar se adiciona su carboxilo terminal también es referida como una proteína híbrida de tipo vacuola (Vac) , y una construcción de ? DNA que codifica la proteina híbrida de tipo vacuola también es referida como una construcción de DNA de tipo vacuola.

La proteína híbrida de la presente invención se puede sintetizar químicamente, o se puede producir mediante ingeniería genética. Un método de producción mediante la ingeniería genética se describe posteriormente.

La construcción de DNA de la presente invención se caracteriza por contener DNA que codifica la proteína híbrida de la presente invención.

Esto es, la construcción de DNA de la presente invención incluye DNA en el cual los DNAs que codifican las dos o tres proteínas de toxina bacteriana se enlazan en tándem a través del DNA que codifica el péptido. El DNA que codifica el péptido es representado mediante, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 (PG12), SEQ ID NO: 81 (PG17), SEQ ID NO: 83 (PG22) . Ejemplos, del DNA que codifica la proteína, de toxina bacteriana incluyen el DNA (SEQ ID NO: 3) que codifica Stx2eA, DNA (SEQ ID NO: 5) que codifica Stx2eB y DNA (SEQ ID NO: 7) que codifica CTB. El DNA que codifica el péptido y el DNA que codifica la proteína de toxina bacteriana se enlazan mediante la correspondencia de sus estructuras de lectura excepto los codones de detención.

El DNA que codifica la proteína de toxina bacteriana se puede obtener mediante una técnica de ingeniería genética común basada en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 3, 5 o 7, por ejemplo. Específicamente, una librería, de cDNA se prepara de una bacteria que produce cada toxina bacteriana de. acuerdo con un método convencional, y un clon deseado se selecciona utilizando una sonda preparada de la librería basada en la secuencia de bases. Alternativamente, el DNA también se puede sintetizar químicamente basado en la secuencia de bases, o sintetizar mediante PCR con DNA genómico como una plantilla utilizando una secuencia de bases 5'- y 3' -terminal de la secuencia de base como cebadores, por ejemplo.

El DNA que codifica la proteína híbrida de la presente invención se representa por la SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 o 99.

En el DNA que codifica la proteína híbrida, de preferencia un codón correspondiente a un aminoácido que compone la proteína híbrida se modifica apropiadamente de modo que la cantidad de la proteína híbrida traducida se incrementa dependiendo de una célula hospedera en la cual se produce la proteína híbrida.

Como el método de modificación del codón, un método de Kang y colaboradores, (2004) puede servir como una referencia, por ejemplo. Y, el método para seleccionar el codón frecuentemente utilizado en la células hospedera, el método para seleccionar el codón en el cual el contenido de GC es alto, o el método para seleccionar el codón frecuentemente utilizado en genes de mantenimiento en la célula hospedera es e emplificado.

Además, el DNA que codifica la proteina híbrida puede ser DNA que se híbrida con DNA que tiene la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 o 99 bajo una condición severa. El término "condición severa" se refiere a la condición donde un llamado híbrido específico se forma mientras que no se forma el híbrido no específico. Se ejemplifica la condición donde dos DNAs con alta identidad, por ejemplo, dos DNAs que tiene la identidad de preferencia 80% más, más de preferencia de 90% o más, y particularmente de preferencia 95% o más se hibridan entre si mientras que no se hibridan dos DNAs con menor identidad que aquellos. Además, se ejemplifica la condición de 2xSSC (NaCl 330 mM, ácido cítrico 30 mM) a 42°C y de preferencia O.lxSSC (NaCl 330 mM, ácido cítrico 30 mM) a 60°C.

En la construcción de DNA de la presente invención, de preferencia el DNA que codifica la proteína híbrida se enlaza operablemente a un aumentador. El término "operablemente" se refiere al hecho de que la proteína híbrida se produce en células hospederas cuando un vector obtenido al insertar la construcción del DNA de la presente invención en un vector que incluye un promotor adecuado se introduce en células hospederas adecuadas. Además, el' término "enlazado" se refiere a tanto un caso donde dos DNAs se enlaza directamente como un caso donde dos DNAs se enlazan por la via de otra secuencia de bases.

Ejemplos del aumentador incluyen la secuencia Kozak y una región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta. Particularmente de preferencia, el DNA que codifica la proteina híbrida se enlaza operablemente a la región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta.

La región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa se refiere a una región que incluye una secuencia entre la base en el sitio de iniciación de transcripción de un gen que codifica un alcohol deshidrogenasa y la base antes del sitio de iniciación de traducción (ATG, metionina) . La región tiene una función para incrementar un nivel de traducción. La frase "función para incrementar un nivel de traducción" se refiere a una función para incrementar una cantidad de una proteína producida mediante traducción cuando la información codificada en un gen estructural es transcrita y luego traducida para producir una proteína. La región puede ser derivada de una planta, y de preferencia se deriva de una planta que pertenece a la familia Solanaceae, Brassicaceae o Asteraceae, además de preferencia se deriva de una planta que pertenece al género Nicotiana , Arabidopsis, Lactuca, etc. y más de preferencia derivada de Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana , Lactuca sativa, etc.

La región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenase particularmente es de preferencia una región que incluye la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 23, que es la región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa (NtADH 5'-UTR) derivado de Nicotiana tabacum, por ejemplo.

La región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta se puede aislar de un gen de alcohol deshidrogenasa de una célula cultivada de planta donde una alcohol deshidrogenasa es altamente expresada, por ejemplo (ver JP 2003-79372 A). Mientras tanto, en el caso de una región que tiene una secuencia de bases determinada, tal como la región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa ^derivado de Nicotiana tabacum, la región también puede ser sintetizada mediante síntesis química, PCR utilizando un DNA genómico como una plantilla y utilizando la secuencias de bases de los 5'- y 3 ' -terminales de la región' como cebadores, o los similares. Además, si una parte de la región que tiene una secuencia de bases determinada se utiliza como una sonda, la región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de otra planta puede ser buscada y aislada.

La región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa representada por la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 23 puede tener la substitución, supresión, inserción o adición de una o varias bases mientras que la región tenga una función para incrementar un nivel de traducción. El término "varios" significa el- número de preferencia de 2 a 10, además de preferencia de 2 a 5, y particularmente de preferencia de 2 a 3.

Además, se puede utilizar DNA que tiene una identidad de preferencia o 85% más y particularmente de preferencia 90% o más a la región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa y que tiene una habilidad para incrementar un nivel de traducción.

Ya sea que la región tiene una función propuesta para incrementar un nivel de traducción o no se puede confirmar mediante, por ejemplo, un ensayo transiente utilizando un gen GUS ( ß-glucuronidasa ) o un gen luciferaza cómo un gen reportador en las células cultivadas de tabaco, o un ensayo en las células transformadas diseñadas para llevar estos genes en un cromosoma.

La construcción DNA de la presente invención tiene la secuencia de bases representada por cualquiera de la SEQ ID NO: 24 a 29 y la" SEQ ID NO: 101 a 111, por ejemplo.

La construcción DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 24 es la construcción de DNA en la cual el DNA (SEQ ID NO: 9) que codifica la proteina híbrida en la cual dos proteínas Stx2eB se enlazan en tándem a través de PG12 se enlaza a la región 5' -no traducida (NtADH 5'-UTR, SEQ ID NO: 23) de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de Nicotiana tabacum. Además, la construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 25 en la construcción de DNA en la cual el DNA (SEQ ID NO: 11) que codifica la proteina híbrida en la cual dos proteínas CTB se enlazan en tándem a través de PG12 se enlaza a NtADH 5'-UTR.

La construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 26 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual dos proteínas Stx2eB se enlazan en tándem a través de PG12, el péptido de señal secretoria se adiciona a su amino terminal, y el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico se adiciona a su carboxilo terminal se enlaza a NtADH 5'-UTR. Además, la construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 27 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual dos proteínas CTB se enlazan en tándem a través de PG12, el péptido de señal secretoria se adiciona a su amino terminal, y el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico se adiciona a su carboxilo terminal se enlaza a NtADH 5'-UTR.

La construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 28 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteina híbrida en la cual dos proteínas Stx2eB se enlazan en tándem a través de PG12, el péptido de señal secretoria se adiciona a su amino terminal, PG12 se enlaza a carboxilo terminal, y además el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico se adiciona al carboxilo terminal se enlaza a NtADH 5'-UTR. Además, la construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 29 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual dos proteínas CTB se enlazan en tándem a través de PG12, el péptido de señal secretoria se adiciona a su amino terminal, PG12 se enlaza su carboxilo terminal, y además el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico se adiciona a su carboxilo terminal se enlaza a NtADH 5'-UTR.

La construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 101 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual las dos proteínas Stx2eB se enlazan en tándem a través de PG12 y PG12 se enlaza a su carboxilo terminal se enlaza NtADH 5'-UTR.

La construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 102 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual dos proteínas Stx2eB se enlazan en tándem a través de PG17 a NtADH 5'-UTR, el péptido de. señal secretoria se adiciona a su amino terminal, PG12 se enlaza a su carboxilo terminal, y además el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico se adiciona a su carboxilo terminal se enlaza a NtADH 5'-UTR. Además, la construcción de DNA qué tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 103 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual dos proteínas Stx2eB se enlazan en tándem a través de PG22, el péptido de señal secretoria se adiciona a su amino terminal, PG12 se enlaza a su carboxilo terminal, y además el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico se adiciona a su carboxilo terminal se enlaza a NtADH 5'-UTR.

La construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 104 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual dos proteínas Stx2eB se enlazan en tándem a través de PG12, el péptido de señal de tránsito de cloroplasto se adiciona a su amino terminal, y PG12 se enlaza a su carboxilo terminal se enlaza a NtADH 5'-UTR.

La construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 105 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual tres proteínas Stx2eB se enlazan cada una en tándem a través de PG12 y PG12 se enlaza a su carboxilo terminal se enlaza a NtADH 5'-UTR.

La construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 106 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteina híbrida en la cual tres proteínas Stx2eB se enlazan cada una en tándem a través de PG12, el péptido de señal secretoria se adiciona a su amino terminal, y PG12 se enlaza a su carboxilo terminal, y además el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico se adiciona a su carboxilo terminal se enlaza a NtADH 5'-UTR.

La construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 107 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual tres proteínas Stx2eB se enlazan cada una en tándem a través de PG12, el péptido de señal de tránsito de cloroplasto se adiciona a su amino terminal, PG12 se enlaza a su carboxilo terminal se enlaza NtADH 5'-UTR.

La construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 108 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual dos proteínas Stx2eB se enlazan en tándem a través de PG12 y PG12 se enlaza a su carboxilo terminal se enlaza NtADH 5'-UTR.

La construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 109 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual dos proteínas Stx2eB se enlazan cada una en tándem a través de PG17, el péptido de señal se adiciona a su amino terminal, PG12 se enlaza a su carboxilo terminal, y además el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico se adiciona a su carboxilo terminal se enlaza NtADH 5'-UTR. Además, la construcción dé DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 110 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual dos proteínas CTB se enlazan en tándem a través de PG22, el péptido de señal se adiciona a su amino terminal, PG12 se enlaza a su carboxilo terminal, y además el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico se adiciona a su carboxilo terminal se enlaza a NtADH 5' -UTR.

La construcción de DNA que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 111 es la construcción de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual dos proteínas CTB se enlazan en tándem a través de PG12, el péptido de señal de tránsito de cloroplasto se adiciona a su amino terminal, y PG12 se .enlaza a su carboxilo terminal se enlaza a NtADH 5' -UTR.

La construcción de DNA de la presente invención se puede preparar mediante una técnica de ingeniería genética general, que incluye los siguientes procedimientos: digestión de DNAs que incluyen la región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta, un DNA que codifica un péptido de señal secretoria derivado de una planta, un DNA que codifica un péptido de señal de tránsito de cloroplasto, un DNA que codifica una proteina de toxina bacteriana, y un DNA que codifica un péptido de señal de retención de retículo endoplásmico con enzimas de restricción adecuadas; y ligación de los fragmentos resultantes con la ligasa adecuada.

El vector recombinante de la presente invención se caracteriza por incluir la construcción de DNA de la presente invención. El vector recombinante de la presente invención puede ser un vector obtenido al insertar un DNA que codifica una proteína híbrida de la presente invención en un vector de modo que el DNA puede ser expresado en células hospederas para ser introducido con el vector. El vector no está particularmente limitado mientras que pueda replicarse en las células hospederas, y ejemplos de los mismos incluyen un DNA de plásmido y un DNA viral. Además, el vector de preferencia incluye un marcador selectivo tal como un gen de resistencia a fármaco. El DNA de plásmido se puede preparar de Escherichia coli o Agrobacterium mediante el método de extracción alcalina (Birnboim, H. C. & Doly, -J. (1979) Nucleic acid Res 7: 1513) o un método modificado del mismo. Se pueden utilizar plásmidos comercialmente disponibles tales como pBl221, pBI121, pBHOly pIG121. El DNA viral puede ser, por ejemplo, pTB2 (Donson y colaboradores, 1991) (ver Donson J. Kerney CM. Hilf ME . Dawson O. Systemic expresión of a bacterial gene by a tabaco mosaic virus-based vector Proc. Nati. Acad. Sci. (1991) 88: 7204-7208) .

Los promotores que son utilizados en vectores pueden ser seleccionados ' apropiadamente dependiendo de las células hospederas que se introducen con los vectores. Los promotores de preferencia son un promotor 35S de virus de mosaico de coliflor (Odell y colaboradores, 1985, Nature 313:810), un promotor de actina de arroz (Zhang y colaboradores, 1991 Plant Cell 3: 1155), un promotor de ubicuitina de maíz (Cornejo y colaboradores, 1993, Plant Mol. Biol. 23:567), etc. por ejemplo. Mientras tanto, los terminadores que se utilizan en vectores pueden ser seleccionados apropiadamente dependiendo sobre las células hospederas que se introducen con los vectores. Los terminadores son de preferencia un terminador de transcripción de gen de nopalina sintasa, un terminador 35S de virus de mosaico de coliflor, etc.

El vector recombinante de la presente invención se puede preparar como sigue.

Primero, una construcción de DNA de la presente invención se digiere con una enzima de restricción adecuada, o un sitio de enzima de restricción se adiciona a la construcción de DNA mediante PCR. Subsecuentemente, la construcción de DNA. se inserta en el sitio de enzima de restricción o el sitio de multiclonación de un vector.

El transformante de la presente invención se caracteriza por ser transformado con el vector recombinante de la presente invención. Las células hospederas que se utilizan para la transformación pueden ser células eucarióticas o células procarióticas .

Las células eucarióticas son de preferencia células de planta, particularmente de preferencia células de planta que pertenecen a la familia Asteracear, Solanaceae, Brassicaceae y Chenopodiaceae . Por otra parte, las células eucarióticas son de preferencia células de plantas que pertenecen al género Lactuca, particularmente de preferencia células de Lactuca sativa. En el caso de utilizar células de Lactuca sativa como células hospederas, un promotor de RNA 35S de virus de mosaico de coliflor o similar se puede utilizar en el vector.

Las células .procarióticas pueden ser células de Echerichia coli, Agrobacterium turnefaciens, etc.

El transformante de la presente invención se puede preparar mediante una técnica de ingeniería genética general al introducir un vector de la presente invención en células hospederas. Por ejemplo, el transformante se puede preparar mediante el método de introducción utilizando Agrobacterium (Hood, y colaboradores, 1993, Transgenic, Res. 2:218, Hiei, y colaboradores, 1994, Plant J. 6:271), un método de electroporación (Tada, y colaboradores, 1990, Theor . Appl . Genet , 80:475), un método de polietilenglicol (Lazzeri, y colaboradores, 1991, Theor. Ap l. Genet. 81;437), un método con pistola de partículas (Sanford, y colaboradores, 1987, J. Part. Sci. Tech. 5:27), un método de policatión (Ohtsuki) , etc.

Después de la introducción del vector de la presente invención en células hospederas, un transformante de la presente invención se puede seleccionar en base al fenotipo de un marcador selectivo. Si se cultiva el transformante seleccionado, se puede producir la proteína de toxina bacteriana. El medio de cultivo y las condiciones para el cultivo se pueden seleccionar adecuadamente dependiendo del tipo de un transformante.

Además, en el caso de usar una célula de planta como una célula hospedera, el cultivo de la célula de planta seleccionada de acuerdo con un método convencional puede regenerar una planta y acumular la proteína de toxina bacteriana en las células de planta o fuera de las membranas de la' célula de las células de planta. El método depende del tipo de la célula de planta, y ejemplos del mismo incluyen el método de Visser y colaboradores, (Theor .Appl . Genet, 78:594(1989) para papa y el método de Nagata y Takebe (Planta, 99:12(1971) para Nicotiana tabacum.

En el caso de Lactuca sativa, un retoño se puede regenerar en el medio MS que contiene 0.1 mg/1 de NAA (ácido naftalen acético), 0.05 mg/1 de BA (benciladenina ) y 0.5 g/1 de polivinilpirrolidona, y el cultivo del retoño generado en 1/2 del medio MS que contiene 0.5 g/1 de polivinilpirrolidona puede causar enraizamiento .

La semilla de la presente invención se puede obtener al recolectar una semilla de una planta regenerada como en lo anterior. Si la semilla de la presente invención se siembra y se cultiva mediante un método adecuado, se puede obtener una planta capaz de producir una proteina de toxina bacteriana y se incluye en el transformante de la presente invención.

EJEMPLOS <1> Experimento de expresión transiente (1) Construcción del vector de expresión transiente Stx2eB Un vector que contiene una construcción de DNA en la cual el DNA (SEQ ID NO: 5) que codifica una subunidad B de proteína Stx2e (Stx2eB) se enlazó a una región 5' -no traducida (NtADH 5' -UTR) de un gen de alcohol deshidrogenasa de tabaco se preparó como sigue.

Un diseño del vector se muestra en la FIG. 1. lxStx2eB (PG12) denota una construcción de DNA que contiene DNA en la cual el DNA que codifica PG12 se enlaza al DNA que codifica Stx2eB. 2xStx2eB (PG12) denota una construcción de DNA que contiene DNA en el cual dos DNAs que codifican Stx2eB se enlazan utilizando DNA que codifica PG12 como un espaciador.

Además, una construcción de DNA, 3xStx2eB (PG12) en la cual tres DNAs que codifican Stx2eB se enlazan utilizando DNA que codifica PG12 como un espaciador, y una construcción de DNA, 4xStx2eB (PG12) en la cual cuatro DNAs que codifican Stx2eB se enlazan utilizando DNA que codifica PG12 como un espaciador se prepararon también.

