WO2006001542A1

WO2006001542A1 - 毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法とｓｔｘ２阻害性ペプチド並びにベロ毒素中和剤

Info

Publication number: WO2006001542A1
Application number: PCT/JP2005/012286
Authority: WO
Inventors: Kiyotaka Nishikawa
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2004-06-28
Filing date: 2005-06-28
Publication date: 2006-01-05
Also published as: EP1782820B1; US20090029864A1; AU2005257527B9; CN101906152A; JPWO2006001542A1; CN101906152B; CN101068560B; AU2005257527A1; CA2575768A1; AU2005257527B2; JP4744443B2; EP1782820A4; US9103820B2; EP1782820A1; CN101068560A; CA2575768C

Abstract

次のステップ: (1)ミューテーションの導入による受容体結合サイトの特定 (2)ペプチドライブラリー法により野性型サブユニットに結合するペプチドモチーフと前記結合サイトが機能的に欠損したミュータントに結合するペプチドモチーフとの対比によるアミノ酸選択比に基づく結合サイト特異性ペプチドモチーフの特定を含むスクリーニング方法とする。受容体結合部がサブユニット構造をもつ毒素を阻害するペプチドをスクリーニングする。これによってリジン(Lys)3分子がペプチド結合された分子核構造部に、STX2阻害性ペプチドが組込まれて、合成が容易で、ベロ毒素を阻害することのできるSTX2阻害剤が提供される。

Description

明細書毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法と

STX2阻害性べプチド並びにべ口毒素中和剤技術分野

本発明はべ口毒素やコレラ毒素、百日咳毒素等の毒素を阻害することのできる毒素中和性べプチドのスクリーニング方法に関するものである。

また、本発明は S TX 2阻害性ペプチドとベロ毒素中和剤に関するものである。さらに詳しくは、ベロ毒素の細胞への接着を競合的に阻害してべ口毒素を効果的に阻害することのできる STX2阻害性べプチドと、経口投与も可能な新しいベロ毒素中和剤に関するものである。背景技術

腸管出血性大腸菌 O 157 : H 7が産生するべ口毒素は、赤痢菌由来志賀毒素と類似した細菌毒素の A B₅7アミリーに属するタンパク質であって、これらの毒素は、各種標的臓器の血管内皮細胞上のグロポトリオシルセラミド（Gb₃, Ga l a l— 4Ga l j81— 4G l c j31— C e r) 中のグロポ 3糖部分を認識し、接着することにより細胞内に取込まれ毒性を示すことが知られている。

そして、このような志賀様毒素は二種類存在し、これらの毒素が出血性大腸炎やその後の一連の微小血管障害である重症合併症〔たとえば、溶血性尿毒症症候群（HUS)〕などを引き起こす。 STX 1として表記される毒素は、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae Type I )の産生する志賀毒素とアミノ酸配列が同一である。一方、 STX2と表記される毒素は、 S TX 1とアミノ酸配列が 50〜60 %の相同性が認められている。これらの毒性は、そのアミノ酸配列のわずかな違いがあるものの、タンパク質合成阻害による細胞毒性や腸管毒性などの活性を示す。 S t Xは、二種類のサブュニット（Aと B) から構成される AB₅型の毒素であり、 Aサブュニット 1分子の周りに Bサブュニット 5分子が疎水性結合により取り囲んでいる。毒素活性を担っているのが Aサブュニットであり、 Bサブユニットは、細胞表層上に存在する糖鎖受容体に結合する役目を担っている。毒素の X線結晶構造解析などによる詳細な検討により、 Bサブュニット 1分子中に糖鎖の結合部位が 3ケ所存在していることが解明されてきている。すなわち、 1分子中の STX 2中には、 5 分子の Bサブュニットが存在することから、合計 1 5箇所の結合部位を提示していると推定される。

すなわち、 S TXは STX 1 , 2の 2つのファミリーに分類されるが、重篤な合併症を引き起こすのは STX 2産生菌がほとんどであり、臨床的には STX 2のほうがより重要である。従って、 STX 2に対する阻害剤の開発が急務である。これら STXは A— B₅型の毒素で、 Bサブユニットが細胞膜上の受容体、 G b₃ (globotriaosylceramide ： G a 1 (1 -4) 一 G a l ( 1 -4) — G l c /3 1 -Ceramide) に結合することにより細胞内に取り込まれる。また Bサブュニットペン夕マーは Gb 3の糖鎖部（グロボ 3糖： G a l a (1 - 4) -G a 1 ^ ( 1 - 4) -G l c /3 1 -) を特異的に認識する。従って、グロボ 3糖を高密度で集積させた化合物は、 STXに高親和性で結合し、その作用を阻害する STX阻害剤となりうる。

このような毒素のサブュニット構成とその機能が解明されるにともなって、細胞表層上の糖鎖受容体への結合機能を有している Bサブュニットの結合を選択的に阻害する方法が注目され、様々な観点からの検討が進められている。

この出願の発明者も前記のような毒素の糖鎖結合部位に対して効果的に糖鎖を結合させ、毒素の宿主細胞への接着を阻害する人工糖鎖クラスターの構築を行ってきた。そして、これまでに、カルポシランを糖鎖担持骨格としたデンドリマー型化合物群や、水溶性のポリマー化合物を提案している（特許文献 1一 2、非特許文献 1)。

