CN111529698B - 一种捻转血矛线虫重组arf1蛋白纳米亚单位疫苗及其应用 - Google Patents

一种捻转血矛线虫重组arf1蛋白纳米亚单位疫苗及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种捻转血矛线虫重组ARF1蛋白纳米亚单位疫苗及其应用。一种捻转血矛线虫纳米材料亚单位疫苗，由重组ARF1蛋白经PLGA纳米材料包裹而成。本实验室用ARF1蛋白构建的rARF1‑PLGA纳米亚单位疫苗作用于小鼠体内能够诱导的小鼠的免疫应答效应，在山羊体内试验也证实rARF1‑PLGA纳米疫苗对机体具有免疫保护作用。本发明将重组ARF1蛋白用PLGA纳米材料进行包裹形成纳米亚单位疫苗，以其为羊的捻转血矛线虫感染的预防应用提供参考。

Description

一种捻转血矛线虫重组ARF1蛋白纳米亚单位疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及生物兽药技术领域，涉及一种捻转血矛线虫重组ARF1蛋白纳米亚单位疫苗及其应用。
背景技术
捻转血矛线虫，主要寄生于骆驼、牛、羊、鹿等反刍动物的皱胃，以吸食宿主血液为生。调查发现，在一些欧洲国家，每年用于防控捻转血矛线虫病的费用已经达到了几百万美元。当前市场上主要以化学药物来防控捻转血矛线虫的感染，但是由于人们对化学药物的过度依赖，导致了捻转血矛线虫耐药虫株出现，使得药物的效果不甚理想。另外由于人们对药物残留以及一些生物安全因素的广泛关注，使得一些抗线虫药物很难在捻转血矛线虫病的防控上的广泛应用。
因此，通过某些免疫学手段来防治捻转血矛线虫病的手段开始逐渐的受到人们的青睐，如开发用于防止捻转血矛线虫病的疫苗，但是到目前为止，仍然只有少许的有效商品化疫苗。且其中可能存在的原因，如一些体表抗原，虫体隐蔽抗原(如半胱氨酸蛋白酶)和某些排泄分泌抗原的免疫保护作用。另外虫体与宿主之间复杂的反应机制也使得疫苗的研发步履维艰。
捻转血矛线虫在寄生过程中产生的ADP糖基化因子小分GTP酶基因(ARF1)在寄生虫-宿主的相互关系中扮演着重要角色，其中可能具有6个B细胞抗原表位6个和9个T细胞抗原表位，可促进IL-4、IL-10、IL-17的产生且呈剂量依赖性，而抑制IFNγ的产生；重组捻转血矛线虫的ARF1蛋白可显著地促进PBMC迁移和抑制PBMC的增殖且呈剂量依赖性。除此之外，重组捻转血矛线虫的ARF1蛋白可显著诱导细胞凋亡和促进NO的产生。但目前尚未见以ARF1为抗原制备疫苗的相关报道。
聚乳酸乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)纳米材料可加速、延长或増强抗原特异性免疫反应，其常与疫苗共同组成疫苗制剂，具有较好的生物相容性和独特的理化性质，具有靶向性、缓释性、安全性及高效性等优点。PLGA是由两种单体乳酸和羟基乙酸聚合而成，在体内可分解并被代谢。美国FDA已批准PLGA用于药物的载体，且在2015版的《中华人民共和国药典》中收录了关于PLGA的技术指标。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够预防羊捻转血矛线感染的重组ARF1蛋白纳米亚单位疫苗。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
SEQ ID NO.1所示的捻转血矛线虫重组ARF1蛋白在制备捻转血矛线虫疫苗中的应用。
一种捻转血矛线虫纳米材料亚单位疫苗，由上述重组ARF1蛋白经PLGA纳米材料包裹而成。
本发明所述的捻转血矛线虫纳米材料亚单位疫苗优选主要通过以下方法制备而成:
1)制备重组ARF1蛋白；
2)将蛋白质rARF1溶于4％～6％PVA溶液中形成内部水相，其中蛋白质rARF1浓度为0.5～1mg/mL；
3)将PLGA溶解于二氯甲烷中得到PLGA浓度为50～55mg/mL的二氯甲烷溶液作为有机相；
4)将内部水相和有机相合并，用超声处理形成w/o乳液；
5)将该w/o乳液转移到含有溶解在的4％～6％PVA溶液的外部水相中，并且再次超声处理获得最终的w/o/w乳液；在25～28℃下搅拌将有机溶剂蒸发形成纳米颗粒；
6)将纳米颗粒的溶液再离心，超纯水洗涤后，冷冻干燥得到所述的捻转血矛线虫重组ARF1蛋白纳米材料亚单位疫苗。
本发明所述的亚单位疫苗粒径优选63-125nm。
本发明所述的捻转血矛线虫重组ARF1蛋白纳米材料亚单位疫苗的制备方法，包含以下步骤:
