CN101016332B

CN101016332B - 一种抑制志贺毒素的短肽及其用途

Info

Publication number: CN101016332B
Application number: CN2007100642287A
Authority: CN
Inventors: 王慧; 包士中; 荫俊; 史晶; 侯晓军; 蔡昆
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2007-03-07
Filing date: 2007-03-07
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2027-03-07
Also published as: CN101016332A

Abstract

本发明公开了一种抑制志贺毒素的短肽，该短肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示，可以通过化学合成或基因重组表达的方法进行大量制备，可以在短肽N端和C端通过添加化学基团、氨基酸、多肽、蛋白质、PEG、标记物等物质进行各种化学或生物修饰，以优化改善其稳定性等理化性质、提高或增加其应用性和应用范围。该短肽具有中和志贺毒素，有效抑制志贺毒素毒性的效应，可以作为毒素拮抗剂用于由产毒志贺菌、肠出血性大肠杆菌O157、霍乱弧菌等引起的疾病的治疗。

Description

一种抑制志贺毒素的短肽及其用途

技术领域

本发明涉及一种生物毒素抑制剂，具体说涉及一种具有抑制志贺毒素的短肽，还涉及该短肽的制备方法及用途。

背景技术

志贺毒素(Shiga Toxin，Stx)作为肠道病原菌产生的一类具有肠毒性、细胞毒性和神经毒性的细菌外毒素，是急性细菌性痢疾、霍乱O139、O157：H7等新发肠道病原菌最为关键的强致病毒力因子。临床上引起出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)以及病死率高达80～90％的溶血性尿毒症(hemolytic uremic syndrome，HUS)等严重并发症，每年此类疾病造成全球数百万人死亡。

目前针对志贺毒素尚无特异有效的预防产品和急救治疗药物。临床普遍采用的抗生素治疗已经引起多重耐药菌株的出现，造成抗生素治疗的失效。抗生素使用造成更加不利的后果是菌体崩解引发志贺毒素过量释放，加大了由毒素引发各种并发症的风险。因此针对志贺毒素相关疾病的治疗主张慎用抗生素，而应寻求特异性拮抗药物作为新的有效治疗手段。

Stx由1个志贺毒素A亚单位(StxA)和5个志贺毒素B亚单位(StxB)组成，毒素通过StxB介导与真核细胞表面的Gb3受体结合，进而StxA作用于细胞28S rRNA引起细胞病变。StxB与细胞Gb3受体的结合是毒素发挥作用的起始关键环节，如能阻断这种结合，将从根本上抑制Stx分子毒性的发挥。研究方向主要集中在毒素受体类似物和抗体治疗方面。Kitov，PI.报道了能与Stx结合的多糖化合物，具有潜在的治疗应用价值(Kitov PI，Sadowska JM，Mulvey G et al.Shiga-like toxin are neutralized by tailored multivalent carbohydrateligants.Nature 2000.403：669-672.)；2002年Natori Y.报道了Gb3受体治疗的实例(Natori Y.New drugs that prevent cytotoxicity of Shigatoxins.Nippon Rinsho.2002.60(6)：1131-1137.)，包括一种能在胃肠道途径阻止毒素扩散的新制剂和另一种可在循环系统抑制志贺毒素毒性的水溶性制剂。但是受体类多糖化合物的复杂制备工艺和副作用成为制约其发展的障碍。最近，有学者报道可表达毒素模拟受体的益生菌具有显著的毒素中和效果，可用于治疗志贺毒素(Paton AW，MoronaR，Paton JC.A new biological agent for treatment of Shiga toxigenicEscherichia coli infections and dysentery in humans.Nat Med.2000.6(3)：257-8.)及破伤风类疾病，但是这种活菌治疗的安全性有待进一步考察和验证(Paton AW et al，2000；Focareta A et al，2006)。在抗体治疗方面，Nakao，H等研究报道的单克隆抗体能够阻断Stx与细胞受体的结合，中和Stx细胞毒性(Nakao H，Kataoka C，Kiyokawa N et al.Monoclonal antibody to Shiga toxin 1，which blocks receptor binding andneutralizes cytotoxicity.Microbiol.and Immunol.2002.46(11)：777-780.)；2004年Inoue，KI(Inoue KI，Itoh K，Nakao H et al.Characterization of a Shiga toxin 1-neutralizing recombinant Fabfragment isolated by phage display system.Tohoku J.Exp.Med.2004.203：295-303.)利用噬菌体展示技术筛选获得具有Stx毒性中和效应的重组Fab抗体片段。但临床应用有待于抗体制备工艺的改进完善。