たとえば、次式で表わされる SUPER TWIG (1) 6等である。このものは O l 57： H 7感染実験において有効性が証明された初めての化合物である

SUPER TWIGをはじめ、これまでの STX阻害剤開発は、生体内における阻害活性を発揮させるために S TX結合ュニットであるグロボ 3糖をいかに集積させるか、というコンセプトに基づいていた。しかしながら、グロポ 3糖単独での STXとの親和性（Kd) は 10— ³Mと必ずしも高くはなく、またその化学合成は非常に困難である。このことが臨床応用のための大きな障害となっている。従って臨床応用可能な治療薬開発のためには、グロポ 3糖よりも合成が容易で、 STXに対する結合能力に優れた新たな S TX結合ュニッ卜の開発が必要である。

そしてまた、以上のような課題は、ベロ毒素特有のものではなく、ベ口毒素 S TXの他に受容体結合部がサブュニッ卜構造をもっと考えられるコレラ毒素（A— B 5型）受容体： GM1、毒素原性大腸菌易熱性下痢原因毒素 LT (A— B 5型）受容体： GM 1、百日咳毒素（A_B

3

替え用紙（規則 26) 5型）受容体、炭疽菌毒素（7量体型）受容体： VWAドメインを有する蛋白（anthrax toxin receptor)等の場合には共通すると推察される。このような状況において、この出願の発明者は、これら毒素のレセプ夕一としての処方物質を構築すべく検討を進めてきた。

特許文献 l : WO 02/02588

特許文献 2 ：特願 2004— 108483号出願

非特許文献 1 ： Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 7669-74 発明の開示

本発明は、以上のような背景から、発明者によるこれまでの検討を踏まえ、合成が容易で、ベロ毒素等の受容体結合部がサブユニット構造をもつ毒素を効果的に阻害することのできる毒素中和剤を実現するため新しいスクリーニング方法を提供することを課題としている。

また、本発明は、発明者による.これまでの検討を踏まえ、合成が容易で、ベロ毒素を効果的に阻害することのできる新しい STX阻害剤、すなわちベロ毒素中和剤を提供することを課題としている。

この出願の発明者は、前記課題を解決するために、毒素中和性のぺプチドを実現することの可能性について検討を進めてきた。ペプチドへの着目は、合成が比較的容易であることと、一般に、薬物としての適用に際して安全性が高いということが大きな理由であった。

そして、発明者による鋭意検討の結果から、この出願は、前記の課題を解決するものとして、まず、以下の毒素中和性ペプチドのスクリー二ング方法を提供し、さらにより具体的に、 STX2阻害性ペプチドとべ口毒素中和剤を提供するものである。

第 1 ：受容体結合部が複数のサブュニット構造をもつ毒素を中和することのできるペプチドのスクリーニング方法であって、次のステップ；

(1) ミューテーシヨンの導入による受容体結合サイトの特定

(2) ペプチドライブラリ一法により野性型サブュニッ卜に結合するぺプチドモチーフと前記結合サイ卜が機能的に欠損したミュータントに結合するべプチドモチーフとの対比によるアミノ酸選択比に基づく結合サイト特異性ペプチドモチーフの特定を含むことを特徵とする毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法。

第 2 ：前記（2) のステップを複数回行い、順次にアミノ酸選択比のより高い結合サイト特異性べプチドモチーフを特定することを特徴とする毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法。

第 3 ：前記（2) のステップにおいては、リジン（Ly s) を複数個結合した核構造を形成し、その末端アミノ酸に複数個のペプチドライブラリーを結合した、多価の一次ペプチドライブラリーを用いることを特徵とする毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法。

第 4 ：前記多価の一次ペプチドライブラリーにおいては、ペプチドライブラリ一はスぺーサ一分子を介して末端アミノ基に結合していることを特徴とする毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法。

第 5 ：リジン（Ly s) 3分子がペプチド結合された分子核構造部に、少なくとも 7個のアミノ酸のペプチド結合によって構成されるべプチドモチーフであって、その配列において、少なくとも 2個の塩基性アミノ酸が結合したクラスタ一部を 2箇所有し、 C一末端側が塩基性ァミノ酸であるべプチドモチーフが組込まれていることを特徵とする S TX 2阻害性ペプチド。

第 6 ：クラスタ一部の塩基性アミノ酸として少なくともアルギニン（A r g) を含むことを特徵とする STX2阻害性ペプチド。

第 7 ：クラスタ一部が A r 3_ §または 8— 8—八 3 11であることを特徵とする STX 2阻害性ペプチド。

第 8 ： N_末端側が疎水性アミノ酸であることを特徵とする STX2阻害性ペプチド。

第 9 ：リジン（Ly s) 3分子がペプチド結合された分子核構造部に、次の 4種のアミノ酸配列のぺプチドモチーフのいずれかが組込まれていることを特徵とする STX 2阻害性ペプチド。

(1) FRRNRRN (配列番号 1 )

(2) PPPRRRR (配列番号 2)

(3) PPRRNRR (配列番号 3 )

(4) KRRNPR (配列番号 4)

