CN102040654B - 抑制2型志贺毒素活性的多肽tf1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制2型志贺毒素活性的多肽TF1及其编码基因与应用。本发明提供的多肽，命名为TF1(又名P1)，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。该多肽P1可以做成药物以预防和/或治疗由2型志贺毒素或产2型志贺毒素的病原菌所引起疾病。

Description

抑制2型志贺毒素活性的多肽TF1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及抑制2型志贺毒素活性的多肽TF1及其编码基因与应用。

背景技术

志贺毒素(Shiga Toxin，Stx)，又称志贺样毒素(Shiga-like Toxin，Slt)作为肠道病原菌产生的一类具有肠毒性、细胞毒性和神经毒性的细菌外毒素，包括1型、2型志贺毒素(Stx1，Stx2)，是急性细菌性痢疾、霍乱O139、O157:H7等新发肠道病原菌最为关键的强致病毒力因子，可以引起出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)以及高病死率的溶血性尿毒症(hemolytic uremicsyndrome，HUS)等严重并发症。而流行病学研究和临床资料均表明，相比较Stx1，Stx2与感染并发症，特别是HUS发生的相关性更高，被认为是重要的防治药物设计靶标。

目前针对志贺毒素相关病原菌的重症感染尚无特异有效的预防产品和急救治疗药物。临床普遍采用的抗生素治疗已经引起多重耐药菌株的出现，造成抗生素治疗的失效。抗生素使用造成更加不利的后果是菌体崩解引发志贺毒素过量释放，加大了由毒素引发各种并发症的风险。因此针对志贺毒素相关疾病的治疗主张慎用抗生素，而应寻求特异性药物作为新的有效治疗手段。

Stx2(又称Slt2)由1个志贺毒素A亚单位(Stx2A)和5个志贺毒素B亚单位(Stx2B)组成，毒素通过Stx2B介导与真核细胞表面的Gb3受体结合，进而Stx2A作用于细胞28S rRNA引起细胞病变。Stx2B与细胞Gb3受体的结合是毒素发挥作用的起始关键环节，如能阻断这种结合，将从根本上抑制Stx2分子毒性的发挥。国内外研究方向主要集中在毒素受体类似物和抗体治疗方面。Nishikawa报道了能与Stx结合的多糖化合物，具有潜在的治疗应用价值(Nishikawa K，Matsuoka K，Watanabe M，et al.Identification of the optimal structure required for a Shiga toxin neutralizer with orientedcarbohydrates to function in the circulation.J Infect Dis 2005；191：2097-2105.)；2002年Natori Y.报道了Gb3受体治疗的实例(Natori Y.New drugs that prevent cytotoxicity ofShiga toxins.Nippon Rinsho.2002.60(6)：1131-1137.)，包括一种能在胃肠道途径阻止毒素扩散的新制剂和另一种可在循环系统抑制志贺毒素毒性的水溶性制剂。但是受体类多糖化合物的复杂制备工艺和副作用成为制约其发展的障碍。最近，有学者报道可表达毒素模拟受体的益生菌具有显著的毒素中和效果，可用于治疗志贺毒素相关疾病(Paton JC，Rogers TJ，Morona R，Paton AW.Oral administration of formaldehyde-killedrecombinant bacteria expressing a mimic of the Shiga toxin receptor protects mice fromfatal challenge with Shiga-toxigenic Escherichia coli.Infect Immun 2001；69：1389-1393.)，但是这种活菌治疗的安全性有待进一步考察和验证。在抗体治疗方面，Sheoran等研究报道的单克隆抗体能够阻断Stx2与细胞受体的结合，中和Stx2细胞毒性(Sheoran AS，Chapman-Bonofiglio S，Harvey BR，et al.Human antibody against shiga toxin 2administered to piglets after the onset of diarrhea due to Escherichia coli O157:H7preventsfatal systemic complications.Infect Immun 2005；73：4607-4613.)，但临床应用有待于抗体制备工艺的改进完善。

