CN101332304A - 一种空肠弯曲菌壳聚糖纳米dna疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗，及其制备和应用。所说的空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗，是壳聚糖和重组质粒构成的纳米微囊，所说的重组质粒是由空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA和真核表达载体pCAGGS组成的pCAGGS－flaA，所述的鞭毛蛋白flaA基因具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列。其是将构建好的重组质粒DNA溶于壳聚糖溶液中制得。该疫苗还能用于制备预防鸡空肠弯曲菌的药物。本发明疫苗经试验表明，可激发产生特异性体液和局部的黏膜免疫应答，口服攻毒后，泄殖腔排菌率呈现显著下降趋势，并能减少血液和小肠、大肠、盲肠中空肠弯曲菌数量。

Description

一种空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及重组质粒、纳米-质粒纳米颗粒的制备和应用，特别是涉及一种空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗，以及质粒-壳聚糖纳米颗粒制备和应用。

技术背景

自1990年偶然发现质粒DNA在肌肉细胞中能进行转化和表达，并推测用DNA注入机体可能产生免疫反应以来，全世界范围内迅速掀起了一股DNA疫苗研究热。DNA疫苗能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，兼有减毒活疫苗的有效性和亚单位疫苗的安全性，可以非常容易操作质粒DNA以改变免疫反应的质和量，并具有简单、经济、易于储存运输等优点，被认为是第三代疫苗。1995年5月，报导了世界第一例DNA疫苗的临床试验，世界卫生组织(WHO)把DNA疫苗纳入WHO全球免疫研制开发计划之中。

DNA疫苗虽然有诸多优点，但也有许多需要优化的地方。如核酸疫苗的免疫剂量问题仍然困扰着人们；DNA疫苗免疫原性弱，不如一般传统疫苗和减毒活疫苗引起的免疫反应强等，成为阻止DNA疫苗应用于临床的障碍。如何提高DNA疫苗的免疫原性，尤其是在人和动物体内诱导免疫反应的能力，在很大程度上决定着DNA疫苗未来的命运。

DNA疫苗新技术的核心之一是将编码抗原的核酸序列组装到含有必要表达调控元件的真核表达载体中构建核酸疫苗，然后将其导入动物体内，重组的核酸疫苗可以利用动物体内的酶系合成外源基因编码的蛋白，从而诱发动物对该外源蛋白产生免疫应答，达到免疫目的。

DNA疫苗的免疫效果是由质粒、佐剂的使用、免疫方案以及免疫接种的操作技术等因素决定的。质粒的因素又包括载体和抗原基因两个方面，一般认为，免疫反应的强度与质粒转染效果和基因表达效率两个因素正相关。不同的疾病对保护性免疫有着不同的要求，是以体液免疫为主还是以细胞免疫为主，增强DNA疫苗免疫效应的策略必须反映这些要求。

为了解决DNA疫苗免疫原性弱的问题，许多科学家正致力于研究提高DNA疫苗免疫原性的方法，其中一个重要的方面就是改进载体以提高抗原的表达，提高载体的靶向性和研究更高效的辅助分子包括细胞因子及其他免疫佐剂。

壳聚糖微囊是一种具有广阔前景的新型药物载体，具有无毒、生物相容性高、生物可降解、可控制药物的释放、提高药物生物利用度以及增加药物局部滞留性等优点。1995年，Munper等人首次报道壳聚糖溶液与DNA以自聚集的方式沉淀能得到一种大小为150～500nm的复合物，初步认为壳聚糖有用于基因治疗载体的潜质。近年来，许多研究表明壳聚糖能和DNA形成微囊，可以用做基因转运系统来转运治疗性基因和基因疫苗。Roy等人的研究证明壳聚糖-DNA纳米微囊系统能有效地在小鼠小肠释放DNA，诱发有效的粘膜免疫保护反应。因此，壳聚糖是发展DNA疫苗的一个有广阔应用前景的介质。