1)制备重组ARF1蛋白(一下简称rARF1)；
2)将蛋白质rARF1溶于4％～6％PVA溶液中形成内部水相，其中蛋白质rARF1浓度为0.5～1mg/mL；
3)将PLGA溶解于二氯甲烷中得到PLGA浓度为50～55mg/mL的二氯甲烷溶液作为有机相；
4)将内部水相和有机相合并，用超声处理形成w/o乳液；
5)将该w/o乳液转移到含有溶解在的4％～6％PVA溶液的外部水相中，并且再次超声处理获得最终的w/o/w乳液；在25～28℃下搅拌将有机溶剂蒸发形成纳米颗粒；
6)将纳米颗粒的溶液再离心，超纯水洗涤后，冷冻干燥得到所述的捻转血矛线虫重组ARF1蛋白纳米材料亚单位疫苗。
本发明所述的制备方法优选，步骤1)制备重组ARF1蛋白包括：提取捻转血矛线虫成虫的总RNA，合成cDNA，用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物PCR扩增出ARF1基因，与克隆载体pMD-32a连接构建成表达载体，转化到BL21(DE3)感受态细胞中，用含氨苄抗性的LB液体培养液培养，经IPTG诱导表达，经镍柱对包涵体蛋白纯化，然后再复性得到重组ARF1蛋白。
本发明所述的制备方法优选，所述的PVA溶液浓度为6％；PLGA溶液的浓度为50mg/mL。
本发明所述的制备方法优选，所述的超声处理条件为超声功率30～50W，超声5～10s，间隔5～10s，超声时间为4～5min。
本发明所述的制备方法优选，步骤6)在用超纯水洗涤前将所述的纳米颗粒的溶液在4℃以40000rpm离心40min，然后收集上清液，使用BCA蛋白质测定试剂盒测定上清中蛋白质的量而计算蛋白质加载效率。
本发明所述的捻转血矛线虫重组ARF1纳米材料亚单位疫苗在制备羊捻转血矛线虫病的药物中的应用。
本发明具有以下优点和效果：
1.本发明将PLGA纳米材料用来包裹捻转血矛线虫的重组ARF1蛋白制备成纳米材料亚单位疫苗，可加速、延长或増强重组ARF1蛋白的特异性免疫反应，具有较好的生物相容性和独特的理化性质，具有靶向性、缓释性、安全性及高效性等优点，其在动物体内可分解并被代谢。
2.本发明所使用的捻转血矛线虫ARF1蛋白，具有6个B细胞抗原表位6个和9个T细胞抗原表位，可促进IL-4、IL-10、IL-17的产生且呈剂量依赖性，而抑制IFNγ的产生；重组捻转血矛线虫的ARF1蛋白可显著地促进PBMC迁移和抑制PBMC的增殖且呈剂量依赖性。除此之外，重组捻转血矛线虫的ARF1蛋白可显著诱导细胞凋亡和促进NO的产生。具有较强的免疫保护能力。
3.本发明的捻转血矛线虫亚单位纳米材料疫苗，能够使感染捻转血矛线虫的山羊虫卵排出率和成虫减少率显著下降，从而抵抗捻转血矛线虫的感染，在临床上具有较高的应用价值。
本发明用ARF1蛋白构建的r ARF1-PLGA纳米亚单位疫苗作用于小鼠体内能够诱导的小鼠的免疫应答效应，在山羊体内试验也证实r ARF1-PLGA纳米疫苗对机体具有免疫保护作用。本发明将重组ARF1蛋白用PLGA纳米材料进行包裹形成纳米亚单位疫苗，以其为羊的捻转血矛线虫感染的预防应用提供参考。
附图说明
图1ARF1的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳。
图2重组质粒酶切鉴定结果
A重组质粒pMD-19T-ARF1的双酶切鉴定；B重组质粒pET-32a-ARF1的双酶切鉴定。
图3重组蛋白ARF1表达(左)和纯化(右)的SDS-PAGE结果。
图4重组蛋白ARF1-PLGA纳米颗粒电镜观察(8000倍)。
图5虫卵排出动态变化。
具体实施方式
1.寄生虫虫体：捻转血矛线虫虫株由南京农业大学动物医学院寄生虫实验室长期保存。
2.实验动物：山羊(3～6月龄)购买自南京农业大学动物医学院实验动物中心，身体健康状况优良，经检查并无寄生虫感染；在整个实验过程中所涉及的处理对待动物方法严格遵循中华人民共和国江苏省科技厅动物福利保护规范以及南京农业大学动物福利等相关条例。
3.质粒及菌种：大肠杆菌DH5α、BL21以及表达载体pET-32a(+)均由本实验室保存，克隆载体pMD-19T载体从大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司购得。
4.主要工具酶和试剂：
Figure BDA0002452852620000041