近年来日益引起人们研究关注的肽类小分子化合物，作为药物具有很鲜明的技术优势，包括分子量小，结构相对简单，可通过化学合成或基因工程方法进行大量低成本制备；功能明确，免疫原性低，副作用小，安全性高；易于从多途径吸收，给药途径可多样化。小分子肽成为新药筛选的重要来源之一(李越希，黄培堂。多肽在生物医药和诊断试剂中的应用。中国生化药物杂志2001.22(4)：208-210.)。其中利用噬菌体肽库具有高容量的特点，筛选具有毒素抑制作用的多肽分子就是可行的技术手段。目前针对志贺毒素的肽类抑制剂未见报道。

发明内容

为解决目前针对志贺毒素的抑制剂的缺乏，本发明提供了一种具有抑制志贺毒素毒性的短肽，该短肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

根据protparam tool软件对上述短肽的理化性质进行预测分析显示其分子量为1419.7，具有较好的稳定性，为疏水性短肽。

本发明的抑制志贺毒素毒性的短肽是通过以下的方法进行制备的。首先通过基因工程技术和分子生物学方法，设计引物，对基因进行修饰，制备StxB基因，构建重组表达StxB的原核基因工程菌-重组大肠杆菌，然后诱导表达并通过一系列纯化步骤，制备高纯度具有生物学活性的重组StxB蛋白。通过流式细胞技术检测，该重组StxB蛋白通过Gb3受体能够很好地结合于细胞表面，具有较好的结合活性，保持了其作为志贺毒素结合亚单位的生物学活性。利用噬菌体展示技术，以重组StxB为靶标，通过亲和淘选步骤，从随机线性十二肽库中筛选获得特异结合StxB的短肽。根据筛选出的与志贺毒素特异结合的短肽序列，搜索出一条出现频率最高的序列，利用生物信息学方法对该短肽的理化性质进行预测，结合预测分析结果，对该短肽进行化学修饰并合成。

本发明的短肽可以通过本领域已知的化学合成或基因工程重组表达的方法进行制备。可以在短肽N端和C端通过添加化学基团、氨基酸、多肽、蛋白质、PEG、标记物等物质进行各种化学或生物修饰，以优化改善其稳定性等理化性质、提高或增加其应用性和应用范围。特别地，本发明公开了在不改变本发明短肽的空间结构和稳定性的前提下，在短肽的N端和C端分别进行乙酰化修饰和氨基化修饰，以增加短肽的水溶性。

通过试验测定本发明短肽与StxB特异结合活性，显示其结合态稳定，结合动力学表现优良。志贺毒素毒性抑制效应动物试验显示本发明的短肽与志贺毒素孵育后，较好地抑制了志贺毒素的毒性，对受试小鼠起到保护作用。

通过上述体内和体外试验证实，本发明的短肽能通过抑制志贺毒素与宿主细胞受体的结合，具有抑制志贺毒素毒性的生物学效应，具有良好的应用前景，可以提供一种志贺毒素新的有效抑制剂，应用于志贺毒素所引起相关疾病的治疗，这些疾病包括由产毒志贺菌、肠出血性大肠杆菌O157或霍乱弧菌等产生志贺毒素的微生物所引起疾病。

附图说明

图1为stxb的PCR扩增鉴定图谱，其中1.DNA Marker；2.stxb的PCR扩增产物

图2为重组质粒pBV220-stxb的双酶切鉴定图谱，其中1.pBV220-stxb双酶切产物；2.DNA Marker

图3为重组大肠杆菌pBV220-stxb/DH5α诱导表达产物的SDS-PAGE图谱，其中1.蛋白分子量标准；2.重组菌未诱导对照；3.重组大肠杆菌诱导表达(箭头所指处为目的蛋白)