空肠弯曲菌是G^-菌，是引起人肠炎的首要病原菌，与人神经炎病变关系密切。空肠弯曲菌能定殖于大多数温血动物的肠黏膜，几乎包括所有的食物源性动物和人类，尤其是在野鸟、雏鸡、火鸡、鹌鹑、鸭和驼鸟等几乎所有禽的肠道，而且空肠弯曲菌在禽肠道的定殖是共栖关系，禽肉加工过程中交叉污染，并通过食物链感染人是公认的途径。减少/消灭食品链尤其是禽类中空肠弯曲菌是控制该菌的主要策略，控制或清除禽类弯曲菌是预防和控制人空肠弯曲菌病的重要前提。

多种措施被应用于减少禽的污染率，包括通过采取生物安全措施、建立健康动物群和提高净化饲养环境卫生等，另外，很多实验性研究也相继开展，如肠道菌群的竞争性抑制、抗菌性微生物或抗生素治疗等，尽管这些方法很有效，但存在耐药性等很多缺点。疫苗仍被认为是控制和减少禽弯曲菌最有效、安全的方法，由于空肠弯曲菌生态和生理特征，包括灭活苗在内的多种常规疫苗对控制鸡空肠弯曲菌的作用较差，不能满足国内外养禽业对高效、安全可靠、有预防作用的鸡空肠弯曲菌疫苗的迫切需求。分子生物学和疫苗设计的发展为鸡空肠弯曲菌防治提供了新思路。

发明内容

本发明目的在于克服现有传统接种空肠弯曲菌灭活菌或裸DNA疫苗作为预防疫苗，产生的抗体滴度低、免疫效果差、易产生免疫逃避、仅有较弱的预防作用等缺陷，从而提供一种能有效降低鸡体内空肠弯曲菌携带量的壳聚糖纳米DNA疫苗。

本发明的另一目的是提供该壳聚糖纳米DNA疫苗的制备。

本发明的再一目的是提供该壳聚糖纳米DNA疫苗的用途。

本发明的目的是由如下的技术方案实现的：一种空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗，是壳聚糖和重组质粒构成的纳米微囊，其中，所说的重组质粒是由空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA和真核表达载体pCAGGS组成的pCAGGS-flaA，所述的鞭毛蛋白flaA基因具有SEQNO.1所示的核苷酸序列。前述的鞭毛蛋白flaA基因是空肠弯曲菌的致病决定基因，其为弯曲菌基因组的核苷酸，应用现代纳米技术研制而成壳聚糖-重组的纳米颗粒，用做基因转运系统来转运基因疫苗。

本发明提供的所述空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗的制备，包括如下步骤：

1)设计特异性引物：根据GenBank登陆序列(gi：30407139)，利用DNAstar软件分析，选取空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA的核苷酸序列，按正确的阅读顺序设计一对引物：

上游引物：FlaA-F 5′-CATCTAGAAGCATTTAACAAGTTCATGG-3′(Xba I)

下游引物：FlaA-R 5′-TAGAATTCGTGTTTATCCTAAAACCCAT-3′(EcoR I)

2)通过PCR技术扩增空肠弯曲菌鞭毛蛋白flaA基因，克隆、回收得到纯化的flaA基因片段；

3)将flaA基因重组到质粒pCAGGS真核表达质粒中，构建成重组质粒pCAGGS-flaA；

4)将构建好的重组质粒pCAGGS-flaA溶于壳聚糖溶液中，制成一种空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗。

本发明进一步提供了空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗在制备用于预防鸡空肠弯曲菌的药物中的应用。

本发明提供的空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗优益之处在于：1)所需的免疫量较小，50-100微克即可；2)核酸疫苗能同时高效激发体液免疫和细胞免疫；3)口服攻毒后，泄殖腔排菌率呈现显著下降趋势，并能减少血液和小肠、大肠、盲肠中空肠弯曲菌数量；4)免疫过程安全、长效(免疫能力有长时间的记忆)、稳定、操作便捷。

附图说明

图1重组质粒pCAGGS-flaA的构建示意图

图2壳聚糖/质粒纳米颗粒的电泳检测，其中M.DNA Marker，1.CS-pCAGGS-flaA，2.pCAGGS-flaA

图3壳聚糖-质粒纳米颗粒的电镜观察(×46 000)

