CN108743933A - 基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒ii型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型‑草鱼出血病毒亚单位疫苗的构建方法，用AOX1启动子控制家蚕质型多角体病毒蛋白基因；用TEF1启动子控制来自于草鱼出血病毒的VP6、VP7和鲤疱疹病毒II型ORF72、ORF66、ORF81、ORF82以及质型多角体病毒VP3的经密码子优化后抗原表位融合序列VP6‑VP7‑ORF72‑ORF66‑ORF81‑ORF82‑VP3，构建酵母表达载体pPICZA‑BmCPVpolh‑GCRV6/7‑CyHV72/66/81/82‑BmCPVVP3。该载体转化酵母菌，用甲醇诱导表达，表达的多抗原表位融合蛋白在家蚕质型多角体病毒VP3引导下包埋进重组家蚕质型多角体蛋白内，形成包埋鲤疱疹病毒II型‑草鱼出血病毒亚单位疫苗的蛋白微晶，该蛋白微晶经碳酸钠－碳酸氢钠溶液裂解，然后用盐酸溶液调pH至7.12，离心后的上清即为鲤疱疹病毒II型‑草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原。

Description

基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出 血病毒亚单位疫苗的构建方法
技术领域
本发明涉及运用基因工程技术表达疫苗领域，具体涉及一种基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的方法。
背景技术
鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2）感染引起的异育银鲫鳃出血病已导致严重经济损失，极大地影响了异育银鲫养殖业的健康发展。目前有关该病的防控主要从苗种产地检测、增强免疫、减少应激反应、降低养殖密度、科学混养、早期诊断、及时清除病鱼等方面进行综合控制，但防控效果不尽人意。草鱼是我国大宗养殖淡水鱼，草鱼出血病由草鱼出病病毒（Grass Carp Reovirus，GCRV）感染引起，是影响草鱼养殖业的严重疾病。免疫接种是防治病毒性疾病最直接有效的方法之一。因此，研发确有免疫保护效果、使用方便安全、价格合理的疫苗在异育银鲫鳃出血病防治中具有关键作用。
目前，常见的疫苗种类主要有：灭活疫苗（死疫苗）、减毒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗以及蛋白亚单位/DNA联合疫苗等。但至今还没有良好效果的用于预防异育银鲫鳃出血病的疫苗。水产养殖中，往往通过合理混养实现充分利用水面、优化养殖生态、减少疾病发生、提高养殖效益。然而，同一种鱼有可能被不同的病原微生物感染，而同一病原微生物也有可能感染不同种类的鱼，从而导致疾病在不同种类鱼之间相互传染，因此人们希望一种疫苗能预防不同疾病。影响疫苗的免疫效果的因素很多，其中，病原微生物通过突变逃避免疫是导致免疫效果差的重要原因，将不同的抗原表位组合制备联合疫苗是解决免疫逃避的有效策略。
通过基因工程技术表达疫苗蛋白是目前疫苗研发的主流途径。由于大肠杆菌表达系统表达外源蛋白技术非常成熟，绝大多数疫苗蛋白是通过大肠杆菌表达系统生产，但从大肠杆菌中获取大量的纯重组蛋白仍是一个挑战。另外由于大肠杆菌无翻译后的修饰系统，有时导致疫苗的免疫原性较差。此外，大肠杆菌的细胞周质中含有种类繁多的内毒素，对疫苗的安全性造成了严重的影响。
免疫的剂型不仅影响免疫效果，也影响免疫保护期。已有研究表明，海藻酸钠载药微球作为新型缓控释制剂，可增强抗原的免疫活性。但海藻酸钠抗原微球的制备工艺较复杂，影响因素较多。现有技术公开了一种通过基因工程技术，利用杆状病毒表达系统将表达的鲤疱疹病毒II型抗原包裹至家蚕质型多角体中的方法；但是现有技术未见同时包裹鲤鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位联合疫苗，而且联合疫苗不等于任何疫苗的随意混合，首先要解决的问题是如何保证联合疫苗终成品的稳定性，以便达到18～24个月以上的保存期。众所周知，许多因素可以在联合疫苗组分之间产生干扰，例如抗原的性质（如纯化蛋白、荚膜多糖或蛋白结合多糖等）和每个抗原的剂量等。疫苗内的添加剂也是一个重要的干扰源，如佐剂、防腐剂、pH值和渗透压调节剂等。另外，联合疫苗的剂型，如液体或冻干粉剂，以及它们混合以后的持续时间，也可影响到疫苗的稳定性。一些研究发现，在DTaP与Hib疫苗联合时，不同的DTaP联合疫苗可使D、T和Hib疫苗产生不同的免疫应答反应。同一个种类Hib疫苗（多聚核糖醇磷酸盐荚膜多糖结合破伤风蛋白）与不同的DTaP-IPV联合疫苗做联合疫苗或同时接种，D、T和Hib疫苗诱导的抗体水平不同。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的方法。将鲤疱疹病毒II型、草鱼出血病毒的抗原表位所对应的DNA融合序列通过酵母表达载体制备的多亚单位联合疫苗，达到有效防止病毒通过突变逃避免疫、一种疫苗同时预防异育银鲫鳃出血病和草鱼出血病的效果。通过生物识别和大分子间的互作，使疫苗蛋白包裹进质型多角体蛋白微晶内，从而方便纯化、保护疫苗蛋白。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的构建方法，包括下列步骤：
（1）将融合序列克隆进pPICZ A载体构建重组质粒；然后酶切所述重组质粒获线性化重组质粒；所述融合序列为SEQ ID NO:1；
（2）将所述线性化重组质粒转化酵母，在含抗生素的YPD平板上培养至形成菌落；然后挑取转化子于含抗生素的YPD培养基中培养至对数生长期，离心收集重组酵母菌，提取基因组DNA，以SEQ ID NO:2 和SEQ ID NO:3为引物进行PCR扩增，然后保存能扩增出包含融合序列片段的重组酵母菌；
（3）步骤（2）的重组酵母菌培养至对数生长期，离心收集菌体，接种于BMGY培养基，振荡培养后，诱导培养，然后离心收集酵母菌体；然后破碎获得的酵母菌体，离心纯化获取包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的蛋白微晶，即基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗。
酵母表达系统属真核表达系统，有较为完整的翻译后加工系统，且酵母系统生产的产品的安全性较高，另外，酵母是许多动物饲料的蛋白源，酵母多糖也是一种良好的免疫增强剂，因此用酵母系统表达疫苗蛋白有明显的优势；质型多角体是昆虫质型多角体病毒在感染细胞内形成的一种包埋有病毒粒子的微米级的多面体蛋白微晶，用质型多角体包埋疫苗蛋白不仅可以方便纯化疫苗蛋白、也可以对疫苗蛋白起保护的缓控释放作用、而且无DNA的污染。
