CN117018173A - 一种罗非鱼链球菌二联亚单位纳米疫苗及其制备与应用 - Google Patents
一种罗非鱼链球菌二联亚单位纳米疫苗及其制备与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种罗非鱼链球菌二联亚单位纳米疫苗及其制备与应用。本发明在保护性抗原Sip和Srr的抗原表位分析的基础上，将两种菌的保护性抗原的基因进行融合表达，得到二联重组蛋白rSS，以细菌纳米纤维素作为载体，构建二联亚单位纳米疫苗，最后将制得的疫苗免疫接种罗非鱼，得出二联亚单位纳米疫苗对于无乳链球菌和海豚链球菌的相对保护率。本发明提供的二联亚单位纳米疫苗，对于无乳链球菌感染罗非鱼后的相对保护率为64.29%；对于海豚链球菌感染罗非鱼后的相对保护率为57.14%，效果显著。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种罗非鱼链球菌二联亚单位纳米疫苗及其制备与应用。
背景技术
罗非鱼（Oreochromis mossambicus）作为优质的动物性蛋白质来源，是最常见的养殖鱼类之一。然而，随着罗非鱼养殖规模和养殖密度的增加，以无乳链球菌Streptococcus agalactiae和海豚链球菌Streptococcus iniae感染为主的链球菌病时有发生，严重时死亡率高达80%以上。疫苗接种作为替代抗生素和化学药物进行鱼病防治更为绿色、安全、有效的方法，得到了广泛重视和研究。
感染鱼类的链球菌具有血清型较多和高度变异等特点，传统疫苗已不能满足防控需求。反之，以强免疫原性和高保守性的保护性抗原为基础的基因工程疫苗越来越受到关注和青睐。另一方面，水产养殖中面临多种病原交叉感染，因此研究出能够治疗多种疾病的联合疫苗，更能满足水产养殖动物的免疫防控需求。
表面免疫原性蛋白（Surface immunogenic protein，Sip）是存在于无乳链球菌表面的一种高度保守蛋白，在各血清型无乳链球菌中均有表达。富丝氨酸重复序列（serine-rich repeat protein，Srr）蛋白是一类具有吸附功能的革兰氏阳性菌细胞壁蛋白。Sip和Srr分别是无乳链球菌和海豚链球菌的保护性抗原。鉴于罗非鱼养殖过程中受到无乳链球菌和海豚链球菌的混合感染，因此开发出具有两种疾病甚至多种疾病免疫功能的疫苗对于鱼类养殖业具有重要的贡献意义。
发明内容
本发明在保护性抗原Sip和Srr的抗原表位分析的基础上，将两种菌的保护性抗原的基因进行融合表达，得到二联重组蛋白（Recombinant Protein）rSS，以细菌纳米纤维素（Bacterial nanocellulose，BNC）作为载体，使用化学连接等技术构建二联亚单位纳米疫苗，最后将制得的疫苗通过浸泡免疫接种罗非鱼，评价疫苗的相对保护率。基于上述技术思路，本发明提供以下详细的技术方案。
本发明首先提供一种二联亚单位纳米疫苗，其组分包括：疫苗佐剂和抗原；所述佐剂为羧基化细菌纳米纤维素。
所述抗原为Sip蛋白与Srr蛋白组成的rSS重组蛋白，所述为Sip蛋白与Srr蛋白之间通过linker序列连接。
所述rSS重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，所述rSS重组蛋白的编码基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
进一步地，所述rSS重组蛋白浓度不低于20mg/mL。
本发明还提供一种重组载体pET32a-rSS，其包含rSS重组蛋白的编码基因，所述rSS重组蛋白的编码基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
另外，本发明还提供一种重组菌E.coli BL21（DE3），其包含上述重组载体pET32a-rSS。
本发明还提供上述二联亚单位纳米疫苗的制备方法，包括：
重组蛋白序列的构建：获取抗原Sip蛋白和Srr蛋白的氨基酸序列，并将Sip蛋白和Srr蛋白使用linker序列EAAAK连接，获得具有Sip1-linker-Sip2-linker-Srr结构的重组蛋白序列rSS；
重组菌的构建：合成能够编码rSS重组蛋白的基因的质粒pET32a-rSS，并将质粒pET32a-rSS转入E.coli BL21（DE3）；
目的基因的诱导表达：将成功转入质粒pET32a-rSS的重组菌E.coli BL21（DE3）培养至发酵液OD600值为1.1~1.3，加入IPTG诱导rSS重组蛋白表达；
重组蛋白的分离纯化：将发酵液中的菌体破碎，收集含有rSS重组蛋白的杂蛋白溶液，再用层析柱和透析袋分离纯化出rSS重组蛋白；