Técnicas especificas se muestran enseguida.

La PCR utilizando un cebador Kozak-stx2eb-F (SEQ ID NO: 30) y un cebador stx2eb-R (SEQ ID NO: 31) se realizó para amplificar un fragmento de DNA que codifica una región madura (excepto para un péptido de señal secretoria al periplasma, Ala 19 a Asn 87) de Stx2eB. El fragmento de DNA resultante se clonó en un espacio de EcoRV en pBluescriptII SK. El plásmido resultante se segmento con HindIII y se trató con T4 DNA polimerasa, seguido por la autoligación para convertir un sitio HindIII a un sitio Nhel (plásmido 1).

Stx2eB se insertó como sigue en el sitio de multiclonación (MCS) de un vector de expresión transiente en células de planta, pBl221 (Clontech) .

Con el fin de introducir los sitios Salí, Kpnl y Smal en el MCS, SalKpnSma-F (SEQ ID NO: 32) y SalKpnSma-R (SEQ ID NO: 33) se recocieron y se fosforilaron con T4 polinucleótido quinaza (t4 PNK) (TaKaRa) y se insertaron en el espacio SacI de pBl221 (plásmido 2) . Stx2eB se segmentó fuera del plásmido 1 utilizando Xbal y Kpnl para insertarse en el plásmido 2, y el producto resultante se arregló entre un promotor de RNA 35S de virus de mosaico de coliflor (35S pro. ) y un terminador de transcripción de gen de nopalina sintasa (NOS-T) (plásmido 3) .

La región 5' -no traducida (NtADH 5'-UTR, SEQ ID NO: 23) de un gen de alcohol deshidrogenasa de tabaco se amplificó mediante PCR con ADH-221 (Sato y colaboradores, (ver enseguida) como una plantilla utilizando el cebador ADH Xbal-F (SEQ ID NO: 34) y el cebador ADH Nsil-R (SEQ ID NO: 35). Una región de DNA (SEQ ID NO: 17) que codifica un péptido de señal secretoria (SEQ ID NO: 18) de ß-D glucan exohidrolasa (GenBank ACCESO AB017502) se amplificó con un DNA genómico de tabaco como una plantilla utilizando el cebador ß? Nsil-F (SEQ ID NO: 36) y el cebador pD MamHI-R (SEQ ID NO: 37).. Los fragmentos de DNA respectivos obtenidos de NtADH 5'-UTR y el péptido de señal secretoria se trataron con Nsil (manufacturado -por Toyobo Co, Ltd.), se ligaron utilizando Ligación High (manufacturada por Toyobo Co, Ltd.), seguido por el despuntamiento, y se clonaron en el espacio de RcoRV en pBluescript II SK (manufacturado por Stratagene) (plásmido 4 ) .

Satoh y colaboradores, The 5' -untranslated región of tobacp alcohol dehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant. J. Biosci. Bioeng. (2004) 98, 1-8 El plásmido 4 se trató con Nsil y se despuntó con T4 DNA polimerasa (manufacturada por Toyobo Co, Ltd. ) , seguido por la realización de la auto-ligación para ser ligado de modo que el codón de iniciación (atg) de NtADH fue correspondiente al' codón de iniciación del péptido de señal secretoria (plásmido 5) .

Un DNA obtenido al ligar un fragmento de NtADH 5'-UTR y un péptido de señal secretoria se amplificó utilizando el plásmido 5 como una plantilla y utilizando el cebador ADH Xbal-F (SEQ ID NO: 34) y el cebador BamHI-R (SEQ ID NO: 35) . El fragmento de DNA resultante se trató con Xbal y BamHI y se insertó en el espacio de Xbal-BamHI del plásmido 3 (plásmido 6) .

Con el fin de adicionar una señal de retención de retículo endoplásmico (SEQ ID NO: 38), un cebador HDEL-F (SEQ ID NO: 39) y un cebador HDEL-R (SEQ ID NO: 40) se recocieron y se fosforilaron con T4 PNK, y el producto resultante se insertó en el espacio de BglII del plásmido 6, que se ha desfosforilado con fosfatasa alcalina (AP) (TaKaRa) (plásmido Una etiqueta HA se adicionó, como una etiqueta de péptido para detectar Stx2eB. Con el fin de adicionar la etiqueta HA, un cebador HA-F (SEQ ID NO: 41) y un cebador HA- R (SEQ ID NO: 42) se recocieron y se fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de HA fosforilado resultante se insertó en el espacio de BglII del plásmido 7 (plásmido 8).

Un espaciador PG12 (SEQ ID NO: 2) se insertó en Stx2eB y la etiqueta HA. Un cebador PG12-F (SEQ ID NO: 43) y un cebador PG12-R (SEQ ID NO: 44) se recocieron y se fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de DNA fosforilaron resultantes se insertó en el espacio de BglII del plásmido 8 (lxStx2eB (PG12) ) . 2xStx2eB (PG12) se obtuvo al segmentar un fragmento de 2eB-PG12 fuera de lxStx2eB (PG12) con BamHI y BglII y luego al insertar el fragmento en el espacio de BamHI del lxStx2eB (PG12) . 3xStx2eB (PG12) se obtuvo al segmentar un fragmento de Stx2eB-PG12 fuera de lxStx2eB (PG12) con BamHI y BglII y luego al insertar el fragmento en el espacio de BamHI de 2xStx2eB (PG12). Además, 4xStx2eB (PG12) se obtuvo al segmentar un fragmento de 2x (Stx2eB-PG12 ) fuera de 2xStx2eB (PG12) con BamHI y BglII y luego al insertar el fragmento en el espacio de BamHI de 2xStx2eB (PG12) . (2) Construcción del vector de expresión transiente de CTB Un vector que contiene una construcción de DNA (2xCTB (PG12)) en el cual el DNA que codifica una subunidad B de proteina CT (CTB) se ha enlazado a la región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa de tabaco se preparó como sigue.

Se preparó un fragmento de DNA (SEQ ID NO: 7) que codifica la región madura (excepto para la señal secretoria al periplasma, Thr 22 a Asn 124) (SEQ ID NO: 8) del CTB. Primero, se prepararon los siguientes diez cebadores.

CTB1: SEQ ID NO: 45 CTB2 : SEQ ID NO: 46 CTB3: SEQ ID NO: 47 CTB4: SEQ ID NO: 48 CTB5: SEQ ID NO: 49 CTB6: SEQ ID NO: 50 CTB7: SEQ ID NO: 51 CTB8: SEQ ID NO: 52 CTB9: SEQ ID NO: 53 CTB10: SEQ ID NO: 54 La PCR utilizando los cebadores sintetizados en lo anterior se realizó bajo las condiciones descritas en Kang y colaboradores, (2004). Esto es, la PCR se realizó en combinación de CTB1 y CTB2, CTB3 y CTB4, CTB5 y CTB6, CTB7 y CTB8 y CTB9 y CTB10 y fragmentos de DNA de 72 bp (1+2), 74 bp (3+4), 67 bp (5+6), 82 bp (7+8) y 68 bp (9+10) se sintetizaron, respectivamente. Subsecuentemente, la segunda PCR se realizó en combinación de CTB1+2 y CTB3+4, CTB3+4, CTB3+4 y CTB5+6, CTB5+6 y CTB+8, y CTB7+8 y CTB9+10 y los fragmentos de DNA de 135 bp (1+2+3+4), 132 bp (3+4+5+6), 138 bp (5+6+7+8) y 141 bp (7+8+9+10) se sintetizaron, respectivamente. Luego, la tercera PCR se realizó en combinación de CTB1+2+3+4 y CTB3+4+5+6, y CTB5+6+7+8 y CTB7+8+9+10 y fragmentos de DNA de 194 bp (1+2+3+4+5+6) y 198 bp (5+6+7+8+9+10) se sintetizaron, respectivamente. Finalmente, la PCR se realizó en combinación de CTB1+2+3+4+5+6 y CTB6+7+8+9+10 , y un fragmento de DNA de 315 bp en el cual se adicionaron un sitio BamHI y un sitio BglII a una región de codificación de CTB se sintetizó.

El fragmento de DNA preparado en lo anterior se trató con BamHI y BglII, y se insertó en un espacio de BamHI-BglII en el plásmido 8 (plásmido 9) .

El espaciador PG12 (SEQ ID NO: 2) se insertó en Stx2eB y la etiqueta HA. Un cebador PG12-F (SEQ ID NO: 43) y un cebador PG12-R (SEQ ID NO: 44) se recocieron y se fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de DNA fosforilaron resultantes se insertó en el espacio de BglII del plásmido 9 (lxCTB (PG12) ) .