上述技术方案中，步聚（1）的融合序列SEQ ID NO:1（BmCPV(polh)-TTCYC-PTEF-VP6-VP7-ORF72-ORF66-ORF81-ORF82-BmCPV(VP3)）的13-759nt为家蚕质型多角体病毒的多角体蛋白基因的编码区域；760-1077nt 为CYC1 转录终止区域（CYC1 transcriptiontermination region）；1078-1488 nt为 TEF1 启动子；1495-1671nt为草鱼出血病毒 VP6的抗原表位的DNA序列；1672-1854 nt 草鱼出血病毒 VP7的抗原表位的DNA序列；1864-2016 nt和2016-2169 nt 分别为鲤疱疹病毒II型ORF72、ORF66的抗原表位的DNA序列；2170-2220 nt、2230-2319nt、2329-2361nt为鲤疱疹病毒II型ORF81的抗原表位的DNA序列；2361-2574nt为鲤疱疹病毒II型ORF82的抗原表位的DNA序列；2575-2856 nt为对应于家蚕质型多角体病毒VP3基因5’端的1-279nt的编码序列。
本发明中，融合序列中多角体病毒的多角体蛋白基因的编码区域、VP6、VP7、ORF72、ORF66、ORF81、ORF82和VP3序列符合酵母偏爱密码子序列；7-16 nt 、1489-1498nt为真核生物kozak保守序列，为“ACCACCATGG”序列；VP6和VP7间、VP7和ORF72间、ORF72与ORF66间、ORF66与ORF81间加上连接肽，为“Gly-Pro-Gly”，对应的DNA序列为“GGTCCTGGA”或“GGACCTGGT”；融合序列SEQ ID NO:1的5’、3’端的限制性内切酶位点分别为EcoR、Not 。
上述技术方案中，步聚（1）中，将融合序列SEQ ID NO:1经过EcoR和Not 双酶切后，克隆进pPICZ系列载体（Invitrogen公司）的EcoR和Not 位点之间，也可以通过无缝克隆的方法克隆进pPICZ系列载体的EcoR和Not 位点；构建重组质粒pPICZA-BmCPVpolh-GCRV6/7-CyHV72/66/81/82-BmCPVVP3。
上述技术方案中，步聚（1）中，通过SacI酶切所述重组质粒获线性化重组质粒。
上述技术方案中，步聚（2）中，转化的酵母优选毕赤酵母X33，优选的转化方法为电转化法；YPD平板中抗生素Zeocin的终浓度一般为100μg/ml；培养至形成菌落的培养温度为30℃，培养时间为3～4天；培养至对数生长期为30℃培养至OD600达2.0～6.0。
上述技术方案中，步聚（2）中，抗生素优选Zeocin，为现有产品。
为了保证步聚（2）的收集的酵母菌为重组酵母菌，本发明抽提其基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:2序列为引物AOX5，SEQ ID NO:3序列为引物AOX3进行PCR扩增，可扩增出包含SEQ ID NO:1的片段（3.3kb左右）。
为了选择表达水平较好的重组酵母菌，通常选择多个经PCR鉴定正确的重组酵母工程菌进入步骤（3）的诱导表达。
上述技术方案中，步骤（3）中，步骤（2）的重组酵母菌培养至对数生长期为在30℃下用BMGY培养基培养至OD600达2.0～6.0，离心收集菌体，接种于BMGY培养基。优选的，从1个单位体积BMGY培养基中离心收集菌体接种于2个单位体积的BMGY培养基。为了提高疫苗基因的表达水平，优选振荡培养为于300 r/min 下30℃振荡培养培养24小时；诱导培养为用终浓度为1%甲醇于300 r/min 下30℃振荡诱导培养2～3天。
为了筛选获得高效表达疫苗基因的工程菌，将重组酵菌经步骤（3）诱导表达后收集的酵母菌体用鲤疱疹病毒II型或草鱼出血病毒的亚单位抗体进行Western blot检测，筛选出表达水平较高的重组酵母工程菌，再用筛选出的高水平表达疫苗基因的重组酵母工程菌诱导培养后，离心收集酵母菌体，然后破碎获得的酵母菌体，离心纯化获取包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的蛋白微晶。
上述技术方案中，步骤（3）中，酵母菌体经细胞破碎后，通过1000转/分和3000转/分的反复差速离心即可纯化获取包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的蛋白微晶。
本发明的包裹鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的蛋白微晶在37℃用pH10.8的碳酸钠-碳酸氢钠溶液裂解，然后用盐酸溶液调pH至7.12左右，出现大量的絮状沉淀后，用12000转/分离心，所获上清为鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原。
本发明还公开了上述一种基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的方法制备的基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗以及鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原；以及所述基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗或者鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原在制备异育银鲫鳃出血病、草鱼出血病免疫预防药物中的应用。
进一步的，本发明公开了一种异育银鲫鳃出血病、草鱼出血病免疫预防药物，包括上述基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗或者鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原。
进一步的，本发明公开了融合序列在制备基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗中的应用；所述融合序列如SEQ ID NO:1所示。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1. 本发明公开的通过酵母系统制备包裹鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位联合疫苗的蛋白微晶没有见报道；本发明的酵母表达载体系统是一种真核表达系统，表达水平高、产物生物活性好、生产成本低，且本发明制备的蛋白微晶不包埋病毒粒子，也无病毒DNA污染，生物安全性高，从而可用于疫苗的研发。
2. 本发明基于酵母表达系统，避免了常规的大肠杆菌系统表达的抗原蛋白的纯化工艺复杂、分离纯化难度大的缺陷；而且避免了由于大肠杆菌不具有翻译后的修饰系统，往往导致重组蛋白的免疫原性较差、且细胞周质中含有种类繁多的内毒素的问题。
3. 本发明将抗原蛋白包裹在蛋白微晶内；蛋白微晶不溶于水，可以通过简单的差速离心实现纯化；纯化的蛋白微晶在碱性条件下裂解后，用盐酸溶液调pH至多角体蛋白等电点，可以通过离心使多角体蛋白沉淀，而鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位联合疫苗抗原留存在上清中，从而可以快速、方便地获得鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位联合疫苗抗原，取得了意想不到的技术效果。
4. 本发明的包裹抗原的蛋白微晶对包裹的抗原蛋白有保护作用，因此本发明获得的包裹鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位联合疫苗抗原的蛋白微晶无需特殊处理，在常温下就可以长期保存，解决了现有获得的抗原蛋白因易发生降解，往往需冻干后在低温下保存的缺陷。
