ES2691985T3 - Vacuna de toxinas bacterianas - Google Patents
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Abstract
Una proteína híbrida que comprende dos proteínas toxinas seleccionadas del grupo que consiste en proteína toxina Shiga (Stx), proteína toxina del cólera (CT) y proteína toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT), en donde dichas proteínas toxinas se unen en tándem a través de un péptido que tiene las siguientes características (A), (B), (C), (D), (E), y (F), y el péptido se añade al extremo carboxi de la proteína híbrida: (A) un número de aminoácidos es de 12 a 30, más preferiblemente de 12 a 22; (B) un contenido en prolina es del 20 al 35%, más preferiblemente del 20 al 27%; y (C) la prolina se distribuye cada dos o tres aminoácidos; (D) el contenido total de alanina, metionina y ácido glutámico en los aminoácidos diferentes de prolina es el 10% o menor; (E) el contenido total de triptófano, leucina, isoleucina, tirosina, fenilalanina y valina en los aminoácidos diferentes de prolina es el 5% o menor; y (F) el contenido total de serina, glicina y asparragina en los aminoácidos diferentes de prolina es el 90% o más.
Description
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DESCRIPCION
Vacuna de toxinas bacterianas Campo tecnico
La presente invencion se refiere a una protema hforida usada para vacunas para enfermedades causadas por toxinas bacterianas tal como toxinas Shiga, toxinas del colera, y toxinas labiles al calor de Escherichia coli, y una construccion de ADN para producir la protema hforida.
Antecedentes tecnicos
Las toxinas Shiga (Stx, verotoxinas) son exotoxinas proteinaceas producidas por Escherichia coli enterohemorragica de especies de Escherichia coli patogenas. Las toxinas Shiga causan enteritis hemorragica, smdrome uremico hemolttico, encefalopatia y similares.
Las toxinas Shiga se clasifican ampliamente en Stx1 y Stx2, cada una de las cuales se clasifica adicionalmente en subclases. Un ejemplo de Stx2 incluye Stx2e que produce la enfermedad de edemas del cerdo. Se sabe que la enfermedad de edemas del cerdo se produce con frecuencia en cerdos recien nacidos una o dos semanas despues del destete. La letalidad debido a infeccion con las bacterias de la enfermedad de edemas es del 50 al 90%, que es extremadamente alta.
Ademas, las toxinas del colera (CT) son exotoxinas proteinaceas producidas por Vibrio cholerae. Se sabe que las CT producen diarrea y emesis graves.
Aun mas, las toxinas labiles al calor de Escherichia coli (LT) son endotoxinas proteinaceas producidas por Escherichia coli enterotoxigenica. Se sabe que las LT producen diarrea y emesis.
Se sabe que las toxinas bacterianas, Stx, LT y CT incluyen todas un pentamero subunidad B implicado en adhesion a las celulas y un monomero subunidad A que tiene una toxicidad. Tambien se sabe que las LT y las CT son estructural y funcionalmente similares.
Como metodo de prevenir las enfermedades causadas por esas toxinas bacterianas, se conocen metodos de administrar una vacuna mediante una inyeccion o un espray nasal y administrar la vacuna por via oral.
Por ejemplo, se conoce una tecnologfa donde se produce una protema Stx2e atenuada usando Escherichia coli recombinante y se administra a cerdos mediante una inyeccion (documento de no patente 1). Sin embargo, por ejemplo, una cantidad de la protema Stx2e atenuada producida por la Escherichia coli recombinante no es suficiente y la administracion de la vacuna mediante inyeccion requiere trabajo humano. Esto ha sido un problema.
Ademas, el metodo de administrar la vacuna por via oral atrae atencion creciente en terminos de reducir el trabajo en un campo de ganadena. En tal contexto, se ha desarrollado una tecnologfa donde la protema toxina bacteriana se produce por plantas usando una tecnologfa transgenica. Por ejemplo, se ha descrito una planta transgenica que contiene ADN que codifica una subunidad B de la protema LT (LTB) y expresa el ADN (documentos de patente 1 y 2). Tambien se ha descrito una planta transgenica que expresa ADN que codifica la protema LT o la protema CT (documento de patente 3). Sin embargo, ha habido un problema que la cantidad de la protema producida no es suficiente en esas tecnologfas. Se ha descrito un ejemplo de producir la LTB en Lactuca sativa (documento de no patente 2). En este estudio, un gen de la subunidad B de la protema LT incluyendo codones modificados se expresa en Lactuca sativa usando tanto un promotor del ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S) que es un promotor que se expresa mucho en una planta como una secuencia de Kozak que es un potenciador. Como resultado, se ha descrito que la subunidad B de la protema LT se acumula en una cantidad de aproximadamente el 2,0% en masa de la protema soluble total de Lactuca sativa. Sin embargo, se piensa que este nivel de la protema acumulada es insuficiente para prevenir eficazmente una enfermedad bacteriana utilizando la planta transgenica. Es decir, es necesario producir y acumular de forma eficaz la protema de la toxina bacteriana diana en celulas vegetales. Se proporciona una subunidad de toxina bacteriana Imbrida por el documento WO 2005/011733. Se proporciona un Imbrido adicional que comprende la subunidad A de LT-A y la subunidad B de CT-B por el documento WO 2001/89456. La inmunogenicidad de un hfbrido que comprende la subunidad B de la toxina Shiga 2 y la subunidad B de la enterotoxina labil al calor de E. coli ha sido estudiada por Ran (2007) Veterinary Microbiology 127, no.1-2, paginas 209-215.
Los inventores de la presente invencion encontraron que la protema Stx2e se podna producir de forma eficaz en una planta tal como Lactuca sativa y acumular a una alta concentracion en un cuerpo vegetal expresando la protema Stx2e donde un peptido senal secretor derivado de una planta se ha anadido a su extremo amino, usando una region 5' no traducida (ADH 5'-UTR) de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta, y presentaron la patente (documento de patente 4).
[Documento de patente 1] JP 10-5077916 A
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[Documento de patente 2] JP 2000-166411 A [Documento de patente 3] JP 2002-533068 A [Documento de patente 4] WO 2009/004842 A1
[Documento de no patente 1] Makino et al., Microbial Pathogenesis, Volumen 31, Numero 1, Julio 2001, pp. 1-8(08) [Documento de no patente 2] Kim et al., Protein Expression and Purification, Volumen 51, Numero 1, Enero 2006, pp. 22-27(06)
Compendio de la invencion
Es un objeto de la presente invencion producir de forma mas eficaz una protema Stx y otras protemas toxinas bacterianas que tienen una conformacion similar a la misma usando celulas vegetales.
Mediante la produccion de una protema hnbrida en la que dos o tres protemas toxinas bacterianas tales como Stx2e y CT se unen en tandem a traves de un peptido que tiene una secuencia particular en celulas vegetales, los inventores de la presente invencion han tenido exito en acumular la protema toxina bacteriana a una alta concentracion en celulas vegetales y han completado la presente invencion.
La presente invencion es como sigue:
1. Una protema hnbrida que comprende dos protemas toxinas seleccionadas del grupo que consiste en protema toxina Shiga (Stx), protema toxina del colera (CT) y protema toxina labil al calor de Escherichia coli (LT), en donde dichas protemas toxinas se unen en tandem a traves de un peptido que tiene las siguientes caractensticas (A),
(B), (C), (D), (E) y (F), y el peptido se anade al extremo carboxi de la protema tnbrida:
(A) un numero de aminoacidos es de 12 a 30, mas preferiblemente de 12 a 22;
(B) un contenido de prolina es desde el 20 hasta el 35%, mas preferiblemente del 20 al 27%; y
(C) la prolina esta distribuida cada dos o tres aminoacidos;
(D) el contenido total de alanina, metionina y acido glutamico en los aminoacidos diferentes de prolina es del 10% o menor;
(E) el contenido total de triptofano, leucina, isoleucina, tirosina, fenilalanina y valina en los aminoacidos diferentes de prolina es del 5% o menor; y
(F) el contenido total de serina, glicina y asparragina en los aminoacidos diferentes de prolina es del 90% o mas.
2. La protema hnbrida segun el punto 1, en donde las protemas toxina Shiga son subunidades B de la protema Stx2e, y las protemas toxinas del colera son subunidades B de la protema toxina del colera.
3. La protema hnbrida segun el punto 1 o 2, en donde un peptido senal secretor derivado de una planta se anade a su extremo amino.
4. La protema hnbrida segun cualquiera de los puntos 1 a 3, en donde un peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico se anade en su extremo carboxilo.
5. La protema hnbrida segun cualquiera de los puntos 1 a 3, en donde un peptido senal de transito al cloroplasto se anade a su extremo amino.
6. Una construccion de ADN que comprende ADN que codifica la protema hnbrida segun cualquiera de los puntos 1 a 5.
7. La construccion de ADN segun el punto 6, en donde el ADN que codifica la protema hnbrida esta operativamente unido a una region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta, preferiblemente Nicotiana tabacum.
8. Un vector recombinante que comprende la construccion de ADN segun el punto 6 o 7.
9. Un transformante transformado con el vector recombinante segun el punto 8, en donde el transformante es una celula eucariota o una celula procariota.
10. El transformante segun el punto 9, en donde el transformante es una celula vegetal transformada o una planta transformada.
11. Una semilla, que se obtiene del transformante segun el punto 9 o 10, en donde la semilla comprende el vector recombinante de la reivindicacion 8.
La divulgacion se refiere a:
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(1) una protema hforida, en la que dos o tres de protemas toxina Shiga, protemas toxina del colera, o protemas toxina labil al calor de Escherichia coli estan cada una unida en tandem a traves de un peptido que tiene las siguientes caractensticas (A) y (B):
(A) el numero de aminoacidos es de 12 a 30; y
(B) el contenido de prolina es del 20 al 35%;
(2) la protema hforida segun el punto (1), en la que el peptido ademas tiene la siguiente caractenstica (C):
(C) la prolina esta distribuida cada dos o tras aminoacidos;
(3) la protema hforida segun el punto (2), en la que el peptido tiene una secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 2, 82 o 84;
(4) la protema hforida segun el punto (3), en la que dos de las protemas toxinas Shiga, protemas toxinas del colera, o protemas toxina labil al calor de Escherichia coli estan unidas en tandem a traves de un peptido que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 2;
(5) la protema hforida segun cualquiera de los puntos (1) a (4), en la que las protemas toxinas Shiga son subunidades B de la protema toxina Shiga;
(6) la protema hforida segun cualquiera de los puntos (1) a (5), en la que las protemas toxinas Shiga son protemas Stx2e;
(7) la protema hforida segun cualquiera de los puntos (1) a (4), en la que las protemas toxinas del colera son subunidades B de la protema toxina del colera;
(8) la protema hforida segun el punto (4), que incluye una secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 10, 12, 14 o 16;
(9) la protema hforida segun el punto (3), que incluye una secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, o 100;
(10) la protema hforida segun cualquiera de los puntos (1) a (9), en la que un peptido senal secretor derivado de una planta se anade en su extremo amino;
(11) la protema hforida segun el punto (10), en la que un peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico se anade en su extremo carboxilo;
(12) la protema hforida segun cualquiera de los puntos (1) a (9), en la que un peptido senal de transito al cloroplasto se anade a su extremo amino;
(13) una construccion de ADN que incluye ADN que codifica la protema hforida segun cualquiera de los puntos (1) a (12);
(14) la construccion de ADN segun el punto (13), que incluye ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 9, 11, 13, o 15;
(15) la construccion de ADN segun el punto (13), que incluye ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, o 99;
(16) la construccion de ADN segun cualquiera de los puntos (13) a (15), en la que el ADN que codifica una protema hfbrida esta operativamente unida a una region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta;
(17) la construccion de ADN segun el punto (16), en la que la region 5' no traducida del gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta deriva de Nicotiana tabacum;
(18) una construccion de ADN segun el punto (17), que incluye una secuencia de bases representada por cualquiera de SEQ ID NO: 24 a 29;
(19) una construccion de ADN segun el punto (17), que una secuencia de bases representada por cualquiera de SEQ ID NO: 101 a 111;
(20) un vector recombinante, que incluye la construccion de ADN segun cualquiera de los puntos (13) a (19);
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(21) un transformante transformado con el vector recombinante segun el punto (20);
(22) un transformante segun el punto (21), en el que el transformante es una celula vegetal transformada o una planta transformada;
(23) una semilla, que se obtiene del transformante segun el punto (21) o (22); y
(24) un peptido que tiene una secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 2, 82 o 84.
