CN116785418A - 一种鱼源无乳链球菌亚单位疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鱼源无乳链球菌亚单位疫苗及其制备方法与应用，经浸浴免疫后，本发明所提供的鱼源无乳链球菌EF‑Tu亚单位疫苗的相对保护率最高达73.33％左右，高于普通无乳链球菌膜蛋白重组片段，基于兼职蛋白的高表达和高分泌机制，提高了重组蛋白的免疫原性和保护效力，且更具广谱性，同时由于其高度可溶性特征使得EF‑Tu重组蛋白生产工艺极大地简化，生产成本大幅降低，对渔业可持续发展和水产品食品安全生产具有重要意义。

Description

一种鱼源无乳链球菌亚单位疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鱼源无乳链球菌兼职蛋白EF-Tu亚单位疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus.agalactiae)也称B族链球菌(Group BStreptococcus，GBS)，是一种人畜及水产共患病原体，广泛分布于自然界，在温水性养殖鱼类中分布较多。无乳链球菌感染引起的鱼类死亡率高达30％，感染的鱼类包括罗非鱼、斑点叉尾鮰、牙鲆、石斑鱼等。此外，该病原菌在冷水性鱼类中也有报道，如虹鳟、齐口裂腹鱼等。该病原的分布范围广，在全球三大洲的多个国家的养殖鱼类中曾有感染报道，如美国、日本、巴西、泰国、澳大利亚等许多国家。自2007年，在中国南方地区相继有以罗非鱼无乳链球菌病为主的报道。该病在华南地区5～10月高温季节容易流行，发病和死亡周期可持续14～21天，水温在26℃～36℃均可发病，最适温度为28℃～31℃，当水温低于20℃时则发病较少，病程缓慢但持续较长时间。该病原菌可同时感染100g以上的稚鱼以及1kg左右的成鱼。无乳链球菌的传播方式类似于海豚链球菌，水平传播是无乳链球菌重要的传播途径，带病苗种是将无乳链球菌带入健康养殖场的一个重要因素，病原通过病鱼的粪便、粘液等传播到水域环境中，从而使得健康鱼受感染。

近年来，鱼类养殖生产上使用化学药物和抗生素来防治该病，但实际效果并不理想且存在诸多问题。目前疫苗在预防疾病方面取得了良好的成效，通过疫苗免疫，能够刺激鱼体自身的免疫系统，达到预防疾病的作用。无乳链球菌已经发现有约10种荚膜多糖血清型，为了研制不依赖于血清型的GBS通用疫苗，研究人员在具有高保护性蛋白抗原的鉴定方面做了大量工作。2005年前，已有少数GBS的蛋白抗原作为潜在的候选疫苗成分被鉴定出来，主要包括Rib、C蛋白α和β亚基，Sip、C5a肽酶等。但是除了Sip、C5a肽酶外，这些蛋白抗原或者不能在所有菌株中表达，或者在不同菌株中高度变异。因而，寻找免疫原性高且能够在不同菌株中均能表达的蛋白抗原成为疫苗开发的热点。

延伸因子Tu(Elongation Factor Tu，EF-Tu)广泛分布于细菌细胞中且含量很高，主要是在蛋白质生物合成中起作用，与肽链的延伸有关。研究证明EF-Tu可作为细菌的一个重要毒力因子。例如，定位于肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)和绿脓假单胞菌(Pesudomonas pyocyaneum)的EF-Tu可以介导病原与纤连蛋白和其它一些宿主蛋白的绑定。土拉热杆菌(Pasteurellatularensis)可通过EF-Tu与核仁蛋白的反应促进其入侵宿主细胞。此外，基于免疫蛋白组学的方法还发现EF-Tu是一个免疫原性很强的蛋白。有研究表明用类鼻疽杆菌(Burkholderiapseudomallei)EF-Tu作为口服疫苗可以减少类鼻疽杆菌在小鼠肺部的定殖，同时可以诱导小鼠良好的体液免疫反应和细胞免疫反应。在人源无乳链球菌免疫原性蛋白的研究中，有文献记载筛选了60株不同遗传背景的GBS分离株，用24个GBS分离株感染了GBS患者的血清以及带菌者和正常人的血清进行免疫反应实验(共孵育)，而后采用SDS-PAGE和Westernblot进行检测，同时结合LC-MS/MS质谱技术，最终筛选到4个强免疫原性蛋白，即烯醇化酶(47.4ku)、醛脱氢酶(50.6ku)、触发因子(47ku)和延伸因子Tu(44ku)，其中触发因子和延伸因子Tu是新发现的无乳链球菌的两种免疫原性蛋白。由此看来，无乳链球菌的延伸因子Tu同样具有兼职功能，是一个重要的毒力因子。