具体实施方式

本发明实施中使用的白莱航鸡(White Leghorn)非免疫蛋(受精)购自扬州大学比较医学中心，置孵化箱中自行孵化，去除弱雏、病雏等不健康鸡，备用。

空肠弯曲菌：(ATCC33560，购自天恒科技有限公司)

T easy vector：(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)

真核表达载体pCAGGS：(Miyazaki J.馈赠，见参考文献)

大肠杆菌DH5α感受态细胞：(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)

COS-7细胞：(购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)

实施例1.本发明的空肠弯曲菌DNA疫苗--pCAGGS-flaA DNA疫苗的构建

本发明的pCAGGS-flaA DNA疫苗的构建步骤如下：

①空肠弯曲菌基因组模板的提取

取空肠弯曲菌纯培养物菌液0.5ml，8000rpm离心5min弃上清，加入100μl超纯水，用移液器将其混合均匀，隔水煮沸20min，取出立即置于冰上，8000rpm离心5min，取上清置于-20℃冰箱中备用。

②设计特异性引物：根据GenBank登陆序列(gi：30407139)，利用DNAstar软件分析，选取空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA的核苷酸序列，按正确的阅读顺序设计合成引物，在引物的5′端加有酶切位点和保护性碱基。其中上游引物中包含起始密码子(ATG)及真核表达所必需的Kozak转译起始序列。

上游引物：FlaA-F 5′-CATCTAGAAGCATTTAACAAGTTCATGG-3′(Xba I)

下游引物：FlaA-R 5′-TAGAATTCGTGTTTATCCTAAAACCCAT-3′(EcoR I)

③空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA的PCR扩增

PCR的总反应体系为50μl，分别在灭菌的0.5mL PCR薄壁管中依次加入：

10×Pyrobest buffer(with 15mM MgCl2) 5μl

dNTPs(10mM each)                     1μl

上游引物-F(75pm)                     3μl

下游引物-R(75pm)                     3μl

基因组DNA                            4μl

Pyrobest DNA Polymerase              0.25μl(1.25U)

灭菌超纯水                           33.75μl

在PCR仪上运行如下程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，32个循环，72℃延伸5min，4℃保存。

④PCR产物的克隆、鉴定和序列测定

用捷瑞生物的Genclean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR扩增片段，与

Teasy vector连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经酶切鉴定，大连宝生物工程有限公司测序。得到阳性重组质粒pT-flaA。

⑤pCAGGS-flaA DNA疫苗的构建

真核表达载体pCAGGS和质粒pT-flaA分别用EcoR I和Xba I酶切产物经电泳后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收酶切后的pCAGGS和flaA片段，最后用15μL的灭菌超纯水洗脱。T4 DNA连接酶连接这两个片段，4℃连接过夜，转化连接产物到DH5α感受态细胞，涂布到Amp抗性(100ug/ml)的LB琼脂板上，37℃培养16h-20h。挑取菌落接种LB肉汤(Amp⁺)，振荡培养，提取质粒，再用EcoR I和Xba I酶切鉴定，得到构建的重组质粒pCAGGS-flaA(图1)。

实施例2.pCAGGS-flaA DNA疫苗外源flaA基因体外瞬时表达鉴定

建立COS-7细胞体外瞬时表达系统，将实施例1中构建的真核表达质粒pCAGGS-flaA用QIAfilter plasmid midi kit小量制备，经脂质体转染到培养在24孔板的COS-7细胞中，以形成DNA-脂质体复合物；48h后，通过间接免疫荧光试验检测flaA基因的表达。将转染细胞用PBS洗涤3次，自然晾干后，加-20℃预冷的无水甲醇置固定5min，弃去固定液，PBS洗涤3次。加入800μL 1∶400稀释的鸡抗空肠弯曲菌多抗血清，37℃培养箱中孵育60min，PBS洗涤3次，加入800μL 1∶160稀释的FITC标记的兔抗鸡荧光二抗，37℃培养箱中孵育40min，用PBS洗涤3次，荧光显微镜观察结果。结果表明，重组质粒pCAGGS-flaA转染COS-7后48h，能在COS-7细胞中检测到基因的表达，蛋白水平的表达量显著高于对照组(空质粒)。