第 10 ：ペプチドモチーフがスぺーサ一分子を介して組込まれていることを特徵とする S T X 2阻害性べプチド。

第 1 1 ：スぺーサ一分子は、ペプチドまたはァミノ基とカルボキシル基とを有し、炭素数：〜 10の炭化水素鎖構造を持つ分子によるものであることを特徴とする S T X 2阻害性べプチド。

第 12 ：ペプチドモチーフが末端修飾分子を有していることを特徴とする STX 2阻害性ペプチド。

第 13 ：末端修飾分子は電荷を有していない分子によるものであることを特徵とする S T X 2阻害性べプチド。

第 14：ペプチドモチーフは、アミノ酸シーケンス用分子を有していてもよいことを特徵とする STX 2阻害性ペプチド。

第 15 ：次式（a) (b)

(M e t— A 1 a— X o _ A 1 a— AHA— ) ₄— 3 L y s (a) (acetyl— X o—AHA_) ₄- 3 L y s (b) 〔式中の AHAは、アミノーへキサンカルボン酸基を示し、 Xoは、前記ペプチドモチーフ（1) (2) (3) (4) のいずれかを示し、 3 Ly sは、次式（1)

一 NH-

\ /

(^C.^Ha> * <CH₂) ₄

\ /

CH~CONH-CH~ (CH₂)广 NHOO— CH

Z ί \

一 CO NH-

OH

の構造を示している。〕

のいずれかで表わされる S TX 2阻害性ペプチド。

第 16. 前記いずれかのペプチドを有効成分として含有することを特徴とするベロ毒素中和剤。図面の簡単な説明

図 1は、ペプチドモチーフ（1) FRRNRRN (配列番号 1 ) 化合物のマススぺクトル図である。

図 2は、ペプチドモチーフ（2) PPPRRRR (配列番号 2 ) 化合物のマススぺクトル図である。

図 3は、ペプチドモチーフ（3) PPRRNRR (配列番号 3 ) 化合物のマススぺクトル図である。

図 4は、ペプチドモチーフ（4) KRRNPRR (配列番号 4) 化合物のマススぺクトル図である。

図 5は、ペプチドモチーフを有していない Me t -A 1 a化合物のマススぺクトル図である。

図 6は、 S TX 2 B_subunitに対する親和性を例示した図である。図 7は、 Ve r o細胞に対する STX 2の細胞毒性の阻害効果を例示した図である。発明を実施するための最良の形態

本発明は前記のとおりの特徵をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。

<毒素中和性べプチドのスクリ一ニング>

まず基本的なことは、本発明の毒素中和性ペプチドのスクリーンニング方法においては、前記第 1の発明のように、次のステップ；

( 1 ) ミューテーシヨンの導入による受容体結合サイ卜の特定

( 2 ) ペプチドライブラリ一法により野性型サブュニットに結合するペプチドモチーフ

と前記結合サイトが機能的に欠損したミュータン卜に結合するべプチドモチーフとの対比によるアミノ選択比に基づく結合サイト特異性べプチドモチーフの特定を含んでいることである。

より好適な形態としては、 ―

前記（2 ) のステップはこれを複数回行い、順次にアミノ酸選択比のより高い結合サイ卜特異性ペプチドモチーフを特定することが考慮される。

また、サブュニットと受容体間の結合にはクラスター効果が存在するとの知見が得られていることから、前記（2 ) のステップのための初期 (一次）ペプチドライブラリ一は、このクラスター効果に対応するものとして、アミノ酸の複数個の結合による核構造をもつものとすることが望ましい。

このような核構造については、たとえばその設計や合成の容易性、そしてなによりも実際的なクラスター効果のための分子サイズの観点から、リジン（L y s ) を複数個、たとえば好適には 2〜5個結合したものを用い、ぺプチドライブラリー自体を多価にしたものとすることが考慮される。

すなわち、前記（2 ) のステップにおいては、リジン（L y s ) を複数個結合した核構造を形成し、その末端アミノ酸に複数個のペプチドライブラリーを結合した、多価の一次ペプチドライブラリーを用いることである。この多価の一次ペプチドライブラリーにおいては、ペプチドラィブラリーはスぺーサ一分子を介して末端アミノ基に結合していてもよい。この場合、たとえばスぺーサ一分子は、ペプチドまたはアミノ基とカルボキシル基とを有し、炭素数 4〜 1 0の炭化水素鎖構造を持つ分子によるものとすることが好適な例の一つとして示される。

また、前記のステップ（1 ) における受容体結合サイトの特定は、公知のものとして対応してもよいし、実際に異変を導入し受容体との結合に及ぼす影響が大きいサイトとして特定してもよい。この出願の発明者らによれば、ベロ毒素 S T Xの場合には、受容体の結合サイトの特定は、グロポ 3糖の結合としてすでに見出されている。