目前，现有技术中还没有将鱼源无乳链球菌的延伸因子Tu应用于亚单位疫苗制备的相关研究。因此，需要研制一种鱼源无乳链球菌EF-Tu亚单位疫苗。

发明内容

本发明旨在开发一种免疫原性高，且能够在不同菌株内都能表达的鱼源无乳链球菌兼职蛋白EF-Tu亚单位疫苗。所述亚单位疫苗具有良好的免疫原性，具有相对较长的免疫保护期和较高的免疫保护力。

为达到这一目的，本发明人在前期鱼源无乳链球菌EF-Tu基因功能研究的基础上，进一步研究无乳链球菌EF-Tu兼职蛋白亚单位疫苗的可能性，以丰富鱼源无乳链球菌亚单位疫苗，探索更为有效的免疫方案，本发明所采用的技术方案如下：

本发明所提供的鱼源无乳链球菌亚单位疫苗，由细菌兼职蛋白EF-Tu制成，所述EF-Tu重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:1，所述疫苗中EF-Tu重组蛋白浓度为5mg/ml，所述疫苗的制备方法包括如下步骤：

S1.EF-Tu重组蛋白的制备：以罗非鱼源无乳链球菌HN0303的基因组DNA模板成功克隆出EF-Tu基因，将EF-Tu基因连接至pMD19-T质粒载体构建出pMD19-T/EF-Tu重组克隆质粒；分别提取包含pET32a(+)表达质粒载体的大肠杆菌菌株与包含所述pMD19-T/EF-Tu重组克隆质粒的大肠杆菌菌株中的pET32a(+)片段和EF-Tu片段；连接所述EF-Tu片段与pET32a(+)片段构建重组表达质粒pET32a(+)/EF-Tu，将所述重组表达质粒pET32a(+)/EF-Tu加入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，孵育后加入培养基扩大培养制得所述EF-Tu重组蛋白；

S2.EF-Tu重组蛋白的纯化：使用Ni-Denature-urea溶液溶解EF-Tu重组蛋白沉淀后按照生工生物工程(上海)股份有限公司的Ni-NTA-Sefinose Column(BSP079-3)纯化柱操作说明对重组蛋白进行纯化；

S3.制备原核表达的EF-Tu重组蛋白：将所述EF-Tu重组蛋白转化入大肠杆菌BL21(DE3)表达载体中以获得原核表达的EF-Tu重组蛋白；

S4.乳化：将所述原核表达的EF-Tu重组蛋白与弗氏不完全佐剂按1:1比例混合后于100r/min下搅拌30分钟，即可制成疫苗；

S5.分装：定量分装，轧盖，贴标。

进一步地，本发明在上述S3中获得原核表达的EF-Tu重组蛋白的同时利用纯化后的EF-Tu重组蛋白免疫家兔，获得多克隆兔抗EF-Tu重组蛋白血清以用于EF-Tu重组蛋白功能的研究。经SDS-PAGE检测发现，诱导表达的重组蛋白以包涵体的形式出现在沉淀中，大小约为66.4ku。用其免疫家兔后成功获得多克隆兔抗EF-Tu重组蛋白血清，并在第3次免疫结束后用琼脂扩散法检测血清抗体效价已达到1:16。

更进一步地，通过Western blot分析，兔抗EF-Tu重组蛋白血清能分别特异性结合菌体蛋白和EF-Tu重组蛋白，同时联合细菌免疫组化法共同证明该蛋白既存在于胞内，也能够分泌到细菌外膜上。