5、本发明中，蛋白微晶是质型多角体，可作为一种良好的载药体，大小为2-3微米，不仅对包裹的蛋白有稳定作用，而且有缓控释作用，因此用质型多角体蛋白微晶包裹蛋白类药物不仅可稳定药物，而且有缓控释作用，从而本发明用质型多角体包裹抗原蛋白制备微颗粒缓释疫苗有可能提高疫苗免疫的保护水平。
尤其是：
本发明的酵母表达系统比杆状病毒表达系统成熟，成本低，不受季节影响，对家蚕养殖业安全；酵母为多种动物饲料的蛋白源，酵母多糖有提高动物免疫的作用；现有技术制备的多角体中仅包裹鲤疱疹病毒II型抗原，而本发明中制备的蛋白微晶中还包裹了草鱼出血病毒的抗原，可同时对育银鲫鳃出血病和草鱼出血病有免疫预防作用。
附图说明
图1为实施例一中pPICZA-BmCPVpolh-GCRV6/7-CyHV72/66/81/82-BmCPVVP3重组质粒结构示意图；
图2为实施例一pPICZA-BmCPVpolh-GCRV6/7-CyHV72/66/81/82-BmCPVVP3重组质粒用SacI酶切线性化后的电泳图；
图3 为实施例一转化子的PCR鉴定结果；
图4为实施例一的酵母工程菌诱导表达后的显微观察图，
图5 为蛋白微晶的多角体蛋白的western blot检测图；
图6 为实施例一的酵母表达的重组疫苗抗原的western blot检测图；
图7为实施例二纯化的蛋白微晶的Western blot检测图；
图8 实施例三中制备鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原的Westernblot检测。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一 一种基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的构建方法
（1）化学合成BmCPV(polh)-TTCYC-PTEF-VP6-VP7-ORF72-ORF66-ORF81-ORF82-BmCPV(VP3)融合序列SEQ ID NO:1，克隆进pMD-19T载体，尔后通过测序验证所合成的序列是否与SEQ ID NO:1序列一致，把验证正确的重组质粒命名为pMD-Target。
（2）pMD-Target质粒用EcoR和Not 酶切，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳，回收分子量为2.86 kb的外源片段，克隆进载体pPICZA（Invitrogen公司）的EcoR和Not 位点，构建重组质粒pPICZA-BmCPVpolh-GCRV6/7-CyHV72/66/81/82-BmCPVVP3。该质粒的结构如图1所示。其中，5’AOX1为AOX1基因启动子，polh为家蚕质型多角体蛋白基因编码序列，cyc1TT为CYC1 转录终止区域，PTEF1 为TEF1基因启动子区域，GCRV6/7-CyHV72/66/81/82-CPV3为草鱼出血病毒的VP6和VP7来源抗原表位与鲤疱疹病毒II型的ORF72、ORF66、ORF81、ORF82来源的抗原表位以及家蚕质型多角体病毒VP3基因5’端的1-279nt DNA拼接后的融合DNA序列，AOX1TT为AOX1的转录终止区域，EcoRI、NotI为限制性内切酶，pPICZ α为克隆的载体名称。
（3）取pPICZA-BmCPVpolh-GCRV6/7-CyHV72/66/81/82-BmCPVVP3质粒10微克，在100微升的酶切体系中用SacI酶切（TAKARA公司）2小时，取5微升电泳，检测质粒是否被酶切线性化，如图2所示，M为标准分子量DNA，奇数泳道为酶切前的重组质粒，偶数泳道为酶切线性化后的质粒。尔后，加入100μl异丙醇和10μl 3 M 醋酸钠(pH5.2), -20℃静置 2h；10000×g, 4℃离心 15min，弃上清；加入 1 ml 70%乙醇，10000×g，4℃离心l0 min，弃上清；乙醇重复清洗一次；彻底晾干，加入15μl无菌水溶解。
（4）步聚（3）中的15μl线性化回收产物与200μ1毕赤酵母X33感受态细胞混合均匀，用电转仪电转后，加入0.5ml预冷的1 M山梨醇，30℃下培养1-2 小时，3000r/min，3min后，弃上清，留200μl，涂于含Zeocin (100μg /ml)的YPD平板, 30℃下培养3.5天，直到出现菌落。挑取转化子于3 ml含100μg /ml zeocin的YPD培养基中，30℃下培养8小时；
（5）提取转化子酵母DNA，作为模板，以SEQIDNO:2和SEQIDNO:3为引物，PCR扩增，PCR产物电泳，如图3所示，M为标准分子量DNA，泳道1、2为以不同的转化子基因组为模板，以AOX5、AOX3为引物的PCR产物电泳图，可观察到3.3 kb左右的特异性条带，将此酵母命名为PGC；
（6） 取PGC重组酵母10μl，置于25 mL BMGY培养基中，30 ℃，300 r/min振荡培养18小时，至对数生长期OD600=5，同时以X-33野生菌型作阴性对照。室温下3000g离心5min，收集菌体，转于50mL BMMY培养基中，30 ℃中振荡培养300 rpm，每24小时向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0%，培养2天；
（7） 每24小时取菌液样品1ml，置于1.5ml EP管中，12000 r/min，离心2min，收集菌体沉淀，并用显微镜观察菌体。图4是诱导表达48小时的酵母菌，酵母细胞内的折光性较强的颗粒为多角体蛋白微晶。
（8） 菌体破碎后，离心，上清和沉淀经SDS-PAGE分离后，将胶中的蛋白转移至PVDF膜上，用鼠源的BmCPV多克隆抗体为一抗，羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot检测，图5为Western blot检测图，0泳道为未转化酵母、1泳道为酵母破碎后的离心上清，2泳道为酵母破碎后的离心沉淀，3泳道为破碎酵母；在2，3泳道可观察到代表多角体蛋白（26kD）的特异性条带，说明多角体蛋白已正确表达；
（9） 步聚（7）菌体破碎后，离心，上清和沉淀经SDS-PAGE分离后，将胶中的蛋白转移至PVDF膜上，用CyHV-2 ORF72鼠抗为一抗，羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot检测。图6为Western blot检测图，0泳道为未转化酵母、1泳道为酵母破碎后的离心上清，2泳道为酵母破碎后的离心沉淀，3泳道为破碎酵母；在2，3泳道可观察到代表VP6-VP7-ORF72-ORF66-ORF81-ORF82的抗原蛋白（50kD）的特异性条带，说明抗原蛋白已正确表达。对图6中的目的条带进行灰度分析，通过计算可知，表达的重组抗原蛋白约有50%被包埋进多角体内；
（10）将步聚（6）用甲醇诱导表达后酵母菌液转移到50ml制备管中，10000r/min离心5min收集菌体，以菌体鲜重与磷酸盐缓冲液为1 g:10 mL加入磷酸盐缓冲液重悬菌体，然后，置于-80℃冰箱，待充分冷冻后，取出放在37℃水浴中融化，重复冻融过程3次。然后通过1000r/min和3000r/min的反复差速离心，可纯化到基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗。
实施例二 一种基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的方法