细菌纳米纤维素羧基化：利用化学方法制备羧基化的细菌纳米纤维素；
羧基化细菌纳米纤维素混悬液的制备：将羧基化的细菌纳米纤维素制成混悬液；
rSS重组蛋白重悬液制备：将rSS重组蛋白重悬到pH值为7.2磷酸盐缓冲液中，制成rSS重组蛋白重悬液；
羧基化细菌纳米纤维素混悬液与rSS重组蛋白重悬液混合：以蛋白重悬液:羧基化细菌纳米纤维素混悬液按照体积比为=1:1的比例混合，室温搅拌4h，反应产物用截留分子量为10K的透析袋透析48h，冷冻干燥获得固体粉末，再按照每20mg固体粉末加入1mL磷酸缓冲盐溶液的比例混合，制成成品疫苗，4℃保存。
进一步地，在上述二联亚单位纳米疫苗的制备方法中，细菌纳米纤维素羧基化的方法为：将4g的细菌纳米纤维素、64g的2，2，6，6-四甲基哌啶-氮-氧化物、400mg的溴化钠和10mL次氯酸钠混合，控制pH值为10.5，室温搅拌12h，加入5mL无水乙醇终止反应，之后用蒸馏水将反应液抽滤至pH≤8，再用70%的浓硫酸与抽滤后的纤维素混合，50℃下加热搅拌2h，再加入蒸馏水终止反应，制得200~300nm规格的羧基化纳米纤维素，透析并冷冻干燥得到羧基化细菌纳米纤维素。
进一步地，在上述二联亚单位纳米疫苗的制备方法中，羧基化细菌纳米纤维素混悬液的制备方法为：将1g羧基化细菌纳米纤维素、40mL的1-乙基-3-（二甲胺丙基）碳二亚胺、60mg的N-羟基丁二酰亚胺混合，在pH值为6.0的吗啉乙磺酸缓冲液中室温搅拌4h，之后加入14μL巯基乙醇终止反应，得到羧基化细菌纳米纤维素混悬液。
本发明还提供上述二联亚单位纳米疫苗在罗非鱼链球菌病防治药剂制备中的应用，所述罗非鱼链球菌病是由无乳链球菌Streptococcus agalactiae或海豚链球菌Streptococcus iniae感染引起的；
在所述二联亚单位纳米疫苗中，所述rSS重组蛋白浓度不低于20mg/mL。
本发明还请求保护上述重组载体pET32a-rSS，或上述重组菌E.coli BL21（DE3）在水产养殖疫苗制备中的应用。
与现有技术相比，本发明“一种罗非鱼链球菌二联亚单位纳米疫苗及其制备与应用”具有以下有益效果：
本发明提供的二联亚单位纳米疫苗BNC-rSS对无乳链球菌和海豚链球菌均具显示出显著的免疫原性：其中，对于无乳链球菌感染罗非鱼后的相对保护率为64.29%；对于海豚链球菌感染罗非鱼后的相对保护率为57.14%。另外，本发明制备的二联亚单位纳米疫苗NC-rSS能显著提升罗非鱼的血清抗体水平和溶菌酶、总抗氧化能力等非特异性免疫指标，显著降低无乳链球菌和海豚链球菌感染后的罗非鱼死亡率，为罗非鱼抵抗链球菌感染提供了较好的免疫保护效果。
附图说明
图1为重组表达质粒pET32a-rSS进行琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图。其中，M1泳道为DL 2000 Plus DNA Marker；1泳道为rSS基因PCR结果；2泳道为pET32a-rSS质粒双酶切分析结果；3泳道为pET32a-rSS质粒单酶切；M2泳道为DL 15000 DNA Marker。
图2为二联重组蛋白rSS的SDS-PAGE检测结果图。其中，M1泳道为蛋白Marker；1泳道为经IPTG诱导的携带空载体的E.coli BL21（DE3）（pET32a）菌体蛋白；2泳道为未经诱导的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）上清中的菌体蛋白；3泳道为未经诱导的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）沉淀中的菌体蛋白；4泳道为IPTG诱导的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）上清中的菌体蛋白；5泳道为经IPTG诱导的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）沉淀中的菌体蛋白。
图3为纯化后的rSS重组蛋白的Western blot检测结果图。图3中，A是rSS重组蛋白的SDS-PAGE结果；B是rSS重组蛋白与携带His标签的鼠抗、羊抗鼠特异性结合；C是rSS蛋白与兔抗无乳链球菌Streptococcus agalactiae血清、羊抗兔的特异性结合反应；D是rSS蛋白与兔抗海豚链球菌Streptococcus iniae血清、羊抗兔的特异性结合反应。其中泳道M为蛋白Marker；泳道1为纯化后rSS蛋白。
图4为各组罗非鱼经浸泡免疫的在不同时间的血清抗体水平检测结果图。