此外，通过使用兔抗EF-Tu重组蛋白血清封闭罗非鱼源无乳链球菌HN0303表面的EF-Tu蛋白后，鱼源无乳链球菌HN0303粘附鲤鱼上皮细胞的能力下降了79.99％±2.43％。结果表明EF-Tu重组蛋白具有较好的抗原性，与菌体的EF-Tu重组蛋白具有相似的结构和功能，并推测该蛋白为无乳链球菌的一个粘附因子，在细菌入侵宿主时具有重要作用。

进一步地，本发明还提供了鱼源无乳链球菌亚单位疫苗在抗无乳链球菌感染中的应用。

通过上述技术方案，结合实施例本发明所提供的一种鱼源无乳链球菌亚单位疫苗至少具有下述有益效果或优点：

1)本发明联合Western blot和细菌免疫组化法共同证明，本发明所提供的EF-Tu重组蛋白既存在于胞内，也能够分泌到细菌外膜上，具有良好的抗原性。

2)本发明经琼脂扩散法检测3次免疫结束后的兔抗EF-Tu血清，结果说明本发明所提供的EF-Tu重组蛋白能有效刺激家兔产生特异性抗体，血清抗体效价至少达到了1:16水平。

3)本发明通过使用兔抗EF-Tu重组蛋白血清封闭罗非鱼源无乳链球菌HN0303表面的EF-Tu蛋白后，罗非鱼源无乳链球菌HN0303粘附鲤鱼上皮细胞的能力下降了79.99％±2.43％，表明本发明所制备的EF-Tu重组蛋白具有较好的抗原性。

4)本发明所制备的鱼源无乳链球菌EF-Tu亚单位疫苗经攻毒试验测定其相对保护率，结果表明不同剂量的免疫组对罗非鱼均具有一定的免疫保护效果，其中低剂量组相对保护率最高为73.33％。

附图说明

图1为重组克隆质粒pMD19-T/EF-Tu菌落PCR鉴定、单酶切鉴定和双酶切鉴定电泳图，M为DNAMarker DL 10000；第1泳道为重组克隆质粒pMD19-T/EF-Tu经BamHI单酶切鉴定；第2泳道为重组克隆质粒pMD19-T/EF-Tu经BamHI、Xho I双酶切鉴定；第3泳道为重组克隆质粒pMD19-T/EF-Tu菌落PCR阳性产物；第4泳道为菌落PCR阴性对照。

图2为重组表达质粒pET32a(+)/EF-Tu诱导表达产物分析，其中M为蛋白非预染Marker；第1泳道为pET32a(+)/EF-Tu诱导表达沉淀；第2泳道为pET32a(+)/EF-Tu诱导表达上清液；第3泳道为pET32a(+)/EF-Tu未诱导表达沉淀；第4泳道为pET32a(+)/EF-Tu未诱导表达上清液；第5泳道为pET32a(+)空载诱导表达沉淀；第6泳道为pET32a(+)空载诱导表达上清液；第7泳道为pET32a(+)空载未诱导表达沉淀；第8泳道为pET32a(+)空载未诱导表达上清液。

图3为重组表达质粒pET32a(+)/EF-Tu诱导表达优化，其中M为蛋白非预染Marker；第1泳道为pET32a(+)空载未诱导沉淀，37℃；第2泳道为pET32a(+)空载诱导沉淀，28℃；第3泳道为pET32a(+)空载诱导沉淀，34℃；第4泳道为pET32a(+)空载诱导沉淀，37℃；第5泳道为pET32a(+)/EF-Tu未诱导沉淀，37℃；第6泳道为pET32a(+)/EF-Tu诱导沉淀，28℃；第7泳道为pET32a(+)/EF-Tu诱导沉淀，34℃；第8泳道为pET32a(+)/EF-Tu诱导沉淀，37℃。

图4为琼脂扩散法检测3次免疫结束后的兔抗EF-Tu血清。

图5为Westernblot分析EF-Tu重组蛋白的抗原性，M为蛋白预染Marker；1为EF-Tu重组重组蛋白。

图6为Westernblot对EF-Tu重组蛋白进行定位分析，M为蛋白预染Marker；1为鱼源无乳链球菌全菌蛋白；2为罗非鱼源无乳链球菌全菌上清液；3为鱼源无乳链球菌全菌沉淀。