<ベロ毒素中和性べプチドのスクリ一二ングと S T X 2阻害性ぺプチド >

そこで、以下にベロ毒素を阻害べプチドのスクリーニングについての例を示し、さらに詳しく本発明について説明する。

O 1 5 7 ： H 7などの腸管出血性大腸菌の感染は出血性大腸炎をひき起こすばかりでなく、時に溶血性尿毒症症候群（H U S ) や脳症を併発させ、むしろこれらの合併症が患者を死いたらしめる大きな原因となつている。ベロ毒素（Shiga toxin; Stx) は腸管出血性大腸菌の産生する主要な病原因子であり、血中に侵入したベロ毒素による腎ゃ脳の微小血管内皮の障害が前記合併症の原因と考えられている。従って、腸管内で産生された S T Xを強力に吸着して S T Xの血中への侵入を阻害する S T X吸着剤や、すでに血中に侵入したごく微量の S T Xに結合してその作用を阻害する S T X中和剤は、腸管出血性大腸菌感染症の有効な治療薬になると期待される。

このような大腸菌べ口毒素中和性のペプチドのスクリーニングに際しては、発明者による前記の SUPER TWIG ( 1 ) 6についての分子構造と作用機序との関係についての詳細な検討を踏まえることができる。以下、詳細に説明する。

1) SUPER TWIG ( 1 ) 6の S T X 1 B及ぴ 2 B— subunitに対する結合サイ卜の同定

一つの B— subimit monomer上にはサイト 1、 2、 3と名付けられた 3種類のグロポ 3糖結合サイトが存在する。従って、 B— subimit peiitamerでは計 15個のグロポ 3糖が結合しうることが知られている。新しい S TX結合ュニットを開発するためには、まずどのサイトを標的とするかが非常に問題となる。そこで、各サイトに single, double, triplemutationを導入して各種 mutant B— subunitを調製し、これら m utant と SUPER TWIG (1) 6との結合親和性を比較検討した。その結果、 SUPER TWIG (1) 6と STX 1 B _ subunitとの結合には「サイト 1 及ぴ 2」または「サイト 3単独」が使用されていること、また STX2 B— subimitとの結合には「サイト 3単独」が使用されるのみであることが明らかとなった。つまり、臨床的にもより重要な STX2に対す新規結合ュニッ卜を開発するためには、サイ卜 3を標的にすればよいことが判った。

2) 新規な S TX結合ユニットの開発

臨床的な重要性、ならびに前記 1) で明らかにされた結合サイトの特異性を考え、 S TX 2 B—subunitに結合し、 STX2の毒性を阻害することのできる新しい物質をペプチド構造を有するものとして探索することにした。このペプチドへの着目は、その合成が比較的容易であつて、一般的に医薬としての適用にも大きな障害がないことが、さらには、そのバリエーション、誘導体の展開についても可能性が大きいことが主要な理由であった。

このような観点からの活性ペプチドの探索のために、ペプチドライブラリーの新しい展開を行った。

すなわち、 1) で得られた知見に基づき、 wild type STX2 B— subimitに結合するペプチドモチーフから、サイト 3が機能的に欠損した mutant S TX 2 B— subimitに結合するペプチドモチーフをサブトラクトすることにより、 STX2 B— subimitのサイト 3特異的な結合モチーフを決定することとした。

すなわち、まず、発明者は、すでに protein kinaseの触媒部位などの機能ドメインに対して直接結合モチーフを決定する方法、ペプチドライブラリー法を開発している（K.Nishikawa et al. , Mol, Cell, 6， 969-2000)。そこで、このペプチドライブラリ一法の知見を踏まえて、ベロ毒素中和剤においては、前記のとおりの Bサブュニットペンタマ一とグロポ 3糖間の結合にはクラスター効果が存在することを利用し、ぺプチドライブラリー自体を多価にした新たな概念に基づいたぺプチドライブラリーを開発した。

まず、前記の SUPER TWIG (1) 6における核分子構造のサイズ等を考慮して、ペプチドライブラリーを多価にするために使用する核構造として、次式 NH-

\ /

i^Cr^i} * (CH₂5₄

\ /

CH-UONH-CH- (CH₂) ₄~NHCO-CH

Ζ ί \

一 CO _ΝΗ

OH で表わされるリジン（Ly s) を 3個結合させた構造を用い、スぺーサ —を介して 4個のペプチドライブラリーを結合した化合物を合成した。この化合物は、前記式における Ly s核分子構造における末端アミノ基に、次式

MAXXXXA- AHA- (配列番号 5 )

で表わされる 4個のペプチドライブラリー（Xa a— Xa a— Xa a— X a a) を結合したもの：（MAXXXXA— AHA) ₄— 3Ly sである。この化合物については、式中の AHAは、 amino- hexanoic acid を示しており、スぺーサ一分子を構成している。

AHA (amino-hexanoic acid) は Carbon 6個分のながさで、 SUPE R TWI Gの最適条件に合致させるために使用している。また、末端の MA (Me t— A 1 a) は、アミノ酸シークェンスを行ったときにちやんとシークェンスが行われているかどうかのチェックのために、スクリーニング時に導入している。 AHA—の前の A (A 1 a) も同様の理由による。その形状、核構造に存在する分岐鎖間距離、ライブラリーの価数、ライブラリ一間の距離、すべての点において SUPER TWIGの最適構造に合致するようにデザインしている。また得られた化合物をアミノ酸シークェンスにかけたところ、アミノ酸を degenerateした posit ionでは使用した 19種のアミノ酸（Cy sを除く）が効率よくランダマイズされていることが確認できた。