Un fragmento de CTB-PG12 se cortó fuera del lxCTB (PG12) utilizando BamHI y BglII, y se insertó en el espacio de BamHI de lxCTB (PG12) (2xCTB (PG12)). (3) Prueba de expresión transiente utilizando el protoplasto de Lactuca sativa Una hoja de Lactuca sativa en maceta (ondulación verde) (aproximadamente 1 g) se cortó en piezas cuadradas de 0.5-cm utilizando una cuchilla quirúrgica, para de esta manera preparar discos de hoja. Los discos de hoja se sumergieron en manitol 500 mM, y se agitaron durante 1 hora. Los discos de hoja se sumergieron en 50 mi de una solución de enzima de protoplastización (celulosa RS al 1.0% (Yakult Honsha Co. LTD.), macerozima R-10 al 0.25% (Yakult Honsha Co. LTD.) manitol 400 mM, CaCl2 8 mM y Mes-KOH 5 mM, pH 5.6) y el total se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La suspensión de 'protoplasto se pasó a través de las mallas de 100 µp? y 40 µp? para remover los discos de hoja. La suspensión de protoplasto se centrifugó a 60 g durante 5 minutos para precipitar el protoplasto. El protoplasto se resuspendió en una solución acuosa que contiene manitol 167 mM y CaCl2 133 mM, y la suspensión se centrifugó a 40 g durante 5 minutos. El protoplasto se resuspendió en una solución acuosa que contiene manitol 333 mM y CaCl2 66.7 mM, y la suspensión se centrifugó a 40 g durante 5 minutos. El protoplasto se suspendió en solución W5 (NaCl 154 mM, CaCl2 125 mM, KC1 5 mM Mes-KOH 2 mM, pH 5.6), y la suspensión se dejó reposar sobre hielo durante 1 hora. La suspensión de protoplasto se centrifugó a 40 g durante 5 minutos, y el protoplasto se suspendió en una solución MaMg (manitol 400 mM, MgCl2 15 mM, y Mes.KOH 4 mM, pH 5.6) para tener una. concentración de protoplasto de 2xl06 células/ml .

Cada uno del vector de expresión transiente de Stx2eB y el vector de expresión transiente de CTB preparados en lo anterior se mezcló con 120 µ]_. de una suspensión de protoplasto, subsecuentemente 140 µ?_. de solución de PEG (manitol 400 mM, Ca(N03)2 100 mM y PEG al 40%) se adicionó a la misma, y la mezcla resultante se mezcló suavemente y se incubó durante 7 minutos. Luego, 1 mL de la solución W5 se adicionó a la suspensión de protoplasto durante aproximadamente 20 minutos. Una solución (1 mL) obtenida al mezclar manitol 400 mM y la solución W5 en una relación de 4:1 se adicionó al protoplasto precipitado por centrifugación. El medio LS (1 mL) que contiene sacarosa al 1%, manitol 400 mM y carbenicilina 0.3 mM se adicionó al protoplasto precipitado por centrifugación, y la mezcla luego se cultivó en un lugar oscuro a 25°C durante 24 horas. (4) Análisis de Western Al protoplasto ' recolectado por centrifugación se adicionaron 30 µL de solución reguladora de muestra de SDS (SDS al 4% (d7v) , glicerol al 20% (p/v) , azul de bromofenol al 0.05% (p/v), ß-mercaptoetanol 300 mM, Tris-HCl 125 mM, pH 6.8), seguido por la desnaturalización térmica a 95°C durante 2 minutos, para de esta manera preparar las muestras. Las proteínas se separaron utilizando un gel de acrilamida al 15% y se mancharon sobre una membrana de PVDF (Hybond-P; Amersham) utilizando un sistema de electro trasferencia . Un anticuerpo anti-HA (No. 11 867 423 001, Roche) se utilizó para detectar Stx2eB y CTB. (a) Efectos del número de enlace de Stx2eB o Un resultado se muestra en la FIG. 2. Cuando lxStx2eB (PG12) se expresó, una señal se detectó en una posición de aproximadamente 8.5 KDa . Cuando se expresó 2xStx2eB (PG12), una señal se detectó en una posición de aproximadamente 17 KDa al mismo nivel como cuando se expresó lxStx2eB (PG12) . Cuando se expresó 3xStx2eB (PG12), una señal se detectó en una posición de aproximadamente 26 KDa, la señal que es más pequeña que aquella cuando se expresó lxStx2eB (PG12). Estos correspondieron a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de DNA. Cuando se expresó 4xStx2eB (PG12), la señal especifica estuvo por abajo de un limite de detección .

A partir del resultado anterior, se demostró que¦ cuado se expresaron 2xStx2eB (PG12) y 3xStx2eB (PG12), las proteínas híbridas en las cuales se enlazaron múltiples proteínas Stx2eB podrían ser producidas.

Puesto que cada una de las construcciones de DNA anteriores contiene una molécula de la etiqueta HA (ver la FIG 1), es concebible que una cantidad de proteína correspondiente a aproximadamente 2 veces una cantidad de' proteína Stx2eB cuando se expresa lxStx2eB' (PG12) se acumula cuando se expresa 2xStx2eB (PG12). Esto es, se ha encontrado que cuando dos DNAs que codifican la proteína Stx2eB se enlazan a través del DNA que codifica PG12, la proteina Stx2eB se puede producir con muy alta eficiencia.

Mientras tanto, también se ha encontrado que cuando tres DNAs que codifican la proteina Stx2eB o cuatro DNAs que codifican la proteina Stx2eB se enlazan a través del DNA que codifica PG.12, la cantidad de la proteina Stx2eB producida es igual o menor que la cantidad cuando se enlaza una proteina Sx2eB a PG12.

Se ha encontrado que el nivel de proteínas acumuladas tiende a ser más alto en la proteína Stx2eB (lxStx2eB (PG12)) que tiene PG12 adicionado en su carboxilo terminal preparado en este experimento, comparado con la proteína Stx2eB que no tiene PG12. Esto se especula que es una forma favorable que el PG12 se adicione al carboxilo terminal en la proteína híbrida de la presente invención. (b) Efectos del número de enlace de CTB Los resultados se muestran en la FIG. 3.

Cuando se expresó lxCTB (PG12), una señal se detectó en una posición de aproximadamente 20KDa. Cuando se expresó 2xCTB (PG12), una señal más grande que aquella cuando se expresó lxCTB (PG12) se detectó en las posiciones de aproximadamente 33 KDa y aproximadamente 35'. KDa.

A partir de los resultados anteriores, se demostró que la proteína híbrida en la cual se enlazaron dos proteínas CTB podría ser producida cuando se expresó 2xCTB (PG12) . Esto correspondió a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de DNA.

Puesto que cada una de las construcciones de DNA anteriores contiene una molécula de la etiqueta HA, es concebible que la cantidad de proteina correspondiente a la cantidad de proteina CTB que es más grande dos veces la cantidad de proteina cuando se expresa lxCTB (PG12) se acumula cuando se expresa 2xCTB (PG12) . Esto es, se .ha encontrado que cuando dos DNAs que codifican la proteina CTB se enlaza a través del DNA que codifica PG12 la proteina CTB se puede producir con muy alta eficiencia. (5·) Análisis de la localización de Stx2eB Con el fin de analizar la localización de Stx2eB en la célula, se preparó un vector de expresión transiente para la proteina híbrida Stx2eB y una proteína fluorescente amarilla YFP. El diseño para el vector se muestra en la FIG. 4. lxStx2eB (PG12)-YFP denota una construcción, de DNA en la cual el DNA que codifica la proteína Stx2eB se enlaza al DNA que codifica YFP. 2xStx2eB (PG12)-YFP denota una construcción del DNA en la cual el DNA que codifica la proteína híbrida en la cual se enlazan- dos proteínas Stx2eB a través de PG12 se enlaza al DNA que codifica YFP. También se preparó 2xStx2eB (RS)-YFP utilizando RS (Arg Ser) en lugar de PG12 como un espaciador.

Una técnica específica se muestra enseguida.

Primero, un fragmento de DNA de YFP se amplificó mediante PCR con pEYFP (Clontech) como una plantilla utilizando un cebador YFP-F (SEQ ID NO: 55) y un cebador YEP-R (SEQ ID NO: 56) . El fragmento de DNA resultante se trató con BamHI y BglII y .se insertó en el espacio de BamHI-BglII del plásmido 8 (ER-YFP) .

Un fragmento Stx2eB se segmentó fuera del plásmido 1 con BamHI y BglII y luego se insertó en el espacio de BamHI del lxStx2eB (PG12) (2xStx2eB (RS)).

Un fragmento Stx2eB-PG12, un fragmento 2x(Stx2eB-RS) y un fragmento 2x (Stx2eB-RS) se segmentaron fuera de lxStx2eB (PG12) 2xStx2eB (RS) y 2xStx2eB (PG12) con BamHI-BglII, respectivamente, y cada fragmento se insertó en el espacio de BamHI del ER-YFP (lxStx2eB (PG12)-YFP, 2xStx2eB (RS)-YFP y 2xStx2eB (PG12)-YFP.

Mientras tanto, un vector de expresión para una proteina fluorescente roja (mRFP, Campbell R. E. y colaboradores, 2002, (ver enseguida)) localizada en el retículo endoplásmico se preparó como un vector para visualizar el retículo endoplásmico. La PCR se realizó utilizando un cebador mRFP-F (SEQ ID NO: 57) y un cebador mRFP-R ( SEQ ID NO: 58) . El fragmento de DNA resultante se trató con BamHI y BglII y se insertó en el espacio de BamHI-BglII del plásmido 8 (ER-mRFP) .

Campbell R. E. y colaboradores, A mononeric red florescent proteína (2002), Proc. Nat. ACAD. Sci. 00: 7877-7882.

El vector de expresión Stx2eB y el vector de expresión de mRFP se introdujeron en los protoplastos de células de tabaco cultivados (BY2) de la misma manera como los métodos anteriores y se observó utilizando un sistema de observación de microscopio confocal (LSM510, Zeiss).

Los resultados se muestran en las FIGS . 5 y 6.