图7为无乳链球菌攻毒后累积死亡曲线。

图8为无乳链球菌攻毒后相对保护率。

图9为攻毒后抗体消长规律及抗体效价。

具体实施方式

下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场获得的常规产品。

实施例1

本实施例构建了具有兼职功能的EF-Tu重组蛋白并对其进行了鉴定。

1.构建pMD19-T/EF-Tu重组克隆质粒

以罗非鱼无乳链球菌的基因组DNA为模板，克隆出EF-Tu基因；将克隆出的EF-Tu基因连接至pMD19-T质粒载体上，获得重组克隆质粒pMD19-T/EF-Tu。

将pMD19-T/EF-Tu质粒分别进行PCR鉴定，单酶切鉴定和双酶切鉴定，如附图1所示，其结果表明：单酶切后出现一条大小约3900bp的条带，与pMD19-T质粒载体(2692bp)和EF-Tu片段(1197bp)之和大小一致(泳道1)；双酶切后出现两条分别约为2700bp和1200bp左右的条带，与pMD19-T载体和EF-Tu片段大小一致(泳道2)。将重组克隆质粒pMD19-T/EF-Tu进行测序，鉴定结果与目的基因碱基序列一致，将测序结果上传至GenBank，获得基因登陆号为KT957429。

进一步地，将pMD19-T/EF-Tu质粒进行测序后比对分析，其结果显示，鱼源无乳链球菌EF-Tu基因有一个由1197个碱基组成的ORF(开放阅读框)，编码398个氨基酸。生物信息学分析显示其分子式为C₁₉₃₃H₃₀₉₆N₅₃₂O₆₁₅S₁₁，分子质量为43.981ku，理论等电点为4.749；具有多个磷酸化位点，不具有信号肽和跨膜区域；具有保守的EF-Tu结构域、EF-Tu-II结构域和EF-Tu-III结构域，且与其他来源无乳链球菌的EF-Tu重组蛋白具有很高的同源性；具有较高的抗原指数，表明其可形成多个抗原表位。

更进一步地，上述测序结果与原序列比对一致后构建系统发育树，系统发育树显示鱼源无乳链球菌与现在已报到的无乳链球菌EF-Tu重组蛋白序列聚为一支，表明该蛋白在无乳链球菌中具有很高的同源性，属于保守蛋白之一。

2.EF-Tu重组蛋白的制备和纯化

将包含pET32a(+)表达质粒载体的大肠杆菌菌株与包含pMD19-T/EF-Tu重组克隆质粒的大肠杆菌菌株分别接种于Amp-LB肉汤中于37℃培养12h～16h，收集菌体，分别按照生工小量质粒DNA抽提试剂盒说明书提取质粒DNA。将获得的两种质粒分别用BamH I和XhoI进行双酶切，酶切后将酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察。随后根据TaKaRa琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书回收双酶切后的EF-Tu片段和pET32a(+)片段，取5mL回收产物加1mL 6×DNA Loading Buffer进行琼脂糖凝胶电泳观察回收产物的纯度。使用T4连接酶连接EF-Tu目的片段与pET32a(+)片段构建重组表达质粒pET32a(+)/EF-Tu，于16℃连接过夜，随后将连接产物10mL加入到50mL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，于冰上孵育30min后42℃热激90s，再立即冰浴5min。将转化产物加入940mL LB肉汤，于37℃，120r/min振荡培养2h，扩大培养得到EF-Tu重组蛋白。

使用Ni-Denature-urea溶液溶解沉淀后按照生工生物工程(上海)股份有限公司的Ni-NTA-Sefinose Column(BSP079-3)纯化柱操作说明对EF-Tu重组蛋白进行纯化。

3.构建原核表达的EF-Tu重组蛋白

收集诱导表达的大肠杆菌BL21(DE3)，使用PBS重悬洗涤细菌3次后，用PBS进行20倍浓缩重悬。重悬后细菌经3次反复冻融后，冰浴超声20min，于12000r/min离心15min，弃上清。使用包涵体洗涤液重悬洗涤沉淀，于12000r/min离心15min，弃上清。

