CN102286106B - 夹心外膜蛋白展示载体及应用其制备的大肠埃希菌疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种夹心外膜蛋白展示载体及应用其制备的大肠埃希菌疫苗。本发明提供了两种融合蛋白,为融合蛋白甲或融合蛋白乙;所述融合蛋白甲自N端至C端依次包括如下片段:序列表的序列2自N末端第1至136位氨基酸残基组成的片段甲、序列表的序列2自N末端第512位至634位氨基酸残基组成的片段乙和序列表的序列2第635至726位氨基酸残基组成的片段丙;所述融合蛋白乙为在所述融合蛋白甲的所述片段甲和所述片段乙之间插入外源蛋白得到的融合蛋白。将本发明的融合蛋白的编码基因导入细菌,可以得到重组菌。该重组菌的菌蜕可以作为细菌疫苗,该细菌疫苗不含有细菌的基因组,但含有所述融合蛋白,安全且效果良好。
Description
技术领域
本发明涉及一种夹心外膜蛋白展示载体及应用其制备的大肠埃希菌疫苗。
背景技术
肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)是一种重要的病原菌,主要包括O157:H7、O26:H11和O111等数种血清型。其中,E.coli O157:H7导致的感染占EHEC感染的50%~80%。E.coli O157:H7感染能引起人的出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis,HC)、阑尾炎、食管狭窄和结肠穿孔等严重的胃肠道并发症。10% E.coli O157:H7感染病例,特别是儿童和老年人,还可引起致死性的溶血性尿毒综合征(Haemolytic uraemic syndrome,HUS)等全身性并发症。近年来,E.coli O157:H7的暴发流行在世界各地时有发生,尤其在日本、美国、英国等地。我国江苏、安徽等地1999、2001年也相继发生了E.coli O157:H7感染的暴发流行,患者超过两万人。统计显示,90%的E.coli O157:H7感染病例是散发,实际上反映了未被识别的暴发流行,或在众多隐性感染者中存在低强度流行。近期发生的欧洲肠道传染病疫情危害凸显,2011年5月1日德国出现第一例病例,一个多月来,一场罕见的、带有强毒性的O104:H4型肠出血性大肠杆菌(EHEC)疫情席卷了欧洲很多国家。世界卫生组织(WHO)15日发布的疫情通报称,感染人数达3343人,感染者中有823人出现了溶血性尿毒综合征(HUS)症状,37人死亡。EHEC感染是一种新发的危害严重的食物源性肠道传染病和人畜共患病。目前普遍认为受污染家畜及食物是该病的主要传染源,并且普遍存在毒素与活菌的共同感染。抗生素的使用会导致更多毒素的分泌而不被推荐临床治疗采用。因此,控制该病暴发流行的最好措施是疫苗免疫,目的是预防人的原发感染和在已感染患者中防止严重并发症的出现。
O157:H7与新发现的O104:H4型等EHEC病原菌的一个重要的特征性毒力因子是志贺毒素(Shiga toxins,Stxs)。Stxs是导致EHEC感染病人出现HC、HUS的主要原因。临床与试验研究认为,针对E.coli O157:H7感染,常规的抗生素治疗会导致菌体裂解、Stxs瀑流释放,增加发生HUS的风险13.4倍。Stxs包括Stx1和Stx2两个亚型,具有不同的抗原表位,但具有相同的分子结构及受体,毒性机理也相似。完整毒素均呈现1A:5B结构。A亚单位具有细胞内毒性,能发挥RNA糖苷酶的活性,特异裂解28S rRNA,从而抑制细胞蛋白质合成,导致细胞死亡。B亚单位能特异结合球丙糖酰基鞘氨醇(Gb3)或者球丁糖酰基鞘氨醇(Gb4)受体,从而引导A亚单位发挥作用。有研究认为,Stx2毒性要强于Stx1,更相关于HUS。鉴于Stxs在诱发感染性系统并发症中的关键作用,Stxs也是预防感染性HUS的核心靶点之一。
目前临床对于EHEC感染仍缺乏有效的防治办法,只能给予对症治疗和适当的抗菌治疗。因此,设计一种新型疫苗,能够将重要毒力相关的非膜保护性抗原进行展示或递送,使多组分抗原共提呈给宿主,就有望提供更为有效和全面的免疫保护。
细菌菌蜕(bacterial ghost,BG)是一种最新发展起来的生物传递系统。细菌菌蜕是革兰阴性细菌被噬菌体phiX174的裂解基因E裂解后形成的完整细菌空壳。其形成是通过对裂解基因E的严格表达调控实现的。BG的形成主要依赖于裂解蛋白E在细胞膜上的跨膜孔道作用,胞内的细胞质和核酸成分在渗透压的作用下经跨膜孔道被排出,形成一个只含有细胞膜结构的空细菌体。BG兼顾了组合抗原免疫原性、佐剂效应、靶向性载体的作用,既能携带外源抗原,又能同时递送核酸和其他药物,特别适合于粘膜免疫及口服免疫及滴鼻免疫,并适宜大规模生产。同时,由于菌蜕缺乏遗传物质,消除了耐药基因或毒力岛基因的水平转移等引起的潜在危害。
发明内容
本发明的目的是提供一种夹心外膜蛋白展示载体及应用其制备的大肠埃希菌疫苗。
本发明提供的融合蛋白,为融合蛋白甲或融合蛋白乙;
所述融合蛋白甲自N端至C端依次包括如下片段:序列表的序列2自N末端第1至136位氨基酸残基组成的片段甲、序列表的序列2自N末端第512位至634位氨基酸残基组成的片段乙和序列表的序列2第635至726位氨基酸残基组成的片段丙;
所述融合蛋白乙为在所述融合蛋白甲的所述片段甲和所述片段乙之间插入外源蛋白得到的融合蛋白。
所述片段甲和所述片段乙组成OmpA N端片段。所述片段丙即为OmpA C端片段。
所述外源蛋白的氨基酸序列可如序列表的序列4(即序列表的序列2自N末端第139至509位氨基酸残基)所示(SAmB蛋白)。
所述融合蛋白乙优选为序列表的序列2所示的蛋白。
所述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述片段甲的编码基因具体可如序列表的序列1自5’末端第1至408位核苷酸所示(即序列表的序列3中自5’末端第1至408位核苷酸)。所述片段乙的编码序列具体可如序列表的序列1自5’末端第457至825位核苷酸所示(即序列表的序列3中自5’末端第1534至1902位核苷酸)。所述片段丙的编码序列具体可如序列表的序列1自5’末端第826至1104位核苷酸所示(即序列表的序列3中自5’末端第1903-2181位核苷酸)。