La FIG. 5 muestra la localización de la proteína híbrida del Stx2eB-YFP. Cuando se expresó 2xStx2eB (PG12)-YFB se observó que la proteína híbrida de Stx2eB-YFP se localizó granularmente en aproximadamente 100 gránulos/célula . Cuando se expresaron lxStx2eB (PG12)-YFP y 2xStx2eB (RS)-YFP, no se observó gránulo.

En la FIG. 6, una imagen A en una columna a la izquierda muestra la localización de mRFP en un cierto protoplasto. La localización de mRFP refleja la localización del retículo endoplásmico . Una imagen B en una columna en la parte media muestra la localización de la proteína híbrida Stx2eB-YFP en el protoplasto idéntico. Una imagen en una columna a la derecha es una imagen compuesta de la imagen A y la imagen B. Se encontró de esta imagen compuesta que la proteína híbrida de Stx2eB-YFP esta localizada granularmente en los retículos, endoplásmicos. (6) Efecto de la función de transporte vesicular Se examinó en que proceso después de la traducción de la proteína ocurre la acumulación y agregación de 2xStx2eB (PG12) . 2xStx2eB (PG12)-YFP se co-expresó con una proteína de regulación de transporte vesicular de Arabidopsis ARF1 o un mutante negativo dominante de la misma ARF1 (Q71L) (ARF1DN) . Como . un reportador para la inhibición del transporte de proteína al aparato de Golgi mediante la coexpresión con ARF1DN, la vacuola-GFP se co-expresó con cada ARF1. Un vector de expresión para cada ARF1 se construyó como sigue. Un vector de expresión, para la vacuola-GFP se puede preparar con referencia al siguiente documento.

Di Sansebastiano y colaboradores, ' Specific accumulation of GEP in a non-acidic vacuola compartment via C-terminal proptide-mediated sorting pathway. Plant J. (1998) 15, 449-457 Como la proteína de regulación de transporte vesicular, se construyeron los vectores de expresión para la ARF1 de Arabidopsis (GenBank AXCESO No. M95166) y para el mutante negativo dominante de la misma ARF1 (Q71L) (Misaki Rakeuchi y colaboradores, (ver enseguida) ) . La PCR utilizando cDNA preparado de la planta de embrión Arabidopsis como una plantilla se realizó utilizando un cebador ARF1-F (SEQ ID NO: 59) y un cebador ARF1-R (SEQ ID NO: 60) . El fragmento de DNA resultante se subclonó en el espacio de EcoRV en pBluescript (St'ratagene) . Otra PCR se realizó utilizando un cebador ARFQL-F (SEQ ID NO: 61) y un cebador ARFQL-R (SEQ ID NO: 62) para sustituir un residuo de glutamina en la posición 71 con un residuo de leucina. Cada fragmento de ARF1 resultante se subclonó en un vector de expresión transiente pBI221.

Cada uno de los vectores preparados se introdujo en el protoplasto de la célula de tabaco cultivado de la misma manera como aquella descrita en lo anterior, y las proteínas respectivas se co-expresaron para examinar la localización de 2xStx2eB (PG12) .

El resultado se muestra en la FIG. 7.

Tanto cuando 2xStx2eB (PG12)-YFP se co-expresó con ARF1 como se co-expresó con ARF1 (Q71L) , se formaron gránulos como se observa en una expresión de 2xStx2eB (PG12)-YFP solamente. Por otra parte, la co-expresión de ARF1 (Q71L) inhibió la salida de la vacuola-GFP del ER. Se especuló a partir de estos que la formación de gránulo no es dependiente del proceso de transporte vesicular del ER al aparato de Golgi. • <2> Experimentos de transformación utilizando células de tabaco cultivadas (1) Construcción de vectores para la transformación Se prepararon lxStx2eB (PG12), 2xStx2eB (PG12), y 4xStx2eB (PG12) de la misma manera como lo anterior.

Además, al utilizar RS (Arg, Ser), PG7 (SEQ ID NO: 63), o SG12 (SEQ ID NO: 64) como un espaciador en lugar de PG12, se prepararon construcciones de DNA, 2xStx2eB (RS) , 2xStx2eB ( PG7 ) , y 2xStx2eB (SG12) mediante los siguientes métodos .

Un espaciador PG7 (SEQ ID NO: 63) se insertó entre Stx2eB y la etiqueta HA en el plásmido 8. Se recocieron un cebador PG7-F (SEQ ID NO: 65) y un cebador PG7-R (SEQ ID NO: 66) y se fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de DNA fosforilado obtenido se insertó en el espacio de BglII del plásmido 8 (plásmido 10) .

Un espaciador SG12 (SEQ ID NO: 64) se insertó entre Stx2eB y la etiqueta HA. Un cebador SG12-F (SEQ ID NO: 67) y un cebador SG12.R (SEQ ID NO: 68) se recocieron y se fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de DNA fosforilado obtenido se insertó en el espacio de BG1-II del plásmido 8 (plásmido 11 ) .

Un fragmento Stx2eB se segmentó fuera del plásmido 1 con BamHI y BglII luego se insertó en el espacio de BamHI de lxStx2eB (PG12) (2xStx2eB (RS)). Un fragmento de Stx2eB-PG7 se segmentó fuera del plásmido 10 como BamHI y luego se insertó en el espacio de BamHI de lxStx2eB (PG12) (2xStx2eB ( PG7 ) ) . Un fragmento de Stx2eB-SG12 se segmentó fuera del plásmido 11 con BamHi y BglII y luego se insertó en el espacio de BamHi de lxStx2eB (PG12) (2xStx2eB (SG12)).

Con el fin de producir Stx2eB utilizando un transformante estable de la planta, cada una de las construcciones de DNA del Stx2eB anterior se subclonó en un vector para la transformación (para el diseño de los vectores, ver la FIG. 1). cada uno de lxStx2eB (PG12), 2xStx2eB (PG12), 3xStx2eB (PG12), 4xStx2eB (PG12), 2xStx2eB (RS), 2xStx2eB (PG7) y 2xStx2eB (SG12) se insertó en pBI121 (Clontech) utilizando Xbal y SacI, y se distribuyó entre un promotor de RNA 35S de virus de mosaico de coliflor (35S pro.) y un terminador de transcripción de gen de nopalina sintetasa (NOS-T) . (2) Transformación de células de tabaco cultivadas El vector producido para la transformación se introdujo en EHA105 de Agrobacterium tumefacience utilizando un método de electroporación. Un medio de Agrobacterium (100 µL) cultivado en 5 mL del medio LB que contiene 100 mg/L de Kanamicina a 28°C durante 2 noches se mezcló con 5 a 10 mL de una suspensión de células de tabaco cultivadas (Nicotiana tabacum, cv BY2) en el cuarto día del cultivo en una caja petri, y la mezcla se co-cultivó al ser dejada reposar en un lugar oscuro a 25°C durante 2 noches. Con el fin de remover Agrobacterium, el medio en la caja petri se transfirió a un tubo de centrifugación de 15-mL, que luego se centrifugó (1,000 rpm, 5 minutos, 4°C), y se removió un sobrenadante. Se cargó un medio LS modificado, y el tubo se centrifugó (1,000 rpm, 5 minutos, 4°C) para lavar las células. Esta operación de lavado ' se repitió cuatro veces para remover Agrobacterium. Las células BY2 resultantes luego se colocaron en un medio de agar LS modificado que contiene Kanamicina (100 mg/L) , y se cultivaron al ser dejadas reposar en el lugar oscuro a 25°C. Después de aproximadamente 2 a 3 semanas, las células que han formado un callo se transfirieron a una nueva placa, y se seleccionó un clon de crecimiento. (3) Semi-cuantificación de la proteina Stx2eB utilizando el análisis de western Las células de tabaco cultivadas en un medio de placa se recolectaron en un tubo de centrifugación, y se adicionó 1 de la solución reguladora de muestra SDS por mg de peso de célula. Las células se desnaturalizaron a 95°C durante 2 minutos para hacer una muestra para la electroforesis . Las proteínas se separaron utilizando gel de acrilamida al 15%, y luego se mancharon sobre una membrana de PVDF (Hybond-P; Amersham) utilizando un aparato de electrotransferencia . Se detectó una proteína Stx2eB utilizando un anticuerpo anti-HA (No. 11 867 423 001, Roche) . La dilución en serie de Stx2eB que tiene la etiqueta HA en concentraciones conocidas se preparó, y se cargó sobre el gel. Se preparó una curva de calibración basado en sus intensidades de señal, y se calculó la cantidad de proteínas Stx2eB en cada muestra.

Los resultados se muestran enseguida. (a) Efectos del número de enlace de Stx2eB Los resultados se muestran en las FIGS . 8 y 9.

Cuando se expresó lxStx2eB (PG12), se detectaron señales en las posiciones de aproximadamente 10 KDa y aproximadamente 17 KDa. Se supone que es Stx2eB en la cual el péptido de señal se segmentó y Stx2eB en la cual el péptido de señal no se, segmentó, respectivamente. Cuando se expresó 2xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 19 kDa en el nivel similar a aquel cuando se expresó lxStx2eB (PG12) . Cuando se expresó 3xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 26 kDa, al señal que es más pequeña de aquella cuando se expresó lxStx2eB (PG12) . Esto correspondió a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de DNA. Cuando se expresó 4xStx2eB (PG12), una señal específica estuvo por debajo del límite de detección (datos no mostrados).