图5为无乳链球菌和海豚链球菌攻毒感染后不同免疫组罗非鱼的存活率和相对保护率。图5中，A是无乳链球菌攻毒感染后不同组罗非鱼的存活率和相对保护率；B是海豚链球菌攻毒感染后不同组罗非鱼的存活率和相对保护率。RPS表示相对保护率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行说明，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了抗原蛋白的氨基酸序列、重组氨基酸序列的获得。
Sip（S.agalactiae AKI94449.1和S.iniae AGM98164.1）和Srr（S.agalactiaeAKI95824.1和S.iniae AGM97982.1）蛋白的氨基酸序列从NCBI网站下载。利用Bepipred线性表位预测2.0（http://tools.immuneepitope.org/bcell/）分别对上述序列进行分析，筛选出相似度较高的部分序列，并分别命名为Sip1、Sip2和Srr。利用连接子linker序列（EAAAK）获得了重组的氨基酸序列Sip1-linker-Sip2-linker-Srr（rSS），并根据该氨基酸序列合成质粒pET32a-rSS（北京擎科生物科技股份有限公司）。将合成的质粒通过PCR扩增（扩增体系为Mix为7.5μL，rSS-F 0.3μL，rSS-R 0.3μL质粒1.8μL，补水至15μL）、双酶切（双酶切体系为Nco I 0.5μL，BamH I 0.5μL，质粒0.8μL，酶切缓冲液为1μL）和测序鉴定了上述质粒，并将正确的质粒转化到E.coli BL21（DE3）细胞中进行蛋白表达。
实施例2
本实施例提供了重组基因工程菌的构建和鉴定。
1.重组基因工程菌的构建
本发明采用E.coli BL21（DE3）构建出重组基因工程菌E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS），该重组基因工程菌含有能够表达rSS重组蛋白的编码基因。
pET32a-rSS质粒由北京擎科生物科技股份有限公司合成，将质粒热转化（42℃热激90秒）入大肠杆菌化学感受态细胞E.coli BL21（DE3）中，将转化后的大肠杆菌涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。然后挑取单菌落进行菌落PCR检测。将PCR鉴定条带正确的菌落接种至含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、以180r/min培养12~16小时。按Omega质粒提取试剂盒操作说明进行质粒的提取，对质粒进行PCR和双酶切，其中质粒PCR引物为：
rSS-F：CATGCCATGGGCCATCACCACCACCACCAT
rSS-R：CCGCTCGAGGGAGGTAGATGCAGATTCAG
经过PCR和双酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：120V电压电泳30分钟，结果如图1所示。其中，M1泳道为DL 2000 Plus DNA Marker；1泳道为rSS基因PCR结果；2泳道为pET32a-rSS质粒双酶切结果；3泳道为pET32a-rSS质粒单酶切；M2泳道为DL15000 DNA Marker。图1中可见泳道1在400bp附近有条带，说明rSS基因被成功扩增；泳道2在6000bp和400bp附近均有条带，泳道3在6400bp附近有条带，说明质粒pET32a-rSS单双酶切结果正确。
2.rSS重组蛋白的诱导表达
将上述构建完成的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）用接种环挑取少量的菌液，划线接种于LB固体培养基，37℃静置培养12~16小时后，挑单菌落接种于LB液体培养基中，置于37℃、180r/min摇床培养12~16小时作为种子液，然后将其按1%（V/V）接种至LB液体培养基，同时加入氨苄青霉素至终浓度50μg/mL,37℃培养5~7小时，至菌液OD600值为1.1~1.3时，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.001mol/L，37℃诱导表达6h。
3.菌体破碎分离rSS重组蛋白
发酵混合物经10000r/min室温离心，收集菌体，用0.01mol/L，pH值7.2的磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤3次，将收集的湿润菌体，按每1g湿润菌体配合10mL PBS缓冲液，将湿润菌体重悬，冰浴条件下超声破碎，对超声破碎后的菌液置于4℃，12000r/min离心5min收集沉淀，用8M尿素溶液溶解，得到含有rSS重组蛋白的杂蛋白溶液。
