CN113735949A

CN113735949A - 一种无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113735949A
Application number: CN202111124567.6A
Authority: CN
Inventors: 吴允昆; 朱春华; 张娜; 肖方南; 张红; 王晶晶; 景鼎鼎
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2021-09-25
Filing date: 2021-09-25
Publication date: 2021-12-03

Abstract

本发明涉及无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白及其制备方法与应用，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重组蛋白的编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述重组蛋白的制备方法即将所述的重组蛋白的编码基因构建到表达载体上，获得重组表达载体；将重组表达载体转化宿主细胞，培养转化的宿主细胞，使转化的宿主细胞表达产生所述无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白，之后回收并纯化所表达的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白；所述重组蛋白在制备罗非鱼抗无乳链球菌感染的疫苗中的应用。一种罗非鱼口服纳米疫苗是以所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白作为抗原；本发明的纳米疫苗对罗非鱼具有良好的免疫保护效果。

Description

一种无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于疫苗和生物制品领域，具体涉及一种无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

罗非鱼是一种重要的经济鱼，在世界水产养殖产量中占有很大的比重。无乳链球菌是一种重要致病菌，其感染宿主包括人、牛、鱼，多年来无乳链球菌严重威胁着罗非鱼养殖业的发展。疫苗因具绿色、安全、高效等优点成为防控鱼类疾病的首要选择的技术。尽管我们对鱼类疫苗的研究不断深入，但是商品化的疫苗种类还较少。由于鱼体不宜注射且生活在开放的水环境中，因此口服免疫是最适用于鱼类的免疫方式。鱼类胃肠道消化酶易对抗原造成破坏，因此，研发能提高疫苗的保护性抗原稳定性和吸收率的佐剂对鱼类口服疫苗具有重要意义。

亚单位疫苗成分稳定，并具有安全高效的特点，是目前新型疫苗开发的热点之一。开发亚单位疫苗的最关键步骤是鉴定“潜在”的保护性抗原，并确认其在宿主物种中对目标病原体的保护性效果。针对罗非鱼无乳链球菌，本研究选择了具有良好免疫原性，高度保守的SIP作为抗原蛋白。从免疫途径来说，传统的注射、浸泡方式难以在水产养殖过程中有效实施，而口服免疫的实施相对便利。口服疫苗开发的主要瓶颈是胃酸环境和肠道丰富水解酶对抗原的降解。为解决这个问题，本研究采用智能化的纳米运载体系对其进行特定环境下的保护和靶向释放，使抗原免于胃肠道水解，并能被肠道中细胞、组织高效吸收和呈递，从而形成全身免疫。应用经济适用的介孔二氧化硅(Mesoporous silica nanoparticles，MSN)纳米材料，对于减少疫苗成本投入和产业化十分迫切。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白及其制备方法与应用；另外，针对罗非鱼无乳链球菌，本发明选择了具有良好免疫原性且高度保守的SIP蛋白作为抗原蛋白，得到了具有高保护率的罗非鱼口服纳米疫苗，该罗非鱼口服纳米疫苗能够刺激罗非鱼产生无乳链球菌特异性抗体，并能够有效提高罗非鱼抗无乳链球菌感染的能力。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

本发明提供一种无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白(SIP重组蛋白)，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白的编码基因，所述编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种包含所述编码基因的表达载体。

所述表达载体包括pMD18-T、pET32a等。

由所述的表达载体转化的宿主细胞。

所述宿主细胞包括大肠杆菌BL21、293T细胞、sf9昆虫细胞、DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株。

本发明还提供所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白的制备方法，即将所述的重组蛋白的编码基因构建到表达载体上，获得重组表达载体；将重组表达载体转化宿主细胞，培养转化的宿主细胞，使转化的宿主细胞表达产生所述无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白，之后回收并纯化所表达的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白；

所述编码基因是以罗非鱼链球菌SIP蛋白基因序列为模板、SEQ ID No:3和SEQ IDNo:4为引物进行PCR扩增得到的。

所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白在制备罗非鱼抗无乳链球菌感染的疫苗中的应用。

本发明还提供一种罗非鱼口服纳米疫苗，它是以所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白作为抗原。

所述的罗非鱼口服纳米疫苗的制备方法，它包括以下步骤：

(1)制备MSN纳米颗粒；

(2)制备SIP-MSN纳米颗粒：将步骤(1)所得的MSN纳米颗粒与权利要求1所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白的溶液混合均匀后，置于多用途旋转摇床上，并在4-8℃混合10-12h，之后离心，回收沉淀，沉淀经冷冻干燥后即得所述SIP-MSN纳米颗粒；

(3)制备罗非鱼口服纳米疫苗：在SIP-MSN纳米颗粒表面包上羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯肠溶包衣，得SIP-MSN@HP55纳米颗粒，即所述罗非鱼口服纳米疫苗。