所述外源蛋白的编码基因优选为序列表的序列5所示的DNA分子(即序列表的序列3中自5’末端第415至1527位核苷酸)(SAmB基因)。
所述融合蛋白乙的编码基因优选为序列表的序列3所示的DNA分子。
含有所述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体具体可为在pGEX载体(如pGEX-KG载体)的多克隆位点插入以上任一所述基因得到的重组质粒。所述重组表达载体优选为将序列表的序列1所示DNA或序列表的序列3所示DNA插入pGEX-KG载体的多克隆位点得到的重组质粒。
所述重组菌具体可为如下(a)或(b):
(a)含有以上任一所述重组表达载体的细菌;
(b)含有以上任一所述重组表达载体并表达裂解酶的细菌;所述裂解酶的氨基酸序列如序列表的序列6所示。
所述(a)中,所述细菌优选为大肠杆菌,最优选为肠出血性大肠杆菌O157:H7(如EDL933菌株)。
所述(b)中,所述表达裂解酶的细菌优选为含有温控裂解质粒P-LysisE的大肠杆菌,所述大肠杆菌优选为肠出血性大肠杆菌O157:H7(如EDL933菌株)。
以上任一所述的重组菌的菌蜕也属于本发明的保护范围。
所述菌蜕菌体具体可通过如下方法制备得到:将所述重组菌28℃培养至OD600为0.3,然后加入IPTG(在菌液中的初始浓度为1mM)200rpm培养至OD600约为0.6;升温至42℃,收集42℃培养1小时的菌液,5000×g离心15min收集沉淀,即为菌蜕。
所述融合蛋白、所述基因、所述重组表达载体或所述重组菌可用于制备细菌菌蜕。所述细菌了可为大肠杆菌(E.coli)。所述大肠杆菌可为肠出血性大肠杆菌O157:H7,所述大肠杆菌具体可为肠出血性大肠杆菌O157:H7 EDL933或肠出血性大肠杆菌88321。
本发明还保护一种细菌疫苗,它的活性成分为以上任一所述菌蜕。所述细菌了可为大肠杆菌(E.coli)。所述大肠杆菌可为肠出血性大肠杆菌O157:H7,所述大肠杆菌具体可为肠出血性大肠杆菌O157:H7 EDL933或肠出血性大肠杆菌88321。
本发明还保护以上任一所述菌蜕在制备细菌疫苗中的应用。所述细菌了可为大肠杆菌(E.coli)。所述大肠杆菌可为肠出血性大肠杆菌O157:H7,所述大肠杆菌具体可为肠出血性大肠杆菌O157:H7 EDL933或肠出血性大肠杆菌88321。
相比O157:H7菌蜕,O157:H7嵌合菌蜕由于展示了Stx毒素抗原,其免疫血清能产生特异的抗Stx2A和Stx1B抗体。O157:H7嵌合菌蜕诱导的血清抗体具有中和Stx毒素的功能,因此,其免疫血清能有效抵抗致死剂量的裂解菌攻击(2 LD50,保护率73.3%)。O157:H7嵌合菌蜕免疫小鼠的肠灌洗液抗intimin特异抗体效价显著高于O157:H7菌蜕,说明OSAmB菌蜕表面intimin的免疫原性有所增强。
O157:H7嵌合菌蜕免疫小鼠比O157:H7菌蜕(12%)更好的保护小鼠(52%)抵抗高致死剂量大肠杆菌O157:H7活菌的灌胃攻击。一方面可能是更高效价的intimin抗体更好的阻断了大肠杆菌O157:H7病原菌对肠道的黏附,另一方面可能是抗Stxs特异抗体能中和灌胃菌裂解产生的Stxs毒素,有效的减少了毒素对机体产生的损伤。进一步的病理结果揭示了腹腔裂解菌攻毒的主要致死作用在于毒素效应(肾损伤),而更接近于正常感染途径的灌胃攻毒除了肾组织外,还产生了严重的黏附擦拭损伤(肠道损伤)。因此,只有采用既能抗病原菌黏附,又能抗毒素攻击的O157:H7嵌合菌蜕免疫小鼠才能更全面、更有效保护小鼠抵抗大肠杆菌O157:H7病原菌的感染。
本发明以夹心外膜蛋白A(融合蛋白甲)作为展示载体,将重要的E.coli O157:H7非膜毒素保护性抗原(SAmB蛋白)在E.coli O157:H7细菌外膜上锚定表达。以细菌菌蜕为传递系统,E.coli O157:H7原有膜表面抗原与新的展示抗原就可以一起提呈给免疫细胞,在预防细菌肠道定植以及抗毒素方面共同发挥作用,以诱导更全面的免疫保护。
附图说明
图1为夹心OmpA载体特异DNA片段的电泳图;1:PCR产物;M:DNA标志物。
图2为插入SAmB基因后的夹心OmpA载体特异DNA片段的电泳图;M:DNA标志物;1:连接产物。
图3为重组菌的PCR鉴定电泳图;M.DNA标志物;1:温控裂解质粒特异引物对鉴定;2:重组质粒pOSAmB特异引物对鉴定。
图4为O157:H7嵌合菌蜕的免疫反应性;A:O157:H7嵌合菌蜕与抗Stx2A兔血清的免疫反应性;B:O157:H7嵌合菌蜕与抗Stx1B鸡IgY的免疫反应性;1:OSAmB嵌合菌蜕;2:O157:H7菌蜕;3:OmpA载体缺失对照菌蜕;4:Stx2A(A)或Stx1B(B);M:低分子量蛋白标准物。
图5为O157:H7嵌合菌蜕外膜展示蛋白的鉴定;A:O157:H7嵌合菌蜕外膜展示蛋白的抗Stx2A兔血清鉴定;B:O157:H7嵌合菌蜕外膜展示蛋白的抗Stx1B鸡IgY鉴定;C:O157:H7嵌合菌蜕外膜展示蛋白的抗intimin兔血清鉴定;OSAmB代表O157:H7嵌合菌蜕;non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕;BGs代表O157:H7菌蜕。
图6为O157:H7嵌合菌蜕的细胞毒效应(*:P>0.05 vs non-OmpA);RBGs代表O157:H7嵌合菌蜕;non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕;O157:H7代表病原菌。