この 1次ペプチドライブラリーを用いて、まず wild type STX2 B — subimitに結合するペプチドモチーフを、またサイト 3の mutant S TX 2 B— subimitに結合するペプチドモチーフを決定した。すなわち、まずビーズにつけた 2 Bおよび 2 B—mutant (W32 A) の各々を 3 一 5 mg相当調整し、この各々をカラムにつめて affinityカラムを作製する。

そこに、 50mg程度の 1次スクリーニング用 multiple peptide library: (MAXXXXA- AHA-) ₄一 3 Ly sを加えて十分に結合させる。そのあと PBS等で十分に洗浄し、結合しなかった library を洗い流す。

最後にカラムに止まっている libraryを 30%酢酸で溶出する。回収された画分を dryupし、アミノ酸配列解析を行う。その結果、各 degenerate positionについて、どのアミノ酸がどの程度の強さで選択されてくるか、数値化された結果が得られる。 19種のアミノ酸すべての値をたすと 1になるように normalizeする。

そして、 2 Bを用いるときに、前記のようにして得られた、各 degenerate posUionの各アミノ酸の値を、 wild type: W32Aを用いたときに、前記のようにして得られた、対応する degenerate position の、対応するアミノ酸の値で割る。その結果、そのアミノ酸が 2Bでは W32 Aにくらベて何倍選択されるようになったかが数値化である。つまり、前者のモチーフ中に存在している各アミノ酸の選択比を後者のモチーフ中に存在している対応するアミノ酸の選択比で除することによつて、 S TX2 B— subimitのサイト 3特異的な結合モチーフを決定することができる。

その他の 18種のアミノ酸について同様の検討をおこない、最後に 1 9種のアミノ酸の値をすべてたすと 19になるように normalizeする。このとき、各アミソ酸の間で、選択性に差がないと値は 1となる。一般にこの値が 1. 5を越えると強い選択性がみられたと判断する。その結果を示したものが表 1である。なお、以下の表 1〜表 4、さらには図 6 〜図 7においては、アミノ酸は一文字標記としている。

表 1

1st screening. of the binding n¾)tif for 2B-subunit

Degenerate position

1 2 3 4

R t2, 1)

tt, 7) R it. δ) R Π. B) F[1.6) (l.T) Kit 7)

(1.6) ついで得られたモチーフを基にして、表 2に示す 2次ライブラリーを作製した。実際には、 1次クリーニングで、 Ar g， As n， Ph eなどのアミノ酸が選択されてきたので、これらのアミノ酸を xed posit ionとして 2次スクリーニングに導入する。すると library全体としての 2 B— subuiiitに対する結合性が増加するので、より特異的なモチーフが得られやすくなる。

¾ 2_

Peptide libraries for the 2nd screening

Degenerate position 1 23456 7

( A~XXXXXXX-A-AHA)₄-3 L y s

XXRXNXX XXX RXXX XXXNXXX この 2次ペプチドライブラリ一を用いて、前記と同様に wild type S TX 2 Β—subunitに結合するペプチドモチーフを、またサイト 3の lutant S TX 2 B— subunitに結合するべプチドモチーフを決定した。前者のモチーフ中に存在している各アミノ酸の選択比を後者のモチーフ中に存在している対応するアミノ酸の選択比で除することによって、 1次ペプチドライブラリーを用いて得られたモチーフよりもより選択性高く、 S TX 2 B— subunitのサイト 3特異的な結合モチーフを決定することができた。その結果を示したものが表 3である。

14

訂正された用紙 (簾 IJ91) 2nd screenjng of thg binding fiiotif for 2B-su¾uni

po ition

Libraries 1 2 3 4 5 6 7

RXN P it 5 HI, 3) R H R (2.1) i3.0)

21 1 { 3) 亂 4) WC1.4)

XRX PC1.4J PCI.4) P (1.3) ft RilS} R C2.3)

1 it Z) ft.2} R it 2)

ffd.El ¾f(t2)

V i 2) (1. ) V/l (1, 2J

XNX Kit?) !HUi P (14J R it 8} /H (t. Si

Rd.ei Pit 4) 11.5) il.41 0(1.3) δ》 Hi 4) ΡΠ.3)

FC1.4)

得られたペプチドモチーフは、そのアミノ酸配列が

(1) FRRNRRN (配列番号 1 )

(2) PPPRRRR (配列番号 2)

(3) PPRRNRR (配列番号 3 )

(4) KRRNPRR (配列番号 4)

である。なお、モチーフ（1) FRRNRRN (配列番号 1 ) については、 2次スクリーニングでも塩基性アミノ酸、 P r o、疎水性アミノ酸が選択されてくるものの、べストなモチーフとして各 posit ionについて一番数値の高いものを取出してゆくと、疎水性アミノ酸が好まれるという情報が反映されなくなってしまうので、各 library を通して得られる consensus配列として P h eを導入したものである。

そこで、得られたモチーフを 3個の Ly sを結合した前記式の分子核構造に、

Me t -A 1 a -X o - A 1 a— AHA—

(X oは前記モチーフのいずれかを示し、 AHAは前記のものを示す。

)

として組み込んだ化合物を合成した。その際には、 Ly a 3の核構造はビーズに結合した状態で市販されているので、通常のアミノ酸合成装置で C末端から順次合成し、つまり、 3 L y sの式において 4本一度に鎖をのばす。 AHAもァミノ基と力ルポキシル基を有するので同様にアミノ酸合成装置の使用が可能である。