Breve descripcion de los dibujos
En los dibujos acompanantes:
La figura 1 es una vista que ilustra un diseno de vectores de expresion de Stx2eB, en los que una flecha indica un sitio de inicio de la traduccion, y un triangulo invertido indica un sitio que se va a cortar despues de la traduccion;
La figura 2 es una fotograffa que ilustra los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de expresion transitoria usando protoplastos de Lactuca sativa;
La figura 3 es una fotograffa que ilustra los niveles de CTB acumulados obtenidos en un experimento de expresion transitoria usando protoplastos de Lactuca sativa;
La figura 4 es una vista que ilustra un diseno de construcciones de ADN que codifican una protema de fusion Stx2eB- YFP, en las que una flecha indica un sitio de inicio de la traduccion, y un triangulo invertido indica un sitio que se va a cortar despues de la traduccion;
La figura 5 es una fotograffa que ilustra la localizacion de la protema de fusion Stx2eB-YFP obtenida en un experimento de expresion transitoria usando protoplastos de celulas de tabaco cultivadas;
La figura 6 es una fotograffa que ilustra la localizacion de la protema de fusion Stx2eB-YFP obtenida en un experimento de expresion transitoria usando protoplastos de celulas de tabaco cultivadas;
La figura 7 es una fotograffa que ilustra la localizacion de GFP de tipo vacuola y la protema de fusion Stx2eB-YFP en coexpresion de ARF1pWT y ARFpDN obtenida en un experimento de expresion transitoria usando los protoplastos de celulas de tabaco cultivadas;
La figura 8 es una fotograffa que ilustra los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformacion usando celulas de tabaco cultivadas (BY2), en la que el numero en cada carril indica un numero de clon;
La figura 9 es una fotograffa que ilustra los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformacion usando celulas de tabaco cultivadas (BY2), en la que el numero en cada carril indica un numero de clon;
La figura 10 es fotograffas que ilustra los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformacion usando celulas de tabaco cultivadas (BY2), en la que el numero en cada carril indica el numero de clon;
La figura 11 es un grafico que ilustra los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformacion usando celulas de tabaco cultivadas (BY2), en la que cada numero indica el numero de clon;
La figura 12 es un grafico que ilustra una relacion entre los niveles de ARNm de Stx2eB y los niveles de Stx2eB acumulados;
La figura 13 es una vista que ilustra un diseno de construcciones de ADN que codifican Stx2eB, en la que A, B y C indican los disenos de un tipo de reffculo endoplasmico, un tipo citoplasmico y un tipo de cloroplasto de las construcciones de ADN, respectivamente;
La figura 14 es una vista que ilustra un diseno de construcciones de ADN que codifican CTB, en la que A, B y C indican los disenos de un tipo de reffculo endoplasmico, un tipo citoplasmico y un tipo de cloroplasto de las construcciones de ADN, respectivamente;
La figura 15 es una fotograffa que ilustra los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de expresion transitoria usando los protoplastos de Lactuca sativa;
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La figura 16 es una fotograffa que ilustra los niveles de CTB acumulados obtenidos en un experimento de expresion transitoria usando los protoplastos de Lactuca sativa;
La figura 17 es fotograffas que ilustran los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformacion usando celulas de tabaco cultivadas (BY2), en la que el numero en cada carril indica el numero de clon;
La figura 18 es fotograffas que ilustran los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformacion usando un cuerpo de planta de tabaco, en la que el numero en cada carril indica el numero de clon;
La figura 19 es fotograffas que ilustran los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformacion usando un cuerpo de planta de tabaco, en la que el numero en cada carril indica el numero de clon;
La figura 20 es una vista que ilustra el diseno de construcciones de ADN que codifican Stx2eB;
La figura 21 es una vista que ilustra el diseno de construcciones de ADN que codifican CTB;
La figura 22 es fotograffas que ilustran los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformacion usando celulas de tabaco cultivadas (BY2), y
La figura 23 es fotograffas que ilustran los niveles de CTB acumulados obtenidos en un experimento de transformacion usando celulas de tabaco cultivadas (BY2).
Descripcion de formas de realizacion
En una protema tubrida de la presente divulgacion, dos o tres de protemas toxina Shiga (Stx), protemas toxina del colera (CT), o protemas toxina labil al calor de Escherichia coli (LT) estan cada una unida en tandem a traves de un peptido que tiene las siguientes caractensticas (A) y (B):
(A) el numero de aminoacidos es de 12 a 30; y
(B) el contenido de prolina es del 20 al 35%.
Las protemas toxinas Shiga (Stx) se clasifican en tipo 1 (Stx1) y tipo 2 (Stx2). La Stx1 se clasifica adicionalmente en subclases desde a hasta d, y la Stx2 se clasifica adicionalmente en subclases de a hasta g, respectivamente. La toxina Shiga incluye una subunidad A que es un cuerpo principal de toxina y cinco subunidades B implicadas en la invasion en la mucosa intestinal.
De estas, por ejemplo, se conoce Stx2e como una toxina de enfermedad de edemas del cerdo, y su subunidad A (Stx2eA) esta representada por una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4 y su subunidad B (Stx2eB) esta representada por una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6.
En Stx2eA y Stx2eB, uno o varios aminoacidos se pueden sustituir, delecionar, insertar o anadir en las secuencias de aminoacidos representadas por SEQ ID NO: 4 o 6 siempre que puedan producir una respuesta inmunitaria administrandolas a cerdos. Por ejemplo, el termino “varios” significa el numero de preferiblemente 2 a 30, mas preferiblemente de 2 a 20, y aun mas preferiblemente de 2 a 10, mas preferiblemente de 2 a 5, y aun mas preferiblemente de 2 a 3, en Stx2eB.
Ademas, Stx2eA y Stx2eB pueden ser las que tienen una identidad de preferiblemente el 85% o mas, mas preferiblemente el 90% o mas, y aun mas preferiblemente del 95% o mas respecto a las secuencias de aminoacidos representadas por SEQ ID NO: 4 y 6, y ser capaces de producir la respuesta inmunitaria administrandolas al cerdo.
La toxina del colera (CT) incluye una subunidad A (CTA) que es el cuerpo principal de la toxina y cinco subunidades B (CTB) representada por SEQ ID NO: 8 e implicadas en la invasion en la mucosa intestinal.
En CTB, uno o varios aminoacidos se pueden sustituir, delecionar, insertar o anadir en la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 8 siempre que CTB pueda producir la respuesta inmunitaria administrandola a animales. El termino “varios” significa preferiblemente de 2 a 10, mas preferiblemente de 2 a 5, y aun mas preferiblemente de 2 a 3.
Ademas, CTB pueden ser las que tienen una identidad de preferiblemente el 85% o mas, mas preferiblemente el 90% o mas, y aun mas preferiblemente del 95% o mas respecto a las secuencias de aminoacidos representadas por SEQ ID NO: 8, y ser capaces de producir la respuesta inmunitaria administrandolas a animales.
La protema toxina labil al calor de Escherichia coli (LT) incluye una subunidad A que es el cuerpo principal de la toxina y cinco subunidades B implicadas en la invasion en la mucosa intestinal.
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La toxina Shiga, la toxina del colera y la toxina labil al calor de Escherichia coli tambien se denominan colectivamente “toxinas bacterianas” en el presente documento.
El numero de aminoacidos en el peptido es preferiblemente de 12 a 25 y mas preferiblemente de 12 a 22. El contenido de prolina en el peptido es preferiblemente del 20 al 27% y mas preferiblemente del 20 al 25%.
Ademas, la prolina se distribuye preferiblemente cada dos o tres residuos en el peptido. Pero, en este caso, los aminoacidos diferentes de prolina pueden ser consecutivos en 5 residuos y preferiblemente 4 residuos en el extremo del peptido.
Ademas, el contenido total de serina, glicina, arginina, lisina, treonina, glutamina, asparragina, histidina, y acido aspartico en los aminoacidos diferentes de prolina es preferiblemente del 70% o mas, mas preferiblemente el 80% o mas, y aun mas preferiblemente del 90% o mas en el peptido. Ademas, el contenido total de serina, glicina y asparragina en los aminoacidos diferentes de prolina es preferiblemente del 70% o mas, mas preferiblemente el 80% o mas, y aun mas preferiblemente del 90% o mas en el peptido. Aun mas, el contenido total de serina y glicina en los aminoacidos diferentes de prolina es preferiblemente del 70% o mas, mas preferiblemente el 80% o mas, y aun mas preferiblemente del 90% o mas en el peptido. Esto es porque el peptido que contiene esos aminoacidos abundantemente es difmil que forme una estructura secundaria (estructura de lamina p y estructura de helice).
Mientras tanto, el contenido total de alanina, metionina, y acido glutamico en los aminoacidos diferentes de prolina es preferiblemente el 30% o menor, mas preferiblemente el 20% o menor, y aun mas preferiblemente el 10% o menor en el peptido. Esto es porque el peptido que contiene esos aminoacidos abundantemente forma facilmente la estructura de helice. El contenido total de triptofano, leucina, isoleucina, tirosina, fenilalanina, y valina en los aminoacidos diferentes de prolina es preferiblemente el 20% o menor, mas preferiblemente el 10% o menor, y aun mas preferiblemente el 5% o menor en el peptido. Esto es porque el peptido que contiene esos aminoacidos abundantemente forma facilmente la estructura de lamina p y la estructura de helice.
El peptido se selecciona preferiblemente del peptido (PG12) que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 2, el peptido (PG17) que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 82, y el peptido (PG22) que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 84.
En la protema tubrida de la presente invencion, dos o tres protemas tubridas de la subunidad A y la subunidad B se pueden unir en tandem a traves del peptido anterior, o dos o tres subunidades A se pueden unir en tandem a traves del peptido, o dos o tres subunidades B se pueden unir en tandem a traves del peptido. Cuando la protema tubrida contiene la subunidad A, la subunidad A esta preferiblemente atenuada. En la protema tubrida de la presente invencion, preferiblemente dos o tres subunidades B se unen en tandem a traves del peptido. En la protema tubrida de la presente invencion, preferiblemente dos subunidades B se unen en tandem a traves de PG12.
Ademas, en la protema tubrida de la presente invencion, el peptido se anade preferiblemente en su extremo C. PG12 en particular se anade preferiblemente a su extremo C en la protema tubrida de la presente invencion.
La protema tubrida de la presente invencion tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, o 100, por ejemplo. En la protema tubrida que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 10, dos Stx2eB estan unidas en tandem a traves de PG12. En la protema tubrida que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 12, dos CTB estan unidas en tandem a traves de PG12. En la protema tubrida que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 14, dos Stx2eB estan unidas en tandem a traves de PG12 y ademas PG12 esta unido al extremo C de la misma. En la protema tubrida que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 16, dos CTB estan unidas en tandem a traves de PG12 y ademas PG12 esta unido al extremo C de la misma. En la protema tubrida que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 86, tres Stx2eB estan cada una unidas en tandem a traves de PG12. En la protema tubrida que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 88, tres Stx2eB estan cada una unidas en tandem a traves de PG12 y ademas PG12 esta unida al extremo C de la misma. En la protema hfbrida que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 90, dos Stx2eB estan unidas en tandem a traves de PG17 y ademas PG12 esta unida al extremo C de la misma. En la protema tubrida que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 92, dos Stx2eB estan unidas en tandem a traves de PG22 y ademas PG12 esta unida al extremo C de la misma. En la protema tubrida que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 94, tres CTB estan cada una unidas en tandem a traves de PG12. En la protema tubrida que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 96, tres CTB estan cada una unidas en tandem a traves de PG12 y ademas PG12 esta unida al extremo C de la misma. En la protema tubrida que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 98, dos CTB estan unidas en tandem a traves de PG17 y ademas PG12 esta unida al extremo C de la misma. En la protema tubrida que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 100, dos CTB estan unidas en tandem a traves de PG22 y ademas PG12 esta unida al extremo C de la misma.
Usando el peptido tal como PG12, PG17 o PG22 como un enlazador para unir las protemas toxinas bacterianas, el nivel de la protema toxina bacteriana acumulado en la celula vegetal se aumenta.
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En la protema tnbrida de la presente invencion, un peptido senal secretor derivado de una planta o un peptido senal de transito al cloroplasto preferiblemente se anade a su extremo amino. Aqm, el termino “adicion” es un concepto que incluye tanto el caso donde el peptido senal secretor se une directamente al extremo amino de las dos o tres protemas toxinas bacterianas unidas a traves del peptido como el caso donde el peptido senal secretor se une a la misma a traves de otro peptido.
El peptido senal secretor deriva de preferiblemente una planta que pertenece a la familia Solanaceae, Brassicaceae, o Asteraceae, mas preferiblemente una planta que pertenece al genero Nicotiana, Arabidopsis, Lactuca, etc., y mas preferiblemente Nicotiana tabacum o Arabidopsis thaliana, Lactuca sativa, etc.
Ademas, preferiblemente deriva de una p-D-glucano exohidrolasa de Nicotiana tabacum o una peroxidasa de 38 kDa de Nicotiana tabacum (Acceso de GenBank D42064).