近年来日益引起人们研究关注的肽类小分子物质，作为药物具有很鲜明的技术优势，包括分子量小，结构相对简单，可通过化学合成或基因工程方法进行大量低成本制备；功能明确，免疫原性低，副作用小，安全性高；易于从多途径吸收，给药途径可多样化。小分子肽成为新药筛选的重要来源之一(李越希，黄培堂。多肽在生物医药和诊断试剂中的应用。中国生化药物杂志2001.22(4)：208-210.)。其中利用噬菌体肽库具有高容量的特点，筛选具有毒素抑制作用的多肽分子就是可行的技术手段。目前针对志贺毒素的肽类抑制剂鲜见报道。可参考的科学文献主要为2006公开的Nishikawa K的研究报道(Nishikawa K，Watanabe M，Kita E，et al.A multivalent peptidelibrary approach identifies a novel Shiga toxin inhibitor that induces aberrant cellulartransport of the toxin.Faseb J 2006；20：2597-2599.)，以及Miura Y的研究报道(Miura Y，Sakaki A，Kamihira M，Iijima S，Kobayashi K.A globotriaosylceramide(Gb3Cer)mimicpeptide isolated from phage display library expressed strong neutralization to Shiga toxins.Biochem Biophys Acta 2006；1760：883-889.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制2型志贺毒素活性的多肽。

本发明提供的多肽，命名为TF1(又名P1)，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

本发明的另一目的在于提供上述的多肽的修饰体。

本发明提供的多肽的修饰体是在上述多肽的N端和/或C端进行化学修饰或生物修饰得到的。

进一步，上述化学修饰可为乙酰化修饰或氨酰化修饰。

上述修饰体可为单肽或分支肽。

上述多肽的编码基因也属于本发明的保护范围之内。

含有上述基因的重组载体、重组菌或转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。

上述多肽或者上述的修饰体在制备预防和/或治疗由2型志贺毒素或产2型志贺毒素的病原菌所引起疾病的药物中的应用也属于本发明的保护范围之内。

上述病原菌为产2型志贺毒素的大肠杆菌、志贺氏痢疾菌或霍乱弧菌。

具体地讲，上述产2型志贺毒素大肠杆菌为肠出血性大肠杆菌O157。

实验证明：本发明提供的多肽P1的浓度越大，其与Stx2B结合量越大。多肽P1与Stx2结合的亲和力常数KD：1.25×10^-6M。细胞毒性中和实验发现：P1的浓度为300μM时，对Stx2细胞毒作用的抑制率达82％。多肽TF1(又名P1)(300μmol/L)对FITC-Stx2B与HeLa细胞结合的阻断率为45.7％。动物实验发现：安慰剂组动物在4-5天时全部死亡，不同剂量多肽P1给药组表现为不同程度的保护效应，当多肽的剂量达到11mg/kg，P1可以对小鼠提供完全保护(见图6A)，多肽P1对小鼠的保护效力具有剂量依赖性。

附图说明

图1为TF1(又名P1)合成肽的质量分析图，A图为质谱分析图，B图为高效液相色谱分析图。

图2为WA8(又名P8)合成肽的质量分析图，A图为质谱分析图，B图为高效液相色谱分析图。

图3为梯度浓度多肽(P1、P8)与Stx2B结合活性，随着浓度增大，多肽P1、P8与Stx2B结合量逐渐增大。

图4为多肽与Stx2的结合动力学曲线图，BIAcore系统动态分析TF1(又名P1)、WA8(又名P8)合成肽与Stx2的梯度特异结合。其中曲线自下而上所示浓度由低到高倍增，A图P1浓度范围为0.96-15.38umol/L，B图P8的浓度范围为2.44-39.125umol/L，结果显示多肽能与Stx2特异结合，具有量效关系。

图5为TF1(又名P1)、WA8(又名P8)合成肽的体外细胞毒抑制效应的光镜观察(×200)，A为对照组(PBS)，B为Stx2，C为Stx2与多肽(P1or P8)孵育后加入HeLa细胞。

图6为小鼠5LD50攻毒保护实验结果，小鼠先腹腔给药，20min后Stx2(5LD50)腹腔攻毒记录存活率，图A为对P1的药效观察，图B为对P8的药效观察，给药剂量范围分别为0.7mg/kg-11mg/kg。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、短肽TF1(又名P1)、WA8(又名P8)的修饰、化学合成与结合活性分析