これら化合物については質量分析により同定を行った。図 1、図 2、図 3および図 4は、各々、前記のペプチドモチーフ（1) (2) (3) ( 4) の場合のマススペクトルを示したものである。また、図 5は、参考として、前記のペプチドモチーフのいずれも有さない化合物（Me t— A 1 a)： M e t - A 1 a - A 1 a— AH Aの場合のマススぺクトルを示したものである。

<STX2阻害性べプチドとベロ毒素中和剤 > 以上の化合物の各々について S TX 2 B— subunitに対する親和性を調べたところ、高い親和性で結合することが示された。さらに vero細胞に対する S TX 2の細胞毒性を効率よく阻害することが明らかとなつた。

表 4および図 6は、 STX2 B— subunitに対する親和性を示している。測定方法は次のとおりである。

すなわち、まず図 6に示す量の合成べプチドを ELISA用 plastic plate にコートする。 1% BSAでブロッキング後、 0. lmicrogram/mlの wild type 2B-Hisまたは site 3 mutant W32A_Hisをくわえて室温 1時間結合させる。洗浄後、結合した各 2 B-subunitを抗 S TX 2 polyclonal antibody を用いた ELISA法にて検出する。

図 6中の小面は、既知量の wild type 2B- Hisまたは site 3 mutant W32A-Hisに対しては抗 S TX 2 polyclonal antibodyは同様に反応することを示している。

また、図 7 Aは、 vero細胞に対する STX 2細胞毒性の阻害効果を示したものである。この図 7の結果の測定においては、培養 vero cellに、 lpg/mlの STX 2、及び各濃度の各合成 peptideを存在させ、 3日間培養し、培養後の生存細胞を WST— assay (cell viability assay kit) にて定量して'いる。

S TX 2 (- )の条件での定量値を 100 %、 STX2、 lpg/ml単独の場合（つまり inhibitor なし）を 0%として、表示してある。

また、図 7 Bは、 E. c o 1 i 0157 : H 7感染のマウスを対象にした検証結果を示したものである。手順は以下のとおりである。すなわち、 0日目：タンパク質カロリー欠乏マウスに、致死量の E. c o l i O 157 ： H7 N— 9株を胃内感染させた。 2日目〜 4日目：マウスに、試料ペプチド、トリサッカロイド類似体（体重あたり、 75 g/g), または、サリンのみを 1日 2回、胃内投与した。 2日目〜 5 日目： PPR_ t e tまたは PPP— t e t (体重あたり、 225 g /g) を 1日 2回、胃内投与した。

本発明の試料ペプチドの優れた作用効果が確認される。

なお、図 6およぴ図 7中の表示； MAは前記のペプチドモチーフ（1 ) (2) (3) (4) のいずれも有していない、図 5にマススぺクトルを示した参考化合物（Me t - A 1 a)： M e t - A 1 a - A 1 a— AH Aによるコントロールの場合を示している。また、図 7における PPR 一 t e t等の表示は、表 4に示したものに対応している。

表 4

Kinetic analysis of the binding of synthetic

Peptides to His— tagged Six 28-subun i t

K_& ( M of unit)

PP RNRR 2,T 1.3S0

P P P R R S¾ 3,2 1,250

KR RN P R 2.1 1, 290

F RN RN 1.T 1，棚

MA m m

SUPER T IG{1)₄0 " u 840 前記例示の化合物については AHA (amino-hexanoic acid)をスぺーサー分子として、そしてこの AHAとペプチドモチーフ X oとの間に介在する A 1 a並びにペプチドモチーフ Xoの末端修飾分子 Me t—A 1 aをアミノ酸シークェンスの確認のために導入しているが、これらは各種であってよい。スぺーサ一分子としての AHAは、ァミノ基とカルポキシル基を有する炭素数 6個の鎖長のものとして S UP ER TW I Gとの対比検討から選択されたものであるが、この炭素数は、 6個がより好ましいとしても、 4〜 10個の範囲程度であってもよい。

また、ペプチドモチーフ X oと分子核構造部 3 Ly sによる S TX 2 阻害活性を損なわない限り、スぺーサ一分子については他の各種の分子によるものであってもよい。

また、スクリーニング時のアミノ酸シーケンスのために導入している末端 Me t一 A 1 aそして AHAに結合している A 1 aについては他の適宜なものであってよい。これらは、 S TX 2の阻害活性そのものを有していないため、スクリーニングの後には不要なものである。だたモチーフの末端に NH₂が露出するとプラス電荷になることから、電荷調節の観点からは、末端の M Aもしくは他種のものが存在することが好適である。これらは、一般的には電荷がないもの、さらには疎水性にも大きな影響を与えないものがさらには好適に考慮される。

このような修飾等は各種考慮されてよい。

たとえば、経口投与にともなう消化管内でのプロテアーゼによる分解を抑えるための安定化を目的として N—末端の Me tの NH₂基をァセチル基により保護してしまうことが考えられる。

そして発明者が確認したところでは、ァセチル化すると、 i n V i t r oでの STX2による細胞障害活性を阻害する作用（活性）は約 5 倍増大する。そして感染実験によっても効果の増大が確認されている。