与实施例一相比，所不同的是其中步骤（1）中合成SEQ ID NO:1时，将2320-2328位的“GGTCCTGGA”改为“GGACCTGGT”进行人工合成，为SEQ ID NO:4。其它步骤与实施例一相同。纯化的多角体用Western blot检测可观察到代表多角体蛋白的信号条带（图7）。Westernblot检测时，用鼠源的BmCPV多克隆抗体为一抗，羊抗鼠IgG为二抗。泳道C为家蚕质型多角体，泳道1-8为从不同酵母工程菌中纯化的基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗。
实施例三疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的制备
实施例一纯化的基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗在37℃用pH10.8的碳酸钠－碳酸氢钠溶液裂解，然后用盐酸溶液调pH至7.12左右，出现大量的絮状沉淀后，用12000转/分离心，所获上清为鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原。图8为从多角体中纯化的抗原的western blot检测图，泳道1-5为从不同酵母工程菌中的多角体中纯化的抗原，一抗CyHV-2 ORF72鼠抗，二抗为羊抗鼠IgG。
本发明中，序列如下：
SEQ ID NO:1
GAATTCACCACCATGGCTGATGTTGCCGGTACTTCCAACAGAGACTTCAGAGGAAGAGAACAAAGATTGTTCAACTCAGAGCAGTACAACTACAACAACTCATTGAACGGTGAAGTTAGTGTCTGGGTTTATGCTTACTATAGTGATGGATCTGTCTTGGTTATCAACAAGAACTCTCAATACAAGGTCGGTGTTAGTGAGACCTTCAAGACATTGAAAGAATACAGAGAGGGACAACATAACGATACTTATGACGAATACGAGGTTAACCAGGGTATTTACTATCCAAATGGTGGAGATGCTAGAAAGTACCACTCTAATGCCAAACCAAGAGCAATTCAGATCGTTTTCTCTCCTTCAGTCAACGTTAGAACTATCAAGATGGCTAAAGGAAATAGTTTGTCTGTTCCAGATGAATATCTTCAAAGATCCCATCCTTGGGAGGCTACCGGTATTAAGTACAGAAAGATCAAAAGAGACGGTGAAATCGTTGGATACTCCCATTACTTCGAATTGCCTCACGAGTATTCTTCCATCTCTCTTGCCGTCTCCGGTGTTCATAAAAACCCATCAAGTTACAATGTTGGATCAGCACACAACGTCATGGATGTTTTCCAGAGTTGTGACCTTGCCTTGAGATTTTGCAATAGATATTGGGCAGAACTTGAGTTGATTAACCACTACGTTTCTCCAAATGCCTATCCTTACTTGGATATTAACAACCATTCTTACGGAGTTGCATTGTCCAACAGACAATAACACGTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCAGGCCTCGGAGATCCGTCCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTTCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGAGACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAATTTTTTTTTTTAGTTTTTTTCTCTTTCAGTGACCTCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGTTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGGGGCACCACCATGGCCCAAAGACAGTTCTTTGGTTTGACTTATAACTTCTACGGACAACCAGCTCCTTTGTTTGATCTTAATGACTTGCAGGAACTTGCTGGTTGTTATGCCAGACCTTGGACTTCTTATACCGCCTACGCATTGACCATTGAGAGACATTTGACAGCAATGCTTGTTGCTAATCCAATGCCTTTGCACATGATCCCTCAAGTTGCTCACGCTATGGTTAGAGCTGCCGCAGCTGGTAGATTGACACTTCCAGCTTTCAACAATTTGACTTTTGCCTGTCATTCAACCTGCGCCAGTGATATGGCACACTTTGACTGCGGTCAGATTGTTGGATTGGATCTTCATGTCGAACCATCAGACGGACCTGGTAGACTTTTGAACCCTTACTTGGCTACCAAGGGTCAAAGAGTTGATCCATCCAATTTGTATATTCCTGACGGAATCTTCGTTACTTACACCCCAACAGGTCCAGATCCTGGAGTCGCTCACGGTGGAGGTTACTATTACAGACCATCTTTGCAGGGACCTGGTGCATCTTCCTTTGTCGATAAGTTGGTTGAAAAATCAGACTTGAGTGCTTGTCTTTCCCATACAGACGGAACTATTGAGTTGCCATCAAGTTGGGTTGATCCTAGAGCTAAACAATTCCACGACTTGGATGACCTTATGATCTATATGACTGTTACCACAGGTGCATTGGCTAGAAAGGCCAAAGCAGTTGGATCTGGTCCAGGTTCTAACAAGTTGTTGGTTAAAATGCCTTTCGATGTCGAAAGATTTAAGATTTTGGTCGCTACTGTTACCCAGGTTGTCTGTCCAATGTTTGGTCCTGGAAGTACATCTCTTTTGAACTCTGTTAGAAAGATGGGTTTGGATCTTACTTGCTCCGTTATTTTCATGGTCGGATGGGTTGCAATGACCGTTTCTACATTTTTGGTCGACAGAGCTGAAGAGGTTAAGTATCATCAAAAAGTCTCCACTTCAGTTTACTTGTCTGTCCTTGCTCTTTTGGGTTCCAGATCCTCTTCTGTTTCATTGATGCATAGTGGAGGTGTTGTCCTTGCTGATTGTAAGGAGGACATGTGGCACTACACATCTATCAACAACGATACTAGAGTTGCCTTGGACCCAAAGCCTAACCAAATCAGAACAATCACTAAGCCAAACACTGTTCCTCAGTTGGGTACAGATTACCTTTACACTTTCAACTCTCAAAGAAGATCCCATACCTTGAGACTTTTGGGTCCATTCCAATACTTCAACAGTTCTGAAACAGACAGAGGACACCCTTTGTTTAGATTGCCACTTAAGTACCCTTCTAAAGCAATTCCAGCTGATGAGTTGATCGATAACCTTCATTAAGCGGCCGC
SEQ ID NO:2