一、短肽TF1(又名P1)、WA8(又名P8)的修饰、合成

1、TF1、WA8合成肽序列的筛选

Stx2B蛋白的制备：以EHEC O157:H7菌(购自ATCC)为模板，用引物5’-catatggctaaaggtaaaattgag-3’和5’gcggccgcgcctcagtcatcagtcatt-3’扩增stx2B基因。利用pEASY-T1克隆载体测序鉴定，测序结果表明，扩增产物的核苷酸序列如GenbankNC_002655的第1353327位至第1353533位。将扩增产物插入pET22b+载体(购自Novagen公司)的NdeI和Not I酶切位点构成重组质粒pET22b-stx2B，然后将pET22b-stx2B导入E.coli.BL21(DE3)菌株(购自Transgen公司)构建重组工程菌pET22b-stx2B/BL21(DE3)。重组菌克隆接入含100ug/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃水浴过夜震荡，次日按1∶100比例转接于三角烧瓶扩大培养。待茵体OD₆₀₀至0.6，加入IPTG至工作浓度为1mmol/L，继续诱导表达5h，可以实现Stx2B的高效表达。诱导菌体超声破碎处理后，10000r/min离心10min，收集包涵体蛋白，以含6mol/L盐酸胍的PBS溶液变性溶解，将变性蛋白装入透析袋，以含递减浓度尿素(6，4，2，1，0mol/L)的Tris缓冲液(10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，0.3mol/L精氨酸，1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.25mmol/L氧化型谷胱甘肽，10％甘油，50mmol/L NaCI，pH 8.0)逐步透析，最后透析至10mmol/L Tris，pH 8.0。复性蛋白最后经Q Sepharose离子柱纯化，洗脱液为10mmol/L Tris-1mol/L NaCI，线性洗脱。相关实验研究细节已公开发表(Tu W，Cai K，Gao X，Xiao L，Chen RC，Shi J，Liu H，Hou XJ，Wang Q，Wang H，Improved production of holotoxin Stx2with biological activities by using a single-promotervector and an auto-induction expression system.Protein Expr.Purif.2009，67(2)：169-174)。

利用噬菌体展示技术，以重组Stx2B为靶标，通过亲和淘选步骤，从随机线性十二肽库中筛选获得特异结合Stx2B的短肽。根据筛选出的与2型志贺毒素特异结合的短肽序列，搜索出现频率最高2个序列，命名为TF1(又名P1)、WA8(又名P8)。利用protparam tool软件(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)对短肽TF1、WA8的理化性质进行预测分析，结果显示：TF1由12个氨基酸组成，分子式为C₇₇H₁₀₁N₁₇O₁₈S₁，分子量为1584.8，理论pI为5.19；WA8由12个氨基酸组成，分子式为C₇₉H₉₆N₁₆O₁₈，分子量为1557.7，理论pI为6.74。

2、化学修饰及体外合成

在不改变短肽一级结构的前提下，在短肽TF1、WA8的N端分别进行乙酰化修饰，以增加短肽的水溶性和稳定性。多肽的化学修饰合成由上海波泰生物科技公司完成。固相合成法进行化学合成，并进行质谱和HPLC质量分析，如图1、2所示，图1-A显示质谱分析合成肽TF1的分子量为1584.9与理论值相符，图1-B显示HPLC质量分析合成肽TF1的纯度为95.1％；图2-A显示质谱分析合成肽WA8的分子量为1557.7与理论值基本相符，图2-B显示HPLC质量分析合成肽WA8的纯度为95.3％。

短肽TF1(又名P1)的氨基酸序列如序列表中序列1所示；WA8(又名P8)的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

二、短肽TF1(又名P1)、WA8(又名P8)的结合活性分析

BIAcore 3000生物传感器系统、CM5芯片及配套试剂为GE公司产品，抗组氨酸HRP标记抗体购自Pierce公司(ELISA效价为1∶2000)。大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞，大肠杆菌DH5α和pEASY-T1克隆载体购自北京TransGen生物技术公司。Taq DNA聚合酶，T4DNA连接酶和限制性内切酶购自NEB公司，PCR引物由Sunbio北京生物科技有限公司合成，质粒提取和纯化试剂盒购自Biomed北京有限公司，5毫升HisTrap纯化柱购自GE公司，8-10kDa的透析膜购自北京科海军舟生物技术公司，表达载体pET32a购自Novagen公司。

1、ELISA分析多肽与Stx2B相互作用

浓度梯度多肽4℃过夜包被(设置阴性对照BSA)，PBST洗涤，3％BSA封闭1h，PBST洗涤，加入步骤一制备得到的Stx2B蛋白，置37℃孵育1小时。然后洗涤，与多肽结合的Stx2B采用抗组氨酸标签抗体检测，显色，OD₄₉₀读数。如图3所示，随着多肽(P1，P8)浓度增大，与Stx2B结合量逐渐增大，相同的多肽浓度下P1结合Stx2B量大于P8。