其中，

步骤(1)的具体操作方法为：在圆底烧瓶中加入CTATOS、TEA以及H₂O，混匀；置于油浴锅上80℃搅拌1h；待溶液为澄清透亮后，快速加入98％TEOS；80℃反应2h后，从油浴锅中取出；加入适量无水乙醇，离心后弃去上清；收集到的沉淀，用纯水清洗3遍；沉淀用6g/L的NH₃NO₃/甲醇重悬后，置于油浴锅上60℃萃取时间≥12h；每次萃取结束后，纯水清洗3遍；共萃取3次，沉淀经常温干燥后即为所述MSN纳米颗粒。

步骤(2)的具体操作方法为：将步骤(1)所得的MSN纳米颗粒重悬在水中，形成MSN纳米颗粒悬浊液；接着在所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白的溶液中加入一定体积的MSN纳米颗粒悬浊液，使得加入的MSN纳米颗粒达到1mg，混合均匀后，再放在多用途旋转摇床上，并在控温为4-8℃的冷室混合10-12h；之后离心，回收沉淀，沉淀经冷冻干燥后即得所述SIP-MSN纳米颗粒，并检测离心所得的上清蛋白浓度，计算蛋白的负载量和负载率。

步骤(3)的具体操作方法为：将步骤(2)所得的SIP-MSN纳米颗粒重悬在水中，得SIP-MSN纳米颗粒悬浊液；接着在SIP-MSN纳米颗粒悬浊液中，加入PEG400作为蛋白保护剂后，再加入司班80作为乳化剂，加入二氯甲烷、乙酸乙酯，混匀；接着，在细胞破碎仪中超声乳化后，迅速倒入0.1％PVA中，超声清洗仪超声3min乳化后，再迅速转移倒入另一0.1％PVA中，将烧杯放在磁力搅拌机匀速搅拌，在溶液中滴加0.5％HP55，搅拌至有机溶剂挥发；离心收集沉淀，产物用去离子水洗2遍。

本发明还提供了一种由所述罗非鱼口服纳米疫苗制备的免疫型罗非鱼饲料。

所述免疫型罗非鱼饲料的制备方法，包括以下步骤：

将SIP-MSN@HP55纳米颗粒重悬在ddH₂O中，形成浓度为1mg/mL的SIP-MSN@HP55纳米颗粒悬浊液；

接着将粘合剂与罗非鱼普通饲料按照重量比为1:1000搅拌混匀；然后将SIP-MSN@HP55纳米颗粒悬浊液均匀的喷洒在罗非鱼饲料表面再搅拌均匀，其中，每20g罗非鱼饲料喷洒1mL SIP-MSN@HP55纳米颗粒悬浊液，再在-30℃下真空冷冻干燥后，将附有SIP-MSN@HP55纳米颗粒的饲料放入壳聚糖溶液中浸润3-5s形成薄包衣后，再迅速转移至纯水中浸润5-8s取出，排除多余的水后，低温冷冻干燥，即得所述免疫型罗非鱼饲料，所得的免疫型罗非鱼饲料于-80℃储存备用。

其中，所述壳聚糖溶液为壳聚糖、柠檬酸三乙酯以及乙酸溶于ddH₂O中形成的溶液，且每100mL壳聚糖溶液中，含有0.5g壳聚糖、2.5g柠檬酸三乙酯以及5mL乙酸，其余为ddH₂O。

本发明将壳聚糖包被在附有疫苗的饲料表面，以防止疫苗在复杂的水体养殖环境中提前释放抗原。壳聚糖是一种无毒且可降解的阳离子多糖，具有良好的吸收性和粘附性。它可以刺激适应性免疫反应，包括细胞和体液免疫，并在鱼类的口腔粘膜和肠中引发有效的免疫反应。HP55与壳聚糖的双层保护为口服疫苗的稳定性和良好的免疫反应提供了保障。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

1.本发明将无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白作为负载的抗原，通过化学合成技术制备纳米颗粒包封SIP，制备的纳米运载系统具有pH可控释放、良好的生物兼容性等特点，提高了保护性抗原的生物利用效率，且口服免疫评估纳米疫苗在无乳链球菌攻击下对罗非鱼具有良好的免疫保护效果。

2.本发明将与介孔二氧化硅纳米运载体系组装成纳米颗粒疫苗能实现强酸性pH环境下免疫原的保护，而且该疫苗具有成本低、制备工艺简单、能耐受鱼类强酸性胃部环境等优点，这为将来口服纳米疫苗研发并走向临床应用提供了技术支撑。

3.研究证实1mg MSN与0.9mg/mL的蛋白混合负载时，能达到最大的负载量0.281mg/mL，此时负载率为21.9％。较高的蛋白负载率可减少MSN纳米颗粒的用量同时保持高浓度的保护性抗原，减少其对鱼类机体细胞的毒性和刺激作用。