Se ha encontrado de lo anterior que 2xStx2eB (PG12) acumula la cantidad más grande de Stx2eB que lxStx2eB (PG12) y 3xStx2eB (PG12) . (b) Efectos del espaciador Los resultados se muestran en las FIGS. 10 y 11.

Basado en la intensidad" de la señal correspondiente Stx2eB, el nivel de Stx2eB acumulado fue el más alto cuando se uso PG12 como un espaciador. Los niveles fueron secundariamente altos cuando se utilizaron PG7 y SG12, que estuvieron en el grado similar. El nivel fue más bajo cuando se utilizó RS. Este indica que la longitud y la secuencia de aminoácidos del espaciador entre Stx2eBs afectan el nivel de la proteina 2xStx2eB acumulada. (4) Cuantificación del mRNA mediante la PCR en tiempo real Se examinó si el nivel de la proteina acumulada fue influenciado por un nivel de transcripción o no influenciado.

El RNA se preparó utilizando el equipo RNeasy Mini Kit de (Qiagen) de cada una de las células BY2 transformadas obtenidas en lo anterior. El RNA resultante se trató con DNasa, y luego se transcribió inversamente utilizando Transcriptasa e Inversa de Transcriptor (Roche) . La PCR en tiempo real se realizó utilizando la mezcla maestra Verde SYBR (Applied Biosystems) . Un primer conjunto (SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70) que amplificó la región que contiene NtADH 5'-UTR y el péptido de señal- que fueron comunes en las construcciones respectivas se utilizó para cuantificación del mRNA de Stx2eB. La cantidad de un gen de ubicuitina BY2 expresado se cuantificó utilizando un cebador UBQ-F (SEQ ID NO: 71) y un cebador UBQ-R (SEQ ID NO: 72) para compensar en nivel de mRNA de un gen Stx2eB. Observar que el nivel de mRNA de lxStx2eB (PG12) se calculó al multiplicar un valor cuantificado por 1/2.

Los resultados se muestran en la FIG. 12 Los niveles de acumulación de la proteina Stx2eB por mRNA tienden a ser más altos en células que expresan 2xStx2eB (PG12) que aquellos en células que expresan 2xStx2eB (RS) o lxStx2eB (PG12) . Esto indica que la diferencia del espaciador no ejerce influencia sobre el nivel de transcripción pero ejerce influencia sobre un nivel o estabilidad de traducción de la proteina después de la traducción. Considerando conjuntamente el resultado que la proteina 2xStx2eB se localizó granularmente, es concebible que el espaciador ejerce influencia sobre la estabilidad de la proteina después de la traducción. <3> Experimentos de expresión transiente (1) Construcción de vectores de expresión transiente de Stx2eB Los vectores de expresión transiente para lxStx2eB (PG12), 2xStx2eB (PG12), 3xStx2eB (PG12) y 4xStx2eB (PG12) se construyeron por el método en el Párrafo <1> anterior (1) (FIG. 13-A) . Estos vectores son referidos como ER-lxStx2eB (PG12), ER-2xStx2eB (PG12), ER-3xStx2eB (PG12) y ER-4xStx2eB (PG12), respectivamente. Observar que "ER" significa el tipo retículo endoplásmico .

Además, los vectores de expresión transientés que contienen el tipo citoplasma (Cyt) de la construcción del DNA (FIG: 13-B) y los vectores de expresión que contienen el tipo cloroplasto (Chl) de la construcción de DNA (FIG. 13-C) se construyeron por el siguiente método. Estas construcciones de DNA se diseñaron para contener DNA que codifica el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico, para el propósito de expresar la proteína híbrida que tiene tan cercana una estructura como es posible a aquella del- tipo retículo endoplásmico de la proteína híbrida. Pero, puesto que estas construcciones de DNA no contienen DNA que codifican péptido .de señal secretorias, el péptido de señal de retención de retículo endoplásmico no ejerce su función (retención de la proteína en el retículo endoplásmico) en la proteína híbrida producida.

Se amplificó un fragmento NtADH 5'-UTR mediante la PCR utilizando un cebador ADH Xbal-F (SEQ ID NO: 34) y un cebador ADH BamHI-R (SEQ ID NO: 112), y el fragmento de DNA resultante se trató con Xbal y BamHI . El fragmento Xbal-BamHI de NtADH 5'-UTR se inserto en el espacio de Xbal-BamHI de cada uno de ER-lxStx2eB (PG12), ER-2xStx2eB (PG12), ER-3Stx2eB. (PG12), y ER-4xStx2eB (PG12) para preparar Cyt-lxStx2eB (PG12), Cyt-2xStx2eB (PG12), Cyt-3xStx2eB (PG12), Cyt-4xStx2eB (PG12) que fueron vectores Stx2eB de tipo citoplasma .

El fragmento NtADH 5'-UTR se amplificó mediante PCR utilizando un cebador ADH Xbal-F (SEQ ID NO: 34) y un cebador ADH BamHI-R (SEQ ID NO: 35), un fragmento de DNA (SEQ ID NO: 80) que codifica el péptido de señal de tránsito, el cloroplasto es derivado de Rbcs de Lactuca sativa (subunidad pequeña de Rubisco) (GenBank ACCESO dl4001) (péptido de tránsito, T.P.), se ' amplificó mediante PCR con cDNA de una hoja de Lactuca sativa como una plantilla utilizando un cebador TP NsiF-F (SEQ ID NO: 113) y un cebador BamHI-R TP (SEQ ID NO: 114) . Cada fragmento de DNA resultante del NtADH 5'-UTR y cada fragmento de DNA del péptido de señal secretoria se trató con Nsil (manufacturado por Toyobo Co. Ltd.), se ligó utilizando Ligation High (Toyobo Co. Ltd.) seguido al ser despuntado, y clonado en el espacio de EcoRV de pBluescript II SK (manufacturado por Stratagene) (plásmido 12). El plásmido 12 se trató con Nsil, se despuntó con T4 DNA polimerasa (Toyobo Co. Ltd.) y luego se auto-ligó para ser fusionado de modo que el codón de. iniciación de NtADH y el codón de iniciación de Rbcs fueron correspondientes (plásmido 13). Un fragmento de fusión NtADH 5'-UTR-T.P. se cortó fuera del plásmido 13 utilizando Xbal y BamHI, y se insertó en el espacio de Xbal-BamHI de cada uno de ER-lxStx2eB (PG12) , ER-2xStx2eB (PG12), ER-3xStx2eB (PG12) y ER-4xStx2eB (PG12) para preparar Chl-lxStx2eB (PG12), Chl-2xStx2eB (PG12), Chl-3xStx2eB (PG12), y Chl-4xStx2eB (PG12), que fueron vectores Stx2eB de tipo cloroplasto. (2) Producción de vectores de expresión transiente de CTB Los vectores de expresión transiente para IxCTB (PG12) y 2xCTB (PG12) se construyeron por el método en el Párrafo <1> anterior (2) (FIG. 14-A) . Después en la presente, estos vectores son referidos como ER-lxCTB (PG12) y ER-2xCTB (PG12) .

Se construyeron vectores de expresión transiente que contienen el tipo citoplasma (Cyt) de la construcción de DNA (FIG. 14-B) y vectores de expresión que contienen el tipo cloroplasto (Chl) de la construcción de DNA (FIG. 14-C) mediante los siguientes métodos Un fragmento de CTB-PG12 se cortó fuera de ER-1CTB (PG12) utilizando BamHI y BglII, y se insertó en el BamHI y BglII espacio de BamHI-BglII en Cyt-lxStx2eB (PG12) y el espacio de BamHI-BglII en Chl-lxStx2eB (PG12) producido en el Párrafo <3> anterior (1) para preparar el tipo citoplasma de IxCTB (PG12) y el tipo cloroplasto dé IxCTB (PG12) (Cyt-lxCTB (PG12) Chl-lxCTB (PG12).

Subsecuentemente, un fragmento, de 2x(CTB-PG12) se cortó fuera del ER-2xCTB (PG12) utilizando BamHI y BglII, y se insertó en el espacio de BamHI-BglII de Cyt-lxStx2eB (PG12) y el espacio de BamHI' y BglII de Chl-lxStx2eB (PG12) para preparar el tipo citoplasma de 2xCTB (PG12) y el tipo cloroplasto de 2xCTB (PG12) (Cyt-2xCTB (PG12) Chl-2xCTB (PG12) ) . (3) Experimentos de- expresión transiente y análisis de Western Los experimentos de expresión transiente se llevaron a cavo utiliz'ando protoplasto de Lactuca sativa de la misma manera como en el Párrafo <1> anterior (3). Subsecuentemente, Stx2eB y CTB se detectaron de la misma manera como en <1> (4) . (a) Efectos del número de enlace de Stx2eB Los resultados se muestran en la FIG. 15.

Cuando se expresó ER-lxStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 10 kDa . Cuando se expresó ER-2xStx2eB (PG12), se detectó una señal en posición de aproximadamente 19 kDa, la señal que es más grande que aquella cuando se expresó ER-lxStx2eB (PG12). Cuando se expresó ER-3xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 27 kDa, la señal que es más grande que aquella cuando se expresó ER-lxStx2eB (PG12). Estos correspondieron a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de DNA cuando se expresó ER-4xStx2eB (PG12), una señal especifica estuvo abajo del limite de detección.