图7为O157:H7嵌合菌蜕免疫小鼠诱导抗菌蜕特异抗体水平监测(*:P<0.01 vsPBS;#:P<0.01 vs PBS;**:P<0.01;##:P<0.05);A:血清中IgA特异抗体效价;B:肠灌洗液中IgA特异抗体效价;C:血清中IgG特异抗体效价;D:肠灌洗液中IgG特异抗体效价;RBGs代表O157:H7嵌合菌蜕;non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕;PBS代表磷酸盐缓冲液。
图8为O157:H7嵌合菌蜕免疫小鼠诱导抗Stx1特异抗体水平监测(*:P<0.01 vsPBS;#:P>0.05 vs PBS;##:P>0.05 vs PBS);A:血清中IgA特异抗体效价;B:肠灌洗液中IgA特异抗体效价;C:血清中IgG特异抗体效价;D:肠灌洗液中IgG特异抗体效价;RBGs代表O157:H7嵌合菌蜕;non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕;PBS代表磷酸盐缓冲液。
图9为O157:H7嵌合菌蜕OSAmB免疫小鼠诱导抗Stx2特异抗体水平监测(*:P<0.01vs PBS;#:P>0.05vs PBS;##:P>0.05 vs PBS);A:血清中IgA特异抗体效价;B:肠灌洗液中IgA特异抗体效价;C:血清中IgG特异抗体效价;D:肠灌洗液中IgG特异抗体效价;RBGs代表O157:H7嵌合菌蜕;non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕;PBS代表磷酸盐缓冲液。
图10为O157:H7嵌合菌蜕免疫小鼠抵抗病原菌(大肠杆菌O157:H7 EDL933)灌胃途径攻击的生存率;A:109CFU大肠杆菌O157:H7 EDL933(相当于100 LD50);B:5×109CFU大肠杆菌O157:H7 EDL933(相当于500 LD50);*:P<0.01 vs PBS;**:P<0.01vs non-OmpA;#:P<0.01 vs PBS;##:P>0.05 vs non-OmpA;RBGs代表O157:H7嵌合菌蜕;non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕;PBS代表磷酸盐缓冲液。
图11为O157:H7嵌合菌蜕免疫小鼠抵抗裂解病原菌(大肠杆菌O157:H7 88321)腹腔途径攻击的生存率;A:2 LD50大肠杆菌O157:H7 88321;B:5 LD50大肠杆菌O157:H788321;*:P<0.01 vs PBS;**:P<0.01 vs non-OmpA.RBGs代表O157:H7嵌合菌蜕;non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕;PBS代表磷酸盐缓冲液。
图12为O157:H7嵌合菌蜕免疫血清体外中和裂解病原菌(大肠杆菌O157:H7 88321)效应;A:2 LD50大肠杆菌O157:H7 88321;B:5 LD50大肠杆菌O157:H7 88321;*:P<0.01 vs PBS;**:P<0.01 vs non-OmpA.RBGs代表O157:H7嵌合菌蜕;non-OmpA代表OmpA载体缺失菌蜕;BGs代表O157:H7菌蜕;PBS代表磷酸盐缓冲液。
图13为小鼠病理组织H&E染色;A:正常小鼠;B:大肠杆菌O157:H7 EDL933活菌灌胃攻击保护小鼠;C:大肠杆菌O157:H7 88321腹腔攻击保护小鼠;D:大肠杆菌O157:H7 EDL933活菌灌胃攻击死亡小鼠;E:大肠杆菌O157:H7 88321腹腔攻击死亡小鼠。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
表1嵌合菌蜕构建所用引物(下划线序列为限制性酶切位点)
引物 | 5’→3’ |
Stxup | GAATTCCGGGAGTTTACGATAGACTTTTCGACCCAA |
Stxdown | GAGCTCACGAAAAATAACTTCGCTGAATCCCCC |
SOup | CCCGGGATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTACA |
SOdown | ACCCAGAACAACTACGGAACCGTCTTTCGG |
EOup | CCGAAAGACGGTTCCGTAGTTGTTCTGGGT |
EOdown | CCATGGTTAAGCTTGCGGCTGAGTTACAAC |
Enzup | CACAACAATGTGACAGGTGAAGAATTCATCGATACTTGATCTAAGATATCATCATTA |
Enzdown | TCGTGGTTTTTCTCAGAGAGCTCACTAGTTAATGATGATATCTTAGATCAAGT |
Stx1和Stx2作为2种毒素蛋白,在本发明中做为抗原用于SAmB免疫原性检测,2种蛋白制备方法相似,相应实验细节已公开发表(Tu W,Cai K,Gao X,Xiao L,ChenRC,Shi J,Liu H,Hou XJ,Wang Q,Wang H,Improved production of holotoxin Stx2with biological activities by using a single-promoter vector and anauto-induction expression system.Protein Expr.Purif.2009,67(2):169-174)。其中Stx2的制备具体如下:以大肠杆菌O157:H7 EDL933菌株为模板,用引物p5:5’-GGGGGGAATTCATGAAGTGTATATTATTTAAATGGG-3’和p6:5’-TTTTTTGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTCATTATTAAACTGCACTTCAG-3’扩增全志贺毒素基因stx2。利用pEASY-T1克隆载体测序鉴定,测序结果表明,扩增产物的核苷酸序列如Genbank NC_002655的第1352290位至第1353527位。采用单启动子双读码框的策略构建工程菌pET32a-stx2/plysS,具体是将扩增产物插入pET32a的EcoRI和Sal I酶切位点构成重组质粒pET32a-stx2,然后将pET32a-stx2导入E.coli.BL21(DE3)plysS菌株(购自Transgen公司)构建重组工程菌pET32a-stx2/plysS。其中,重组质粒pET32a-stx2含有一个T7启动子,全志贺毒素基因stx2克隆含有两个开放阅读框(stx2a和stx2b)。添加IPTG至终浓度为1mmol/L进行诱导,30℃水浴振荡培养5h,可以实现Stx2的高效可溶表达,Stx2经镍柱HisTrap纯化后纯度达90%以上,具有生物学功能活性。