图4为重组StxB纯化产物的SDS-PAGE图谱，其中1.纯化后的StxB；2.蛋白分子量标准

图5为流式细胞术检测FITC-StxB与Hela细胞的结合图，(下列图示A-D分别显示，0μg、10μg、20μg、30μg FITC-StxB与Vero细胞的结合情况，结果证明重组制备的StxB能与靶细胞特异结合。)

图6为A6合成肽的质谱分析图

图7为A6合成肽纯度的HPLC分析

图8为BIAcore系统动态分析A6合成肽与StxB的梯度特异结合。

(图中紫色、篮色、红色、绿色、粉色曲线分别显示，1∶15、1∶30、1∶60、1∶80、1∶100 A6与StxB的动态结合情况，结果证明A6能与StxB特异结合，并具有量效关系)。

图9为A6合成肽的志贺毒素体内中和实验。

具体实施方式

实施例1重组大肠杆菌pBV220-stxb/DH5α

的构建及重组StxB的表达、鉴定

1.材料

1.1菌株、质粒和培养基

I型痢疾志贺菌51054购自中国药品生物制品鉴定所，用于stxb基因的钓取；大肠杆菌DH5α购自道普公司，用于基因克隆菌株构建和外源蛋白表达；温度调控性高效表达质粒pBV220购自Takara公司用于在大肠杆菌DH5α中表达外源蛋白。pMD18-T载体购自Takara公司，用于目的基因克隆。LB-Amp培养基(1％胰化蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％氯化钠，pH7.0，50μg/mL氨苄青霉素)用于大肠杆菌的培养和外源蛋白的表达。

1.2寡核苷酸引物

根据GenBank AJ271153序列设计编码stxb基因片段的5’端和3’端寡核苷酸引物，在各自5’末端分别引入EcoRI与PstI限制性酶切位点，并将上游引物中的密码子替换为大肠杆菌中高频使用密码子。5’端和3’端寡核苷酸引物序列如下：

5’端引物：5’GCGAATTCATGAAAAAAACCCTGCTGATCGCTGCATCG 3’如序列表中序列2所示。

3’端引物：5’GCCTGCAGCTGAGCTATTCTGAGTCAAC 3’如序列表中序列3所示。

2.方法与结果

2.1stxb基因的扩增和序列测定

以I型痢疾志贺菌51054为模板，用pfu DNA聚合酶进行PCR反应，反应条件为95℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 30s，7℃ 30s(30个循环)，72℃ 10min，扩增获得270bp的片段。见图1所示。

获得的PCR产物回收后，与pMD18-T载体连接，构建克隆质粒pMD18-T/stxb，转化感受态大肠杆菌DH5α，用ABI PRISM377DNA测序仪测序。

2.2pBV220-stxb重组质粒的构建及转化

以限制性内切酶EcoR I与Pst I将stxb基因从pMD18-T/stxb载体中切除回收，与同以EcoR I与Pst I酶切的质粒pBV220连接，获得重组质粒pBV220-stxb，转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR方法鉴定阳性克隆。

将stxb基因插入载体pBV220，构建成重组质粒pBV220-stxb。质粒以EcoR I与Pst I酶切，产生与stxb基因大小一致的片段，stxb基因正确插入到pBV220载体(图2)。

将重组质粒pBV220-stxb和PBV220分别转化至感受态大肠杆菌DH5α，以含50μg/mL氨苄青霉素LB的琼脂平板挑选转化子，分别命名为pBV220-stxb/DH5α和pBV220/DH5α。

2.3重组StxB在大肠杆菌中的诱导表达

选取如上述制备的重组大肠杆菌pBV220-stxb/DH5 α，接种至含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡过夜，次日以1∶100接种至LB液体培养基，继续在37℃振荡培养，至菌液浓度达到OD₆₀₀为0.8～1.0，迅速提高温度至41℃，继续培养5h。4℃5000g离心10min，以预冷的PBS洗菌体一次，离心收集菌体，待超声破碎。

SDS-PAGE分析：收集经过41℃温度诱导的重组菌体进行SDS-PAGE电泳，结果显示重组菌体样品中出现分子量为7.7kD的蛋白条带(图3)，与StxB预期分子量相符，凝胶扫描分析显示重组蛋白占总蛋白量20％左右。