Un ejemplo del peptido senal secretor incluye un peptido que deriva de una p-D-glucano exohidrolasa de Nicotiana tabacum y tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 18.
Un ejemplo del peptido senal de transito al cloroplasto incluye un peptido senal de transito al cloroplasto (peptido de transito, TP, sEq ID NO: 79) derivado de Rbcs (subunidad pequena de Rubisco) de Lactuca sativa (acceso de GenBank D14001). Una secuencia de bases de ADN que codifica el peptido senal de transito al cloroplasto derivado de Rbcs de Lactuca sativa esta representada por SEQ ID NO: 80. En el presente documento, la protema tnbrida que incluye el peptido senal de transito al cloroplasto anadido a su extremo amino tambien se denomina como una protema tnbrida de tipo cloroplasto (Chl), y una construccion de ADN que codifica la protema tnbrida de tipo cloroplasto (Chl) tambien se denomina una construccion de ADN de tipo cloroplasto. La protema tnbrida de tipo cloroplasto se acumula de forma eficaz particularmente en una planta cuyo cloroplasto se desarrolla bien tal como Nicotiana tabacum.
La protema tnbrida en la que no se anade ni el peptido senal secretor ni la protema senal de transito al cloroplasto en su extremo amino se denomina una protema tnbrida de tipo citoplasma (Cyt), y la construccion de ADN que codifica la protema tnbrida de tipo citoplasma se denomina como una construccion de ADN de tipo citoplasma. En la protema tnbrida de tipo citoplasma, en particular preferiblemente tres subunidades B de protema toxina bacteriana se unen en tandem a traves del peptido.
En la protema tnbrida de la presente invencion, el peptido senal tal como un peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico y un peptido senal de transporte vacuolar se puede anadir al extremo carboxilo. Aqm, el termino “adicion” es el concepto que incluye tanto el caso donde el peptido senal se une directamente al extremo carboxilo de la protema tnbrida como el caso donde el peptido senal se une a la misma a traves de otro peptido. En el presente documento, la protema tnbrida en la que el peptido senal secretor se anade a su extremo amino y el peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico se anade al extremo carboxilo tambien se denomina una protema tnbrida de tipo retmulo endoplasmico (ER), y la construccion de ADN que codifica la protema tnbrida de tipo retmulo endoplasmico tambien se denomina una construccion de ADN de tipo retmulo endoplasmico. La protema tnbrida de tipo retmulo endoplasmico se acumula de forma eficaz en particular en una planta tal como Lactuca sativa.
En la protema tnbrida de la presente invencion, el peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico preferiblemente se anade a su extremo carboxilo. Los ejemplos de peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico incluyen un peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico que incluye la secuencia KDEL (SEQ ID NO: 19), la secuencia HDEL (SEQ ID NO: 20), la secuencia KDEF (SEQ ID NO: 21), o la secuencia HDEF (SEQ ID NO: 22).
El peptido senal de transporte vacuolar deriva preferiblemente de una planta que pertenece a la familia Solanaceae, Brassicaceae, o Asteraceae, mas preferiblemente una planta que pertenece al genero Nicotiana, Arabidopsis, Armoracia, etc., y mas preferiblemente Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Armoracia rusticana, etc. Ademas, el peptido deriva preferiblemente de una quitinasa. La secuencia de aminoacidos de un peptido senal de transporte vacuolar derivada de una quitinasa de tabaco esta representada por SEQ ID NO: 76. Mientras tanto, la secuencia de bases del ADN que codifica un peptido senal de transporte vacuolar derivada de una quitinasa de tabaco esta representada por SEQ ID NO: 75, por ejemplo.
Ademas, el peptido preferiblemente deriva de una isozima C1a de peroxidasa de rabano picante. La secuencia de aminoacidos de un peptido senal de transporte vacuolar derivada de una isozima C1a de peroxidasa de rabano picante esta representada por SEQ ID NO: 78. Mientras tanto, la secuencia de bases del ADN que codifica un peptido senal de transporte vacuolar derivada de una isozima C1a de peroxidasa de rabano picante esta representada por SEQ ID NO: 77, por ejemplo. En el presente documento, la protema tnbrida en la que el peptido senal secretor se anade a su extremo amino, y el peptido senal de transporte vacuolar se anade a su extremo carboxilo tambien se denomina protema tnbrida de tipo vacuola (Vac), y una construccion de ADN que codifica la protema tnbrida de tipo vacuola tambien se denomina una construccion de ADN de tipo vacuola.
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La protema hnbrida de la presente invencion se puede sintetizar qmmicamente, o se puede producir por ingeniena genetica. Un metodo de produccion por ingeniena genetica se describe posteriormente.
La construccion de ADN de la presente invencion se caracteriza por contener ADN que codifica la protema hnbrida de la presente invencion.
Es decir, la construccion de ADN de la presente invencion incluye ADN en el que los ADN que codifican las dos o tres protemas toxinas bacterianas estan unidos en tandem a traves de ADN que codifica el peptido. El ADN que codifica el peptido esta representado por, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 (PG12), SeQ ID NO: 81 (PG17), y SEQ ID NO: 83 (PG22). Los ejemplos del ADN que codifica la protema toxina bacteriana incluyen ADN (SEQ ID NO: 3) que codifica Stx2eA, ADN (SEQ ID NO: 5) que codifica Stx2eB, y ADN (SEQ ID NO: 7) que codifica CTB. El ADN que codifica el peptido y el ADN que codifica la protema toxina bacteriana se unen haciendo coincidir sus marcos de lectura excepto los codones de terminacion.
El ADN que codifica la protema toxina bacteriana se puede obtener por una tecnica de ingeniena genetica comun basada en la secuencia de bases de SEQ ID NO: 3, 5 o 7, por ejemplo. Espedficamente, se prepara una genoteca de ADNc de una bacteria que produce cada toxina bacteriana segun un metodo convencional, y se selecciona un clon deseado usando una sonda preparada de la genoteca basada en la secuencia de bases. Alternativamente, el ADN tambien se puede sintetizar qmmicamente basado en la secuencia de bases, o sintetizar por PCR con ADN genomico como molde usando una secuencia de bases 5' y 3'-terminal de la secuencia de bases como cebadores, por ejemplo.
El ADN que codifica la protema hnbrida de la presente invencion esta representado por SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 97 o 99.
En el ADN que codifica la protema hnbrida, preferiblemente, se modifica apropiadamente un codon correspondiente a un aminoacido que compone la protema hnbrida de modo que la cantidad de la protema hnbrida traducida se aumente dependiendo de una celula huesped en la que se produce la protema hnbrida.
Como el metodo de modificar el codon, un metodo de Kang y col. (2004) puede servir como referencia, por ejemplo, Y, se ejemplifica el metodo de seleccionar el codon frecuentemente usado en la celula huesped, el metodo de seleccionar el codon en el que el contenido de GC es alto, o el metodo de seleccionar el codon frecuentemente usado en genes de mantenimiento en la celula huesped.
Ademas, el ADN que codifica la protema hnbrida puede ser ADN que hibrida con ADN que tiene la secuencia de bases de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, o 99 en condiciones rigurosas. El termino “condiciones rigurosas” se refiere a la condicion donde se forma un denominado hnbrido espedfico mientras que no se forma ningun hnbrido no espedfico. Se ejemplifica la condicion donde dos ADN con alta identidad, por ejemplo, dos ADN que tienen la identidad de preferiblemente el 80% o mas, mas preferiblemente el 90% o mas, y en particular preferiblemente el 95% o mas hibridan entre sf mientras que dos ADN con menor identidad que esa no hibridan. Ademas, se ejemplifica la condicion de SSX 2* (NaCl 330 mM, acido dtrico 30 mM) a 42°C y preferiblemente SSC 0,1* (NaCl 330 mM, acido dtrico 30 mM) a 60°C.
En la construccion de ADN de la presente invencion, preferiblemente el ADN que codifica la protema hnbrida esta operativamente unido a un potenciador. El termino “operativamente” se refiere al hecho de que la protema hnbrida se produce en celulas huespedes cuando un vector obtenido insertando la construccion de ADN de la presente invencion en un vector que incluye un promotor adecuado se introduce en celulas huespedes adecuadas. Ademas, el termino “unido” se refiere tanto a un caso donde los dos ADN estan directamente unidos como al caso donde dos ADN estan unidos a traves de otra secuencia de bases.
Los ejemplos del potenciador incluyen la secuencia de Kozak y una region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta. En particular preferiblemente, el ADN que codifica la protema tnbrida esta operativamente unido a la region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta.
La region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa se refiere a una region que incluye una secuencia entre la base en el sitio de inicio de la transcripcion de un gen que codifica una alcohol deshidrogenasa y la base antes del sitio de inicio de la traduccion (ATG, metionina). La region tiene una funcion de aumentar un nivel de traduccion. La frase “funcion de aumentar un nivel de traduccion” se refiere a una funcion para aumentar una cantidad de una protema producida por la traduccion cuando la informacion codificada en un gen estructural se transcribe y despues se traduce para producir una protema. La region puede derivar de una planta, y preferiblemente deriva de una planta que pertenece a la familia Solanaceae, Brassicaceae, o Asteraceae, mas preferiblemente derivada de una planta que pertenece al genero Nicotiana, Arabidopsis, Lactuca, etc., y mas preferiblemente derivada de Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Lactuca sativa, etc.
La region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa es en particular preferiblemente una region que incluye la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 23, que es la region 5' no traducida de un gen alcohol deshidrogenasa (NtADH 5'-UTR) derivado de Nicotiana tabacum, por ejemplo.
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La region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta se puede aislar de un gen de alcohol deshidrogenasa de una celula vegetal cultivada donde una alcohol deshidrogenasa se expresa mucho, por ejemplo (vease el documento JP 2003-79372 A). Mientras tanto, en el caso de una region que tiene una secuencia de bases determinada, tal como la region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de Nicotiana tabacum, la region tambien se puede sintetizar mediante smtesis qmmica, PCR usando un ADN genomico como molde y usando las secuencias de bases de los extremos 5' y 3' de la region como cebadores, o similar. Ademas, si una parte de la region que tiene una secuencia de bases determinada se usa como sonda, se puede buscar y aislar la region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de otra planta.
La region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa representada por la secuencia de bases de SEQ ID NO: 23 puede tener sustitucion, delecion, insercion o adicion de una o varias bases siempre que la region tenga una funcion para aumentar un nivel de traduccion. El termino “varias” significa el numero de preferiblemente 2 a 10, mas preferiblemente 2 a 5, y en particular preferiblemente 2 a 3.
Ademas, se puede usar ADN que tiene una identidad de preferiblemente el 85% o mas y en particular preferiblemente el 90% o mas respecto a la region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa y que tiene capacidad de aumentar un nivel de traduccion.
Si la region tiene una funcion pretendida para aumentar un nivel de traduccion o no se puede confirmar mediante, por ejemplo, un ensayo transitorio usando un gen GUS (p-glucuronidasa) o un gen luciferasa como un gen indicador en celulas de tabaco cultivadas, o un ensayo en celulas transformadas manipuladas para que porten esos genes en un cromosoma.
La construccion de ADN de la presente invencion tiene la secuencia de bases representada por cualquiera de SEQ ID NO: 24 a 29 y SEQ ID NO: 101 a 111, por ejemplo.
La construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 24 es la construccion de ADN en la que el ADN (SEQ ID NO: 9) que codifica la protema hnbrida en la que dos protemas Stx2eB estan unidas en tandem a traves de PG12 esta unido a la region 5' no traducida (NtADH 5'-UTR, SEQ ID NO: 23) de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de Nicotiana tabacum. Ademas, la construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 25 es la construccion de ADN en la que el ADN (SEQ ID NO: 11) que codifica la protema hnbrida en la que dos protemas CTB estan unidas en tandem a traves de PG12 esta unido a NtADH 5'-UTR.
La construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 26 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hnbrida en la que dos protemas Stx2eB estan unidas en tandem a traves de PG12, el peptido serial secretor esta anadido a su extremo amino, y el peptido serial de retencion en el retmulo endoplasmico esta anadido en su extremo carboxilo esta unido a NtADH 5'-UTR. Ademas, la construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 27 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hnbrida en la que dos protemas CTB estan unidas en tandem a traves de PG12, el peptido senal secretor esta anadido a su extremo amino, y el peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico esta anadido en su extremo carboxilo esta unido a NtADH 5'-UTR.
La construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 28 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hnbrida en la que dos protemas Stx2eB estan unidas en tandem a traves de PG12, el peptido senal secretor esta anadido a su extremo amino, PG12 esta unido en su extremo carboxilo y ademas el peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico esta anadido en su extremo carboxilo esta unido a NtADH 5'-UTR. Ademas, la construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 29 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hnbrida en la que dos protemas CTB estan unidas en tandem a traves de PG12, el peptido senal secretor esta anadido a su extremo amino, PG12 esta unido en su extremo carboxilo, y ademas el peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico esta anadido en su extremo carboxilo esta unido a NtADH 5'-UTR.
La construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 101 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hnbrida en la que dos protemas Stx2eB estan unidas en tandem a traves de PG12 y PG12 esta unido a su extremo carboxilo esta unido a NtADH 5'-UTR.
La construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 102 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hnbrida en la que dos protemas Stx2eB estan unidas en tandem a traves de PG17 a NtADH 5'-UTr, el peptido senal secretor esta anadido en su extremo amino, PG12 esta unido a su extremo carboxilo, y ademas el peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico esta anadido a su extremo carboxilo esta unido a NtADH 5'-UtR. Ademas, la construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 103 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hnbrida en la que dos protemas Stx2eB estan unidas en tandem a traves de PG22, el peptido senal secretor esta anadido en su extremo amino, PG12 esta unido a su extremo carboxilo, y ademas el peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico esta anadido a su extremo carboxilo esta unido a NtADH 5'-UTR.
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La construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 104 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hforida en la que dos protemas Stx2eB estan unidas en tandem a traves de PG12, el peptido senal de transito al cloroplasto esta anadido en su extremo amino, PG12 esta unido a su extremo carboxilo, esta unido a NtADH 5'-UTR.
La construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 105 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hforida en la que tres protemas Stx2eB estan cada una unidas en tandem a traves de PG12, y PG12 esta unido a su extremo carboxilo, esta unido a NtADH 5'-UTR.
La construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 106 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema Imbrida en la que tres protemas Stx2eB estan cada una unidas en tandem a traves de PG12, el peptido senal secretor esta anadido en su extremo amino, y PG12 esta unido a su extremo carboxilo, y ademas el peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico esta anadido a su extremo carboxilo esta unido a NtADH 5'-UTR.
La construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 107 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hforida en la que tres protemas Stx2eB estan cada una unidas en tandem a traves de PG12, el peptido senal de transito al cloroplasto esta anadido en su extremo amino, y PG12 esta unido a su extremo carboxilo, esta unido a NtADH 5'-UTR.
La construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 108 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hforida en la que dos protemas CTB estan unidas en tandem a traves de PG12, y PG12 esta unido a su extremo carboxilo, esta unido a NtADH 5'-UTR.
La construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 109 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hforida en la que dos protemas CTB estan unidas en tandem a traves de PG17, el peptido senal esta anadido a su extremo amino, PG12 esta unido a su extremo carboxilo, y ademas el peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico esta anadido a su extremo carboxilo esta unido a NtADH 5'- UTR. Ademas, la construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 110 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hforida en la que dos protemas CTB estan unidas en tandem a traves de PG22, el peptido senal esta anadido a su extremo amino, PG12 esta unido a su extremo carboxilo, y ademas el peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico esta anadido a su extremo carboxilo esta unido a NtADH 5'-UTR.
La construccion de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 111 es la construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema hforida en la que dos protemas CTB estan unidas en tandem a traves de PG12, el peptido senal de transito al cloroplasto esta anadido a su extremo amino, y PG12 esta unido a su extremo carboxilo, esta unido a NtADH 5'-UTR.
La construccion de ADN de la presente invencion se puede preparar por una tecnica de ingeniena genetica general, que incluye los siguientes procedimientos: digerir los ADN incluyendo la region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta, un ADN que codifica un peptido senal secretor derivado de una planta, un ADN que codifica un peptido senal de transito al cloroplasto, un ADN que codifica una protema toxina bacteriana, y un ADN que codifica un peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico con enzimas de restriccion adecuadas; y ligar los fragmentos resultantes con una ligasa adecuada.
El vector recombinante de la presente invencion se caracteriza por incluir la construccion de ADN de la presente invencion. El vector recombinante de la presente invencion puede ser un vector obtenido insertando un ADN que codifica una protema hforida de la presente invencion en un vector de modo que el ADN se pueda expresar en celulas huespedes en las que se va introducir el vector. El vector no esta particularmente limitado siempre que se pueda replicar en celulas huespedes, y los ejemplos del mismo incluyen un ADN de plasmido y un ADN vmco. Ademas, el vector preferiblemente incluye un marcador selectivo tal como un gen de resistencia a farmaco. El ADN de plasmido se puede preparar de Escherichia coli o Agrobacterium por el metodo de extraccion alcalina (Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7:1513) o un metodo modificado de la misma. Se pueden usar plasmidos comercialmente disponibles tal como pBI221, pBI121, pBI101, y pIG121Hm. El ADN vmco puede ser, por ejemplo, pTB2 (Donson et al., 1991) (vease Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of a bacterial gene by a tabacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci.(1991) 88: 7204-7208).
Los promotores que se van a usar en los vectores se pueden seleccionar apropiadamente dependiendo de las celulas huespedes en las que se van a introducir los vectores. Los promotores son preferiblemente un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al., 1985, Nature 313:810), un promotor de actina de arroz (Zhang et al.1991 Plant Cell 3:1155), un promotor de ubiquitina de mafz (Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol., 23:567), etc. por ejemplo. Mientras tanto, los terminadores que se van a usar en vectores se pueden seleccionar apropiadamente dependiendo de las celulas huespedes en las que se van a introducir los vectores. Los terminadores son preferiblemente un
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terminador de la transcripcion del gen de la nopalina sintasa, un terminador 35S del virus del mosaico de la coliflor, etc.
El vector recombinante de la presente invencion se puede preparar como sigue.
Primero, una construccion de ADN de la presente invencion se digiere con una enzima de restriccion adecuada, o se anade un sitio de enzima de restriccion a la construccion de ADN por PCR. Posteriormente, la construccion de ADN se inserta en el sitio de la enzima restriccion o sitio de clonacion multiple de un vector.
El transformante de la presente invencion se caracteriza por ser transformado con el vector recombinante de la presente invencion. Las celulas hospedes que se van a usar pueden ser celulas eucariotas o celulas procariotas.
Las celulas eucariotas son preferiblemente celulas vegetales, en particular preferiblemente celulas de plantas que pertenecen a la familia Asteraceae, Solanaceae, Brassicaceae, y Chenopodiaceae. Ademas, las celulas eucariotas son preferiblemente celulas de plantas que pertenecen al genero Lactuca, en particular preferiblemente celulas de Lactuca sativa. En el caso de usar celulas de Lactuca sativa como celulas huespedes, se puede usar un promotor del ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor o similar, en el vector.
Las celulas procariotas pueden ser celulas de Escherichia coli o Agrobacterium tumefaciens, etc.
El transformante de la presente invencion se puede preparar por una tecnica de ingeniena genetica general introduciendo un vector de la presente invencion en celulas huespedes. Por ejemplo, el transformante se puede preparar por el metodo de introduccion usando Agrobacterium (Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2:218, Hiei, et al.,1994 Plant J. 6:271), un metodo de electroporacion (Tada, et al., 1990, Theor.Appl.Genet, 80:475), un metodo de polietilenglicol (Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:437), un metodo de bombardeo de partmulas (Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci. tech. 5:27), un metodo de polication (Ohtsuki), etc.
Despues de la introduccion del vector de la presente invencion en las celulas huespedes, un transformante de la presente invencion se puede seleccionar basado en el fenotipo de un marcador selectivo. Si el transformante seleccionado se cultiva, se puede producir la protema toxina bacteriana. El medio de cultivo y condiciones para el cultivo se pueden seleccionar adecuadamente dependiendo del tipo de transformante.
Ademas, en el caso de usar una celula vegetal como celula huesped, el cultivo de la celula vegetal seleccionada segun un metodo convencional puede regenerar una planta y acumular la protema toxina bacteriana en las celulas vegetales o fuera de las membranas celulares de las celulas vegetales. El metodo depende del tipo de celula vegetal, y los ejemplos del mismo incluyen el metodo de Visser et al. (Theor.Appl.Genet, 78:594(1989)) para patata y el metodo de Nagata y Takebe (Planta, 99:12(1971)) para Nicotiana tabacum.
En el caso de Lactuca sativa, se puede regenerar un brote en medio MS que contiene NAA (acido naftaleno acetico) 0,1 mg/l, BA (benciladenina) 0,05 mg/l, y polivinilpirrolidona 0,5 g/l, y el cultivo del brote regenerado en medio 1/2 MS que contiene polivinilpirrolidona 0,5 g/l puede producir enraizamiento.
La semilla de la presente invencion se puede obtener recogiendo una semilla de una planta regenerada como anteriormente. Si la semilla de la presente invencion se siembra y cultiva por un metodo adecuado, se puede obtener una planta capaz de producir una protema toxina bacteriana y se incluye en el transformante de la presente invencion.
Ejemplos
<1> Experimento de expresion transitoria
(1) Construccion del vector de expresion transitoria de Stx2eB
Un vector que contiene una construccion de ADN en el que el ADN (SEQ ID NO: 5) que codifica una subunidad B de la protema Stx2e (Stx2eB) se unio a una region 5' no traducida (NtADH 5'-UTR) de un gen de alcohol deshidrogenasa de tabaco se preparo como sigue.
Se muestra un diseno del vector en la figura 1.
1*Stx2eB (PG12) indica una construccion de ADN que contiene ADN en el que el ADN que codifica PG12 esta unido a ADN que codifica Stx2eB. 2*Stx2eB (PG12) indica una construccion de aDn que contiene ADN en el que dos ADN que codifican Stx2eB estan unidos usando ADN que codifica PG12 como un enlazador.
Ademas, una construccion de ADN, 3*Stx2eB (PG12) en la que tres ADN que codifican Stx2eB estan unidos usando ADN que codifica PG12 como un enlazador, y una construccion de ADN, 4*Stx2eB (PG12) en la que cuatro ADN que codifican Stx2eB estan unidos usando ADN que codifica PG12 como un enlazador tambien se prepararon.
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Las tecnicas espedficas se muestran a continuacion.
Se realizo PCR usando un cebador Kozak-stx2eb-F (SEQ ID NO: 30) y un cebador stx2eb-R (SEQ ID NO: 31) para amplificar un fragmento de ADN que codifica una region madura (excepto por un peptido senal secretor al periplasma, Ala 19 a Asn 87) de Stx2eB. El fragmento de ADN resultante se clono en un hueco EcoRV en pBluescript II SK. El plasmido resultante se corto con HindIII, y se trato como ADN polimerasa de T4, seguido por autoligacion para convertir un sitio HindIII a un sitio NheI (plasmido 1).
Se inserto Stx2eB como sigue en el sitio de clonacion multiple (MCS) de un vector de expresion transitoria en celulas vegetales, pBI221 (Clontech).
Para introducir sitios SalI, KpnI y SmaI en el MCS, SalKpnSma-F (SEQ ID NO: 32) y SalKpnSma-R (SEQ ID NO: 33) se hibridaron y fosforilaron con polinucleotido quinasa de T4 (T4 PNK) (TaKaRa) y se inserto en el hueco SacI de pBI221 (plasmido 2). Se corto Stx2eB del plasmido 1 usando XbaI y KpnI para insertarlo en el plasmido 2, y el producto resultante se dispuso entre un promotor de ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S pro.) y un terminador de la transcripcion del gen de la nopalina sintasa (NOS-T) (plasmido 3).
La region 5' no traducida (NtADH 5'-UTR, SEQ ID NO: 23) de un gen de alcohol deshidrogenasa de tabaco se amplifico por PCR con ADH-221 (Sato et al., 2004, (vease posteriormente)) como molde usando cebador ADH XbaI-F (sEq ID NO: 34) y cebador ADH NsiI-R (SEQ ID NO: 35). Una region de AdN (SEQ ID NO: 17) que codifica un peptido senal secretor (SEQ ID NO: 18) de p-D-glucano exohidrolasa (Acceso de GenBank AB017502) se amplifico con ADN genomico de tabaco como molde usando cebador pD NsiI-F (SEQ ID NO: 36) y cebador pD BamHI-R (SEQ ID NO: 37). Los fragmentos de ADN respectivos obtenidos de NtADH 5'-UTR y el peptido senal secretor se trataron con NsiI (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se ligaron usando Ligation High (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), seguido por hacerlos romos, y clonarlos en el hueco EcoRV en pBluescript II SK (fabricado pro Stratagene) (plasmido 4).
Satoh et al., The 5'-untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant. J. Biosci. Bioeng. (2004) 98,1-8
El plasmido 4 se trato con NsiI, y se hizo romo con ADN polimerasa de T4 (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), seguido por realizar autoligacion para ligarse de modo que el codon de iniciacion (atg) de NtADH coincidiera con el codon de iniciacion del peptido senal secretor (plasmido 5).