GGCAAATGGCATTCTGACAT
SEQ ID NO:3
GACTGGTTCCAATTGACAAGC
SEQ ID NO:4
GAATTCACCACCATGGCTGATGTTGCCGGTACTTCCAACAGAGACTTCAGAGGAAGAGAACAAAGATTGTTCAACTCAGAGCAGTACAACTACAACAACTCATTGAACGGTGAAGTTAGTGTCTGGGTTTATGCTTACTATAGTGATGGATCTGTCTTGGTTATCAACAAGAACTCTCAATACAAGGTCGGTGTTAGTGAGACCTTCAAGACATTGAAAGAATACAGAGAGGGACAACATAACGATACTTATGACGAATACGAGGTTAACCAGGGTATTTACTATCCAAATGGTGGAGATGCTAGAAAGTACCACTCTAATGCCAAACCAAGAGCAATTCAGATCGTTTTCTCTCCTTCAGTCAACGTTAGAACTATCAAGATGGCTAAAGGAAATAGTTTGTCTGTTCCAGATGAATATCTTCAAAGATCCCATCCTTGGGAGGCTACCGGTATTAAGTACAGAAAGATCAAAAGAGACGGTGAAATCGTTGGATACTCCCATTACTTCGAATTGCCTCACGAGTATTCTTCCATCTCTCTTGCCGTCTCCGGTGTTCATAAAAACCCATCAAGTTACAATGTTGGATCAGCACACAACGTCATGGATGTTTTCCAGAGTTGTGACCTTGCCTTGAGATTTTGCAATAGATATTGGGCAGAACTTGAGTTGATTAACCACTACGTTTCTCCAAATGCCTATCCTTACTTGGATATTAACAACCATTCTTACGGAGTTGCATTGTCCAACAGACAATAACACGTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCAGGCCTCGGAGATCCGTCCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTTCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGAGACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAATTTTTTTTTTTAGTTTTTTTCTCTTTCAGTGACCTCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGTTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGGGGCACCACCATGGCCCAAAGACAGTTCTTTGGTTTGACTTATAACTTCTACGGACAACCAGCTCCTTTGTTTGATCTTAATGACTTGCAGGAACTTGCTGGTTGTTATGCCAGACCTTGGACTTCTTATACCGCCTACGCATTGACCATTGAGAGACATTTGACAGCAATGCTTGTTGCTAATCCAATGCCTTTGCACATGATCCCTCAAGTTGCTCACGCTATGGTTAGAGCTGCCGCAGCTGGTAGATTGACACTTCCAGCTTTCAACAATTTGACTTTTGCCTGTCATTCAACCTGCGCCAGTGATATGGCACACTTTGACTGCGGTCAGATTGTTGGATTGGATCTTCATGTCGAACCATCAGACGGACCTGGTAGACTTTTGAACCCTTACTTGGCTACCAAGGGTCAAAGAGTTGATCCATCCAATTTGTATATTCCTGACGGAATCTTCGTTACTTACACCCCAACAGGTCCAGATCCTGGAGTCGCTCACGGTGGAGGTTACTATTACAGACCATCTTTGCAGGGACCTGGTGCATCTTCCTTTGTCGATAAGTTGGTTGAAAAATCAGACTTGAGTGCTTGTCTTTCCCATACAGACGGAACTATTGAGTTGCCATCAAGTTGGGTTGATCCTAGAGCTAAACAATTCCACGACTTGGATGACCTTATGATCTATATGACTGTTACCACAGGTGCATTGGCTAGAAAGGCCAAAGCAGTTGGATCTGGTCCAGGTTCTAACAAGTTGTTGGTTAAAATGCCTTTCGATGTCGAAAGATTTAAGATTTTGGTCGCTACTGTTACCCAGGTTGTCTGTCCAATGTTTGGACCTGGTAGTACATCTCTTTTGAACTCTGTTAGAAAGATGGGTTTGGATCTTACTTGCTCCGTTATTTTCATGGTCGGATGGGTTGCAATGACCGTTTCTACATTTTTGGTCGACAGAGCTGAAGAGGTTAAGTATCATCAAAAAGTCTCCACTTCAGTTTACTTGTCTGTCCTTGCTCTTTTGGGTTCCAGATCCTCTTCTGTTTCATTGATGCATAGTGGAGGTGTTGTCCTTGCTGATTGTAAGGAGGACATGTGGCACTACACATCTATCAACAACGATACTAGAGTTGCCTTGGACCCAAAGCCTAACCAAATCAGAACAATCACTAAGCCAAACACTGTTCCTCAGTTGGGTACAGATTACCTTTACACTTTCAACTCTCAAAGAAGATCCCATACCTTGAGACTTTTGGGTCCATTCCAATACTTCAACAGTTCTGAAACAGACAGAGGACACCCTTTGTTTAGATTGCCACTTAAGTACCCTTCTAAAGCAATTCCAGCTGATGAGTTGATCGATAACCTTCATTAAGCGGCCGC
本发明是通过酵母表达系统制备包裹鲤鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位联合疫苗的蛋白微晶，该疫苗可同时预防异育银鲫鳃出血病和草鱼出血病，到目前为止，还没有相关研究报道。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的构建方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2864
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcacca ccatggctga tgttgccggt acttccaaca gagacttcag aggaagagaa 60
caaagattgt tcaactcaga gcagtacaac tacaacaact cattgaacgg tgaagttagt 120
gtctgggttt atgcttacta tagtgatgga tctgtcttgg ttatcaacaa gaactctcaa 180
tacaaggtcg gtgttagtga gaccttcaag acattgaaag aatacagaga gggacaacat 240