将所制备的EF-Tu重组蛋白转入经过上述处理的大肠杆菌BL21(DE3)表达载体中获得原核表达的EF-Tu重组蛋白。

经SDS-PAGE检测发现，诱导表达的重组蛋白以包涵体的形式出现在沉淀中，大小约为66.4ku，见附图2，3。

4.EF-Tu重组蛋白的功能鉴定

利用纯化后的EF-Tu重组蛋白免疫家兔，获得多克隆兔抗EF-Tu重组蛋白血清用于接下来的EF-Tu重组蛋白功能的研究。

经琼脂扩散法检测3次免疫结束后的兔抗EF-Tu重组蛋白血清，根据结果可知血清1:2、1:4、1:8、1:16倍稀释均可见沉淀线出现，1:32倍稀释未见沉淀线出现，说明EF-Tu重组蛋白能有效刺激家兔产生特异性抗体，此时的血清抗体效价至少达到了1:16水平，见附图4。

通过Westernblot分析表明，兔抗EF-Tu重组蛋白血清能分别特异性结合菌体蛋白和EF-Tu重组蛋白，见附图5。同时，联合细菌免疫组法共同证明该蛋白既存在于胞内，也能够分泌到细菌外膜上，见附图6。

此外，通过使用兔抗EF-Tu重组蛋白血清封闭罗非鱼源无乳链球菌HN0303表面的EF-Tu蛋白后，罗非鱼源无乳链球菌HN0303粘附EPC(Epithelioma papulosum cyprini，鲤鱼上皮细胞)的能力下降了79.99％±2.43％。结果表明EF-Tu重组蛋白具有较好的抗原性，与菌体的EF-Tu重组蛋白具有相似的结构和功能，并推测该蛋白为无乳链球菌的一个粘附因子，在细菌入侵宿主时具有重要作用。

实施例2

本实施例提供了一种鱼源无乳链球菌亚单位疫苗的制备方法：将实施例1所构建的原核表达的EF-Tu重组蛋白与弗氏不完全佐剂按1:1比例混合后于100r/min下搅拌30分钟，制成疫苗，定量分装，轧盖，贴标得到本发明所述鱼源无乳链球菌亚单位疫苗。

实施例3

本实施例对实施例1所制备的罗非鱼源无乳链球菌EF-Tu重组蛋白的免疫效力进行评价。

1.攻毒试验

将实施例1所构建的原核表达的EF-Tu重组蛋白与弗氏不完全佐剂等比例乳化。而后，将乳化后的EF-Tu重组蛋白腹腔注射免疫尼罗罗非鱼，分为低、中、高三个不同剂量，具体分组情况见表1。

表1，试验分组情况

将720尾健康尼罗罗非鱼(50g±5g)随机分成6个组，每组120尾。分别设置蛋白加佐剂组(3个浓度梯度)，蛋白对照组，佐剂对照组(PBS加佐剂组)和PBS对照组，每尾鱼采用腹腔注射方法注射疫苗，每尾鱼注射0.1mL疫苗，分组及注射情况见表1。

免疫接种后的鱼饲养管理同暂养时管理，在免疫后第29天进行攻毒试验，以50倍LD₅₀(LD₅₀为5.4×10⁶cfu)的细菌浓度进行攻毒，每尾鱼腹腔注射0.2mL，每个试验组各选取30尾鱼进行攻毒，攻毒后连续观察14d，记录各组罗非鱼的临床症状及死亡情况。

2.免疫效力评价

2.1相对保护率

通过攻毒试验测得各试验组对罗非鱼的相对保护率，结果见附图7，8。据附图，攻毒后不同剂量的免疫组对罗非鱼均具有一定的免疫保护效果，以低剂量组为最好，相对保护率为73.33％。