Un ADN obtenido por ligacion de un fragmento NtADH 5'-UTR y un peptido senal secretor se amplifico usando el plasmido 5 como molde y usando cebador ADH XbaI-F (SEQ ID NO: 34) y cebador pDNsiI-R (SeQ ID NO: 35). El fragmento de ADN resultante se trato con XbaI y BamHI y se inserto en el hueco XbaI-BamHI del plasmido 3 (plasmido 6).
Para anadir una senal de retencion en el retfculo endoplasmico (SEQ ID NO: 38), un cebador HDEL-F (SEQ ID NO: 39) y un cebador HDEL-R (SEQ ID NO: 40) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK, y el producto resultante se inserto en hueco BglII del plasmido 6, que se habfa desfosforilado con fosfatasa alcalina (AP) (TaKaRa) (plasmido 7).
Se anadio una etiqueta HA como una etiqueta peptfdica para detectar Stx2eB. Para anadir la etiqueta HA, un cebador HA-F (SEQ ID NO: 41) y un cebador HA-R (SEQ ID NO: 42) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento HA fosforilado resultante se inserto en el hueco BglII del plasmido 7 (plasmido 8).
Se inserto un espaciador PG12 (SEQ ID NO: 2) entre Stx2eB y la etiqueta HA. Un cebador PG12-F (SEQ ID NO:43) y un cebador pG12-R (SEQ ID NO:44) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado resultante se inserto en el hueco BglII del plasmido 8 (1*Stx2eB (PG12)).
Se obtuvo 2*Stx2eB (PG12) cortando un fragmento 2eB-PG12 de 1*Stx2eB (PG12) con BamHI y BglII y despues insertando el fragmento en el hueco BamHI de 1*Stx2eB (PG12). Se obtuvo 3*Stx2eB (PG12) cortando un fragmento Stx2eB-PG12 de 1*Stx2eB (PG12) con BamHI y BglII y despues insertando el fragmento en el hueco BamHI de 2*Stx2eB (PG12). Ademas, se obtuvo 4*Stx2eB (PG12) cortando un fragmento 2 * (Stx2eB-PG12) de 2*Stx2eB (PG12) con BamHI y BglII y despues insertando el fragmento en el hueco BamHI de 2*Stx2eB (PG12).
(2) Construccion de un vector de expresion transitoria de CTB
Un vector que contema una construccion de ADN (2*CTB (PG12)) en el que el ADN que codifica una subunidad B de una protema CT (CTB) se habfa unido a la region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa de tabaco se preparo como sigue.
Se preparo un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 7) que codifica la region madura (excepto la senal secretora al periplasma, Thr 22 a Asn 124) (SEQ ID NO: 8) de CTB. Primero, se prepararon los siguientes diez cebadores.
CTB1: SEQ ID NO: 45
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CTB2: SEQ ID NO: 46 CTB3: SEQ ID NO: 47 CTB4: SEQ ID NO: 48 CTB5: SEQ ID NO: 49 CTB6: SEQ ID NO: 50 CTB7: SEQ ID NO: 51 CTB8: SEQ ID NO: 52 CTB9: SEQ ID NO: 53 CTB10: SEQ ID NO: 54
Se realizo PCR usando los cebadores sintetizados anteriormente en las condiciones descritas en Kang et al., (2004). Es dedr, se realizo PCR en combinacion de CTB1 y CTB2, CTB3 y CTB4, CTB5 y CTB6, CTB7 y CTB8, y CtB9 y CTB10, y se sintetizaron fragmented de 72 pb (1+2), 74 pb (3+4), 67 pb (5+6), 82 pb (7+8) y 68 pb (9+10), respectivamente. Posteriormente, la segunda PCR se realizo en combinacion de CTB1+2 y CTB3+4, CTB3+4 y CTB5+6, CTB5+6 y CTB7+8, y CTB7+8 y CTB9+10 y se sintetizaron fragmentos de ADN de 135 pb (1+2+3+4), 132 pb (3+4+5+6), 138 pb (5+6+7+8), y 141 pb (7+8+9+10), respectivamente. A continuacion, se realizo la tercera PCR en combinacion de CTB1+2+3+4 y CTB3+4+5+6, y CTB5+6+7+8 y CTB7+8+9+10, y se sintetizaron fragmentos de ADN de 194 pb (1+2+3+4+5+6) y 198 pb (5+6+7+8+9+10), respectivamente. Por ultimo, se realizo PCR en combinacion de CTB1+2+3+4+5+6 y CTB5+6+7+8+9+10, y se sintetizo un fragmento de ADN de 315 pb en el que un sitio BamHI y un sitio BglII se anadieron a una region codificante de CTB.
El fragmento de ADN preparado anteriormente se trato con BamHI y BglII y se inserto en un hueco BamHI-BglII en el plasmido 8 (plasmido 9).
El espaciador PG12 (SEQ ID NO: 2) se inserto entre CTB y la etiqueta HA. Un cebador PG12-F (SEQ ID NO: 43) y un cebador PG12-R (SEQ ID NO: 44) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado resultante se inserto en el hueco BglII del plasmido 9 (1*CTB (PG12)).
Se corto un fragmento CTB-PG12 de 1*CTB (PG12) usando BamHI y BglII, y se inserto en el hueco BamHI del 1*CTB (PG12) (2*CTB (PG12)).
(3) Prueba de expresion transitoria usando protoplasto de Lactuca sativa
Una hoja de Lactuca sativa en maceta (Green wave) (aproximadamente 1 g) se corto en trozos cuadrados de 0,5 cm usando un bistun, para preparar de esta manera discos de hojas. Los discos de hojas se sumergieron en manitol 500 mM, y se agitaron durante 1 hora. Los discos de hoja se sumergieron en 50 ml de una solucion de enzima de protoplastizacion (celulosa RS (Yakult Honsha Co., Ltd.) al 1,0%, macerozima R-10 (Yakult Honsha Co., Ltd.) al 0,25%, manitol 400 mM, CaCh 8 mM, y Mes-KOH 5 mM, pH 5,6), y el conjunto se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La suspension de protoplastos se paso a traves de mallas de 100 pm y 40 pm para eliminar los discos de hoja. La suspension de protoplastos se centrifugo a 60 g durante 5 minutos para precipitar el protoplasto. El protoplasto se resuspendio en una solucion acuosa que contema manitol 167 mM y CaCl2133 mM, y la suspension se centrifugo a 40 g durante 5 minutos. El protoplasto se resuspendio en una solucion acuosa que contema manitol 333 mM y CaCh 66,7 mM, y la suspension se centrifugo a 40 g durante 5 minutos. El protoplasto se resuspendio en solucion W5 (NaCl 154 mM, CaCl2125 mM, KCl 5 mM, Mes-KOH 2 mM, pH 5,6), y la suspension se dejo reposar en hielo durante 1 hora. La suspension de protoplasto se centrifugo a 40 g durante 5 minutos, y el protoplasto se resuspendio en una solucion MaMg (manitol 400 mM, MgCh 15 mM, y Mes-KOH 4 mM, pH 5,6) para tener una concentracion de protoplastos de 2*106 celulas/ml.
Cada uno de los vectores de expresion transitoria de Stx2eB y el vector de expresion transitoria de CTB preparados anteriormente se mezclo con 120 pl de una suspension de protoplastos, posteriormente se anadieron a la misma 140 pl de solucion PEG (manitol 400 mM, Ca(NO3)2100 mM y PEG al 40%), y la mezcla resultante se mezclo suavemente y se incubo durante 7 minutos. A continuacion, 1 ml de solucion W5 se anadio a la suspension de protoplastos a lo largo de aproximadamente 20 minutos. Se anadio una solucion (1 ml) obtenida mezclando manitol 400 mM y la solucion W5 en una proporcion de 4:1 al protoplasto precipitado por centrifugacion. Se anadio medio LS (1 ml) que contema sacarosa al 1%, manitol 400 mM y carbenicilina 0,3 mM al protoplasto precipitado por centrifugacion, y la mezcla se cultivo despues en un lugar oscuro a 25°C durante 24 horas.
(4) Analisis de inmunotransferencia
Al protoplasto recogido por centrifugacion se anadieron 30 pl de tampon de muestra de SDS (SDS al 4% (p/v), glicerol al 20% (p/v), azul de bromofenol al 0,05% (p/v), p-mercaptoetanol 300 mM, Tris-HCl 125 mM, pH 6,8), seguido por desnaturalizacion termica a 95°C durante 2 minutos, para preparar las muestras de esta manera. Las protemas se separaron usando un gel de acrilamida al 15% y se transfirieron a una membrana de PVDF (Hybond-P; Amersham) usando un sistema de electrotransferencia. Se uso un anticuerpo anti-HA (No. 11 867 423 001, Roche) para detectar Stx2eB y CTB.
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(a) Efectos del numero de union de Stx2eB
Se muestra un resultado en la figura 2. Cuando se expreso 1*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en una posicion de aproximadamente 8,5 kDa. Cuando se expreso 2*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en una posicion de aproximadamente 17 kDa al mismo nivel que cuando se expreso 1*Stx2eB (PG12). Cuando se expreso 3*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en una posicion de aproximadamente 26 kDa, siendo la senal menor que cuando se expreso 1*Stx2eB (PG12). Estas correspondfan a los pesos moleculares estimados del diseno de las construcciones de ADN. Cuando se expreso 4*Stx2eB (PG12), la senal espedfica estaba por debajo del lfmite de deteccion.
Del resultado anterior, se demostro que cuando se expresaron 2*Stx2eB (PG12) y 3*Stx2eB (PG12), se pudieron producir protemas tubridas en las que multiples protemas Stx2eB estaban unidas.
Puesto que cada una de las construcciones de ADN anteriores contiene una molecula de la etiqueta HA (vease la figura 1), es concebible que una cantidad de protema correspondiente a aproximadamente 2 veces la cantidad de protema Stx2eB cuando se expresa 1*Stx2eB (PG12) se acumule cuando se expresa 2*Stx2eB (PG12). Es decir, se ha encontrado que cuando dos ADN que codifican la protema Stx2eB estan unidos a traves del ADN que codifica PG12, la protema Stx2eB se puede producir con una eficacia muy alta.
Mientras tanto, tambien se ha encontrado que cuando tres ADN que codifican la protema Stx2eB o cuatro ADN que codifican la protema Stx2eB estan unidos a traves del ADN que codifica PG12, la cantidad de la protema Stx2eB producida es igual a o menor que la cantidad cuando una protema Stx2eB esta unida a PG12.
Se ha encontrado que el nivel de protemas acumuladas tiende a ser mayor en la protema Stx2eB (1*Stx2eB (PG12)) que tiene PG12 anadido en su extremo carboxilo preparada en este experimento, comparada con la protema Stx2eB que no tiene PG12. Esto especula que es una forma favorable que PG12 se anada al extremo carboxilo en la protema tubrida de la presente invencion.
(b) Efectos del numero de union de CTB Los resultados se muestran en la figura 3.
Cuando se expreso 1*CTB (PG12), se detecto una senal en una posicion de aproximadamente 20 kDa. Cuando se expreso 2*CTB (PG12), se detecto una senal mayor que cuando se expreso 1*CTB (PG12) en las posiciones de aproximadamente 33 kDa y aproximadamente 35 kDa.
De los resultados anteriores, se demostro que la protema tubrida en la que dos protemas CTB esta unidas se pudo producir cuando se expreso 2*CTB (PG12). Estas correspondfan a los pesos moleculares estimados del diseno de las construcciones de ADN.
Puesto que cada una de las construcciones de ADN anteriores contiene una molecula de la etiqueta HA, es concebible que la cantidad de protema correspondiente a la cantidad de protema CTB que es mayor de dos veces la cantidad de protema cuando se expresa 1*CTB (PG12) se acumule cuando se expresa 2*CTB (PG12). Es decir, se ha encontrado que cuando dos ADN que codifican la protema CTB estan unidos a traves del ADN que codifica PG12, la protema CTB se puede producir con una eficacia muy alta.
(5) Analisis de localizacion de Stx2eB
Para analizar la localizacion de Stx2eB en la celula, se preparo un vector de expresion transitoria para la protema tubrida de Stx2eB y una protema fluorescente amarilla YFP. El diseno para el vector se muestra en la figura 4. 1*Stx2eB (PG12)-YFP indica una construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema Stx2eB esta unida al ADN que codifica YFP. 2*Stx2eB (PG12)-YFP indica una construccion de ADN en la que el ADN que codifica la protema tubrida en la que dos protemas Stx2eB estan unidas a traves de PG12 esta unida al ADN que codifica YFP. Tambien se preparo 2*Stx2eB (RS)-YFP que usa RS (Arg Ser) en lugar de PG12 como espaciador.
Una tecnica espedfica se muestra a continuacion.