4.rSS重组蛋白的纯化
按每1g蛋白沉淀用10mL溶解液（5mmol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8M尿素，20mmol/L Tirs-HCl，pH值7.9）的比例进行溶解，室温下200r/min振荡溶解2小时后，4℃、10000r/min离心30min，收集上清。用平衡缓冲液（5mmol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8M尿素，20mmol/L Tirs-HCl，pH值7.9）充分平衡金属（镍Ni2＋）螯合亲和层析柱后，按2倍柱体积上样，再用平衡缓冲液平衡，然后用洗脱缓冲液（0.5mol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8M尿素，20mmol/LTirs-HCl，pH值7.9）洗脱，收集蛋白。将纯化的200mL蛋白置于截留分子量（MWCO）为10K的透析袋（SnakeSkin™）于4℃透析12h，直接完全浸入到10L的复性液中（150 mM NaCl、2.5 mMKCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、1%吐温-20、10mM β-环糊精、1M的L-半胱氨酸，3 mM还原型和1 mM氧化型谷胱甘肽，pH值7.9）。期间每6h更换1次复性液，透析结束后，收集透析后的蛋白液4℃保存备用。
5.rSS重组蛋白的检测
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测：
SDS-PAGE检测实验分为5组，分别为：
1）组：经IPTG诱导、携带空载体的E.coli BL21（DE3）（pET32a）菌体蛋白；
2）组：未经诱导、携带目的基因的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）上清液菌体蛋白；
3）组：未经诱导、携带目的基因的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）沉淀菌体蛋白；
4）组：经IPTG诱导、携带目的基因的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）上清液菌体蛋白；
5）组：经IPTG诱导、携带目的基因的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）沉淀菌体蛋白。
将上述不同组别制得的蛋白分别进行SDS-PAGE电泳检测，分离胶的丙烯酰胺浓度为12%。考马斯亮蓝染色，脱色液脱色至条带清晰为止，SDS-PAGE检测结果如图2所示。由图2可知rSS蛋白主要分布在沉淀的菌体蛋白中，说明其为包涵体表达。其中，M1泳道为蛋白Marker；1泳道为经IPTG诱导的携带空载体的E.coli BL21（DE3）（pET32a）菌体蛋白；2泳道为未经诱导的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）上清液中的菌体蛋白；3泳道为未经诱导的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）沉淀中的菌体蛋白；4泳道为IPTG诱导的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）上清中液的菌体蛋白；5泳道为经IPTG诱导的E.coli BL21（DE3）（pET32a-rSS）沉淀中的菌体蛋白。
免疫印迹试验（Western-blot）：
利用上述SDS-PAGE电泳得到的rSS重组蛋白进行Western-blot试验。将上述经SDS-PAGE电泳的胶片置于转膜仪上，200mA条件下转膜1h。将载有蛋白的聚偏二氟乙烯膜（PVDF）置于塑料洗盒中，加入25mL的5%脱脂乳在室温下封闭2h，倒掉脱脂乳，用TBST缓冲液洗3次后，加入30mL鼠源组氨酸单克隆抗体（一抗，抗体稀释液稀释比例1:1000），室温缓慢振荡反应2h，倒掉一抗，用TBST缓冲液洗5次后，加入30mL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（抗体稀释液稀释，比例1:2000稀释），室温缓慢振荡反应2h，倒掉二抗，用TBST洗5次后，将膜放入平皿中，置于暗室。先加入1mL去离子水，再加入DAB显色液（A液和B液各1滴），用移液器反复冲洗膜表面1分钟，至显色完全后，用去离子水冲洗、晾干、成像，显色后在约45kDa有特异性条带，表明样品中存在表达正确的rSS重组蛋白。