4.本发明在附着了所述罗非鱼口服纳米疫苗的饲料表面包裹了一层壳聚糖得到了一种免疫型罗非鱼饲料，该免疫型罗非鱼饲料表面的壳聚糖可以防止疫苗在复杂的微碱性水坏境中提前释放抗原，且壳聚糖可在鱼类口腔粘膜和肠道产生有效的免疫应答。HP55和壳聚糖的双重保护为本发明口服疫苗的稳定性和免疫应答提供了重要保障。

附图说明

图1是本发明双酶切验证电泳结果图，其中M为5000bp Marker；泳道1为pET-32a载体骨架与目的基因条带。

图2是SIP蛋白纯化电泳图，其中，M为蛋白Marker；1为200mL 20mM咪唑洗脱液；2为300mM咪唑洗脱液；3为流穿的目的蛋白；4为10mM咪唑洗脱目的蛋白。

图3是各纳米材料颗粒的透射电镜图；其中，A为MSN纳米颗粒；B为MSN-SIP纳米颗粒；C为MSN-SIP@HP55纳米颗粒。

图4是ELISA检测罗非鱼血清特异性抗体水平结果图；相同血清稀释度和相同时间段中各试验组对比，^*P<0.05，^**P<0.01，^****P<0.0001。

图5是罗非鱼攻毒保护试验结果图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

1.实验方法

1.1基因构建

通过PCR扩增罗非鱼链球菌SIP基因，其中，PCR反应体系和程序如表1所示。PCR反应体系的上游引物序列与下游引物序列是根据罗非鱼链球菌全基因序列的第25241到第26501位进行设计的。

上游引物序列为：5’-GGATCCATGGAAATGAATAAAAAGG-3’(SEQ ID No:3)，

下游引物序列为：5’-CTCGAGTTAGTTAAAGGATACGTGA-3’(SEQ ID No:4)。

之后将PCR产物进行双酶切；其中，PCR产物双酶切体系：总体积为50μL，其中10×Cutsmart buffer 5μL，BamHI 1μL，XhoI 1μL，纯化后PCR产物20μL，ddH₂O 23μL。37℃酶切60min；

酶切后琼脂糖凝胶核酸电泳(agarose浓度为1-1.2％)，凝胶成像系统下观察是否酶切完全，然后紧挨着电泳条带切下目标片段，然后再进行胶回收纯化。

接着，进行载体质粒pET32a-TEV双酶切；其中，载体质粒pET32a-TEV酶切体系如下：总体积为50μL，其中10×Cutsmart buffer 5μL，BamHI 1μL，XhoI 1μL，载体质粒5μL，ddH₂O 38μL；进行胶回收后得到载体骨架。将双酶切后的载体骨架和基因连接，连接反应体系为：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，T4DNALigase 1μL，载体骨架1μL，基因7μL，16℃连接过夜，得到pET32a-SIP连接产物。将得到的pET32a-SIP连接产物加入感受态细胞BL21(DE3)中，冰上放置后在42℃水浴锅中热激45sec，立刻转移在冰上冷却2min；加500μL不含任何抗生素的液体LB培养基在摇床上复苏1h后涂板，平板37℃培养14h。平板挑取菌落培养后，提取质粒进行双酶切验证和测序验证，阳性的重组菌冻存。

表1 PCR反应体系和程序

重组SIP基因的双酶切及测序鉴定结果如下：

双酶切验证电泳结果如图1所示，其中，第一条泳道上样20μL样品。双酶切的结果都显示了清晰的两条带，分别是目的基因(1302bp)和克隆载体pET-32a(5.9Kb)。将阳性克隆送公司检测，测序结果显示SIP的重组基因序列正确。