Stx1的制备与上述Stx2的制备的区别在于:所用引物为p7:5-ggggggggaattcatgaaaataattatttttagagtgctaacttttttc-3和p8:5-gtcgactcagtggtggtggtggtggtgacgaaaaataacttcgctgaat-3,扩增产物的核苷酸序列如Genbank NC_002655的第2995757位至第2996977位,宿主菌选用E.coliTransB(DE3),即为构建工程菌pET32a-stx1/E.coli TransB(DE3);其余步骤完全相同。Stx1经镍柱HisTrap纯化后纯度达90%以上,具有生物学功能活性。
肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 EDL933(简称大肠杆菌O157:H7 EDL933)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)88321(国际标准株,Stx1和Stx2双产毒型;简称大肠杆菌O157:H7 88321,均购自ATCC。pEASYE2载体(拓扑异构型载体,无需限制性酶切位点),购自Transgen。痢疾志贺菌51054:中国药品生物制品检定所。BALB/c小鼠:购自军事医学科学院实验动物中心。大肠杆菌(E.coli)DH5α购自全式金公司。非洲绿猴肾细胞株(Vero细胞):购自Hyclone公司。
温控裂解质粒P-LysisE:公众可以从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得;该专利为现有质粒,提及该质粒的文献如下:Cai K,Gao X,Li T,etal.Intragastric immunization of mice with enterohemorrhagic Escherichia coliO157:H7 bacterial ghosts reduces mortality and shedding and induces a Th2-typedominated mixed immune response.Can J Microbiol.2010,56(5):389-98.。
pGEX-KG载体:公众可以从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得;该专利为现有质粒,提及该质粒的文献如下:Li Jun,Dou Lin andDou Zhong-ying,Construction of Prokaryotic Expression Vector of Mouse NanogGene and Its Expression,Agricultural Sciences in China.2007,6(4):487-492)。
实施例1、重组质粒及重组菌的构建
一、夹心OmpA载体特异DNA片段的制备
1、以痢疾志贺菌51054为模板,用SOup和SOdown组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物(约740bp)。
2、以大肠杆菌O157:H7 EDL933为模板,用EOup和EOdown组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物(约290bp)。
3、同时以步骤1和步骤2的PCR扩增产物作为模板,用SOdown、EOup、SOup和EOdown组成的引物组合进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
4、以步骤3的PCR扩增产物为模板,用Enzup、Enzdown、SOup和EOdown组成的引物组合进行PCR扩增,得到的PCR扩增产物(约1100bp)即为夹心OmpA载体特异DNA片段。
5、将夹心OmpA载体特异DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳(见图1)并回收,与pMD18-T载体(Takara公司)连接后转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,挑取菌落并依次进行PCR鉴定和测序鉴定。
测序结果表明,夹心OmpA载体特异DNA片段如序列表的序列1所示。序列表的序列1所示的特异DNA片段中,自5’末端第1至408位、第457至825位核苷酸为痢疾志贺菌OmpAN端的编码基因、第409至456位核苷酸为限制性酶切位点区域(含EcoRI、ClaI、…SacI等酶切识别序列和终止子)、第826至1104位核苷酸为大肠杆菌OmpA C端的编码基因(含终止子)。
二、重组质粒pSAmB的构建
1、融合蛋白的编码基因获得
以大肠杆菌O157:H7 EDL933的基因组DNA为模板,使用引物1和引物2 PCR扩增II型志贺毒素的A亚单位蛋白基因(Stx2A基因),使用引物3和引物4扩增I型志贺毒素的B亚单位蛋白基因(Stx1B基因)。