用上述同样的方法检测蛋白分别与兔抗S.agalactiae血清和兔抗S.iniae血清（分别作为一抗，羊抗兔为二抗）反应有无显色条带，显色后在约45kDa有特异性条带，表明rSS重组蛋白具有交叉免疫原性。结果如图3所示。
实施例3
本实施例提供了二联亚单位纳米载体疫苗的制备。
细菌纳米纤维素的羧基化：将237g 的湿状细菌纤维素（干重4g）与2，2，6，6-四甲基哌啶-氮-氧化物（TEMPO，64mg）、溴化钠（400mg）和次氯酸钠（约10mL），控制pH值为10.5，室温搅拌12h，加入5mL无水乙醇终止反应，之后将反应液用蒸馏水抽滤至pH≤8，配置70%的浓硫酸与抽滤后的纤维素混合，50℃下加热搅拌用以制备200~300nm规格的羧基化纳米纤维素，搅拌2h后加入蒸馏水终止反应，透析并冷冻干燥。
将1g羧基化细菌纳米纤维素与40mg1-乙基-3-（二甲胺丙基）碳二亚胺（EDAC）、60mgN-羟基丁二酰亚胺（NHS），在pH值为6.0的吗啉乙磺酸（MES）缓冲液中室温搅拌4h。加入14μL巯基乙醇终止反应。
以rSS重组蛋白与羧基化细菌纳米纤维素的质量比为1:1的用量，将rSS重组蛋白重悬到磷酸盐缓冲液（pH值为7.2）中，制得蛋白重悬液，再以蛋白重悬液:上述BNC反应液=1:1（V/V）的比例混合，室温搅拌4h。
反应产物用截留分子量（MWCO）10K的透析袋透析48h，用冷冻干燥机冻干产物，获得固体粉末。按照每20mg固体粉末加入1mL磷酸缓冲盐溶液（PBS）的比例混合，制成成品疫苗，4℃保存。
实施例4
本实施例提供了二联亚单位纳米疫苗的免疫效果评价。
1.血清抗体水平的ELISA检测
取3.0~4.0g的健康罗非鱼280尾，分为4组（70尾/组），其中1组为对照组，其余3组为试验组。各处理方式分别如下：
PBS组（对照组）：磷酸缓冲盐溶液（PBS）浸泡处理罗非鱼8小时后转入正常养殖用水；
rSS组：rSS重组蛋白浸泡处理罗非鱼8小时后转入正常养殖用水；
BNC组：细菌纳米纤维素（BNC）浸泡处理罗非鱼8小时后转入正常养殖用水；
BNC-rSS组：配制每1L中含有1mL成品疫苗（每1mL成品疫苗中含有20mg的rSS重组蛋白）浸泡处理罗非鱼8小时后转入正常养殖用水。
在7、14、21、28天分别采集各组罗非鱼血液，将采集的血液在室温下静置2h，放入4℃冰箱过夜。第二天，以5000×G的离心力于低温冷冻离心机中离心15min，取上层血清，于-20℃中保存。
将上述血清用包被稀释液1:400稀释，以每孔100μL加入至96孔酶标板中，每个样品三重复，4℃过夜包被。结束后，弃去孔中液体；加入5%小牛血清置于37℃封闭1h。封闭结束后，用TBST洗涤3遍，每遍3min。
将rSS重组蛋白稀释至10μg/mL，以每孔100μL加入至96孔酶标板中，每孔100μL，置于37℃，40~60min。然后用TBST洗涤3遍，每遍3min。
将鼠源His-tag单克隆抗体（1:1000）进行稀释，每孔100μL加入96孔酶标板中，于37℃，孵育30~60min，然后用TBST洗涤3遍，每遍3min。
将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（1:5000）进行稀释，每孔100μL的体积加入96孔酶标板中，于37℃，孵育30~60min，然后用TBST洗涤3遍，每遍3min。
每孔加入100μL四甲基联苯胺（TMB）显色液，置于37℃避光放置5~10min；每孔加入终止液50μL终止反应，20min内测定450nm波长下的吸光度。
结果显示各疫苗组血清抗体水平均在28天时达到最高，免疫后BNC-rSS组各周的抗体水平均显著（p<0.05）高于其他3个组，如图4所示。
2.细菌人工感染后免疫保护率检测
上述免疫罗非鱼观察28天后，分别用无乳链球菌（细菌含量为1×108CFU/mL）和海豚链球菌（细菌含量为1×109CFU/mL）菌液对各组进行腹腔注射攻毒，100μL/尾，攻毒后连续观察14天，记录罗非鱼死亡情况。
结果表明，浸泡免疫罗非鱼28天后，二联亚单位纳米载体疫苗BNC-rSS对罗非鱼抗无乳链球菌和海豚链球菌感染的免疫保护率分别为64.29%和57.14%，如图5所示。图5中RPS指的是相对免疫保护率（relative percent survival），RPS=（1-试验组死亡率/对照组死亡率）×100%）。说明本发明提供的二联亚单位纳米载体疫苗具有无乳链球菌和海豚链球菌的免疫作用。