扩增的重组SIP基因序列如下：

ATGGAAATGAATAAAAAGGTACTATTGACATCGACAATGGCAGCTTCGCTATTATCAGTCGCAAGTGTTCAAGCACAAGAAACAGATACGACGTGGACAGCACGTACTGTTTCAGAGGTAAAGGCTGATTTGGTAAAGCAAGACAATAAATCATCATATACTGTGAAATATGGTGATACACTAAGCGTTATTTCAGAAGCAATGTCAATTGATATGAATGTCTTAGCAAAAATTAATAACATTGCAGATATCAATCTTATTTATCCTGAGACAACACTGACAGTAACTTACGATCAGAAGAGTCATACTGCCACTTCAATGAAAATAGAAACACCAGCAACAAATGCTGCTGGTCAAACAACAGCTACTGTCGATTTGAAAACCAATCAAGTTTCTGTTGCAGACCAAAAAGTTTCTCTCAATACAATTTCGGAAGGTATGACACCAGAAGCAGCAACAACGATTGTTTCGCCAATGAAGACATATTCTTCTGCGCCAGCTTTGAAATCAAAAGAAGTATTAGCACAAGGGCAAGCTGTTAGTCAAGCAGCAGCTAATGAACAGGTATCACCAGCTCCTGTGAAGTCGATTACTTCAGAAGTTCCAGCAGCTAAAGAGGAAGTTAAACCAACTCAGACGTCAGTCAGTCAGTCAACAACAGTATCACCAGCTTCTGTTGCCGCTGAAACACCAGCTCCAGTAGCTAAAGTAGCACCGGTAAGAACTGTAGCAGCCCCTAGAGTGGCAAGTGTTAAAGTAGTCACTCCTAAAGTAGAAACTGGTGCATCACCAGAGCATGTATCAGCTCCAGCAGTTCCTGTGACTACGACTTCAACAGCTACAGACAGTAAGTTACAAGCGACTGAAGTTAAGAGCGTTCCGGTAGCACAAAAAGCTCCAACAGCAACACCGGTAGCACAACCAGCTTCAACAACAAATGCAGTAGCTGCACATCCTGAAAATGCAAGGCTCCAACCTCATGTTGCAGCTTATAAAGAAAAAGTAGCGTCAACTTATGGAGTTAATGAATTCAGTACATACCGTGCGGGAGATCCAGGTGATCATGGTAAAGGTTTAGCAGTTGACTTTATTGTAGGTAAAAACCAAGCACTTGGTAACGAAGTTGCACAGTACTCTACACAAAATATGGCAGCAAATAACATTTCATATGTTATCTGGCAACAAAAGTTTTACTCAAATACAAATAGTATTTATGGACCTGCTAATACTTGGAATGCAATGCCAGATCGTGGTGGCGTTACTGCCAACCACTATGACCACGTTCACGTATCCTTTAACTAA

重组SIP基因编码的氨基酸序列如下：

Met Glu Met Asn Lys Lys Val Leu Leu Thr Ser Thr Met Ala Ala Ser LeuLeu Ser Val Ala Ser Val Gln Ala Gln Glu Thr Asp Thr Thr Trp Thr Ala Arg ThrVal Ser Glu Val Lys Ala Asp Leu Val Lys Gln Asp Asn Lys Ser Ser Tyr Thr ValLys Tyr Gly Asp Thr Leu Ser Val Ile Ser Glu Ala Met Ser Ile Asp Met Asn ValLeu Ala Lys Ile Asn Asn Ile Ala Asp Ile Asn Leu Ile Tyr Pro Glu Thr Thr LeuThr Val Thr Tyr Asp Gln Lys Ser His Thr Ala Thr Ser Met Lys Ile Glu Thr ProAla Thr Asn Ala Ala Gly Gln Thr Thr Ala Thr Val Asp Leu Lys Thr Asn Gln ValSer Val Ala Asp Gln Lys Val Ser Leu Asn Thr Ile Ser Glu Gly Met Thr Pro GluAla Ala Thr Thr Ile Val Ser Pro Met Lys Thr Tyr Ser Ser Ala Pro Ala Leu LysSer Lys Glu Val Leu Ala Gln Gly Gln Ala Val Ser Gln Ala Ala Ala Asn Glu GlnVal Ser Pro Ala Pro Val Lys Ser Ile Thr Ser Glu Val Pro Ala Ala Lys Glu GluVal Lys Pro Thr Gln Thr Ser Val Ser Gln Ser Thr Thr Val Ser Pro Ala Ser ValAla Ala Glu Thr Pro Ala Pro Val Ala Lys Val Ala Pro Val Arg Thr Val Ala AlaPro Arg Val Ala Ser Val Lys Val Val Thr Pro Lys Val Glu Thr Gly Ala Ser ProGlu His Val Ser Ala Pro Ala Val Pro Val Thr Thr Thr Ser Thr Ala Thr Asp SerLys Leu Gln Ala Thr Glu Val Lys Ser Val Pro Val Ala Gln Lys Ala Pro Thr AlaThr Pro Val Ala Gln Pro Ala Ser Thr Thr Asn Ala Val Ala Ala His Pro Glu AsnAla Arg Leu Gln Pro His Val Ala Ala Tyr Lys Glu Lys Val Ala Ser Thr Tyr GlyVal Asn Glu Phe Ser Thr Tyr Arg Ala Gly Asp Pro Gly Asp His Gly Lys Gly LeuAla Val Asp Phe Ile Val Gly Lys Asn Gln Ala Leu Gly Asn Glu Val Ala Gln TyrSer Thr Gln Asn Met Ala Ala Asn Asn Ile Ser Tyr Val Ile Trp Gln Gln Lys PheTyr Ser Asn Thr Asn Ser Ile Tyr Gly Pro Ala Asn Thr Trp Asn Ala Met Pro AspArg Gly Gly Val Thr Ala Asn His Tyr Asp His Val His Val Ser Phe Asn。