aacgatactt atgacgaata cgaggttaac cagggtattt actatccaaa tggtggagat 300
gctagaaagt accactctaa tgccaaacca agagcaattc agatcgtttt ctctccttca 360
gtcaacgtta gaactatcaa gatggctaaa ggaaatagtt tgtctgttcc agatgaatat 420
cttcaaagat cccatccttg ggaggctacc ggtattaagt acagaaagat caaaagagac 480
ggtgaaatcg ttggatactc ccattacttc gaattgcctc acgagtattc ttccatctct 540
cttgccgtct ccggtgttca taaaaaccca tcaagttaca atgttggatc agcacacaac 600
gtcatggatg ttttccagag ttgtgacctt gccttgagat tttgcaatag atattgggca 660
gaacttgagt tgattaacca ctacgtttct ccaaatgcct atccttactt ggatattaac 720
aaccattctt acggagttgc attgtccaac agacaataac acgtccgacg gcggcccacg 780
ggtcccaggc ctcggagatc cgtccccctt ttcctttgtc gatatcatgt aattagttat 840
gtcacgctta cattcacgcc ctccccccac atccgctcta accgaaaagg aaggagttag 900
acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt 960
atttatattt caaatttttc ttttttttct gtacagacgc gtgtacgcat gtaacattat 1020
actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg acgctcgaag gctttaattt gcaagctccc 1080
acacaccata gcttcaaaat gtttctactc cttttttact cttccagatt ttctcggact 1140
ccgcgcatcg ccgtaccact tcaaaacacc caagcacagc atactaaatt ttccctcttt 1200
cttcctctag ggtgtcgtta attacccgta ctaaaggttt ggaaaagaaa aaagagaccg 1260
cctcgtttct ttttcttcgt cgaaaaaggc aataaaaatt tttatcacgt ttctttttct 1320
tgaaattttt ttttttagtt tttttctctt tcagtgacct ccattgatat ttaagttaat 1380
aaacggtctt caatttctca agtttcagtt tcatttttct tgttctatta caactttttt 1440
tacttcttgt tcattagaaa gaaagcatag caatctaatc taaggggcac caccatggcc 1500
caaagacagt tctttggttt gacttataac ttctacggac aaccagctcc tttgtttgat 1560
cttaatgact tgcaggaact tgctggttgt tatgccagac cttggacttc ttataccgcc 1620
tacgcattga ccattgagag acatttgaca gcaatgcttg ttgctaatcc aatgcctttg 1680
cacatgatcc ctcaagttgc tcacgctatg gttagagctg ccgcagctgg tagattgaca 1740
cttccagctt tcaacaattt gacttttgcc tgtcattcaa cctgcgccag tgatatggca 1800
cactttgact gcggtcagat tgttggattg gatcttcatg tcgaaccatc agacggacct 1860
ggtagacttt tgaaccctta cttggctacc aagggtcaaa gagttgatcc atccaatttg 1920
tatattcctg acggaatctt cgttacttac accccaacag gtccagatcc tggagtcgct 1980
cacggtggag gttactatta cagaccatct ttgcagggac ctggtgcatc ttcctttgtc 2040
gataagttgg ttgaaaaatc agacttgagt gcttgtcttt cccatacaga cggaactatt 2100
gagttgccat caagttgggt tgatcctaga gctaaacaat tccacgactt ggatgacctt 2160
atgatctata tgactgttac cacaggtgca ttggctagaa aggccaaagc agttggatct 2220
ggtccaggtt ctaacaagtt gttggttaaa atgcctttcg atgtcgaaag atttaagatt 2280
ttggtcgcta ctgttaccca ggttgtctgt ccaatgtttg gtcctggaag tacatctctt 2340
ttgaactctg ttagaaagat gggtttggat cttacttgct ccgttatttt catggtcgga 2400
tgggttgcaa tgaccgtttc tacatttttg gtcgacagag ctgaagaggt taagtatcat 2460
caaaaagtct ccacttcagt ttacttgtct gtccttgctc ttttgggttc cagatcctct 2520
tctgtttcat tgatgcatag tggaggtgtt gtccttgctg attgtaagga ggacatgtgg 2580
cactacacat ctatcaacaa cgatactaga gttgccttgg acccaaagcc taaccaaatc 2640
agaacaatca ctaagccaaa cactgttcct cagttgggta cagattacct ttacactttc 2700
aactctcaaa gaagatccca taccttgaga cttttgggtc cattccaata cttcaacagt 2760
tctgaaacag acagaggaca ccctttgttt agattgccac ttaagtaccc ttctaaagca 2820
attccagctg atgagttgat cgataacctt cattaagcgg ccgc 2864
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcaaatggc attctgacat 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gactggttcc aattgacaag c 21