Primero, un fragmento de ADN de YFP se amplifico por PCR con pEYFP (Clontech) como molde usando un cebador YFP-F (SEQ ID NO: 55) y un cebador YFP-R (SEQ ID NO: 56). El fragmento de ADN resultante se trato con BamHI y BglII, y se inserto en el hueco BamHI-BglII del plasmido 8 (ER-YFP).
Se corto un fragmento Stx2eB del plasmido 1 con BamHI y BglII, y despues se inserto en el hueco BamHI de 1*Stx2eB (PG12) (2*Stx2eB (RS)).
Se cortaron un fragmento Stx2eB-PG12, un fragmento 2*(Stx2eB-RS) y un fragmento 2*(Stx2eB-PG12) de 1*Stx2eB (PG12), 2*Stx2eB (RS) y 2*Stx2eB (PG12) con BamHI-BglII, respectivamente, y cada fragmento se inserto en el hueco BamHI de ER-YFP (1*Stx2eB (PG12)-YFP, 2*Stx2eB (RS)-YFP y 2*Stx2eB (PG12)-YFP).
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Mientras tanto, se preparo un vector de expresion para una protema fluorescente roja (mRFP, Campbell R. E. et al., 2002, (vease posteriormente)) localizado en el retmulo endoplasmico como un vector para visualizar el retmulo endoplasmico. Se realizo PCR usando un cebador mRFP-F (SEQ ID NO: 57) y un cebador mRFP-R (SEQ ID NO: 58). El fragmento de ADN resultante se trato con BamHI y BglII, y se inserto en el hueco BamHI-BglII del plasmido 8 (ER- mRFP).
Campbell R. E. et al., A monomeric red fluorescent protein (2002), Proc. Nat. Acad. Sci., 99: 7877-7882.
El vector de expresion de Stx2eB y el vector de expresion de mRFP se introdujeron en los protoplastos de celulas de tabaco cultivadas (BY2) de la misma manera que los metodos anteriores, y se observo usando un sistema de observacion de microscopio confocal (LSM510, Zeiss).
Los resultados se muestran en las figuras 5 y 6.
La figura 5 muestra la localizacion de la protema hnbrida de Stx2eB-YFP. Cuando se expreso 2*Stx2eB (PG12)-YFP, se observo que la protema hnbrida de Stx2eB-YFP estaba localizada granularmente a aproximadamente 100 granulos/celula. Cuando se expresaron 1*Stx2eB (PG12)-YFP y 2*Stx2eB (RS)-YFP, no se observaron granulos.
En la figura 6, una imagen A en la columna mas a la izquierda muestra la localizacion de mRFP en un cierto protoplasto. La localizacion de mRFP refleja la localizacion del retmulo endoplasmico. Una imagen B en una columna media muestra la localizacion de la protema hnbrida de Stx2eB-YFP en el protoplasto identico. Una imagen en la columna mas a la derecha es una imagen compuesta de la imagen A y la imagen B. Se determino de esta imagen compuesta que la protema hnbrida de Stx2eB-YFP esta localizada granularmente en el retmulo endoplasmico.
(6) Efecto de la funcion de transporte vesicular
Se examino en que proceso despues de la traduccion de protemas se produce la acumulacion y agregacion de 2*Stx2eB (PG12).
2*Stx2eB (PG12)-YFP se coexpreso con una protema de regulacion de transporte vesicular de Arabidopsis ARF1 o un mutante negativo de la misma ARF1 (Q71L) (ARF1DN). Como un indicador para la inhibicion del transporte de protemas al aparato de Golgi por la coexpresion con ARF1DN, se coexpreso vacuola-GFP con cada ARF1. Se construyo un vector de expresion para cada ARF1 como sigue. Se puede preparar un vector de expresion para vacuola-GFP con referencia al siguiente documento.
Di Sansebastiano et. al., Specific accumulation of GFP in a non-acidic vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. (1998) 15, 449-457
Como la protema de regulacion de transporte vesicular, se construyeron vectores de expresion para ARF1 de Arabidopsis (acceso de GenBank No. M95166) y para el mutante dominante negativo de la misma ARF1 (Q71L) (Misaki Takeuchi et al., 2002 (vease posteriormente)). Se realizo PCR usando ADNc preparado de embrion de Arabidopsis como molde usando un cebador ARF1-F (SEQ ID NO: 59) y un cebador ARF1-R (SEQ ID NO: 60). El fragmento de ADN resultante se subclono en el hueco EcoRV en pBluescript (Stratagene). Se realizo otra PCR usando un cebador ARFQL-F (SEQ ID NO: 61) y un cebador ARFQL-R (SeQ ID NO: 62) para sustituir un residuo de glutamina en la posicion 71 con un residuo de leucina. Cada fragmento ARF1 resultante se subclono en un vector de expresion transitoria pBI221.
Cada uno de los vectores preparados se introdujo en el protoplasto de celula de tabaco cultivada de la misma manera que se ha descrito anteriormente, y las protemas respectivas se coexpresaron para examinar la localizacion de 2*Stx2eB (PG12).
El resultado se muestra en la figura 7.
Tanto cuando 2*Stx2eB (PG12)-YFP se coexpreso con ARF1 como se coexpreso con ARF1 (Q71L), se formaron granulos como se observo en una expresion de 2*Stx2eB (PG12)-YFP sola. Por otra parte, la coexpresion de ARF1 (Q71L) inhibio la salida de vacuola-GFP del ER. Se especulo de esto que la formacion de granulos no depende del proceso de transporte vesicular del ER al aparato de Golgi.
<2> Experimentos de transformacion usando celulas de tabaco cultivadas
(1) Construccion de vectores para la transformacion
Se prepararon 1*Stx2eB (PG12), 2*Stx2eB (PG12), 3*Stx2eB (PG12), y 4*Stx2eB (PG12) de la misma manera que anteriormente.
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Ademas, usando RS (Arg, Ser), PG7 (SEQ ID NO: 63), o SG12 (SEQ ID NO: 64) como espaciador en lugar de PG12, se prepararon construcciones de aDn, 2*Stx2eB (Rs), 2^StX2eB (PG7), y 2*Stx2eB (SG12) por los siguientes metodos.
Se inserto un espaciador PG7 (SEQ ID NO: 63) entre Stx2eB y la etiqueta HA en el plasmido 8. Un cebador PG7-F (SEQ ID NO: 65) y un cebador PG7-R (SEQ ID No: 66) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado obtenido se inserto en el hueco BglII del plasmido 8 (plasmido 10).
Se inserto un espaciador SG12 (SEQ ID NO: 64) entre Stx2eB y la etiqueta HA. Un cebador SG12-F (SEQ ID NO: 67) y un cebador sGl2-R (SEQ ID NO: 68) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado obtenido se inserto en el hueco BglII del plasmido 8 (plasmido 11).
Se corto un fragmento Stx2eB del plasmido 1 con BamHI y BglII y despues se inserto en el hueco BamHI de 1*Stx2eB (PG12) (2*Stx2eB (RS)). Se corto un fragmento Stx2eB-pG7 del plasmido 10 con BamHI y BglII y despues se inserto en el hueco BamHI de 1*Stx2eB (PG12) (2*Stx2eB (PG7)). Se corto un fragmento Stx2eB-SG12 del plasmido 11 con BamHI y BglII y despues se inserto en el hueco BamHI de 1*Stx2eB (PG12) (2*Stx2eB (SG12)).
Para producir Stx2eB usando un transformante estable de la planta, cada una de las construcciones de ADN del anterior Stx2eB se subclono en un vector para transformacion (para el diseno de vectores, vease la figura 1). Cada uno de 1*Stx2eB (PG12), 2*Stx2eB (PG12), 3*Stx2eB (PG12), 4*Stx2eB (PG12), 2*Stx2eB (RS), 2*Stx2eB (PG7), y 2*Stx2eB (SG12) se inserto en pBI121 (Clontech) usando XbaI y SacI, y se repartio entre un promotor de ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S pro.) y un terminador de la transcripcion del gen de nopalina sintetasa (NOS-T).
(2) Transformacion de celulas de tabaco cultivadas
El vector producido para transformacion se introdujo en Agrobacterium tumefacience EHA105 usando un metodo de electroporacion. Un medio de Agrobacterium (100 pl) cultivado en 5 ml de medio LB que contema 100 mg/l de kanamicina a 28°C durante 2 noches se mezclo con de 5 a 10 ml de una suspension de celulas de tabaco cultivadas (Nicotiana tabacum, cv BY2) el cuarto dfa del cultivo en una placa de Petri, y la mezcla se cocultivo dejandola reposar en un lugar oscuro a 25°C durante 2 noches. Para eliminar Agrobacterium, el medio en la placa de Petri se transfirio a un tubo de centrifugacion de 15 ml, que despues se centrifugo (1.000 rpm, 5 minutos, 4°C), y el sobrenadante se elimino. Se cargo un medio LS modificado, y el tubo se centrifugo (1.000 rpm, 5 minutos, 4°C) para lavar las celulas. Esta operacion de lavado se repitio cuatro veces para eliminar Agrobacterium. Las celulas BY2 resultantes se colocaron despues en un medio Ls agar modificado que contema kanamicina (100 mg/l), y se cultivaron dejandolas reposar en un lugar oscuro a 25°C. Despues de aproximadamente 2 a 3 semanas, las celulas que han formado un callo se transfirieron a una placa nueva, y se selecciono un clon en crecimiento.
(3) Semicuantificacion de protema Stx2eB usando analisis por inmunotransferencia.
Se recogieron celulas de tabaco cultivadas en un medio en placa en un tubo de centnfuga, y se anadio 1 pl de tampon de muestra de SDS por mg de peso celular. Las celulas se desnaturalizaron a 95°C durante 2 minutos para hacer una muestra para electroforesis. Las protemas se separaron usando un gel de acrilamida al 15%, y despues se transfirieron a una membrana de PVDF (Hybond-P; Amersham) usando un aparato de electrotransferencia. Se detecto una protema Stx2eB usando un anticuerpo anti-HA (No. 11 867 423 001, Roche). Se prepararon diluciones en serie de Stx2eB que tema la etiqueta HA a concentraciones conocidas, y se cargaron en el gel. Se preparo una curva de calibracion basada en sus intensidades de senal, y se calculo la cantidad de protemas Stx2eB en cada muestra.
Los resultados se muestran a continuacion.
(a) Efectos del numero de union de Stx2eB
Los resultados se muestran en las figuras 8 y 9.
Cuando se expreso 1*Stx2eB (PG12), se detectaron senales en las posiciones de aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 17 kDa. Se presume que son Stx2eB en la que el peptido senal se corto y Stx2eB en la que el peptido senal no se corto, respectivamente. Cuando se expreso 2*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 19 kDa a un nivel similar que cuando se expreso 1*Stx2eB (PG12). Cuando se expreso 3*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 26 kDa, siendo la senal menor que cuando se expreso 1*Stx2eB (PG12). Estas correspondfan a los pesos moleculares estimados del diseno de las construcciones de ADN. Cuando se expreso 4*Stx2eB (PG12), una senal espedfica estaba por debajo del lfmite de deteccion (datos no mostrados).
Se ha encontrado de lo anterior que 2*Stx2eB (PG12) acumula la cantidad mayor de Stx2eB que 1*Stx2eB (PG12) y 3*Stx2eB (PG12).
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(b) Efectos del espaciador
Los resultados se muestran en las figuras 10 y 11.
Basado en la intensidad de la senal correspondiente a Stx2eB, el nivel de Stx2eB acumulada era el mas alto cuando se uso PG12 como espaciador. Los niveles eran en segundo lugar altos cuando se usaron PG7 y SG12, que estaban en grado similar. El nivel fue el mas bajo cuando se uso RS. Esto indica que la longitud y la secuencia de aminoacidos del espaciador entre dos Stx2eB afecta el nivel de protema 2*Stx2eB acumulada.
(4) Cuantificacion de ARNm por PCR a tiempo real
Se examino si el nivel de la protema acumulada estaba influido por un nivel de trascripcion o no.
Se preparo ARN usando RNeasy Mini Kit (Qiagen) de cada una de las celulas BY2 transformadas obtenidas anteriormente. El ARN resultante se trato con DNasa, y despues se sometio a transcripcion inversa usando Transcriptor Reverse Transcriptase (Roche). Se realizo pCr a tiempo real usando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Se uso un conjunto de cebadores (SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70) que amplificaba la region que contema NtADH 5'-UTR y el peptido senal que eran comunes en las construcciones respectivas para la cuantificacion del ARNm de Stx2eB. Se cuantifico la cantidad de un gen de ubiquitina de BY2 expresada usando un cebador UBQ-F (SEQ ID NO: 71) y un cebador UBQ-R (SEQ ID NO: 72) para compensar el nivel de ARNm de un gen Stx2eB. Notese que el nivel de ARNm de 1*Stx2eB (PG12) se calculo multiplicando un valor cuantificado por 1/2.
Los resultados se muestran en la figura 12.