1.2蛋白表达

将阳性的重组菌化冻后，取10μL接种至10mL液体LB培养基(含有终浓度为100μg/mL的Amp)中，摇床设置37℃、250rpm连续培养6h。按1:100接种至新的液体LB中，之后将摇床温度设置为16℃，待降温后再向液体LB中加入IPTG(终浓度为0.3mM)过夜诱导培养。将上述诱导培养后的菌液倒入收菌瓶离心收集菌体。用蛋白缓冲液(50mM Tris pH 8.0、300mMNaCl)轻轻润洗菌体沉淀，弃去上清后，加入50mL预冷过的蛋白缓冲液重悬菌体，并加入2mM的β-ME和1‰的Tween-20混匀后转移至破碎杯中。将破碎杯放在冰水混合物中，利用超声破碎仪超声破碎，超声功率40-50％，开2s，间隔6s，每次15min，破碎第一次后混匀菌液，再破碎一次，使菌体充分破碎。超声破碎结束后，18000g离心收集上清液，并上样于镍柱中，控制变速阀6s/滴，使目的蛋白充分与镍结合，从而留在镍柱上。为了除去非特异性结合的蛋白，先用150mL的蛋白缓冲液过柱洗脱，随后控制变速阀6s/滴，用不同浓度(20mM-300mM)咪唑溶液进行梯度洗脱。收集洗脱液，并用考马斯亮蓝显色检测蛋白是否洗脱完全，用300mM咪唑洗脱液洗脱目的蛋白。

重组蛋白的表达及纯化结果：经过菌体破碎、蛋白纯化等步骤。收集每步样品后SDS-PAGE分析，结果如图2所示，SIP重组蛋白主要存在大肠杆菌破碎后的上清液中。用20mM、40mM、100mM、300mM的咪唑梯度溶液洗脱蛋白，得到蛋白大小为70kDa。透析酶切后，收集上样流穿液、10mM洗脱目的蛋白，得到与预测结果(48.64kDa)大小相近的蛋白(50kDa)(图2泳道3和4)。

1.3纳米疫苗制备

(1)制备MSN纳米颗粒；

圆底烧瓶中加入0.961g CTATOS、0.14mL TEA、50mL H₂O，混匀；置于油浴锅上80℃搅拌1h；待溶液为澄清透亮后，快速加入2mL TEOS(98％)；80℃反应2h后，从油浴锅中取出；加入适量无水乙醇，离心后弃去上清；收集到的沉淀，用纯水清洗3遍；沉淀用6g/L的NH₃NO₃/甲醇重悬后，置于油浴锅上60℃萃取时间≥12h；每次萃取结束后，纯水清洗3遍；共萃取3次；沉淀经常温干燥后即为所述MSN纳米颗粒。

(2)制备SIP-MSN纳米颗粒：将MSN纳米颗粒分散于纯水中，形成MSN纳米颗粒悬浊液。将制备好的MSN纳米颗粒悬浊液混匀后，吸取1mL加入1.5mL的离心管中，放在真空干燥箱中，过夜烘干至水分完全蒸发，称量管中MSN的重量，计算MSN纳米颗粒悬浊液的浓度；

将1.2制备得到的SIP重组蛋白稀释成8个不同浓度的溶液分装在离心管中，每管加入MSN纳米颗粒悬浊液，且使每管中MSN纳米颗粒达1mg；接着，混合均匀后放在多用途旋转摇床上，并在冷室(4℃)混合过夜(10-12h)；之后离心，回收沉淀，沉淀经冷冻干燥后即得所述SIP-MSN纳米颗粒，并检测上清蛋白浓度，并计算蛋白的负载量和负载率。

(3)制备罗非鱼口服纳米疫苗：通过改变试验条件和引入不同试剂来制备肠溶SIP-MSN@HP55纳米颗粒，即罗非鱼口服纳米疫苗；将步骤(2)所得的SIP-MSN纳米颗粒重悬在水中，得SIP-MSN纳米颗粒悬浊液；接着，在SIP-MSN纳米颗粒悬浊液中，加入1μL PEG400作为蛋白保护剂后，再加入50μL司班80作为乳化剂，加入2.5mL二氯甲烷与2.5mL乙酸乙酯，混匀。在细胞破碎仪(功率：20％)中超声乳化后，迅速倒入50mL 0.1％PVA中。超声清洗仪超声3min乳化后，迅速转移倒入另一50mL 0.1％的PVA中，将烧杯放在磁力搅拌机匀速搅拌，在溶液中滴加0.5％HP55，搅拌至有机溶剂挥发。离心收集沉淀，产物用去离子水洗2遍。

(4)免疫型罗非鱼饲料的制备：

接着将粘合剂(本发明所用的粘合剂为广州精博生物技术有限公司生产的强力粘合剂)与罗非鱼普通饲料按照重量比为1:1000搅拌混匀；然后将SIP-MSN@HP55纳米颗粒悬浊液均匀的喷洒在罗非鱼饲料表面再搅拌均匀，其中，每20g罗非鱼饲料喷洒1mL SIP-MSN@HP55纳米颗粒悬浊液，再在-30℃下真空冷冻干燥后，将附有SIP-MSN@HP55纳米颗粒的饲料放入壳聚糖溶液(0.5％壳聚糖、2.5％柠檬酸三乙酯、5％乙酸)中适当浸润后，摘迅速转移至纯水中浸润，排除多余的水后，低温冷冻干燥，即得所述免疫型罗非鱼饲料，所得的免疫型罗非鱼饲料于-80℃储存备用。