<210> 4
<211> 2864
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaattcacca ccatggctga tgttgccggt acttccaaca gagacttcag aggaagagaa 60
caaagattgt tcaactcaga gcagtacaac tacaacaact cattgaacgg tgaagttagt 120
gtctgggttt atgcttacta tagtgatgga tctgtcttgg ttatcaacaa gaactctcaa 180
tacaaggtcg gtgttagtga gaccttcaag acattgaaag aatacagaga gggacaacat 240
aacgatactt atgacgaata cgaggttaac cagggtattt actatccaaa tggtggagat 300
gctagaaagt accactctaa tgccaaacca agagcaattc agatcgtttt ctctccttca 360
gtcaacgtta gaactatcaa gatggctaaa ggaaatagtt tgtctgttcc agatgaatat 420
cttcaaagat cccatccttg ggaggctacc ggtattaagt acagaaagat caaaagagac 480
ggtgaaatcg ttggatactc ccattacttc gaattgcctc acgagtattc ttccatctct 540
cttgccgtct ccggtgttca taaaaaccca tcaagttaca atgttggatc agcacacaac 600
gtcatggatg ttttccagag ttgtgacctt gccttgagat tttgcaatag atattgggca 660
gaacttgagt tgattaacca ctacgtttct ccaaatgcct atccttactt ggatattaac 720
aaccattctt acggagttgc attgtccaac agacaataac acgtccgacg gcggcccacg 780
ggtcccaggc ctcggagatc cgtccccctt ttcctttgtc gatatcatgt aattagttat 840
gtcacgctta cattcacgcc ctccccccac atccgctcta accgaaaagg aaggagttag 900
acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt 960
atttatattt caaatttttc ttttttttct gtacagacgc gtgtacgcat gtaacattat 1020
actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg acgctcgaag gctttaattt gcaagctccc 1080
acacaccata gcttcaaaat gtttctactc cttttttact cttccagatt ttctcggact 1140
ccgcgcatcg ccgtaccact tcaaaacacc caagcacagc atactaaatt ttccctcttt 1200
cttcctctag ggtgtcgtta attacccgta ctaaaggttt ggaaaagaaa aaagagaccg 1260
cctcgtttct ttttcttcgt cgaaaaaggc aataaaaatt tttatcacgt ttctttttct 1320
tgaaattttt ttttttagtt tttttctctt tcagtgacct ccattgatat ttaagttaat 1380
aaacggtctt caatttctca agtttcagtt tcatttttct tgttctatta caactttttt 1440
tacttcttgt tcattagaaa gaaagcatag caatctaatc taaggggcac caccatggcc 1500
caaagacagt tctttggttt gacttataac ttctacggac aaccagctcc tttgtttgat 1560
cttaatgact tgcaggaact tgctggttgt tatgccagac cttggacttc ttataccgcc 1620
tacgcattga ccattgagag acatttgaca gcaatgcttg ttgctaatcc aatgcctttg 1680
cacatgatcc ctcaagttgc tcacgctatg gttagagctg ccgcagctgg tagattgaca 1740
cttccagctt tcaacaattt gacttttgcc tgtcattcaa cctgcgccag tgatatggca 1800
cactttgact gcggtcagat tgttggattg gatcttcatg tcgaaccatc agacggacct 1860
ggtagacttt tgaaccctta cttggctacc aagggtcaaa gagttgatcc atccaatttg 1920
tatattcctg acggaatctt cgttacttac accccaacag gtccagatcc tggagtcgct 1980
cacggtggag gttactatta cagaccatct ttgcagggac ctggtgcatc ttcctttgtc 2040
gataagttgg ttgaaaaatc agacttgagt gcttgtcttt cccatacaga cggaactatt 2100
gagttgccat caagttgggt tgatcctaga gctaaacaat tccacgactt ggatgacctt 2160
atgatctata tgactgttac cacaggtgca ttggctagaa aggccaaagc agttggatct 2220
ggtccaggtt ctaacaagtt gttggttaaa atgcctttcg atgtcgaaag atttaagatt 2280
ttggtcgcta ctgttaccca ggttgtctgt ccaatgtttg gacctggtag tacatctctt 2340
ttgaactctg ttagaaagat gggtttggat cttacttgct ccgttatttt catggtcgga 2400
tgggttgcaa tgaccgtttc tacatttttg gtcgacagag ctgaagaggt taagtatcat 2460
caaaaagtct ccacttcagt ttacttgtct gtccttgctc ttttgggttc cagatcctct 2520
tctgtttcat tgatgcatag tggaggtgtt gtccttgctg attgtaagga ggacatgtgg 2580
cactacacat ctatcaacaa cgatactaga gttgccttgg acccaaagcc taaccaaatc 2640