以上所述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。在依据本发明构思的条件下本领域普通技术人员进行的相关推演和替换，在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种二联亚单位纳米疫苗，其特征在于，组分包括：疫苗佐剂和抗原；所述佐剂为羧基化细菌纳米纤维素；
所述抗原为Sip蛋白与Srr蛋白组成的rSS重组蛋白，所述Sip蛋白与Srr蛋白之间通过linker序列连接；
所述rSS重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的二联亚单位纳米疫苗，其特征在于，所述rSS重组蛋白的编码基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的二联亚单位纳米疫苗，其特征在于，所述rSS重组蛋白浓度不低于20mg/mL。
4.一种重组载体pET32a-rSS，其特征在于，包含权利要求1所述rSS重组蛋白的编码基因，所述rSS重组蛋白的编码基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
5.一种重组菌E.coli BL21（DE3），其特征在于，包含权利要求4所述的重组载体pET32a-rSS。
6.权利要求1所述的二联亚单位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括：
重组蛋白序列的构建：获取抗原Sip蛋白和Srr蛋白的氨基酸序列，并将Sip蛋白和Srr蛋白使用linker序列EAAAK连接，获得具有Sip1-linker-Sip2-linker-Srr结构的重组蛋白rSS；
重组菌的构建：合成能够编码rSS重组蛋白的基因的质粒pET32a-rSS，并将质粒pET32a-rSS转入E.coli BL21（DE3）；
目的基因的诱导表达：将成功转入质粒pET32a-rSS的重组菌E.coli BL21（DE3）培养至发酵液OD600值为1.1~1.3，加入IPTG诱导rSS重组蛋白表达；
重组蛋白的分离纯化：将发酵液中的菌体破碎，分离纯化出rSS重组蛋白；
细菌纳米纤维素羧基化：利用化学方法制备羧基化的细菌纳米纤维素；
羧基化细菌纳米纤维素混悬液的制备：将羧基化的细菌纳米纤维素制成混悬液；
rSS重组蛋白重悬液制备：将rSS重组蛋白重悬到pH值为7.2磷酸盐缓冲液中，制成rSS重组蛋白重悬液；
羧基化细菌纳米纤维素混悬液与rSS重组蛋白重悬液混合：以蛋白重悬液:羧基化细菌纳米纤维素混悬液按照体积比为=1:1的比例混合，室温搅拌4h，反应产物用截留分子量为10K的透析袋透析48h，冷冻干燥获得固体粉末，再按照每20mg固体粉末加入1mL磷酸缓冲盐溶液的比例混合，制成成品疫苗，4℃保存。
7.根据权利6所述的二联亚单位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，细菌纳米纤维素羧基化的方法为：将4g的细菌纳米纤维素、64g的2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物、400mg的溴化钠和10mL次氯酸钠混合，控制pH值为10.5，室温搅拌12h，加入5mL无水乙醇终止反应，之后用蒸馏水将反应液抽滤至pH≤8，再用70%的浓硫酸与抽滤后的纤维素混合，50℃下加热搅拌2h，再加入蒸馏水终止反应，制得200~300nm规格的羧基化纳米纤维素，透析并冷冻干燥得到羧基化细菌纳米纤维素。
8.根据权利6所述的二联亚单位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，羧基化细菌纳米纤维素混悬液的制备方法为：将1g羧基化细菌纳米纤维素、40mL的1-乙基-3-（二甲胺丙基）碳二亚胺、60mg的N-羟基丁二酰亚胺混合，在pH值为6.0的吗啉乙磺酸缓冲液中室温搅拌4h，之后加入14μL巯基乙醇终止反应，得到羧基化细菌纳米纤维素混悬液。
9.权利要求1所述的二联亚单位纳米疫苗在罗非鱼链球菌病防治药剂制备中的应用，其特征在于，所述罗非鱼链球菌病是由无乳链球菌Streptococcus agalactiae或海豚链球菌Streptococcus iniae感染引起的；
在所述二联亚单位纳米疫苗中，所述rSS重组蛋白浓度不低于20mg/mL。
10.权利要求4所述的重组载体pET32a-rSS，或权利要求5所述的重组菌E.coli BL21（DE3）在水产养殖疫苗制备中的应用。
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