各纳米颗粒的透射电镜结果如图3所示：由图3A可见，MSN纳米颗粒具有均一的圆形形状，延伸出的介孔臂间形成了许多孔隙，粒径为71.67±8.33nm。图3B为SIP-MSN纳米颗粒的透射电镜图。从图中得出圆形的纳米粒表面已看不到延伸出的介孔臂，MSN的孔隙被SIP蛋白填充，粒径为76.76±10.09nm。图3C为包裹了HP55的SIP-MSN@HP55纳米颗粒的透射电镜照片，透射电镜图显示HP55将SIP-MSN完整包封，但是包封的纳米疫苗颗粒数量不同，纳米颗粒SIP-MSN@HP55的大小不均一。

步骤(2)中对SIP-MSN纳米颗粒蛋白的负载量和负载率进行计算得：1mg MSN与0.9mg/mL的蛋白混合负载时，能达到最大的负载量0.281mg/mL，此时负载率为21.9％。较高的蛋白负载率可减少MSN纳米颗粒的用量同时保持高浓度的保护性抗原，减少其对鱼类机体细胞的毒性和刺激作用。

1.4罗非鱼血清抗体水平检测

用包被缓冲液将SIP重组蛋白稀释至20μg/μL作为抗原，每孔50μL包被在酶标板中，4℃过夜。甩板弃去孔中液体，用150μL PBST洗涤实验孔3次。每孔加入100μL封闭液(2％牛血清蛋白的PBST缓冲液)，37℃条件下进行封闭，封闭时间为1.5h。甩板弃去孔中液体后用150μL PBST洗涤实验孔3次。每孔加入50μL以1:25、1:50、1:100、1:200、1:400稀释(稀释液是PBST缓冲液配置的1％牛血清蛋白)的免疫后罗非鱼血清，37℃作用1h，设置未免疫罗非鱼的血清为阴性对照，PBS为空白对照。每孔加入50μL的1:200稀释的鼠多抗(稀释液是PBST缓冲液配制的1％牛血清蛋白)，37℃作用1.5h。每孔再加入50μL 1:10000稀释的羊抗鼠IgG(稀释液是PBST缓冲液配制的1％牛血清蛋白)，37℃下作用1.5h。每孔加入50μL OPD液显色，静置15min之后向每孔中加入30μL 2M H₂SO₄终止反应。用酶标仪检测492nm处的OD值。

罗非鱼血清抗体水平检测结果如下：

采集第二次免疫一周后和两周后(首免后21d、28d)试验组罗非鱼血清，ELISA法测定罗非鱼血清中抗体效价。如图4，第二次免疫一周后(首免后21d)能在各组血清中检测到不同的抗体水平，28d时各组抗体水平均下降。SIP-MSN@HP55组能产生相应抗体，并显著高于SIP组(P<0.05)。21d时SIP-MSN@HP55组的抗体效价为1:200。第二次免疫两周后(首免后28d)，各组的抗体水平下降，但SIP-MSN@HP55组仍然能检测到抗体水平。

1.5攻毒保护试验

将稳定健康的罗非鱼随机分为8组，第一组为SIP组，在第一周和第三周分别投喂SIP重组蛋白与基础饲料的拌料。第二组、第三组和第四组为SIP-MSN@HP55组，在第一周和第三周分别投喂SIP-MSN@HP55与基础饲料的拌料。第五组、第六组、第七组为仅攻毒组(Challenge组)(将设置3个攻毒浓度)，投喂基础饲料。第八组为空白对照组(Control组)，投喂基础饲料。其余时间均投喂基础饲料。

首次，免疫后第28天，根据预攻毒结果，设置3组不同剂量的攻毒，第一组、第二组、第五组每尾注射0.2mL浓度为1.5×10⁶CFU/mL无乳链球菌。第三组、第六组每尾注射0.2mL浓度为1.18×10⁶CFU/mL无乳链球菌。第四组、第七组每尾注射0.2mL浓度为0.88×10⁶CFU/mL无乳链球菌。Control组仅投喂基础饲料，再不做任何处理。观察14天内的罗非鱼存活情况，每日记录试验鱼的健康及存活情况，并计算各组相对免疫保护率(relative percentsurvival，RPS)。相对免疫保护率(RPS)计算公式：RPS＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。