Cuando se expresó Cyt-lxStx2.eB (PG12) , una señal especifica estuvo abajo del limite de detección. Cuando se expresó Cyt-2xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de .aproximadamente 20 kDa. Cuando se expresó Cyt-3xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 30 kDa. Estos correspondieron a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de DNA. Además, cuando se expresó Cyt-4xStx2eB (PG12), una señal especifica estuvo abajo del limite de detección.

Cuando se expresó Chl-lxStx2eB (PG12), se detectó una señal de momento en la posición de aproximadamente 14 kDa. Cuando se expresó Chl-2xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 22 kDa, la señal que está en el nivel similar a aquella cuado se expresó ER-3xStx2eB (PG12) . Cuando se expresó Chl-3xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 30 kDa, la señal que está en el nivel similar a aquel cuando se expresa Chl-2xStx2eB (PG12) . Estos correspondieron a los pesos' moleculares estimados del diseño de las construcciones de DNA. Cuando se expresó Chl-4xStx2eB (PG12), se detectó una señal de nuevamente en la posición de aproximadamente 34 kDa.

Puesto que cada una de las construcciones de DNA anteriores contiene una molécula de etiqueta HA (ver la FIG. 13), cuando el DNA que codifica dos Stx2eBs se expresa y cuando el DNA que codifica tres Stx2eBs se expresa, las cantidades de las proteínas acumuladas se cree que corresponde a aproximadamente dos veces y aproximadamente tres veces, respectivamente, la cantidad cuando DNA que contiene un Stx2eB se expresa.

Por lo tanto, se ha encontrado que cuando cualquiera del tipo retículo endoplásmico (ER) , tipo citoplasma (Cyt) y tipo cloroplasto (Chl) de las construcciones de DNA se expresa, la proteina Stx2eB puede' ser más eficientemente acumulada cuando la proteina en la cual dos o tres Stx2eBs se enlazan en tándem a través del espaciador se expresa que cuando una proteina Stx2eB se expresa . (b) Efecto del número de enlace de CTB Los resultados se muestran en la FIG. 16.

Cuando se expresó ER-lxCTB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 17 kDa. Cuando se expresó ER-2xCTB (PG12), una señal más grande que aquella cuando se expresó ER-lxStx2eB (PG12) se detectó en las posiciones de aproximadamente' 28 kDa y aproximadamente 30 kDa. Estos correspondieron a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de DNA.

Cuando se expresó Cyt-lxCTB (PG12), una señal se detectó tenuemente en la posición de aproximadamente 14 kDa. Cuando se expresó Cyt-2xCTB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 26 kDa, la señal que está en el nivel similar a aquella cuando se expresó ER-lxCTB (PG12) . Estos correspondieron a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones del DNA.

Cuando se expresó Chl-lxCTB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 14 kDa. Cuando se expresó Chl-2xCTB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 26 kDa, la señal que está en el nivel similar a aquella cuando se expresó ER-2xCTB (PG12). Estos correspondieron a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones del DNA.

A partir de- lo anterior, se ha encontrado que cuando cualquiera del tipo retículo endoplásmico (ER) , tipo citoplasma (Cyt) , y tipo cloroplasto (Chl) de las construcciones de DNA se expresa, las proteínas CTB pueden ser más eficientemente acumuladas cuando la proteína en la cual dos CTBs se enlazan en tándem, a través del espaciador se expresa que cuando una protéína CTB se expresa. <4> Experimentos de transformación utilizando células de tabaco cultivadas (1) Construcción de vectores para la transformación Los experimentos de transformación se realizaron utilizando ER-2xStx2eB (PG12), Cyt-2xStx2eB (PG12) y Cyt-3xStx2eB (PG12) preparadas en lo anterior.

Los vectores para la transformación se prepararon de la misma manera como el método en <2> (1) anterior. (2) Transformación y análisis de western de células de tabaco cultivadas Los experimentos de transformación y el análisis de western se llevaron a cabo de las mismas maneras como los métodos en <2> (2) y (3) anteriores.

Los resultados se muestran en la FIG. 17.

Cuando se expresó ER-2xStx2eB (PG12), se detectó una señal en las posiciones de aproximadamente 19, 21 y 23 kDa. Cuando se expresó Cyt-lxStx2eB (PG12) una señal especifica estuvo abajo del limite de detección. Cuando se expresó Cyt-2xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 19 kDa. Cuando se expresó Cyt-3xStx2eB (PG12) se detectó una señal en la posición de aproximadamente 27 kDa, la señal que es más grande que aquella cuando se expresó Cyt-2xStx2eB (PG12) .

A partir de lo anterior, se ha encontrado que también en el transformante de la célula de tabaco cultivada, las proteínas Stx2eB puede ser más eficientemente acumuladas cuando la proteína en la cual dos o tres Stx2eBs se enlazan en tándem a través del espaciador se expresa que cuando una proteína Stx2eB se expresa. También se ha encontrado que cuando el tipo citoplasma de construcción de DNA se expresa en el transformante de la célula de tabaco cultivada, en particular cuando la proteína en la cual tres Stx2eBs se enlazan en tándem a través del espaciador se expresa, las proteínas Stx2eB pueden ser eficientemente acumuladas.

También se ha encontrado que en el transformante de la célula de tabaco cultivada, las proteínas Stx2eB pueden ser más eficientemente acumuladas cuando el tipo retículo endoplásmico de la construcción de DNA se expresa que cuando el tipo citoplasma de la construcción de DNA se expresa. <5> Experimentos de transformación utilizando el cuerpo de planta de tabaco (1) Construcción de vectores para la transformación Los experimentos de transformación se realizaron utilizando ER-2xStx2eB (PG12), Chl-l-Stx2eB (PG12), Chl-2xStx2eB (PG12) y Chl-3xStx2eB (PG12) preparados en lo anterior .

Los vectores para la transformación se prepararon de la misma manera como el método en <2> (1) anterior. (2) Transformación del cuerpo de planta de tabaco Los cuerpos de planta de tabaco se transformaron mediante el siguiente método utilizando los vectores preparados en lo anterior.

Las semillas del cuerpo de planta de tabaco {Nicotiana tabacum L. cv. Petit habana SRl) se esterilizaron y se sembraron sobre un medio MS . Una porción de la hoja del Nicotiana tabacum esterilizado se cortó en piezas cada una que tiene un tamaño de aproximadamente lxl cm sin incluir las venas de las hojas, y se colocó enfrentada hacia arriba al lado posterior de la hoja en una caja petri que contiene agua estéril. Una suspensión de Agrobacterium cultivada durante dos noches en el medio LB que contiene 100 mg/L de kanamicina y obtenida en <2> (2) anterior se vació en la caja petri, y la pieza de la hoja se sumergió en la misma o durante 3 a 5 minutos. La pieza de la hoja se recolectó, y un medio extra bacteriano de la pieza de la hoja se limpió con una toallita estéril. La pieza de la hoja se colocó sobre un medio de formación de callo y se cultivó a 25°C. Después de 2 a 3 días, cuando el Agrobacterium llegó a ser visible en el medio, la pieza de la hoja se transfirió en un tubo de 50-mL, se lavó cinco veces con agua estéril, se colocó sobre un medio de formación de callo (que contiene 100 mg/L de kanamicina y 250 mg/L de carbenicilina ) y se cultivó a 25°C durante 1 a 2 semanas. Cuando la pieza de la hoja se onduló hacia arriba comparada con la original y mostró una superficie cóncavoconvexa, la pieza de la hoja se transfirió en un medio de formación de retoño (que contiene 100 mg/L de kanamicina y 250 mg/L de carbenicilina) . Después de 4 a 6 semanas adicionales, un retoño que tiene un tallo desarrollado y porción de hoja se cortó, se transfirió un medio de formación de raíz (que contiene 100 mg/L de kanamicina y 250 mg/L de carbenicilina) y se cultivó a 25°C hasta que se observó rizogénesis. Un cuerpo de planta cultivado a un cierto tamaño se cultivó como una planta de maceta. (3) Análisis de western La hoja del cuerpo de planta de tabaco genéticamente diseñado producida en lo anterior se muestreo, y una solución reguladora de muestra SDS se adicionó a la misma en la proporción de ^L de SDS a 1 mg de hoja. La muestra se desnaturalizó térmicamente a 95°C durante 2 minutos para servir como la muestra para electroforesis . Las proteínas se separaron utilizando gel de acrilamida al 15%, y luego se mancharon sobre una membrana de PVDF (Hybond-P; Amersham) utilizando un aparato de electrotransferencia . La proteína Stx2eB se detectó utilizando un anticuerpo anti-HA (No. 11 867 423 001, Roche) .

Los resultados se muestran en las FIGS . 18 y 19. Los clones en los cuales se acumuló Stx2eB con alta eficiencia se obtuvieron en el cuerpo de planta transformado con uno de ER-2xStx2eB (PG12), Chl-lxStx2eB (PG12), Chl-2xStx2eB (PG12) y Chl-3xStx2eB (PG12) . También en el tipo cloroplasto de las construcciones de DNA, se ha encontrado que se obtiene el clon que acumula Stx2eB eficientemente o una probabilidad más alta cuando la proteína en la cual dos o tres Stx2eB se enlazan en tándem a través del espaciador se expresa que cuando una proteína Stx2eB se expresa.