このようなことからも、たとえば（a c e t y l—Xo—AHA) ₄ 3Ly s、あるいは a c e t y lを他の保護基に変更したり、 AHAを別のスぺ一サ一に変更した場合、さらにはスぺーサーを用いない場合についても好適に考慮されることになる。

そして本発明者の検討によれば、以上のとおりのスクリーニング法によつて導かれた S T X 2阻害性べプチドについては、その活性が発現されるものとしてさらに各種のバリエーションが見出されるている。

すなわち、より一般的には、 STX2阻害性ペプチドとしては、リジン（Ly s) 3分子がペプチド結合された分子核構造部に、少くとも 7 個のアミノ酸のぺプチド結合によって構成されるぺプチドモチーフであって、その配列において、少くとも 2個の塩基性アミノ酸、たとえばァスパラギン (A r g) や、リジン (Ly s)、ヒスチジン (H i s) が結合したクラスタ一部を 2箇所有し、 C一末端側が塩基性アミノ酸であるべプチドモチーフが組込れているものとして考慮されることが見出されている。

なかでも、クラスタ一部を構成する塩基性アミノ酸としてはアルギニン（Ar g) を含むことが好適に考慮される。このため、たとえば好適なクラス夕一部は、一 Ar g_Ar g—、 -Ar g-Ar g-As n- 等である。

また、本発明の S TX 2阻害性べプチドにおいては C一末端側は塩基性アミノ酸、たとえばアルギニン（Ar g) 等であり、 N—末端側が疎水性アミノ酸、たとえばプロリン（P r o) 等であることが好ましい。

C一末端側が塩基性アミノ酸であることが望ましいことは、結合する相手である STX2 B— subunitのグロポ 3糖結合部位 3 (S i t e 3) 付近に酸性アミノ酸のクラスターが存在することから、両者が静電的な相互作用をして親和性を増加させるためであると考えられる。また、 N—末端側が疎水性アミノ酸が望ましい理由としては、 STX2 B— subunitのグロポ 3糖結合部位 3 (S i t e 3) で中心的な役割を果たしている、トリブトファン（T r p) と疎水性の相互作用することによつて考えられる。

以上のことからも、本発明においては、前記の（1) (2) (3) (4 ) のべプチドモチーフが好適なものの一つとして提洪されることになるなお、本発明におけるペプチドモチーフは、 STX2阻害作用についての分子サイズ効果を考慮して前記のとおりの少くとも 7個のアミノ酸により構成されているが、前記の 7個以上であっても S TX 2阻害性を大きく損わない限り、薬剤等への利用としてさらにアミノ酸数が多くしてもよく、また、前記のように各種のスぺーサゃ末端修飾基を有していてもよいことは改めて言うまでもない。そして、本発明においては、以上のように、 S T X 2阻害活性を有するペプチドを有効成分とするベロ毒素中和剤としては、各種の剤型が採用されてよく、経口投与では、賦型剤等とともに成形して、錠剤や粉末としてもよいし、精製水等との組成物として液剤としてもよい。これらの組成物や剤型については従来公知のものをはじめとする各種の配合成分が用いられてよいし、そのための各種の方法が採用されてもよい。ベロ毒素中和剤としての投与量については、大腸菌 O 1 5 7 ： H 7感染が発見されてから、一般的には 5〜 5 0 O m g Z k g—体重程度となるように処方することが考慮されてよい。もちろん症状によって適宜としてよい。

なお、近年、微量で強力な生理活性を有するペプチドが数多く発見され、また遺伝子組換え技術や細胞融合などのバイオテクノロジーの急速な進歩によるペプチドの大量供給が可能になり、これら生理活性べプチドを医薬品として疾病の治療に応用しょうとする試みがなされている。しかしながら、こうしたペプチド性医薬品を経口投与しても十分な吸収率が得られないことが知られている。この原因は、これらペプチド性医薬品が消化管内の消化酵素やタンパク分解酵素により速やかに分解を受けたり、あるいは水溶性で高分子であるため消化管粘膜を透過しにくいことによると考えられる。このため、これら医薬品の投与法は、臨床上ほとんどすべてが筋肉投与、皮下投与及び静脈内投与などの注射による投与に限られているのが現状である。しかしながら、これら注射による投与は、患者に苦痛を伴い、またアレルギー反応やアナフィラキシーショックなどの重篤な副作用を発現するという欠点を有する。そこで最近では、こうした注射に代わる投与経路として経口投与をはじめとする経粘膜投与が注目されているが、注射に比べると十分な吸収率が得にくいのが現状である。したがって、現在では経口並びに経粘膜投与後の生理活性ペプチドの吸収率を改善するため、種々の方法が試みられているが、それらを大別すると、（ 1 ) 吸収促進剤やタンパク分解酵素阻害剤などの製剤添加物の利用、（2 ) 薬物の新規投与経路の開発、（3 ) 薬物の分子構造修飾、（4 ) 薬物の剤形修飾に分類できる。