2、TF1、WA8合成肽与Stx2特异结合的SPR动态分析

Stx2的制备：以EHEC O157:H7菌为模板，用引物1：5’-GGGGGGAATTCATGAAGTGTATATTATTTAAATGGG-3’和2：5’-TTTTTTGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTCATTATTAAACTGCACTTCAG-3’扩增全志贺毒素基因stx2。利用pEASY-T1克隆载体测序鉴定，测序结果表明，扩增产物的核苷酸序列如Genbank NC_002655的第1352290位至第1353527位。采用单启动子双读码框的策略构建工程菌pET32a-stx2/plysS，具体是将扩增产物插入pET32a的EcoRI和SalI酶切位点构成重组质粒pET32a-stx2，然后将pET32a-stx2导入E.coli.BL21(DE3)plysS菌株(购自Transgen公司)构建重组工程菌pET32a-stx2/plysS。

其中，重组质粒pET32a-stx2含有一个T7启动子，全志贺毒素基因stx2克隆含有两个开放阅读框(stx2a和stx2b)。添加IPTG至终浓度为1mmol/L进行诱导，30℃水浴振荡培养5h，可以实现Stx2的高效可溶表达，Stx2经镍柱HisTrap纯化后纯度达90％以上，具有生物学功能活性，相关实验研究细节已公开发表(Tu W，Cai K，Gao X，XiaoL，Chen RC，Shi J，Liu H，Hou XJ，Wang Q，Wang H，Improved production of holotoxinStx2with biological activities by using a single-promoter vector and an auto-inductionexpression system.Protein Expr.Purif.2009，67(2)：169-174)。

借助BIAcore生物传感器系统，测定短肽与制备的Stx2特异结合活性。将Stx2偶联到芯片CM5的Fc4上，偶联量为2235.9RU，以EDC/NHS活化和乙醇胺封闭。测定不同浓度的短肽(2倍比稀释)与Stx2结合的动力学曲线。检测在20μL/min流速下进行，由Sensorgram记录曲线分别观察短肽TF1、WA8的动态结合过程。通过BIAevaluation 3.0软件包分析，由Sensorgram记录曲线中的结合(association)部分获得Ka，解离(dissociation)部分获得Kd。对应梯度浓度多肽有不同的反应量。从分析结果报告中可以读取Ka、Kb、KA、KD数值。公式为：R为某一时刻的SPR信号(RU，Req为多肽(analyte)稳定结合水平(RU)，Rmax为多肽的最大结合能力(RU)，t为时间，dR/dt为SPR信号变换率，C为多肽浓度。Rnax＝(MWanalyte/MWligand)Rligand×Svalence，Ka＝(dR/dt)/t，Kd＝(dt/dR)/R，KD＝Kd/Ka＝C×(Rmax-Req)/Req。

结果如图4所示，P1和P8的浓度范围分别为0.96-15.38uM、2.44-39.125uM，测算结果表明，P1与Stx2结合的亲和力常数KD：1.25×10^-6M；P8与Stx2结合的亲和力常数KD：2.48×10^-5M。

实施例2、TF1、WA8合成肽的体外细胞毒抑制活性及对毒素的靶细胞结合阻断作用

HeLa细胞株、胰酶消化液和双抗购自Hyclone公司，DMEM培养基购自GIBCO公司，胎牛血清购自Biochorm公司，MTT为sigma公司产品，FITC购自莱宝公司。细胞培养瓶、培养板购自CORNING公司，CO₂培养箱为日本SANYO公司产品，倒置光学显微镜为日本Olympus产品，流式细胞仪为Coulter公司产品。

一、细胞毒性中和实验

收集培养的对数期细胞(HeLa细胞)，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl，铺板使待测细胞调密度至10⁴/孔(边缘孔用无菌PBS填充)，5％CO2，37℃孵育过夜。终浓度150uM的多肽(100ul)与5CD50的Stx2(2.5ng)混合，同时设置一个正常对照组PBS，设置一个只加Stx2的对照组，4℃过夜孵育。再加入96孔细胞培养板培养的细胞中，5％CO₂，37℃孵育72小时，倒置显微镜下观察。弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，每孔加入50μl MTT溶液(5mg/ml)继续培养4h，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡5min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD₅₇₀处测量各孔的吸光值，按以下公式计算抑制率：抑制率％＝[(多肽+Stx2)OD₅₇₀-Stx2OD₅₇₀]/[正常OD₅₇₀-Stx2OD₅₇₀]。如图5所示，相同浓度下，P1比P8对Stx2的细胞毒作用的抑制率高，针对大于细胞致死毒量的Stx2(5×CD50)，P1的IC50(半数抑制浓度)为180μM，P8的IC50为193μM，其中P1的浓度为300μM时，对Stx2细胞毒作用的抑制率达82％；P8的浓度为300μM时，对Stx2细胞毒作用的抑制率可以达到54％。