实施例3.壳聚糖-质粒纳米颗粒的制备

壳聚糖(Chitosan，以下简称CS)购自浙江金壳生物化学有限公司，批号D070831151，黄色粉末，分子量201Kda，脱乙酰度87％，粘度20mpa.s。称取壳聚糖200mg加入800μl的乙酸，然后加SW至5mL，37℃ 180r/min摇荡过夜使甲壳糖(购自浙江金壳生物化学有限公司)完全溶解，次日加水至480mL后用NaOH调节pH为5.5，最后定容500mL，真空过滤(0.22μm滤膜)除菌得a液。

将构建好的pCAGGS-flaADNA疫苗溶于无菌的5mmoL/L Na₂SO4溶液中至300μg/mL得b液。

将等量的a液和b液分别加热至55℃10～15min，按1∶1混合均匀，摇动30S即可得到壳聚糖包被的质粒DNA的免疫微囊，用相差显微镜观察有无颗粒形成。将上述制备好的悬浮液室温下放置1h后，6000r/min离心35min，然后小心去除95％的上清液，再用无菌水稀释即可得到壳聚糖-质粒纳米颗粒(以下简称为CS-pCAGGS-fla A)。

实施例4.壳聚糖-质粒纳米疫苗颗粒的鉴定

①1％琼脂糖电泳鉴定

用壳聚糖包裹空肠弯曲菌DNA疫苗质粒pCAGGS-flaA后(以下简称CS-pCAGGS-flaA)。为检测包裹效果，经1％(质量分数)琼脂糖电泳检测(图2)，在裸质粒泳道，质粒显示出明显的条带，而由于包裹颗粒较大而存留在加样孔中，在壳聚糖/质粒包裹组泳道上看不出条带，说明壳聚糖已经包裹了质粒。

②透射电子显微镜观察

利用透射电子显微镜观察包裹后颗粒的大小及包裹状态(图3)。在扫描电子显微镜放大46,000倍下，观察到壳聚糖已将质粒包裹形成直径100nm左右的圆球形颗粒。

③包裹率

将质粒进行适当的倍比稀释，调整浓度至0.3-0.4mg/ml，然后与壳聚糖等比例混合。经微量分光光度计测定制备前质粒浓度为0.32mg/ml(包裹前总的DNA)，包裹后经离心分层后取上清液再次测定0.026mg/ml(未被包裹的DNA)，经计算包裹率达91.9％。

实施例5.运送空肠弯曲菌flaA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的安全性评估

对于免疫鸡的安全性检测：检测不同剂量(50μg-300μg)CS-pCAGGS-flaA疫苗免疫90只白莱航鸡，120天后无一只死亡；进行不同剂量CS-pCAGGS-flaA疫苗注射鸡后的毒理性和常规生理指标的观察测定，利用组织化学方法确定注射疫苗后鸡组织病理变化，将相应组织器官进行冰冻切片，在显微镜下观察，没有发现鸡组织有病理变化。

实施例6.运送空肠弯曲菌flaA基因壳聚糖纳米DNA疫苗体内免疫反应的检测

将白莱航鸡随机分为3组，每组30只；一组为实验组，对实验鸡滴鼻免疫实施例3中制备的纳米DNA疫苗100μg(pCAGGS-flaA的含量)；另二组为对照组，分别对实验鸡滴鼻免疫100μg纳米pCAGGS空质粒和生理盐水。试验过程如下：共进行3次免疫，在1日龄时首免，免疫间隔2周；各组在首免后第28和42天分别采血、取脾脏，分别测定血清、黏膜抗体、鸡脾脏IL-4和IFN-γ及T细胞亚群。