Cuando se expresó ER-2xStx2eB (PG12) , se detectaron señales en las posiciones de aproximadamente 15 kDa, aproximadamente 19 kDa y aproximadamente 22 kDa. Cuando se expresó Chl-lxStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 12 kDa. Cuando se expresó Chl-2xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 19 kDa. Cuando se expresó Chl-3xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 27 kDa. Estos correspondieron a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de DNA. <6> Experimentos de transformación . utilizando células de tabaco cultivadas (1) Construcción de vectores para la transformación de Stx2eB Se preparó ER-2xStx2eB (PG12) por el método en <1> (1) anterior. ER-2xStx2eB (PG12) y ÉR-2xStx2eB (PG12) se prepararon por el siguiente método. El diseño de las construcciones de DNA se muestra en la FIG. 20.

Un cebador PG7-F (SEQ ID NO: 65) y un cebador PG7-F (SEQ ID NO: 66) se recocieron y se fosforilaron con T4 PN . El fragmento de DNA fosforilado resultante se insertó en el espacio de BglII de ER-lxStx2eB (PG12) obtenido en <1> (1) (plásmido 14 ) .

Un cebador PG12-F (SEQ ID NO: 43) y un cebador PG12-R (SEQ ID NO: 44) se recocieron y se fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de DNA fosforilado resultante se insertó en el espacio de BglII de ER-lxStx2eB (PG12) (plásmido 15) .

Un fragmento de Stx2eB-PG17 se cortó fuera del plásmido 14 utilizando BamHI y BglII, y se insertó en el espacio de BamHI ER-lxStx2eB (PG12) (2xStx2eB (PG17)). Un fragmento de Stx2eB-PG22 se cortó fuera del plásmido 15 utilizando BamHI y BglII, y se insertó en el espacio de BamHI de ER-lStx2eB (PG12) (ER-2xStx2eB (PG22)).

Con el fin de producir Stx2eB utilizando el transformante estable de la planta, cada una de las construcciones de DNA anteriores para Stx2eB se subclonó en un vector para la transformación. Esto es, cada uno de ER-2xStx2eB (PG12), ER-2xStx2eB (PG17) y ER-2xStx2eB (PG12) se insertó en pBI121 (Clontech) utilizando Xbal y SacI, y se distribuyeron entre el promotor de RNA 35S de virus de mosaico de coliflor (35S pro.) y el terminador de transcripción de gen del nopalina sintetasa (NOS-T) . (2) Construcción de vectores para la transformación de CTB ER-2xStx2eB (PG12) se preparó mediante el método en <1> (2) anterior. ER-2xCTB (PG17) y ER-2xCTB (PG22) se prepararon mediante el siguiente método. El diseño de las construcciones de DNA se muestra en la FIG. 21..

.Un cebador PG7-F (SEQ ID NO: 65) y un cebador PG7-R (SEQ ID NO: 66) se recocieron y se fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de DNA fosforilado resultante se insertó en el espacio de BglII de ER-lx-CTB (PG12) obtenido en <1> (2) plásmido 16) . Un cebador PG12-F (SEQ ID NO: 43) y un cebador PG12-R (SEQ ID NO: 44) se recocieron y se fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de DNA fosforilado resultante se insertó en el espacio de BglII de ER-lx-CTB (PG12) plásmido 17).

Un fragmento de CTB-PG17 se cortó fuera del plásmido 16 utilizando BmHI y BglII y se insertó en el espacio de BmHI y ' ER-lxCTB (PG12) (ER-2xCTB (PG17)). Un fragmento de CTB-PG22 se cortó fuera del plásmido 17 utilizando BmHI y BglII y se insertó en el espacio de BmHI de ER-lxCTB (PG12) (ER-2xCTB (PG22)).

Con el fin de producir CTB utilizando el transformante estable de la planta, cada una de las construcciones de DNA anteriores para CTB se subclonó en un vector para la transformación. Esto es, cada uno de ER-2xCTB (PG12) ER-2xCTB (PG17) y ER-2xCTB (PG22) se insertó en pBI121 (Clontech) utilizando Xbal y .SacI, y se distribuyó entre el promotor de RNA 35S de virus de mosaico de coliflor (35S pro.) y el terminador de transcripción de gen de nopalina sintetasa (NOS-T) . (3) Experimentos de transformación y análisis de western Los experimentos de la transformación y análisis de western se llevaron a cabo por los métodos en <2> (2) y (3) anteriores . (a) Efectos de ' la longitud del espaciador en el enlace en tándem de Stx2eB Los resultados se muestran en la FIG. 22.

Cuando se expresó uno de ER-2xStx2eB- (PG17) y ER-2xStx2eB (PG22), se detectó una señal en el nivel similar a aquel cuando se expresó ER-2xStx2eB (PG12) . Esto indica que cualquiera de PG17 y PG22 exhibe el mismo efecto como PG12.

Cuando se expresó ER-2xStx2eB (PG12), se detectaron señales en las posiciones de aproximadamente 19 kDa y aproximadamente 22 kDa. Cuando se expresó ER-2xStx2eB (PG17), se detectaron señales en las posiciones de aproximadamente 19 kDa y aproximadamente 22 kDa. Cuando se expresó ER-2xStx2eB (PG22), se detectaron señales en los posiciones de aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 23 kDa. Estos correspondieron a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de DNA. (b) Efectos de la longitud del espaciador en el enlace en tándem de CTB.

Los resultados se muestran en la FIG. 23.

Cuando se expresó uno de ER-2xCTB (PG17) y ER-2xCTB (PG22), se detectó una señal en el nivel similar a aquel cuando se expresó ER-2xCTB (PG12) . Esto indica que cualquiera de PG17 y PG22 exhibe el mismo efecto como PG12.

Cuando se expresó ER-2xCTB (PG12, se detectaron señales en las posiciones de aproximadamente 32 kDa, aproximadamente 34 kDa y aproximadamente 36 kDa. Cuando se expresó ER-2xCTB (PG17), se detectaron, señales en las posiciones de aproximadamente 32 kDa, aproximadamente 34 kDa y aproximadamente 36 kDa. Cuando se expresó ER-2xCTB (PG22) , se detectaron señales en las posiciones de aproximadamente 32 kDa, aproximadamente 34 kDa y aproximadamente 36 kDa. Estos correspondieron a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de DNA.

CAMPO DE APLICACIÓN INDUSTRIAL La proteína híbrida de la presente invención es altamente estable y acumulada en un alto nivel en células de planta. Además, al producir la proteína híbrida de la presente invención en la planta utilizando la construcción de DNA de la presente invención, es posible producir eficientemente vacunas orales para la toxina Shiga, toxina de cólera y la toxina termo-inestable de Escherichia coli.

La presente invención permite expresar un antígeno bacteriano en la planta al nivel que es bastante para inducir inmunidad. La presente invención permite dar la inmunidad contra el antígeno bacteriano al animal en bajo costo al dar una planta transgénica como alimento al animal. Por ejemplo, la presente invención es útil para desarrollar vacuna contra la enfermedad de edema de cerdos y vacuna para el cólera.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteina híbrida, caracterizada porque dos o tres de proteínas de toxina Shiga, proteínas de toxina de cólera o proteínas de toxina termo-inestable de Escherichia coli cada una se enlazan en tándem a través de un péptido que tiene las siguientes características (A) y (B) : (A) un número de aminoácidos es 12 a 30; y (B) un contenido de prolina es 20 a 35%.

2. La proteína híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido además tiene la siguiente característica (C) : (C) la prolina se distribuye cada dos o tres aminoácidos .

3. La proteína híbrida de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el péptido tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, 82 u 84.

4. La proteína híbrida de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque dos de las proteínas de toxina Shiga, proteínas de toxina de cólera o proteínas de toxina termo-inestable de Escherichia coli se enlazan en tándem a través de un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2.

5. La proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque las proteínas de . toxina Shiga son subunidades B de proteína de toxina Shiga.

6. La proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque las proteínas de toxina Shiga son proteínas Stx2e.

7. La proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque las proteínas de toxina de cólera son subunidades B de proteína de toxina de cólera.

8. La proteína híbrida de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10, 12, 14 o 16.

9. La proteína híbrida de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 86, 88, 90, 92, 96, 98 o 100.

10. La proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque un péptido de señal secretoria derivado de una planta se adiciona a su amino terminal.

11. La proteína híbrida de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque un péptido de señal de retención de retículo endoplásmico se adiciona a su carboxilo terminal.

12. La proteina híbrida de conformidad con la reivindicación 1 a 9, caracterizada porque un péptido de señal de tránsito de cloroplasto se adiciona - a su amino terminal.

13. Una construcción de DNA, caracterizada porque comprende DNA que codifica la proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. La construcción de DNA de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende DNA que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 9, 11, 13 o 15.

15. La construcción de DNA de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende DNA que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 o 99.

16. La construcción de DNA de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizada porque el DNA que codifica una proteína híbrida es operablemente enlazado a una región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta.

17. La construcción del DNA de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la región 5' -no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta se deriva de Nicotiana tabacum.

18. La construcción del DNA de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque comprende una secuencia de bases representada por cualquiera de las SEQ ID NOS: 24 a 29.

19. La construcción de DNA de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque comprende una secuencia de bases representada por cualquiera de las SEQ ID NOS: 101 a 111.

20. Un vector recombinante, caracterizado porque comprende la construcción de DNA de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19.

21. Un transformante, caracterizado porque se transforma con el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 20.

22. El transformante de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el transformante es una célula de planta transformada o una planta transformada.

23. Una semilla, caracterizada porque se obtiene del transformante de conformidad con la reivindicación 21 o 22.

24. Un péptido, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos representada por una de la SEQ ID NO: 2, 82 u 84.