Los niveles de acumulacion de protema Stx2eB por ARNm tienden a ser mayores en celulas que expresan 2*Stx2eB (PG12) que esos en celulas que expresan 2*Stx2eB (RS) o 1*Stx2eB (PG12). Esto indica que la diferencia del espaciador no influye en el nivel transcripcion, pero influye en un nivel de traduccion o estabilidad de la protema despues de la traduccion. Considerando junto el resultado de que la protema 2*Stx2eB se localizaba granularmente, es concebible que el espaciador influya en la estabilidad de la protema despues de la traduccion.
<3> Experimentos de expresion transitoria
(1) Construccion de vectores de expresion transitoria de Stx2eB
Se construyeron vectores de expresion transitoria para 1*Stx2eB (PG12), 2*Stx2eB (PG12), 3*Stx2eB (PG12), y 4*Stx2eB (PG12) por el metodo en el anterior <1> (1) (Fig. 13-A). Estos vectores se denominan ER-1*Stx2eB (PG12), ER-2*Stx2eB (PG12), ER-3*Stx2eB (PG12), y ER-4*Stx2eB (PG12), respectivamente. Notese que “ER” significa el tipo retmulo endoplasmico.
Ademas, se construyeron vectores de expresion transitoria que conteman el tipo citoplasmico (Cyt) de la construccion de ADN (Fig. 13-B) y vectores de expresion que conteman el tipo cloroplasto (Chl) de la construccion de ADN (Fig. 13-C) mediante el siguiente metodo. Estas construcciones de ADN se disenaron para contener ADN que codifica el peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico, para el fin de expresar la protema tnbrida que tiene una estructura tan cercana como sea posible a la del tipo de retmulo endoplasmico de la protema Imbrida. Pero, puesto que estas construcciones de ADN no contienen ADN que codifica el peptido senal secretor, el peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico no ejerce su funcion (la retencion de la protema en el retmulo endoplasmico) en la protema Imbrida producida.
Se amplifico un fragmento NtADH 5'-UTR por PCR usando un cebador ADH XbaI-F (SEQ ID NO: 34) y un cebador ADH BamHI-R (SEQ ID NO: 112), y el fragmento de ADN resultante se trato con XbaI y BamHI. El fragmento XbaI- BamHI de NtADH 5'-UTR se inserto en el hueco XbaI-BamHI de cada una de ER-1*Stx2eB (PG12), ER-2*Stx2eB (PG12), ER-3*Stx2eB (PG12), y ER-4*Stx2eB (PG12) para preparar Cyt-1*Stx2eB (PG12), Cyt-2*Stx2eB (PG12), Cyt-3*Stx2eB (PG12), y Cyt-4*Stx2eB (PG12) que eran vectores de Stx2eB de tipo citoplasmico.
Se amplifico un fragmento NtADH 5'-UTR por PCR usando un cebador ADH XbaI-F (SEQ ID NO: 34) y un cebador ADH NsiI-R (SEQ ID NO: 35). Un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 80) que codifica el peptido senal de transito, derivando el cloroplasto de Rbcs (subunidad pequena de Rubisco) de Lactuca sativa (acceso de GenBank D14001) (peptido de transito, T.P.), se amplifico por PCR con ADNc de una hoja de Lactuca sativa como molde usando un cebador TP NsiI-F (SEQ ID NO: 113) y un cebador TP BamHI-R (SEQ ID NO: 114). Cada fragmento de ADN resultante de NtADH 5'-UTR y cada fragmento de ADN del peptido senal secretor se trato con NsiI (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se ligo usando Ligation High (Toyobo Co., Ltd.) seguido por hacerlo romo, y clonarlo en el hueco EcoRV de pBluescript II SK (fabricado por Stratagene) (plasmido 12). El plasmido 12 se trato con NsiI, se hizo romo con ADN polimerasa de T4 (Toyobo Co., Ltd.), y despues se autoligo para fusionarse de modo que el codon de iniciacion de NtADH y el codon de iniciacion de Rbcs fueran coincidentes (plasmido 13). Un fragmento de fusion NtADH 5'-UTR- T.P. se corto del plasmido 13 usando XbaI y BamHI, y se inserto en el hueco XbaI-BamHI de cada uno de ER-1*Stx2eB
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(PG12), ER-2*Stx2eB (PG12), ER-3*Stx2eB (PG12), y ER-4*Stx2eB (PG12) para preparar Chl-1*Stx2eB (PG12), Chl-2*Stx2eB (PG12), Chl-3*Stx2eB (PG12), y Chl-4*Stx2eB (PG12) que eran vectores de Stx2eB de tipo cloroplasto.
(2) Produccion de vectores de expresion transitorios de CTB
Se construyeron vectores de expresion transitoria para 1*CTB (PG12) y 2*CTB (PG12) por el metodo en el anterior <1> (2) (Fig. 14-A). De aqu en adelante, estos vectores se denominan ER-1*CTB (PG12) y ER-2*CTB (PG12).
Se construyeron vectores de expresion transitoria que conteman el tipo citoplasmico (Cyt) de construccion de ADN (Fig. 14-B) y vectores de expresion que conteman el tipo cloroplasto (Chl) de construccion de ADN (Fig. 14-C) por los siguientes metodos.
Se corto un fragmento CTB-PG12 de ER-1*CTB (PG12) usando BamHI y BglII, y se inserto en el hueco BamHI-BglII de Cyt-1*Stx2eB (PG12) y el hueco BamHI-BglII de Chl-1*Stx2eB (PG12) producidos en el anterior <3> (1) para preparar el tipo citoplasmico de 1*CTB (PG12) y el tipo cloroplasto de 1*CTB (PG12) (Cyt-1*CTB (PG12), Chl-1*CTB (PG12)).
Posteriormente, se corto un fragmento 2 * (CTB-PG12) de ER-2*CTB (PG12) usando BamHI y BglII, y se inserto en el hueco BamHI-BglII de Cyt-1*Stx2eB (PG12) y el hueco BamHI-BglII de Chl-1*Stx2eB (PG12) para preparar el tipo citoplasmico de 2*CTB (PG12) y el tipo cloroplasto de 2*CTB (PG12) (Cyt-2*CTB (PG12), Chl-2*CTB (PG12)).
(3) Experimentos de expresion transitoria y analisis de inmunotransferencia
Los experimentos de expresion transitoria se llevaron a cabo usando protoplastos de Lactuca sativa de la misma manera que en el anterior <1> (3). Posteriormente, Stx2eB y CTB se detectaron de la misma manera que en el anterior <1> (4).
(a) Efectos del numero de union de Stx2eB Los resultados se muestran en la figura 15.
Cuando se expreso ER-1*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 10 kDa. Cuando se expreso ER-2*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 19 kDa, siendo la senal mayor que cuando se expreso ER-1*Stx2eB (PG12). Cuando se expreso ER-3*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 27 kDa, siendo la senal mayor que cuando se expreso ER-1*Stx2eB (PG12). Estas correspondfan a los pesos moleculares estimados del diseno de las construcciones de ADN. Cuando se expreso ER-4*Stx2eB (PG12), una senal espedfica estaba por debajo del lfmite de deteccion.
Cuando se expreso Cyt-1*Stx2eB (PG12), una senal espedfica estaba por debajo del lfmite de deteccion. Cuando se expreso Cyt-2*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 20 kDa. Cuando se expreso Cyt-3*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 30 kDa. Estas correspondfan a los pesos moleculares estimados del diseno de las construcciones de ADN. Ademas, cuando se expreso Cyt-4*Stx2eB (PG12), una senal espedfica estaba por debajo del lfmite de deteccion.
Cuando se expreso Chl-1*Stx2eB (PG12), se detecto una senal debilmente en la posicion de aproximadamente 14 kDa. Cuando se expreso Chl-2*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 22 kDa, estando la senal a un nivel similar que esa cuando se expreso ER-3*Stx2eB (PG12). Cuando se expreso Chl-3*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 30 kDa, estando la senal a un nivel similar que esa cuando se expreso Chl-2*Stx2eB (PG12). Estas correspondfan a los pesos moleculares estimados del diseno de las construcciones de ADN. Cuando se expreso Chl-4*Stx2eB (PG12), se detecto una senal debilmente en la posicion de 34 kDa.
Puesto que cada una de las construcciones de ADN anteriores contiene una molecula de la etiqueta HA (vease la figura 13), cuando se expresa ADN que codifica dos Stx2eB y cuando se expresa ADN que codifica tres Stx2eB, se piensa que las cantidades de las protemas acumuladas corresponden a aproximadamente dos veces y aproximadamente tres veces, respectivamente, la cantidad cuando se expresa ADN que contiene una Stx2eB.
Por tanto, se ha encontrado que cuando se expresa cualquiera del tipo retfculo endoplasmico (ER), tipo citoplasmico (Cyt) y tipo cloroplasto (Chl) de las construcciones de ADN, la protema Stx2eB se puede acumular de forma mas eficaz cuando se expresa la protema en la que dos o tres Stx2eB estan unidas en tandem a traves del espaciador que cuando se expresa una protema Stx2eB.
(b) Efectos del numero de union de CTB Los resultados se muestran en la figura 16.
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Cuando se expreso ER-1*CTB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 17 kDa. Cuando se expreso ER-2*CTB (PG12), se detecto una senal mayor que cuando se expreso ER-1*CTB (PG12) en las posiciones de aproximadamente 28 kDa y aproximadamente 30 kDa. Estas correspondfan a los pesos moleculares estimados del diseno de las construcciones de ADN.
Cuando se expreso Cyt-1*CTB (PG12), se detecto una senal debilmente en la posicion de aproximadamente 14 kDa. Cuando se expreso Cyt-2*CTB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 26 kDa, la senal estaba a un nivel similar que esa cuando se expreso ER-2*CTB (PGl2). Estas correspondfan a los pesos moleculares estimados del diseno de las construcciones de ADN.
Cuando se expreso Chl-1*CTB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 14 kDa. Cuando se expreso Chl-2*CTB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 26 kDa, la senal estaba a un nivel similar que esa cuando se expreso ER-2*CTB (PG12). Estas correspondfan a los pesos moleculares estimados del diseno de las construcciones de ADN.
De lo anterior, se ha encontrado que cuando se expresa cualquiera del tipo retmulo endoplasmico (ER), tipo citoplasmico (Cyt) y tipo cloroplasto (Chl) de las construcciones de ADN, las protemas CTB se pueden acumular de forma mas eficaz cuando se expresa la protema en la que dos CTB estan unidas en tandem a traves del espaciador que cuando se expresa una protema CTB.
<4> Experimentos de transformacion usando celulas de tabaco cultivadas
(1) Construccion de vectores para la transformacion
Los experimentos de transformacion se realizaron usando ER-2*Stx2eB (PG12), Cyt-1*Stx2eB (PG12), Cyt-2*Stx2eB (PG12), y Cyt-3*Stx2eB (PG12) preparados anteriormente.
Los vectores para la transformacion se prepararon de la misma manera que el metodo en el anterior <2> (1).
(2) Transformacion y analisis por inmunotransferencia de celulas de tabaco cultivadas
Los experimentos de transformacion y el analisis por inmunotransferencia se llevaron a cabo de la misma manera que los metodos en los anteriores <2> (2) y (3).
Los resultados se muestran en la figura 17.
Cuando se expreso ER-2*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en las posiciones de aproximadamente 19, 21 y 23 kDa. Cuando se expreso Cyt-1*Stx2eB (PG12), una senal espedfica estaba por debajo del lfmite de deteccion. Cuando se expreso Cyt-2*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 19 kDa. Cuando se expreso Cyt-3*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 27 kDa, siendo la senal mayor que esa cuando se expreso Cyt-2*Stx2eB (PG12).
De lo anterior, se ha determinado que tambien en el transformante de la celula de tabaco cultivada, las protemas Stx2eB se pueden acumular de forma mas eficaz cuando se expresa la protema en la que dos o tres Stx2eB estan unidas en tandem a traves del espaciador que cuando se expresa una protema Stx2eB. Tambien se ha encontrado que cuando se expresa el tipo citoplasmico de construccion de ADN en el transformante de celulas de tabaco cultivadas, en particular cuando se expresa la protema en la que tres Stx2eB estan unidas en tandem a traves del espaciador, las protemas Stx2eB se pueden acumular de forma eficaz.
Tambien se ha encontrado que, en el transformante de la celula de tabaco cultivada, las protemas Stx2eB se pueden acumular de forma mas eficaz cuando se expresa el tipo retmulo endoplasmico de construccion de ADN que cuando se expresa el tipo citoplasmico de construccion de ADN.
<5> Experimentos de transformacion usando cuerpo de planta de tabaco
(1) Construccion de vectores para la transformacion
Los experimentos de transformacion se realizaron usando ER-2*Stx2eB (PG12), Chl-1*Stx2eB (PG12), Chl-2*Stx2eB (PG12), y Chl-3*Stx2eB (PG12) preparados anteriormente.