①血清抗体、肠道黏膜抗体sIgA测定

血清抗体测定：各免疫组在首免后第28和42天分别取三只试验鸡血，自然凝固后，3500rpm离心20min取上清，-20℃保存备用；

肠道黏膜抗体sIgA测定：各免疫组在首免后第28和42天分别每组剖杀三只试验鸡，制备肠道黏膜样品：采集完整的小肠，去除多余的脂肪，于5ml PBS(含100μg/ml PMSF)中用剪刀将肠道剖开，剪成1cm小段，置于100ml瓶中剧烈摇振5min，4℃ 8000rpm离心20min取上清，-20℃保存备用。

以ALM-80分离株作包被原，采用ELISA方法检测二免、三免后2周免疫组诱导鸡的血清抗体和肠道黏膜抗体(如表1)。从抗体产生情况看，免疫于二免14天均能检测到特异性抗体，但抗体滴度较低；三免后14天抗体水平上升明显，且与对照组具有显著性差异(P＜0.01)

表1疫苗对免疫鸡的免疫原性试验结果

Table 1 The results of immunogenicity assay of C.jejuni vaccine in chickens

^*：差异显著。

②RT-PCR检测鸡脾脏细胞IL-4和IFN-γ

根据GenBank中已发表的鸡IL-4和IFN-γ基因的mRNA序列分别用Primer Premier 5.0软件辅助设计两对引物，扩增鸡IL-4和IFN-γ基因，预期扩增片段长度分别为236bp和281bp。

IL-4引物：

上游引物：5’-TGACATCCAGGGAGAGGTTT-3’

下游引物：5’-TCCATTGAAGTAGTGTTGCC-3’

IFN-γ引物：

上游引物：5’-ACGGTGGACCTATTATTGTA-3’

下游引物：5’-CTGTAAGATGCTGAAGAGTT-3’

无菌采集实验鸡的脾脏，加1ml PBS研磨后转移至1.5ml指形管中，4℃，300rpm离心2min，取上清，重复一次。细胞计数板计数，取5×10⁶的脾脏细胞4℃，1500rpm离心10min，沉淀悬于100μlPBS中，然后按RNAprep Tissue/Bacteria Kit试剂盒说明书上的操作步骤提取脾脏细胞总RNA，用30μl RNase-free ddH₂O溶解RNA。

分别采用IL-4、IFN-γ下游引物为反转录的引物，以mRNA为模板合成cDNA。

反转录：总反应体系25μL，DEPC处理过的PCR管中依次加入下列组分。42℃作用1.5h后94℃处理5min后至冰水中。反转录反应体系为25μL：

5×M-MLV buffer                5μl

M-MLV Reverse Transcriptase    0.1μl(20U)

dNTPs(2.5mM each)              1μl

Rnase抑制剂(HPR1)              0.1μl

IL-4下游(10μM)                1μl

IFN-γ下游(10μM)              1μl

RNA                            15μl

Rnase-free ddH₂O               1.8μl

PCR的反应体系为25μL：

10×PCR buffer                 2.5μl

dNTPs(10mM each)               0.2μl

上游引物(2.5Mm)                1μl

下游引物(2.5mM)                1μl

cDNA                           0.1ul

Taq DNA polymerase             0.15μl(0.75U)

SW                             17.5μl

PCR反应的循环参数：94℃预变性10min，94℃变性1min，58℃退火25s，72℃延伸20s，32个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。配制2.0％琼脂糖溶液，按0.3mg/L加溴化乙锭(EB)制胶，取8μl PCR产物点样，以DNA Marker作对照，60V电泳1.5h取出凝胶，在凝胶成像仪上观察结果。

二免、三免后2周，每组宰杀3只鸡，取鸡脾脏，经研磨后收集脾脏细胞、提取总RNA，RT-PCR测定IL-4、IFN-γ的表达。二免、三免后14天脾脏细胞IL-4的量强于对照组，且IL-4的量强于IFN-γ。表明疫苗免疫后能激发鸡机体产生免疫应答。

③鸡脾脏和盲肠扁桃体CD4⁺/CD8⁺分析

采取脾脏和盲肠扁桃体，研磨，300目过滤除去组织碎片，用PBS反复洗涤细胞悬液，计数，定量为1×10⁶/ml。取200μl细胞悬液，分别加入PE-CD8a和FITC-CD4抗体，4℃避光作用20min，1,500rpm离心5min，洗涤三次后，定容为200μl，上机FACSAria(分析软件为FACSDiva)流式细胞仪进行分析。