罗非鱼攻毒保护试验结果：对试验组的罗非鱼进行攻毒后，观察各组罗非鱼健康状态及存活情况。罗非鱼在死亡前一天出现不规则游动、不进食，身体发黑等体表症状。死亡后的罗非鱼躯体弯曲，眼球浑浊，解剖后内脏有不同程度的糜烂。14天后罗非鱼存活率见图5。攻毒剂量为0.2mL(浓度1.5×10⁶CFU/mL)无乳链球菌活菌的组，第1天未见死亡，第2天各组罗非鱼开始大量死亡，3天后罗非鱼稳定。SIP-MSN@HP55组的罗非鱼存活率(65％)远高于SIP组的存活率(5％)。而SIP组和1.5×10⁶CFU/Challenge组的存活率(4.5％)很接近。第三组和第四组每尾罗非鱼分别腹腔注射0.2mL(浓度分别为1.18×10⁶CFU/mL和0.88×10⁶CFU/mL)无乳链球菌。1.18×10⁶CFU组在攻毒后第3天开始出现死亡，0.88×10⁶CFU组在攻毒后第4天开始出现死亡，第7天后罗非鱼未见死亡。计算各组相对保护率RPS。结果得出：1.5×10⁶CFU/SIP组的RPS为0.52％，1.5×10⁶CFU/SIP-MSN@HP55组、1.18×10⁶CFU/SIP-MSN@HP55组、0.88×10⁶CFU/SIP-MSN@HP55组的RPS分别为63.33％、64.23％、76.31％。可见罗非鱼口服纳米疫苗SIP-MSN@HP55相对于SIP蛋白具有更高的保护率。

需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 福建师范大学

<120> 一种无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白及其制备方法与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1302

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaaatga ataaaaaggt actattgaca tcgacaatgg cagcttcgct attatcagtc 60

gcaagtgttc aagcacaaga aacagatacg acgtggacag cacgtactgt ttcagaggta 120

aaggctgatt tggtaaagca agacaataaa tcatcatata ctgtgaaata tggtgataca 180

ctaagcgtta tttcagaagc aatgtcaatt gatatgaatg tcttagcaaa aattaataac 240

attgcagata tcaatcttat ttatcctgag acaacactga cagtaactta cgatcagaag 300

agtcatactg ccacttcaat gaaaatagaa acaccagcaa caaatgctgc tggtcaaaca 360

acagctactg tcgatttgaa aaccaatcaa gtttctgttg cagaccaaaa agtttctctc 420

aatacaattt cggaaggtat gacaccagaa gcagcaacaa cgattgtttc gccaatgaag 480

acatattctt ctgcgccagc tttgaaatca aaagaagtat tagcacaagg gcaagctgtt 540

agtcaagcag cagctaatga acaggtatca ccagctcctg tgaagtcgat tacttcagaa 600

gttccagcag ctaaagagga agttaaacca actcagacgt cagtcagtca gtcaacaaca 660

gtatcaccag cttctgttgc cgctgaaaca ccagctccag tagctaaagt agcaccggta 720

agaactgtag cagcccctag agtggcaagt gttaaagtag tcactcctaa agtagaaact 780

ggtgcatcac cagagcatgt atcagctcca gcagttcctg tgactacgac ttcaacagct 840

acagacagta agttacaagc gactgaagtt aagagcgttc cggtagcaca aaaagctcca 900

acagcaacac cggtagcaca accagcttca acaacaaatg cagtagctgc acatcctgaa 960

aatgcaaggc tccaacctca tgttgcagct tataaagaaa aagtagcgtc aacttatgga 1020

gttaatgaat tcagtacata ccgtgcggga gatccaggtg atcatggtaa aggtttagca 1080

gttgacttta ttgtaggtaa aaaccaagca cttggtaacg aagttgcaca gtactctaca 1140

caaaatatgg cagcaaataa catttcatat gttatctggc aacaaaagtt ttactcaaat 1200

acaaatagta tttatggacc tgctaatact tggaatgcaa tgccagatcg tggtggcgtt 1260

actgccaacc actatgacca cgttcacgta tcctttaact aa 1302

<210> 2

<211> 433

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Met Asn Lys Lys Val Leu Leu Thr Ser Thr Met Ala Ala Ser

1 5 10 15

Leu Leu Ser Val Ala Ser Val Gln Ala Gln Glu Thr Asp Thr Thr Trp

20 25 30

Thr Ala Arg Thr Val Ser Glu Val Lys Ala Asp Leu Val Lys Gln Asp

35 40 45

Asn Lys Ser Ser Tyr Thr Val Lys Tyr Gly Asp Thr Leu Ser Val Ile

50 55 60

Ser Glu Ala Met Ser Ile Asp Met Asn Val Leu Ala Lys Ile Asn Asn

65 70 75 80

Ile Ala Asp Ile Asn Leu Ile Tyr Pro Glu Thr Thr Leu Thr Val Thr

85 90 95

Tyr Asp Gln Lys Ser His Thr Ala Thr Ser Met Lys Ile Glu Thr Pro

100 105 110

Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Thr Thr Ala Thr Val Asp Leu Lys Thr