二、流式细胞分析多肽对Stx2B与细胞结合作用的影响

HeLa细胞为Gb3+细胞，Stx2B为毒素的受体结合区，Stx2B可通过Gb3受体与HeLa细胞特异结合，利用此细胞模型可检测多肽对Stx2B与HeLa细胞结合是否具有阻断作用。应用荧光素FITC标记毒素亚单位Stx2B制备FITC-Stx2B：将上述纯化的蛋白样品Stx2B透析至碳酸盐缓冲液(pH9.2)，按0.05mg FITC/mg蛋白的剂量加入DMSO溶解的FITC，室温避光搅拌2h，以磷酸盐缓冲液(pH7.2)透析，换液数次至不再有FITC析出，即制备的FITC-Stx2B。将标记蛋白FITC-Stx2B(5ug)和多肽(终浓度300μM)(100ul)孵育4℃过夜(注意避光)，然后加入细胞(细胞数量大约10⁶)37℃孵育2h，1000r/min离心5min，PBS洗涤和悬浮细胞，重复2次。细胞用40％多聚甲醛固定(4℃，10min)，离心，取细胞以PBS悬浮，进行流式细胞检测。剩余细胞以PBS悬浮，采用流式细胞术分析FITC-Stx2B与Hela细胞的结合情况。实验分为三组：阴性对照细胞组(PBS)；FITC-Stx2B组；FITC-Stx2B和多肽组。细胞检测结果显示(图略)：FITC-Stx2B处理的HeLa细胞有97.22％荧光结合，FITC-Stx2B与多肽TF1(又名P1)孵育后处理的HeLa细胞有52.77％荧光结合，可以计算出多肽TF1(又名P1)(300μmol/L)对FITC-Stx2B与HeLa细胞结合的阻断率为45.7％，相似的计算出多肽WA8(又名P8)(300μmol/L)对FITC-Stx2B与HeLa细胞结合的阻断率为24.8％。

实施例3、TF1、WA8合成肽对2型志贺毒素攻毒小鼠的保护效果

雄性Balb/C(17-19g)小鼠，由军事医学科学院动物中心提供。试验用多肽TF1(又名P1)和WA8(又名P8)纯度＞95％(g级)

一、TF1、WA8合成肽在毒素攻击小鼠致死模型上的保护作用

1、2型志贺毒素粗制品的制备

接种产2型志贺毒素O157大肠杆菌(购自ATCC)于LB培养基过夜培养，次日按1∶100比例接种至1L培养基，震荡培养72h，5000rpm离心10min。菌体沉淀悬于PBS缓冲液，超声波破碎细胞，10000rpm离心10min，上清滴加饱和硫酸铵溶液至50％浓度，收集盐析沉淀，以PBS溶解并透析完全，得到志贺毒素2型志贺毒素粗制产物。

2、TF1、WA8合成肽的体内志贺毒素毒性抑制效应

雄性17-19g Balb/C小鼠随机分六组，每组20只。多肽TF1(又名P1)或WA8(又名P8)腹腔给药，20min后用剂量为5LD50的2型志贺毒素粗制品(50ng)腹腔攻毒，同时设置安慰剂对照组(生理盐水)，攻毒组(Stx2)。连续观察10天，每天两次记录各组动物的存活情况。结果如附图6显示，Stx2(5LD50)腹腔攻毒，安慰剂组动物在4-5天时全部死亡，不同剂量多肽(P1或P8)给药组表现为不同程度的保护效应，当多肽的剂量达到11mg/kg，P1可以对小鼠提供完全保护(见图6A)，P8有80％保护率(图6B)；多肽P1或P8对小鼠的保护效力具有剂量依赖性。P1在小鼠大于致死剂量攻毒保护实验中表现出具有优于P8的体内抗毒活性。

Claims (9)

1.一种多肽，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2.权利要求1所述的多肽的修饰体，其特征在于：所述修饰体是在权利要求1所述多肽的N端和/或C端进行化学修饰得到的。

3.如权利要求2所述的修饰体，其特征在于：所述化学修饰为乙酰化修饰或氨酰化修饰。

4.如权利要求2所述的修饰体，其特征在于：所述修饰体为单肽。

5.权利要求1所述多肽的编码基因。

6.含有权利要求5所述基因的重组载体、重组菌或转基因细胞系。

7.权利要求1所述多肽或者权利要求2-4中任一所述的修饰体在制备预防和/或治疗由2型志贺毒素或产2型志贺毒素的病原菌所引起疾病的药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述病原菌为产2型志贺毒素的大肠杆菌、志贺氏痢疾菌或霍乱弧菌。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述产2型志贺毒素大肠杆菌为肠出血性大肠杆菌O157。 

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