应用流式细胞仪测定二免、三免后2周各组鸡脾脏和盲肠扁桃体CD4⁺/CD8⁺细胞的数量变化。从检测情况看，二免和三免后14天脾脏细胞的CD4⁺/CD8⁺T细胞比值与对照组相比显著增加，CD4⁺细胞较CD8⁺显著增加；而盲肠扁桃体只在三免后14天CD4⁺/CD8⁺细胞比值与对照组相比显著增加。结果表明，CS-pCAGGS-fla A三免后导致脾脏和盲肠扁桃体CD4⁺/CD8⁺细胞数量比值的升高，CD4⁺细胞的数量高于CD8⁺细胞(表2)。

表2免疫鸡脾脏和盲肠扁桃体CD4⁺/CD8⁺测定结果

Table 2 Ratio of CD4⁺/CD8⁺T cells assay in spleen and cecal tonsil of immunized chickens

^*：差异显著。

实施例7.运送空肠弯曲菌flaA基因壳聚糖纳米DNA疫苗在鸡群中实际预防的实验

1日龄白莱航鸡90只，雌雄兼有的雏鸡随机分为3组，每组30只。攻毒用菌株ALM-80为鸡地方分离株。三免后二周，以口服途径攻毒，口服前需禁食、禁水3h，每只灌服100μl4％碳酸氢钠，0.5h后再用攻毒，灌服之后禁食、禁水3h，剂量为5×10⁷/只。

第1组接种纳米DNA疫苗100μg(pCAGGS-flaA的含量)，8周后ALM-80口服攻毒；

第2组接种纳米pCAGGS空质粒100μg(pCAGGS的含量)，8周后ALM-80口服攻毒；

第3组接种生理盐水，8周后ALM-80口服攻毒。

①泄殖腔排毒

口服攻毒后，分别于7、14、21d采集泄殖腔棉拭子样品，测定泄殖腔排毒状况如表3，疫苗组在测定的时间内排毒率呈现下降趋势，21d的排毒率为0，而对照组的排毒率保持相对稳定的水平(表3)。

表3白莱航鸡攻毒后泄殖腔阳性率

Table 3 The average positive rate of swab specimens of White Leghorn chickens challenged with ALM-80

②实验鸡小肠、大肠、盲肠和血液中的空肠弯曲菌数量

攻毒后3、6、9、12、15、18、21d应用平板计数法分别测定小肠、大肠、盲肠和血液中的空肠弯曲菌的数量。由表4、5、6和表7可见，口服攻毒后空肠弯曲菌在疫苗组小肠、大肠、盲肠和血液中的细菌量大致呈抛物线状，大约在9d-15d间达到高峰，然后呈下降趋势；而对照组在各脏器的分布呈上升趋势。免疫组小肠、大肠、盲肠和血液中细菌的细菌数量均低于对照组，18d后能有效清除小肠内空肠弯曲菌，免疫组大肠、盲肠和血液的细菌数量较对照组分别降低2lg-3lg、2lg和2lg-3lg数量。研究表明，运送空肠弯曲菌flaA基因的壳聚糖纳米DNA疫苗能有效减少血液和小肠、大肠、盲肠中空肠弯曲菌的数量。

表4攻毒后鸡小肠中空肠弯曲菌数量的变化

Table 4 The CFU counts of C.jejuni in chicken small intestine after oral infection

表5攻毒后鸡大肠中空肠弯曲菌数量的变化

Table 5 The CFU counts of C.jejuni in chicken large intestine after oral infection

表6攻毒后鸡盲肠中空肠弯曲菌数量的变化

Table 6 The CFU counts of C.jejuni in chicken cecum after oral infection

表7攻毒后鸡血液中空肠弯曲菌数量的变化

Table7 The CFU counts of C.jejuni in blood after oral infection

SEQUENCE  LISTING

<110>扬州大学

<120>一种空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗及其制备方法和应用

<160>1

<210>1

<211>1719

<212>DNA

<213>鸡(Chicken)