2.4重组StxB的纯化

将离心收集的菌体用缓冲液A(20mM Tris-HCl，10mM NaCl，1mM EDTA，pH7.4)悬浮，置于冰浴中超声波破碎菌体，每次300W超声波处理20s，间隙10s，90个循环。破碎后的菌体悬液4℃10000g离心10min。上清缓慢滴加饱和硫酸铵溶液至30％浓度，边滴加边搅拌，4℃静置4h以上，4℃10000g离心10min，上清继续滴加饱和硫酸铵至80％浓度，4℃静置4h以上，4℃10000g离心10min，沉淀以缓冲液A复溶。复溶物装入透析袋(截流分子量3.5kD)，4℃下搅拌以缓冲液A透析，4h换液一次，共4次。4℃10000g离心10min，弃沉淀，留取上清。

透析后的样品进行离子交换层析。上样前以缓冲液A平衡QSepharose^TM HP HTrap^TM柱，2mL/min上样后仍以缓冲液A平衡，以缓冲液B(20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.4，)线性梯度洗脱，60min内缓冲液B升至100％浓度，收集280nm洗脱峰，SDS-PAGE鉴定目的蛋白峰位。

将离子交换层析收集获得的StxB样品，加样至Sephacry S-100凝胶柱(26/100)，以10mM PBS(pH7.4，)洗脱，流速0.5mL/min，收集280nm洗脱峰，SDS-PAGE鉴定目的蛋白峰位。StxB各步纯化的SDS-PAGE分析见图4。

2.5重组StxB的结合活性分析

将制备的StxB与FITC混合，装入透析袋，以0.1M NaHCO₃(pH8.6)溶液透析，至透析液中观察不到显著的FITC颜色。取1×10⁵/mL的新鲜Hela细胞0.5mL，和FITC-StxB混合后置于37℃孵育2h，通过流式细胞技术检测FITC-StxB与Hela细胞的结合。结果显示，制备的StxB能够很好地与靶细胞结合，保持了其作为志贺毒素受体结合区(亚单位)的生物学活性。结果如图5所示。

实施例2 具有志贺毒素毒性抑制效应的短肽的化学合成及活性鉴定

1.材料

Protparam tool软件(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)；本发明的短肽由军事医学科学院生物工程研究所合成，BIAcore 3000生物传感器系统为Pharmacia公司产品，Balb/C小鼠由军事医学科学院动物中心提供，菌株S.dys51054购自中国生物药物制品检定所，

StxB抗体购自Biodesign公司(ELISA效价为1∶200)。

2.方法与结果

2.1短肽A6的理化性质预测

利用protparam tool软件对毒素结合短肽A6的理化性质进行预测分析。显示短肽A6分子量为1419.7，具有较好的稳定性，为疏水性短肽，结果如下：

Number of amino acids：12

Molecular weight：1419.7

Theoretical pI：8.59

Formula：C₇₀H₁₁₀N₁₄O₁₅S₁

Total number of atoms：210

Extinction coefficients：

Extinction coefficients are in units of M^-1cm^-1，at 280nm.

Ext.coefficient 6990

Abs 0.1％(＝1g/l) 4.924，assuming ALL Cys residues appear as half cystines

Estimated half-life：

The N-terminal of the sequence considered is Y(Tyr).

The estimated half-life is：2.8hours(memmalian reticulocytes，in vitro).

10min (yeast，in vivo).

2min (Escherichia coli，in vivo).

Instability index：

The instability index(II)is computed to be-10.47

This classifies the protein as stable.