以引物1和引物6为引物对,引物2和引物5为引物对分别从Stx2A基因中扩增,得到两个片段,该两个片段混合为模板通过重叠PCR(采用引物1和引物2组成的引物对)得到单点氨基酸突变的Stx2A基因;再以引物1和引物8为引物对、引物2和引物7为引物对,分别对单点氨基酸突变的Stx2A基因进行扩增,得到两个片段,该两个片段混合为模板再次进行重叠PCR(采用引物1和引物2组成的引物对)得到3点氨基酸突变的Stx2A基因,命名为Stx2Am;最后将3点氨基酸突变的Stx2A基因(即Stx2Am)与Stx1B基因混合为模板,通过重叠PCR(采用引物1和引物4组成的引物对)得到融合蛋白编码基因,命名为SAmB基因。
引物1至引物8的核苷酸序列见表2。
表2引物1至引物8的核苷酸序列
2、重组质粒pSAmB的构建
将SAmB基因纯化后连入pEASYE2载体,具体操作参见Transgen的载体使用说明书,得到重组质粒pSAmB。测序结果表明:重组质粒pSAmB是在pEASYE2载体的拓扑异构位点间插入了序列表中序列5所示的SAmB基因片段(编码序列表的序列4所示的蛋白)得到的重组质粒。序列表的序列5自5’末端第1-891位核苷酸为3点突变的Stx2A基因(即Stx2Am),第907-1113核苷酸为Stx1B基因。
三、重组质粒pOSAmB的构建
1、以重组质粒pSAmB为模板,用Stxup和Stxdown组成的引物对进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物,用限制性内切酶EcoR I和Sac I双酶切后,回收酶切产物(约1150bp)。
2、用限制性内切酶EcoR I和Sac I双酶切步骤一得到的夹心OmpA载体特异DNA片段,回收酶切产物。
3、将步骤1回收的酶切产物和步骤2回收的酶切产物采用T4DNA连接酶进行连接,得到连接产物(约2300bp)(琼脂糖凝胶电泳图见图2)。
所述连接产物的核苷酸序列如序列表的序列3所示。序列表的序列3中,自5’末端第1至408位核苷酸、第1534至1902位核苷酸为痢疾志贺菌OmpA N端的编码基因,第415至1527位核苷酸为SAmB基因,第1903-2181位核苷酸为大肠杆菌OmpA C端的编码基因(含终止子),第409至414位核苷酸为EcoR I酶切识别序列,第1528至1533位核苷酸为Sac I酶切识别序列。
序列表的序列3所示DNA编码序列表的序列2所示的融合蛋白。序列表的序列2中,自N末端第1至136位氨基酸残基和第512至634位氨基酸残基为痢疾志贺菌OmpA N端,第139至509位氨基酸残基为SAmB蛋白(由371个氨基酸残基组成),第635至726位氨基酸残基为大肠杆菌OmpA C端,第137至138位氨基酸残基和第510至511位氨基酸残基为引入的酶切识别序列编码的氨基酸残基。
4、用限制性内切酶Xma I和Nco I双酶切步骤3的连接产物,回收酶切产物(琼脂糖凝胶电泳图见图3)。
5、用限制性内切酶Xma I和Nco I双酶切pGEX-KG载体,回收载体骨架(约5000bp)。
6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接,得到重组质粒pOSAmB。
四、重组菌的构建
将重组质粒pOSAmB和温控裂解质粒P-LysisE共转化大肠杆菌O157:H7 EDL933感受态细胞,得到工程菌。
分别用温控裂解质粒特异引物对(phiXE-F和phiXE-R,靶序列约294bp)和重组质粒pOSAmB特异引物对(SOup和EOdown,靶序列约2300bp)对工程菌进行PCR鉴定。
phiXE-F:5’-CCGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGGGAT-3’;
phiXE-R:5’-TGCGACGTCTCACTCCTTCCGCACGTA-3’。
鉴定结果见图3。结果表明,重组质粒pOSAmB和温控裂解质粒P-LysisE能较长时间共存于大肠杆菌O157:H7 EDL933。
五、对照菌的构建
1、对照菌甲的构建
将温控裂解质粒P-LysisE转化于大肠杆菌O157:H7 EDL933的感受态细胞,得到对照菌甲。
2、对照菌乙的构建
(1)将序列表中序列序列4所示的SAmB基因片段插入pGEX-KG载体的Xma I和Nco I酶切位点之间,得到重组质粒。
(2)将步骤(1)得到的重组质粒和温控裂解质粒P-LysisE共转化于大肠杆菌O157:H7 EDL933感受态细胞,得到对照菌乙。
实施例2、O157:H7嵌合菌蜕的制备
一、O157:H7嵌合菌蜕的制备
将实施例1制备的工程菌接种至新鲜LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中,28℃培养至OD600约为0.3,然后加入IPTG(在菌液中的初始浓度为1mM),200rpm培养至OD600约为0.6;迅速升温至42℃,收集42℃培养1小时的菌液。升温前的菌液样本作为诱导前样本,42℃培养1小时的菌液样品作为诱导后样本。
将等体积的诱导前样本和诱导后样本分别5000×g离心15min收集沉淀。
用PBS缓冲液洗涤沉淀,然后进行梯度稀释后分别涂布于LB固体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)上,28℃培养24h。记数固体培养基上的菌落数(CFU),根据公式[1-诱导后样本的CFU/诱导前样本的CFU]计算裂解效率。
菌落LB平板计数结果显示,工程菌的诱导后样本收集的沉淀的裂解效率>99.99%,即收集的沉淀中基本不含有菌体,均为菌蜕,将该沉淀命名为O157:H7嵌合菌蜕。
将实施例1制备的对照菌甲代替工程菌进行上述操作,得到对照菌蜕甲(O157:H7菌蜕)。
将实施例1制备的对照菌乙代替工程菌进行上述操作,得到对照菌蜕乙(non-OmpA菌蜕),即OmpA载体缺失菌蜕。
二、O157:H7嵌合菌蜕的免疫反应性
1、将O157:H7嵌合菌蜕(或O157:H7菌蜕或OmpA载体缺失菌蜕)用PBS缓冲液重悬,然后进行15%SDS-PAGE。