<400>1

ctactgtagt aatcttaaaa cattttgttg aacagaatta gcctgtgcca tggcataaga    60

gccgctttga gctaagatat ttgctttaga gtagtttgca ctctcggctg caaagtctac    120

atcacggatt tgcgattctg ctgctttaac gtttacttga gttacggtga tgttgtttat    180

agttgatgta acttgatttt gtaccgaacc aatgtcggct ctgatttgat caagatttgt    240

tatagctgtt tcagctatat ccatcacagc catagcgcct ttaagtgtgg taacacctgc    300

tgtttcatct tttactccaa aagcagttgt tttcatagtt gcaaactgag aaagtgttga    360

accacttgaa aaacctgagc ctgcagaaac attatatacc gtagaaagtt gcgaagcagc    420

tgaaatagct atagcgtttg caaaacctgt ggaataattt ttaccgctac ctacagaata    480

acctgaacct gaagaaaatc cacttcctgc gctactcata taggcactaa cagaagaata    540

accacctaac acaactcctt tgtttgcaga accaaatccc atagcatcag cgatattagc    600

atcaatttgt ccttttgact ctcttaaaga aacagaagct tgagagataa attgagttgc    660

accaaaacct gcagaagaaa gattgctacc gctgattaaa atatctttac catcattttt    720

aactaaagac aagcggccat agttttcttt catatcagca ttgataaagg cacctccacc    780

tatattacca tcgattttaa tccctctacc ttctcttgaa gtaagtaaaa gttgtccatt    840

agcatcgatc gaagcttcaa ctccagtggt atctttaacc gaattgattg cagcaactaa    900

ggctccatta gcatcaccat ctttgtaatc tactttaccg atttttaccc cattgatagc    960

aaaagtatct gaagtagctc ctgctctaac tgcagctata cctctagttt ctactgtaaa    1020

agtagctcta acacctgttt tatcagcatt tttattgatc tcatctgcta aagctccaag    1080

tcctgttcca actgaagttg aaatcacaac tttttgaaac tgaaaatcat ctataccatt    1140

gtaattttta agagtaaatt gtacttcgcc actagttgaa attcttcctc ctgtttcaaa    1200

gcgtgttaaa cctatcttag aagattgagt tgctcctata gtagctttta cagtttgatt    1260

tgaacttgca ccgatttgaa attcttgatt gataaaattc ccacttaaaa gttgtttacc    1320

gttaaatgaa gtagtatttg caatattgtc aagttcttcc attaaacggt tgatatctgc    1380

ttgaagcatg gttcttgttt ttaaactttg tccatcttga gccgcttgag ttgccttagt    1440

tttgattgta tctaagattt taagttgctc atccatagcc ttatcagcag tttgtaagat    1500

acctaaagca tcattaccat tagatatagc ttgacctaaa gtattagctt gagatcttaa    1560

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atttaaagct gcaacattgg tgttaatacg aaatcccat                           1719

Claims (3)

1、一种空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗，是壳聚糖和重组质粒构成的纳米微囊，其特征在于，所说的重组质粒是由空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA和真核表达载体pCAGGS组成的pCAGGS-flaA，所述的鞭毛蛋白flaA基因具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列。

2、一种权利要求1所述的空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)设计特异性引物：根据GenBank登陆序列gi:30407139设计一对引物：

上游引物：FlaA-F 5′-CATCTAGAAGCATTTAACAAGTTCATGG-3′Xba I

下游引物：FlaA-R 5′-TAGAATTCGTGTTTATCCTAAAACCCAT-3′EcoR I

2)通过PCR技术扩增空肠弯曲菌鞭毛蛋白flaA基因，克隆、回收得到纯化的flaA基因片段；

3)将flaA基因重组到质粒pCAGGS真核表达质粒中，构建成重组质粒pCAGGS-flaA；

4)将构建好的重组质粒pCAGGS-flaA溶于壳聚糖溶液中，制成空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗。

3、一种权利要求1所述的空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗在制备用于预防鸡空肠弯曲菌药物中的应用。

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