Los vectores para la transformacion se prepararon de la misma manera que el metodo en el anterior <2> (1).
(2) Transformacion de cuerpo de planta de tabaco
Se transformaron cuerpos de plantas de tabaco por el siguiente metodo usando los vectores preparados anteriormente.
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Se esterilizaron semillas de cuerpo de planta de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv. Petit habana SR1) y se sembraron en un medio MS. Una porcion de hoja de Nicotiana tabacum esterilizada se corto en trozos, cada uno tema un tamano de aproximadamente 1*1 cm sin incluir venas de la hoja, y se colocaron con la parte trasera de la hoja hacia arriba en una placa de Petri que contema agua esteril. Una suspension de Agrobacterium cultivada durante dos noches en el medio LB que contema 100 mg/l de kanamicina y obtenida en el anterior <2> (2) se echo en la placa de Petri, y el trozo de hoja se sumergio en la misma durante 3 a 5 minutos. El trozo de hoja se recogio, y un medio bacteriano extra en el trozo de hoja se seco con una toalla de papel esteril. El trozo de hoja se coloco en un medio de formacion de callo y se cultivo a 25°C. Despues de 2 a 3 dfas, cuando Agrobacterium se volvio visible en el medio, el trozo de hoja se transfirio a un tubo de 50 ml, se lavo cinco veces con agua esteril, se coloco en un medio de formacion de callo (que contema 100 mg/l de kanamicina y 250 mg/l de carbenicilina), y se cultivo a 25°C durante 1 a 2 semanas. Cuando el trozo de hoja se curvo comparado con la original y mostro una superficie concavo-convexa, el trozo de hoja se transfirio a un medio de formacion de brotes (que contema 100 mg/l de kanamicina y 250 mg/l de carbenicilina). Despues de 4 a 6 semanas adicionales, se corto un brote que tema un tallo desarrollado y una porcion de hoja, se transfirio a un medio de formacion de rafz (que contema 100 mg/l de kanamicina y 250 mg/l de carbenicilina), y se cultivo a 25°C hasta que se observo rizogenesis. Un cuerpo de planta crecido hasta un cierto tamano se hizo crecer como una planta en maceta.
(3) Analisis de inmunotransferencia
La hoja del cuerpo de planta de tabaco manipulada geneticamente producida anteriormente se tomo como muestra, y se anadio tampon de muestra de SDS a la misma en la proporcion de 1 pl de SDS respecto a 1 mg de hoja. La muestra se desnaturalizo termicamente a 95°C durante 2 minutos para servir como la muestra para electroforesis. Las protemas se separaron usando un gel de acrilamida al 15%, y despues se transfirieron a una membrana de PVDF (Hybond-P; Amersham) usando un aparato de electrotransferencia. La protema Stx2eB se detecto usando un anticuerpo anti-HA (No. 11 867 423 001, Roche).
Los resultados se muestran en las figuras 18 y 19.
Se obtuvieron clones en los se acumulo Stx2eB con alta eficacia en el cuerpo de planta transformado con uno de ER- 2*Stx2eB (PG12), Chl-1*Stx2eB (PG12), Chl-2*Stx2eB (PG12), y Chl-3*Stx2eB (PG12). Tambien en el tipo cloroplasto de construcciones de ADN, se ha encontrado que se obtuvo el clon que acumula Stx2eB de forma eficaz con una mayor probabilidad cuando se expresa la protema en que dos o tres Stx2eB estan unidas en tandem a traves del espaciador que cuando se expresa una protema Stx2eB.
Cuando se expreso ER-2*Stx2eB (PG12), se detectaron senales en las posiciones de aproximadamente 15 kDa, aproximadamente 19 kDa, y aproximadamente 22 kDa. Cuando se expreso Chl-1*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 12 kDa. Cuando se expreso Chl-2*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 19 kDa. Cuando se expreso Chl-3*Stx2eB (PG12), se detecto una senal en la posicion de aproximadamente 27 kDa. Estas correspondfan a los pesos moleculares estimados del diseno de las construcciones de ADN.
<6> Experimentos de transformacion usando celulas de tabaco cultivadas (1) Construcciones de vectores para la transformacion de Stx2eB
Se preparo ER-2*Stx2eB (PG12) por el metodo en el anterior <1> (1). Se prepararon ER-2*Stx2eB (PG17) y ER- 2*Stx2eB (PG22) por el siguiente metodo. El diseno de las construcciones de ADN se muestra en la figura 20.
Un cebador PG7-F (SEQ ID NO: 65) y un cebador PG7-R (SEQ ID NO: 66) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado resultante se inserto en el hueco BglII de ER-1*Stx2eB (PG12) obtenido en <1> (1) (plasmido 14).
Un cebador PG12-F (SEQ ID NO: 43) y un cebador PG12-R (SEQ ID NO: 44) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado resultante se inserto en el hueco BglII de ER-1*Stx2eB (PG12) (plasmido 15).
Se corto un fragmento Stx2eB-PG17 del plasmido 14 usando BamHI y BglII, y se inserto en el hueco BamHI de ER- 1*Stx2eB (PG12) (2*Stx2eB (PG17)). Se corto un fragmento Stx2eB-PG22 del plasmido 15 usando BamHI y BglII, y se inserto en el hueco BamHI de ER-1*Stx2eB (PG12) (2*Stx2eB (PG22)).
Para producir Stx2eB usando el transformante estable de la planta, cada una de las construcciones de ADN anteriores para Stx2eB se subclono en un vector para la transformacion. Es decir, cada una de ER-2*Stx2eB (PG12), ER- 2*Stx2eB (PG17) y ER-2*Stx2eB (PG22) se inserto en pBI121 (Clontech) usando XbaI y SacI, y se repartio entre el promotor del ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S pro.) y el terminador de la transcripcion del gen de nopalina sintetasa (NOS-T).
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(2) Construcciones de vectores para la transformacion de CTB
Se preparo ER-2*CTB (PG12) por el metodo en el anterior <1> (2). Se prepararon ER-2*CTB (PG17) y ER-2*CTB (PG22) por el siguiente metodo. El diseno de las construcciones de ADN se muestra en la figura 21.
Un cebador PG7-F (SEQ ID NO: 65) y un cebador PG7-R (SEQ ID NO: 66) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado resultante se inserto en el hueco BglII de ER-1*CTB (PG12) obtenido en <1> (2) (plasmido 16). Un cebador PG12-F (SEQ ID NO: 43) y un cebador PG12-R (SEQ ID NO: 44) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado resultante se inserto en el hueco BglII de eR-1*CTB (PG12) (plasmido 17).
Se corto un fragmento CTB-PG17 del plasmido 16 usando BamHI y BglII, y se inserto en el hueco BamHI de ER- 1*CTB (PG12) (2*CTB (PG17)). Se corto un fragmento CTB-PG22 del plasmido 17 usando BamHI y BglII, y se inserto en el hueco BamHI de ER-1*CTB (PG12) (2*CTB (PG22)).
Para producir CTB usando el transformante estable de la planta, cada una de las construcciones de ADN anteriores para CTB se subclono en un vector para la transformacion. Es decir, cada una de ER-2*CTB (PG12), ER-2*CTB (PG17) y ER-2*CTB (PG22) se inserto en pBI121 (Clontech) usando XbaI y SacI, y se repartio entre el promotor del ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S pro.) y el terminador de la transcripcion del gen de nopalina sintetasa (NOS-T).
(3) Experimentos de transformacion y analisis por inmunotransferencia
Los experimentos de transformacion y el analisis por inmunotransferencia se llevaron a cabo de la misma manera que los metodos en los anteriores <2> (2) y (3).
(a) Efectos de la longitud de espaciador en la union en tandem de Stx2eB Los resultados se muestran en la figura 22.
Cuando se expreso uno de ER-2*Stx2eB (PG17) y ER-2*Stx2eB (PG22), se detecto una senal a un nivel similar a la esa cuando se expreso ER-2*Stx2eB (PG12). Esto indica que cualquiera de PG17 y PG22 muestra el mismo efecto que PG12.
Cuando se expreso ER-2*Stx2eB (PG12), se detectaron senales en las posiciones de aproximadamente 19 kDa y aproximadamente 22 kDa. Cuando se expreso ER-2*Stx2eB (PG17), se detectaron senales en las posiciones de aproximadamente 19 kDa y aproximadamente 22 kDa. Cuando se expreso ER-2*Stx2eB (PG22), se detectaron senales en las posiciones de aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 23 kDa. Estas correspondfan con los pesos moleculares estimados del diseno de las construcciones de ADN.
(b) Efectos de la longitud de espaciador en la union en tandem de CTB Los resultados se muestran en la figura 23.
Cuando se expreso uno de ER-2*CTB (PG17) y ER-2*CTB (PG22), se detecto una senal a un nivel similar a la esa cuando se expreso ER-2*CTB (PG12). Esto indica que cualquiera de PG17 y PG22 muestra el mismo efecto que PG12.
Cuando se expreso ER-2*CTB (PG12), se detectaron senales en las posiciones de aproximadamente 32 kDa, aproximadamente 34 kDa y aproximadamente 36 kDa. Cuando se expreso ER-2*CTB (PG17), se detectaron senales en las posiciones de aproximadamente 32 kDa, aproximadamente 34 kDa y aproximadamente 36 kDa. Cuando se expreso ER-2*CTB (PG22), se detectaron senales en las posiciones de aproximadamente 32 kDa, aproximadamente 34 kDa y aproximadamente 36 kDa. Estas correspondfan con los pesos moleculares estimados del diseno de las construcciones de ADN.
Aplicabilidad industrial
La protema hnbrida de la presente invencion es muy estable y se acumula a un alto nivel en celulas vegetales. Ademas, al producir la protema hnbrida de la presente invencion en la planta usando la construccion de ADN de la presente invencion, es posible producir de forma eficaz vacunas orales para la toxina Shiga, la toxina del colera y la toxina labil al calor de Escherichia coli.
La presente invencion permite expresar un antfgeno bacteriano en la planta al nivel que es suficiente para inducir inmunidad. La presente invencion permite dar la inmunidad contra el antfgeno bacteriano al animal a bajo coste dando una planta transgenica como pienso al animal. Por ejemplo, la presente invencion es util para desarrollar vacuna contra la enfermedad de edemas del cerdo y vacuna contra el colera.
Claims (11)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Una protema Imbrida que comprende dos protemas toxinas seleccionadas del grupo que consiste en protema toxina Shiga (Stx), protema toxina del colera (CT) y protema toxina labil al calor de Escherichia coli (LT), en donde dichas protemas toxinas se unen en tandem a traves de un peptido que tiene las siguientes caractensticas (A), (B), (C), (D), (E), y (F), y el peptido se anade al extremo carboxi de la protema hforida:(A) un numero de aminoacidos es de 12 a 30, mas preferiblemente de 12 a 22;(B) un contenido en prolina es del 20 al 35%, mas preferiblemente del 20 al 27%; y(C) la prolina se distribuye cada dos o tres aminoacidos;(D) el contenido total de alanina, metionina y acido glutamico en los aminoacidos diferentes de prolina es el 10% o menor;(E) el contenido total de triptofano, leucina, isoleucina, tirosina, fenilalanina y valina en los aminoacidos diferentes de prolina es el 5% o menor; y(F) el contenido total de serina, glicina y asparragina en los aminoacidos diferentes de prolina es el 90% o mas.
- 2. La protema Imbrida segun la reivindicacion 1, en donde las protemas toxinas Shiga son subunidades B de la protema Stx2e, y las protemas toxinas del colera son subunidades B de la protema toxina del colera.
- 3. La protema Imbrida segun la reivindicacion 1 o 2, en donde un peptido senal secretor derivado de una planta se anade a su extremo amino.
- 4. La protema hforida segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde un peptido senal de retencion en el retmulo endoplasmico se anade a su extremo carboxilo.
- 5. La protema Imbrida segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde un peptido senal de transito al cloroplasto se une en su extremo amino.
- 6. Una construccion de ADN que comprende ADN que codifica la protema Imbrida segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
- 7. La construccion de ADN segun la reivindicacion 6, en donde el ADN que codifica la protema Imbrida esta operativamente unido a una region 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta, preferiblemente Nicotiana tabacum.
- 8. Un vector recombinante que comprende la construccion de ADN segun la reivindicacion 6 o 7.
- 9. Un transformante transformado con el vector recombinante segun la reivindicacion 8, en donde el transformante es una celula eucariota o una celula procariota.
- 10. El transformante segun la reivindicacion 9, en donde el transformante es una celula vegetal transformada o una planta transformada.
- 11. Una semilla, que se obtiene del transformante segun la reivindicacion 9 o 10, en donde la semilla comprende el vector recombinante de la reivindicacion 8.
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