2、将电泳胶转至硝酸纤维素膜上,3% BSA 4℃封闭过夜。
3、PBST缓冲液洗涤后,分别加入抗Stx1B鸡IgY或抗Stx2A兔血清,4℃孵育4h。
4、PBST缓冲液洗涤后,分别加入HRP标记兔抗鸡IgG或羊抗兔IgG检测抗体,4℃孵育2h。
5、PBST缓冲液洗涤去除未结合抗体,DAB显色并观察结果。
结果见图4。Western blot结果显示,无论对于抗Stx1B鸡IgY还是抗Stx2A兔血清,O157:H7嵌合菌蜕在目的条带处(70 kDa)都有良好的免疫反应性,而O157:H7菌蜕和OmpA载体缺失菌蜕均没有反应。
三、O157:H7嵌合菌蜕的抗原分析
1、O157:H7嵌合菌蜕(或O157:H7菌蜕或OmpA载体缺失菌蜕)分别与抗Stx1B鸡IgY或抗Stx2A兔血清4℃孵育4h。
2、PBST缓冲液洗涤后,分别加入HRP标记兔抗鸡IgG或羊抗兔IgG检测抗体,4℃孵育2h。
3、PBST缓冲液洗涤彻底除去未结合抗体,嵌合菌蜕与Hep-2细胞一起在CO2培养箱37℃孵育4h,流式细胞术检测(3×104细胞)。
结果见图5。O157:H7嵌合菌蜕能被Stx1B鸡IgY和抗Stx2A兔血清结合,同时也不影响其intimin的表达,从而能黏附于Hep-2细胞。O157:H7菌蜕和OmpA载体缺失菌蜕不能被特异的抗Stx抗体识别。
四、O157:H7嵌合菌蜕的毒性分析
(一)细胞毒性分析
1、将Vero细胞接种于96孔细胞培养板,培养至单层细胞(106/well)。梯度稀释O157:H7嵌合菌蜕(或O157:H7菌蜕或OmpA载体缺失菌蜕),并分别与细胞37℃孵育3d。
2、PBS缓冲液洗涤后,加入新鲜DMEM培养基(含0.5mg/ml MTT)孵育4h。
3、PBS缓冲液洗涤去除杂质,每孔加入150μl DMSO孵育10min,混匀后酶联仪570nm读数。
以大肠杆菌O157:H7 EDL933(病原菌)作为阳性对照。
结果见图6。10mg O157:H7嵌合菌蜕(相当于1010菌蜕)、O157:H7菌蜕和OmpA载体缺失菌蜕一样未见明显的Vero细胞毒性(P>0.05)。而107大肠杆菌O157:H7 EDL933就能杀死100%细胞。
(二)动物致死效应
用100mg O157:H7嵌合菌蜕(相当于1011菌蜕)灌胃免疫雄性BALB/c小鼠,未观察到动物死亡。
实施例3、O157:H7嵌合菌蜕的免疫效果
一、分组给药
3周龄雄性BALB/c小鼠随机分为4组,每组50只,分别进行如下操作(实验首日为第0天,以后依次为第1天、第2天,……):
第一组(RBGs):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫剂量0.1mg实施例2的步骤一制备的O157:H7嵌合菌蜕(1mg相当于109菌蜕);用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫;
第二组(BGs):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;,每只小鼠每次的免疫剂量0.1mg实施例2的步骤一制备的O157:H7菌蜕(1mg相当于109菌蜕);用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫;
第三组(non-OmpA):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫剂量0.1mg实施例2的步骤一制备的OmpA载体缺失菌蜕(1mg相当于109菌蜕);用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫;
第四组(PBS免疫组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫0.1毫升PBS缓冲液。
二、诱导产生抗菌蜕特异抗体
分别于第0、7、14、21和28天,每个组取3只小鼠;眼眶摘离采血,离心分离获得血清;以PBS缓冲液冲洗肠道,离心分离肠灌洗液上清。
分别采用ELISA方法检测血清和肠灌洗液上清的抗体效价。用5μg O157:H7菌蜕包被96孔板,100μl HRP标记羊抗小鼠IgA或IgG抗体(1∶5000)作为检测抗体,OD450读数。
结果见图7。PBS免疫组各样品中均没有检测到特异抗体产生。O157:H7嵌合菌蜕能有效诱导抗菌蜕的IgA和IgG特异抗体(P<0.01),并且O157:H7嵌合菌蜕相比OmpA载体缺失菌蜕或O157:H7菌蜕能诱导更高水平的肠灌洗液IgA特异抗体(P<0.01或P<0.05)。O157:H7菌蜕和OmpA载体缺失菌蜕的实验结果没有明显差异。
三、诱导产生更强抗黏附因子intimin特异抗体
将包被抗原替换为重组蛋白Int281,其它同步骤二。
与PBS免疫组相反,O157:H7嵌合菌蜕和对照菌蜕(OmpA载体缺失菌蜕或O157:H7菌蜕)均能诱导小鼠产生抗intimin的IgA和IgG特异抗体(P<0.01)。对于肠灌洗液样品,O157:H7嵌合菌蜕OSAmB诱导的特异抗体效价明显高于OmpA载体缺失菌蜕或O157:H7菌蜕(P<0.01)。同时,血清中IgG特异抗体也有相同特性(P<0.05)。O157:H7菌蜕和OmpA载体缺失菌蜕的实验结果没有明显差异。
四、诱导产生抗Stx毒素亚单位特异抗体
将包被抗原分别替换为Stx1蛋白和Stx2蛋白,其它同步骤二。
结果见图8和图9。O157:H7嵌合菌蜕能诱导机体产生抗Stx1的IgA特异抗体(P<0.01)。血清中能检测到抗Stx1的IgG特异抗体(P<0.01),但在肠灌洗液中呈阴性结果(P>0.05)。OmpA载体缺失菌蜕或O157:H7菌蜕与PBS免疫组一样,均不能诱导机体产生抗Stx1的特异抗体(P>0.05)。O157:H7嵌合菌蜕能诱导机体产生抗Stx2的IgA特异抗体(P<0.01),血清中能检测到抗Stx2的IgG特异抗体(P<0.01),但在肠灌洗液中呈阴性结果(P>0.05)。OmpA载体缺失菌蜕或O157:H7菌蜕与PBS免疫组一样,均不能诱导机体产生抗Stx2的特异抗体(P>0.05)。O157:H7菌蜕和OmpA载体缺失菌蜕的实验结果没有明显差异。