agaacaatca ctaagccaaa cactgttcct cagttgggta cagattacct ttacactttc 2700
aactctcaaa gaagatccca taccttgaga cttttgggtc cattccaata cttcaacagt 2760
tctgaaacag acagaggaca ccctttgttt agattgccac ttaagtaccc ttctaaagca 2820
attccagctg atgagttgat cgataacctt cattaagcgg ccgc 2864

Claims (10)

1.一种基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的构建方法，包括下列步骤：
（1）将融合序列克隆进pPICZ A载体构建重组质粒；然后酶切所述重组质粒获线性化重组质粒；所述融合序列为SEQ ID NO:1；
（2）将所述线性化重组质粒转化酵母，在含抗生素的YPD平板上培养至形成菌落；然后挑取转化子于含抗生素的YPD培养基中培养至对数生长期，离心收集重组酵母菌，提取基因组DNA，以SEQ ID NO:2 和SEQ ID NO:3为引物进行PCR扩增，然后保存能扩增出包含融合序列片段的重组酵母菌；
（3）步骤（2）的重组酵母菌培养至对数生长期，离心收集菌体，接种于BMGY培养基，振荡培养后，诱导培养，然后离心收集酵母菌体；然后破碎获得的酵母菌体，离心纯化获取包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的蛋白微晶，即基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗。
2.根据权利要求1所述基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的构建方法，其特征在于，步聚（1）中，将融合序列经过EcoR和Not 双酶切后，克隆进pPICZ系列载体的EcoR和Not 位点之间，或者通过无缝克隆的方法克隆进pPICZ系列载体的EcoR和Not 位点构建重组质粒；通过SacI酶切所述重组质粒获线性化重组质粒。
3.根据权利要求1所述基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的构建方法，其特征在于，步聚（2）中，所述酵母为毕赤酵母X33；所述转化的方法为电转化法；YPD平板中抗生素的终浓度为100μg/ml；培养至形成菌落的培养温度为30℃，培养时间为3～4天；培养至对数生长期为30℃培养至OD600达2.0～6.0；所述抗生素为Zeocin。
4.根据权利要求1所述基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，步骤（2）的重组酵母菌培养至对数生长期为在30℃下用BMGY培养基培养至OD600达2.0～6.0，离心收集菌体，接种于BMGY培养基；振荡培养为于300 r/min 下30℃振荡培养培养24小时；诱导培养为用终浓度为1%甲醇于300 r/min 下30℃振荡诱导培养2～3天。
5.一种鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原的制备方法，包括下列步骤：
（1）将融合序列克隆进pPICZ A载体构建重组质粒；然后酶切所述重组质粒获线性化重组质粒；所述融合序列为SEQ ID NO:1；
（2）将所述线性化重组质粒转化酵母，在含抗生素的YPD平板上培养至形成菌落；然后挑取转化子于含抗生素的YPD培养基中培养至对数生长期，离心收集重组酵母菌，提取基因组DNA，以SEQ ID NO:2 和SEQ ID NO:3为引物进行PCR扩增，然后保存能扩增出包含融合序列片段的重组酵母菌；
（3）步骤（2）的重组酵母菌培养至对数生长期，离心收集菌体，接种于BMGY培养基，振荡培养后，诱导培养，然后离心收集酵母菌体；然后破碎获得的酵母菌体，离心纯化获取包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的蛋白微晶；
（4）将包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的蛋白微晶在37℃用pH10.8的碳酸钠-碳酸氢钠溶液裂解，然后用盐酸溶液调pH至7～7.5，再用12000转/分离心，取上清为鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原。
6.根据权利要求5所述鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原的制备方法，其特征在于，步聚（1）中，将融合序列经过EcoR和Not 双酶切后，克隆进pPICZ系列载体的EcoR和Not 位点之间，或者通过无缝克隆的方法克隆进pPICZ系列载体的EcoR和Not 位点构建重组质粒，通过SacI酶切所述重组质粒获线性化重组质粒；步聚（2）中，所述酵母为毕赤酵母X33；所述转化的方法为电转化法；YPD平板中抗生素的终浓度为100μg/ml；培养至形成菌落的培养温度为30℃，培养时间为3～4天；培养至对数生长期为30℃培养至OD600达2.0～6.0；所述抗生素为Zeocin。
7.根据权利要求5所述鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，步骤（2）的重组酵母菌培养至对数生长期为在30℃下用BMGY培养基培养至OD600达2.0～6.0，离心收集菌体，接种于BMGY培养基；振荡培养为于300 r/min下30℃振荡培养培养24小时；诱导培养为用终浓度为1%甲醇于300 r/min 下30℃振荡诱导培养2～3天。
8.一种融合DNA序列，其特征在于，所述融合DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
9.根据权利要求1所述基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的构建方法制备的基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗；根据权利要求5所述鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原的制备方法制备的鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原。
10.权利要求9所述基于酵母表达载体的蛋白微晶包埋鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗或者鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒联合亚单位疫苗抗原在制备异育银鲫鳃出血病和/或草鱼出血病免疫预防药物中的应用；或者融合序列在制备包裹鲤鲤疱疹病毒II型-草鱼出血病毒亚单位疫苗的蛋白微晶中的应用，所述融合DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
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