本発明においても実際の薬剤としての投与に際して、経口投与を可能にするためにこれまでの技術知見を踏まえた様々な形態を採用することができる。たとえば吸収促進剤として代表的な界面活性剤や胆汁酸、キレート剤、脂肪酸等の炭化物を用いることや、タンパク分解酵素阻害剤としてダリココール酸ナトリゥムゃパシトラシン、大豆トリプシンィンヒビター、力モスタツ卜、ァプロチニン等を添加すること、あるいはリボソームゃェマルジヨンに包含させたり、カプセルに封入して使用することなどの適宜な手段が採用されてよい。産業上の利用可能性

本発明の方法によれば、前記のとおりのベロ毒素やコレラ毒素、百日晐毒素、炭疽菌毒素等の受容体結合部がサブュニッ卜構造をもつ毒素の阻害性を有し、その合成がペプチド合成として容易であって、治療薬としても有効な毒素中和性のペプチドをスクリーニングすることが可能とされ、これらペプチドの提供が可能とされる。

そして、前記のとおりの本発明のぺプチドは S T X 2阻害性を有し、その合成がペプチド合成として容易であって、腸管出血性大腸菌感染症の治療薬として有効なベロ毒素中和剤を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 受容体結合部が複数のサブュニッ卜構造をもつ毒素を中和することのできるペプチドのスクリーニング方法であって、次のステップ；

( 1 ) ミューテーシヨンの導入による受容体結合サイトの特定

( 2 ) ペプチドライブラリ一法により野性型サブュニッ卜に結合するぺプチドモチーフと前記結合サイ卜が機能的に欠損したミュータントに結合するべプチドモチーフとの対比によるアミノ酸選択比に基づく結合サイト特異性ペプチドモチーフの特定を含むことを特徴とする毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法。

2 . 前記（2 ) のステップを複数回行い、順次にアミノ酸選択比のより高い結合サイト特異性べプチドモチーフを特定することを特徴とする請求項 1の毒素中和性べプチドのスクリ一二ング方法。

3 . 前記（2 ) のステップにおいては、リジン（L y s ) を複数個結合した核構造を形成し、その末端アミノ酸に複数個のペプチドライブラリ一を結合した、多価の一次ペプチドライブラリーを用いることを特徴とする請求項 1または 2の毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法。

4 . 前記多価の一次ペプチドライブラリーにおいては、ペプチドライブラリーはスぺーサ一分子を介して末端アミノ基に結合していることを特徴とする請求項 3の毒素中和性ペプチドのスクリーニング方法。

5 . リジン（L y s ) 3分子がペプチド結合された分子核構造部に、少なくとも 7個のアミノ酸のぺプチド結合によって構成されるべプチドモチーフであって、その配列において、少なくとも 2個の塩基性ァミノ酸が結合したクラス夕一部を 2箇所有し、 C—末端側が塩基性アミノ酸であるべプチドモチーフが組込まれていることを特徴とする S T X 2 阻害性ペプチド。

6 ：クラスタ一部の塩基性アミノ酸として少なくともアルギニン（A r ) を含むことを特徴とする請求項 5の S T X 2阻害性べプチド。

7. クラス夕一部が、 A r g— A r gまたは A r g— A r g— A s ηであることを特徵とする請求項 6の S Τ X 2阻害性べプチド。

8. Ν—末端側が疎水性アミノ酸であることを特徴とする請求項 5から 7のうちの STX2阻害性ぺプチド。

9. 次の 4種のアミノ酸配列のペプチドモチーフの少なくともいずれかが組込まれていることを特徴とする請求項 5から 7のうちのいずれかの S ΤΧ 2阻害性ぺプチド。

(1) FRRNRRN (配列番号 1 )

(2) PPPRRRR (配列番号 2)

(3) PPRRNRR (配列番号 3 )

(4) KRRNPRR (配列番号 4)

10. ペプチドモチーフがスぺーサ一分子を介して組込まれていることを特徵とする請求項 5から 9のうちのいずれかの S ΤΧ 2阻害性ぺプチド。

11. スぺーサ一分子は、ペプチドまたはァミノ基とカルボキシル基とを有し、炭素数 4〜10の炭化水素鎖構造を持つ分子によるものであることを特徴とする請求項 10の STX2阻害性のペプチド。

12. ペプチドモチーフが末端修飾分子を有していることを特徵とする請求項 5から 1 1のうちのいずれかの STX2阻害性のペプチド。

13. 末端修飾分子は電荷を有していない分子によるものであることを特徴とする請求項 12のペプチド。

14. ペプチドモチーフは、アミノ酸シーケンス用分子を有していてもよいことを特徴とする請求項 5のペプチド。

15. 次式（a) (b)

(Me t -A l a-Xo-A l a-AHA-) ₄-3 Ly s (a) (acetyl— X o— AHA—） ₄- 3 L y s (b)

〔式中の AHAは、アミノーへキサンカルボン酸基を示し、 Xoは、前記のペプチドモチーフ（1) (2) (3) (4) のいずれかを示し、 3 L y sは、次式 H

\ /

( ₄ (CH₂) ₄

\ /

-CDNH-CH- (CH₂)广 NHCO— CH

^→ CO _NH—

ί

OH の構造を示している。〕

のいずれかで表わされる請求項 12または 13のペプチド。

16. 請求項 5から 15のうちのいずれかのペプチドを有効成分として含有することを特徵とするベロ毒素中和剤。