实施例4、O157:H7嵌合菌蜕作为疫苗的免疫效果
一、分组给药
3周龄雄性BALB/c小鼠随机分为4组,每组50只,分别进行如下操作(实验首日为第0天,以后依次为第1天、第2天,……):
第一组(RBGs组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫剂量0.1mg实施例2的步骤一制备的O157:H7嵌合菌蜕(1mg相当于109菌蜕);用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫;
第二组(BGs组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;,每只小鼠每次的免疫剂量0.1mg实施例2的步骤一制备的O157:H7菌蜕(1mg相当于109菌蜕);用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫;
第三组(non-OmpA组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫剂量0.1mg实施例2的步骤一制备的OmpA载体缺失菌蜕(1mg相当于109菌蜕);用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫;
第四组(PBS组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫0.1毫升PBS缓冲液。
第28天,每组小鼠等分为两个亚组,每组25只,分别用109CFU大肠杆菌O157:H7EDL933(相当于100 LD50)或5×109CFU大肠杆菌O157:H7 EDL933(相当于500 LD50)灌胃途径攻毒一次,同时腹腔注射丝裂霉素C(2.5mg/kg);小鼠攻毒前3d喂食含5g/L硫酸链霉素的水,攻毒前24h停食。
二、生存率统计
自攻毒开始计天数,各组小鼠的生存率见图10和表3。
表3各亚组自攻毒开始计天数每天的存活小鼠只数
109CFU大肠杆菌O157:H7 EDL933活菌灌胃途径攻毒,PBS组小鼠全部死亡,OmpA载体缺失菌蜕组(non-OmpA)小鼠存活20只,O157:H7菌蜕组(BGs)小鼠存活20只,而O157:H7嵌合菌蜕组(RBGs)共22只小鼠存活。5×109CFU大肠杆菌O157:H7 EDL933活菌灌胃途径攻毒,PBS组无小鼠存活,对照的OmpA载体缺失菌蜕组(non-OmpA)小鼠存活3只,O157:H7菌蜕组(BGs)3只小鼠存活,而O157:H7嵌合菌蜕组RBGs仍存活13只。
各实验组死亡及存活小鼠分别取肝(Liver)、肾(Kidney)、肠(Intestinum)进行H&E染色,用于病理损伤观察。正常BALB/c小鼠的组织染色图片见图13A。O157:H7嵌合菌蜕组(RBGs)存活小鼠的组织染色图片见图13B。O157:H7嵌合菌蜕组(RBGs)死亡小鼠的组织染色图片见图13D。大肠杆菌O157:H7 EDL933活菌灌胃攻毒没有肝组织损伤,但除了肾组织损伤外,还有严重的肠道损伤(上皮细胞坏死、脱落);O157:H7嵌合菌蜕组存活小鼠各器官病理损伤减轻或者消失。
实施例5、O157:H7嵌合菌蜕作为疫苗的免疫效果
一、分组给药
3周龄雄性BALB/c小鼠随机分为4组,每组30只,分别进行如下操作(实验首日为第0天,以后依次为第1天、第2天,……):
第一组(RBGs组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫剂量0.1mg实施例2的步骤一制备的O157:H7嵌合菌蜕(1mg相当于109菌蜕);用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫;
第二组(BGs组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;,每只小鼠每次的免疫剂量0.1mg实施例2的步骤一制备的O157:H7菌蜕(1mg相当于109菌蜕);用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫;
第三组(non-OmpA组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫剂量0.1mg实施例2的步骤一制备的OmpA载体缺失菌蜕(1mg相当于109菌蜕);用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫;
第四组(PBS组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫0.1毫升PBS缓冲液。
第28天,每组小鼠等分为两个亚组,每组15只,分别用3×108CFU大肠杆菌O157:H788321(相当于2倍LD50)或8×108CFU大肠杆菌O157:H788321(相当于5倍LD50)腹腔内注射途径攻毒一次。
二、生存率统计
自攻毒开始计天数,各组小鼠的生存率见图11和表4。
表4各亚组自攻毒开始计天数每天的存活小鼠只数
3×108CFU大肠杆菌O157:H7 88321腹腔攻毒,PBS组无小鼠存活,O157:H7菌蜕组(BGs)和OmpA载体缺失菌蜕组(non-OmpA)小鼠仅1只存活,O157:H7嵌合菌蜕组(RBGs)共11只小鼠存活。提高攻毒剂量至8×108CFU大肠杆菌O157:H7 88321,PBS组、OmpA载体缺失菌蜕组(non-OmpA)与O157:H7菌蜕组(BGs)小鼠全部死亡,而O157:H7嵌合菌蜕组(RBGs)仍存活3只小鼠。