Aliphatic index：145.83

Grand arerage of hydropathicity (GRAVY)：1.133

2.1短肽A6的化学修饰及体外合成

在不改变短肽A6空间结构和稳定性的前提下，在短肽A6的N端和C端分别进行乙酰化修饰和氨基化修饰，以增加短肽的水溶性。

固相合成法进行化学合成，如图6、7所示。

2.2短肽A6与StxB特异结合的动态分析

借助BIAcore生物传感器系统，测定A6短肽与StxB特异结合活性。将StxB偶联到芯片CM5上，偶联量为785RU，以EDC/NHS活化和乙醇胺封闭。测定不同浓度的A6短肽与StxB结合的动力学常数。检测流速在20μL/min下进行，由Sensorgram记录曲线观察A6短肽的动态结合过程。结果显示，A6短肽与作为对照通道(Fc1)的无关蛋白结合的RU值为9.8，不同浓度A6短肽与StxB结合的RU值，随着A6短肽浓度的逐渐增加(1∶100、1∶80、1∶60、1∶30、1∶15、1∶1)，短肽与StxB偶联通道(Fc2)的结合量也随之升高，RU值分别为17.3、28.4、49.5、246.7、367.4。图8所示的结合动态曲线反映出了不同浓度A6短肽与StxB结合的动态过程，A6短肽呈现了较快速的结合(图中“结合区”所示结合曲线上升趋势明显)，并且解离的很缓慢，(图中“解离区”所示解离曲线没有明显下降趋势)，其结合态稳定，结合动力学表现优良。

2.3短肽A6的志贺毒素毒性抑制效应

2.3.1志贺毒素粗制品的制备：接种S.dys 51054于LB培养基过夜培养，次日按1∶100比例接种至1L培养基，震荡培养72h，5000rpm离心10min。菌体沉淀悬于PBS缓冲液，超声波破碎细胞，10000rpm离心10min，上清滴加饱和硫酸铵溶液至50％浓度，收集盐析沉淀，以PBS溶解并透析完全，得到志贺毒素粗制产物。

2.3.2短肽A6的志贺毒素毒性抑制效应：将1×LD₁₀₀志贺毒素(约65ul)与不同浓度的短肽A6分别混合至1ml，4℃孵育过夜。按照短肽A6使用剂量的不同，将小鼠分为6组，每组12只；另设PBS阴性对照组，即以PBS与志贺毒素混合；抗体阳性对照组，即以StxB抗体与志贺毒索混合。各组混合液体按照腹腔注射的方法，对小鼠进行攻毒，观察72h存活状况。结果显示，阴性对照组中，全体小鼠在48h内全部死亡；阳性对照组中，小鼠在72h观察期内，无死亡发生，72h后小鼠全部恢复正常状态。实验组中，各组小鼠出现眼睛闭合、皮毛耸立、四肢无力、不进食等志贺毒素中毒症状，严重程度与短肽A6使用剂量呈反比；短肽A6浓度达到75μg/mL时，小鼠存活率为8.3％(1/12)，浓度升至95μg/mL，小鼠存活率为58.3％(7/12)。结果证实，短肽A6与志贺毒素孵育中和后，较好地抑制了志贺毒素的毒性，对受试小鼠起到保护作用，结果如图9所示。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>一种抑制志贺毒素的短肽及其用途

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>

<400>1

Tyr Ile Trp Lys Pro Met Gly Thr Val Leu Leu Val

1 5 10

<210>2

<211>38

<212>DNA

<213>

<400>2

gcgaattcat gaaaaaaacc ctgctgatcg ctgcatcg 38

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>

<400>3

gcctgcagct gagctattct gagtcaac 28

Claims

1.一种抑制志贺毒素的短肽，其特征在于该短肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2.具有权利要求1所述短肽生物学活性的修饰肽，其特征在于在权利要求1的短肽的N端、C端添加化学基团、氨基酸、多肽、蛋白质、PEG或标记物物质进行化学或生物修饰。

3.根据权利要求2所述修饰肽，其特征在于在权利要求1的短肽的N端和C端进行的修饰分别为乙酰化修饰和氨基化修饰。

4.根据权利要求2所述修饰肽，其特征在于该修饰肽为单价或多价。

5.权利要求1所述短肽的制备方法，其特征在于该方法为化学合成或基因工程重组方法。

6.权利要求1-4中任一权利要求所述抑制志贺毒素的短肽或其修饰肽在制备由志贺毒素所引起相关疾病的治疗药物中的用途。

7.根据权利要求6所述用途，其中志贺毒素来自产生志贺毒素的微生物：产毒志贺菌、肠出血性大肠杆菌O157或霍乱弧菌。

8.根据权利要求7所述用途，其中产毒志贺菌为菌株S.dys51054。