相对保护率(Relative Percent Survival，RPS)，RPS(％)＝[1-(免疫组死亡率％/对照组死亡率％)]×100％。PBS对照组于攻毒后第7天全部死亡。攻毒14d后计算各组抵抗无乳链球菌的相对保护率分别为：低剂量组：73.33％(22/30)，中剂量组：53.33％(16/30)，高剂量组：60％(18/30)，蛋白对照组：3.33％(1/30)，佐剂对照：10％(3/30)。

2.2特异性免疫指标

本实施例于免疫后对罗非鱼特异性免疫指标(Ig M抗体效价)进行检测，了解EF-Tu重组蛋白免疫对罗非鱼免疫系统的影响。

对特异性免疫指标检测结果显示，从免疫后第1周开始，不同剂量的免疫组鱼血清抗体水平都逐渐升高，在第3周后检测发现均上升至各组较高水平，高剂量组产生的抗体效价最高，见附图9。

2.3血清抗体水平

对攻毒后血清抗体水平经ELISA检测发现，低量组在攻毒后24h内迅速产生抗体来保护机体，而中、高剂量组则在第24h以后才逐渐产生抗体；到达各自最高水平时，低剂量组和中剂量组抗体水平都开始下降，而高剂量组还逐渐上升，如表2所示。通过抗体效价测定显示，低剂量在短时间内抗体水平由最初的1:500提升到了1:700，而中剂量组上升水平较少，高剂量组一直保持在较高的抗体水平，如附图9所示。

表2，ELISA检测攻毒后不同时间点血清抗体水平

综上，EF-Tu重组蛋白是一种高效抗原物，能够帮助罗非鱼抵抗无乳链球菌的感染。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种鱼源无乳链球菌亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗由鱼源无乳链球菌的EF-Tu重组蛋白制备，所述EF-Tu重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:1。

2.根据权利要求1所述的鱼源无乳链球菌亚单位疫苗，其特征在于，所述鱼源无乳链球菌亚单位疫苗中EF-Tu重组蛋白的浓度为5mg/ml。

3.根据权利要求1所述的鱼源无乳链球菌亚单位疫苗，其特征在于，所述EF-Tu重组蛋白纯化后免疫家兔获得的兔抗EF-Tu重组蛋白血清，经3次免疫后其抗体效价为1:16。

4.根据权利要求3所述的鱼源无乳链球菌亚单位疫苗，其特征在于，所述兔抗EF-Tu重组蛋白血清封闭罗非鱼源无乳链球菌HN0303表面的EF-Tu蛋白后，鱼源无乳链球菌HN0303粘附鲤鱼上皮细胞的能力下降了79.99％±2.43％。

5.权利要求1-4任一项所述的鱼源无乳链球菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：制备EF-Tu重组蛋白，并对其进行纯化；制备原核表达的EF-Tu重组蛋白；将所述原核表达的EF-Tu重组蛋白与弗式不完全佐剂混合，搅拌，制成疫苗；将制得的疫苗定量分装，轧盖，贴标。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述EF-Tu重组蛋白的制备方法包括：以罗非鱼源无乳链球菌HN0303的基因组DNA模板克隆出EF-Tu基因，将所述EF-Tu基因连接至pMD19-T质粒载体构建出pMD19-T/EF-Tu重组克隆质粒；分别提取包含pET32a(+)表达质粒载体的大肠杆菌菌株与包含所述pMD19-T/EF-Tu重组克隆质粒的大肠杆菌菌株中的pET32a(+)片段和EF-Tu片段；连接所述EF-Tu片段与pET32a(+)片段构建重组表达质粒pET32a(+)/EF-Tu，将所述重组表达质粒pET32a(+)/EF-Tu加入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，孵育后加入培养基扩大培养制得所述EF-Tu重组蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述重组表达质粒pET32a(+)/EF-Tu与大肠杆菌DH5α感受态细胞的加入体积比为1:5。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述原核表达的EF-Tu重组蛋白的制备包括：将所述EF-Tu重组蛋白转化入大肠杆菌BL21(DE3)表达载体中获得所述原核表达的EF-Tu重组蛋白。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述EF-Tu重组蛋白与弗式不完全佐剂的混合比例为1:1。

10.权利要求1-4任一项所述的鱼源无乳链球菌亚单位疫苗在抗无乳链球菌感染中的应用。