各实验组死亡及存活小鼠分别取肝(Liver)、肾(Kidney)、肠(Intestinum)进行H&E染色,用于病理损伤观察。正常BALB/c小鼠的组织染色图片见图13A。O157:H7嵌合菌蜕组(RBGs)存活小鼠的组织染色图片见图13C。O157:H7嵌合菌蜕组(RBGs)死亡小鼠的组织染色图片见图13E。大肠杆菌O157:H7裂解菌腹腔攻毒主要造成肾组织损伤(肾小球充血、坏死),伴随有肝损伤(小灶性坏死、间质充血);O157:H7嵌合菌蜕组存活小鼠各器官病理损伤减轻或者消失。
实施例6、O157:H7嵌合菌蜕作为疫苗的免疫效果
一、分组给药
3周龄雄性BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只,分别进行如下操作(实验首日为第0天,以后依次为第1天、第2天,……):
第一组(RBGs组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫剂量0.1mg实施例2的步骤一制备的O157:H7嵌合菌蜕(1mg相当于109菌蜕),用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫;第28天,每只小鼠取血清100μl,与3×108CFU大肠杆菌O157:H7 88321(相当于2倍LD50)或8×108CFU大肠杆菌O157:H7 88321(相当于5倍LD50)体外混合(总体积200μl),37℃孵育1h;每份混合物腹腔内注射一只7周龄雄性BALB/c小鼠进行攻毒(设置10只小鼠的重复处理);
第二组(BGs组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫剂量0.1mg实施例2的步骤一制备的O157:H7菌蜕(1mg相当于109菌蜕),用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫;第28天,每只小鼠取血清100μl,与3×108CFU大肠杆菌O157:H7 88321(相当于2倍LD50)或8×108CFU大肠杆菌O157:H788321(相当于5倍LD50)体外混合(总体积200μl),37℃孵育1h;每份混合物腹腔内注射一只7周龄雄性BALB/c小鼠进行攻毒(设置10只小鼠的重复处理);
第三组(non-OmpA组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫剂量0.1mg实施例2的步骤一制备的OmpA载体缺失菌蜕(1mg相当于109菌蜕),用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫;第28天,每只小鼠取血清100μl,与3×108CFU大肠杆菌O157:H7 88321(相当于2倍LD50)或8×108CFU大肠杆菌O157:H7 88321(相当于5倍LD50)体外混合(总体积200μl),37℃孵育1h;每份混合物腹腔内注射一只7周龄雄性BALB/c小鼠进行攻毒(设置10只小鼠的重复处理);
第四组(PBS组):经灌胃途径于第0d天进行首次免疫,第14d进行加强免疫;每只小鼠每次的免疫0.1毫升PBS缓冲液;第28天,每只小鼠取血清100μl,与3×108CFU大肠杆菌O157:H7 88321(相当于2倍LD50)或8×108CFU大肠杆菌O157:H7 88321(相当于5倍LD50)体外混合(总体积200μl),37℃孵育1h;每份混合物腹腔内注射一只7周龄雄性BALB/c小鼠进行攻毒(设置10只小鼠的重复处理);
二、生存率统计
自攻毒开始计天数,各组小鼠的生存率见图12和表5。
表5各亚组自攻毒开始计天数每天的存活小鼠只数
3×108CFU大肠杆菌O157:H7 88321剂量下,PBS组、OmpA载体缺失菌蜕组(non-OmpA)与O157:H7菌蜕组(BGs)均只有1只小鼠存活,O157:H7嵌合菌蜕组(RBGs)有8只小鼠存活。8×108CFU大肠杆菌O157:H7 88321剂量下,PBS组、OmpA载体缺失菌蜕组(non-OmpA)与O157:H7菌蜕组(BGs)小鼠全部死亡,O157:H7嵌合菌蜕组(RBGs)仍有2只小鼠存活。
Claims (11)
1.融合蛋白乙,其自N端至C端依次为如下片段:序列表的序列2自N末端第1至136位氨基酸残基组成的片段甲、外源蛋白、序列表的序列2自N末端第512位至634位氨基酸残基组成的片段乙和序列表的序列2第635至726位氨基酸残基组成的片段丙;所述外源蛋白的氨基酸序列如序列表的序列4所示。
2.权利要求1所述融合蛋白的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因,其特征在于:所述片段甲的编码基因如序列表的序列1自5’末端第1至408位核苷酸所示;所述片段乙的编码序列如序列表的序列1自5’末端第457至825位核苷酸所示;所述片段丙的编码序列如序列表的序列1自5’末端第826至1104位核苷酸所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组菌,其特征在于:所述重组菌为如下(a)或(b):
(a)含有所述重组表达载体的细菌;
(b)含有所述重组表达载体并表达裂解酶的细菌;所述裂解酶的氨基酸序列如序列表的序列6所示。
6.权利要求5所述的重组菌的菌蜕。
7.权利要求1所述融合蛋白、权利要求2或3所述基因、或权利要求4或5所述重组表达载体或重组菌在制备细菌菌蜕中的应用。
8.一种细菌疫苗,它的活性成分为权利要求6所述菌蜕。
9.如权利要求8所述的细菌疫苗,其特征在于:所述细菌为大肠杆菌。
10.权利要求6所述菌蜕在制备细菌疫苗中的应用。
11.如权利要求10所述的应用,其特征在于:所述细菌为大肠杆菌。
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