115 120 125

Asn Gln Val Ser Val Ala Asp Gln Lys Val Ser Leu Asn Thr Ile Ser

130 135 140

Glu Gly Met Thr Pro Glu Ala Ala Thr Thr Ile Val Ser Pro Met Lys

145 150 155 160

Thr Tyr Ser Ser Ala Pro Ala Leu Lys Ser Lys Glu Val Leu Ala Gln

165 170 175

Gly Gln Ala Val Ser Gln Ala Ala Ala Asn Glu Gln Val Ser Pro Ala

180 185 190

Pro Val Lys Ser Ile Thr Ser Glu Val Pro Ala Ala Lys Glu Glu Val

195 200 205

Lys Pro Thr Gln Thr Ser Val Ser Gln Ser Thr Thr Val Ser Pro Ala

210 215 220

Ser Val Ala Ala Glu Thr Pro Ala Pro Val Ala Lys Val Ala Pro Val

225 230 235 240

Arg Thr Val Ala Ala Pro Arg Val Ala Ser Val Lys Val Val Thr Pro

245 250 255

Lys Val Glu Thr Gly Ala Ser Pro Glu His Val Ser Ala Pro Ala Val

260 265 270

Pro Val Thr Thr Thr Ser Thr Ala Thr Asp Ser Lys Leu Gln Ala Thr

275 280 285

Glu Val Lys Ser Val Pro Val Ala Gln Lys Ala Pro Thr Ala Thr Pro

290 295 300

Val Ala Gln Pro Ala Ser Thr Thr Asn Ala Val Ala Ala His Pro Glu

305 310 315 320

Asn Ala Arg Leu Gln Pro His Val Ala Ala Tyr Lys Glu Lys Val Ala

325 330 335

Ser Thr Tyr Gly Val Asn Glu Phe Ser Thr Tyr Arg Ala Gly Asp Pro

340 345 350

Gly Asp His Gly Lys Gly Leu Ala Val Asp Phe Ile Val Gly Lys Asn

355 360 365

Gln Ala Leu Gly Asn Glu Val Ala Gln Tyr Ser Thr Gln Asn Met Ala

370 375 380

Ala Asn Asn Ile Ser Tyr Val Ile Trp Gln Gln Lys Phe Tyr Ser Asn

385 390 395 400

Thr Asn Ser Ile Tyr Gly Pro Ala Asn Thr Trp Asn Ala Met Pro Asp

405 410 415

Arg Gly Gly Val Thr Ala Asn His Tyr Asp His Val His Val Ser Phe

420 425 430

Asn

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatccatgg aaatgaataa aaagg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgagttag ttaaaggata cgtga 25

Claims

1.一种无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白的编码基因，其特征在于：所述编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种包含权利要求2所述编码基因的表达载体。

4.由权利要求3所述的表达载体转化的宿主细胞。

5.如权利要求1所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白的制备方法，其特征在于：

将权利要求1所述的重组蛋白的编码基因构建到表达载体上，获得重组表达载体；将重组表达载体转化宿主细胞，培养转化的宿主细胞，使转化的宿主细胞表达产生所述无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白，之后回收并纯化所表达的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白；

所述编码基因是以罗非鱼链球菌SIP蛋白基因序列为模板、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4为引物进行PCR扩增得到的。

6.如权利要求1所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白在制备罗非鱼抗无乳链球菌感染的疫苗中的应用。

7.一种罗非鱼口服纳米疫苗，其特征在于：它是以权利要求1所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白作为抗原。

8.如权利要求7所述的罗非鱼口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)制备MSN纳米颗粒；

9.根据权利要求8所述的罗非鱼口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(2)的具体操作方法为：将步骤(1)所得的MSN纳米颗粒重悬在水中，形成MSN纳米颗粒悬浊液；接着在权利要求1所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白的溶液中加入一定体积的MSN纳米颗粒悬浊液，使得加入的MSN纳米颗粒达到1mg，混合均匀后，再放在多用途旋转摇床上，并在控温为4-8℃的冷室混合10-12h；之后离心，回收沉淀，沉淀经冷冻干燥后即得所述SIP-MSN纳米颗粒，并检测离心所得的上清蛋白浓度，计算蛋白的负载量和负载率。

10.根据权利要求8所述的罗非鱼口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)的具体操作方法为：将步骤(2)所得的SIP-MSN纳米颗粒重悬在水中，得SIP-MSN纳米颗粒悬浊液；接着在SIP-MSN纳米颗粒悬浊液中，加入PEG400作为蛋白保护剂后，再加入司班80作为乳化剂，加入二氯甲烷、乙酸乙酯，混匀；接着，在细胞破碎仪中超声乳化后，迅速倒入0.1％PVA中，超声清洗仪超声3min乳化后，再迅速转移倒入另一0.1％PVA中，将烧杯放在磁力搅拌机匀速搅拌，在溶液中滴加0.5％HP55，搅拌至有机溶剂挥发；离心收集沉淀，产物用去离子水洗2遍。