Reagent购于ThermoFisher科技公司；PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、LA Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、10×PCR Buffer、限制性核酸内切酶、克隆载体pMD-19T、T4 DNA连接酶均购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司；/>
Figure BDA0002452852620000042
Plasmid DNA Mini kitⅠ、/>
Figure BDA0002452852620000043
Gel Extractionkit购自OMEGA公司；HisTrapTM FF蛋白亲和层析柱为美国GE公司产品；BCA蛋白定量分析试剂盒为美国Thermo Scientific公司产品。
5.主要仪器及设备：普通PCR仪为日本TaKaRa公司产品；台式恒温振荡仪(THZ-C)为苏州培英实验设备有限公司产品；台式常温离心机(5418)、台式冷冻离心机(5417R)均为德国eppendorf公司产品；水平核酸电泳仪为上海Tanon公司产品；落地高速离心机为美国Backman Coulter公司产品；蛋白质电泳系统(Mini-PROTEAN)、转印系统(Mini Trans-Blot)购自Bio-Rad公司；凝胶成像分析系统(ImageQuant300)为美国GE公司产品；立式压力蒸汽灭菌器(MLS-3870)为日本Sanyo公司产品；37℃隔水式恒温培养箱为上海森信实验仪器有限公司产品；超声破碎仪器源自Scientz Biotechnology公司(China)；冷场发射JEOLIT-100扫描电子显微镜(日本)；超速离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)；冷冻干燥机(Labconco，USA)。
实施例1.捻转血矛线虫重组ARF1蛋白纳米材料亚单位疫苗的制备
1.捻转血矛线虫虫体总RNA的提取
按照Inviotrgen TRIzol说明书的方法进行捻转血矛线虫总RNA的提取，具体步骤如下：(1)向装有捻转血矛线虫成虫的离心管中加入1mL TRIzol试剂，转移至0.1％DEPC浸泡处理的匀浆器中，冰上充分研磨后，转入一新离心管中室温静置5min；
(2)向离心管中加入200μL氯仿，用手大力摇管15s，室温静置3min；
(3)4℃离心机12000rpm离心15min，将上层水相小心转移至新的离心管中；
(4)向离心管中加入500μL异丙醇，颠倒混匀后，室温静置10min；
(5)4℃离心机12000rpm离心10min，弃上清；
(6)向离心管中加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)，涡旋混匀，洗涤RNA沉淀；
(7)4℃离心机7500rpm离心5min，弃去上清；
(8)重复上述洗涤步骤一次，在风机下晾干5min使残留乙醇挥发，用30μL的DEPC水溶解RNA；
(9)测定RNA浓度及纯度，－70℃保存或立即进行反转录。
2.cDNA模板的合成
(1)按下表所示在无RNase的PCR管中配制反应液：
Figure BDA0002452852620000051
(2)轻轻吹打混匀，65℃保温5min后，冰上迅速冷却，按下表配制反应液：
Figure BDA0002452852620000052
(3)缓慢混匀，42℃孵育60min；
(4)95℃保温5min,使酶失活，冰上放置；
(5)立即进行PCR扩增或者－20℃冻存备用。
3.引物合成
根据捻转血矛线虫ARF1蛋白相对应的开放阅读框编码序列，利用Primer Primer5.0软件设计上下游引物，交由苏州金唯智有限公司合成，上游引物GGATCCATGGGTAACATTTTCGG(SEQ ID NO.2)，下游引物CTCGAGTTATCCTCTGTTTTTCA(SEQ IDNO.3)。
4.PCR扩增ARF1
(1)以1.2.2合成的cDNA为模板，按下列表格所示配制PCR体系：
Figure BDA0002452852620000061
(2)用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心，按以下程序进行PCR反应：
94℃预变性5min，
94℃变性30s，
55℃退火30s，
72℃延伸1min
72℃再延伸10min，
总共35个循环。
16℃保存。
5.目的基因的克隆
5.1 PCR产物的回收与纯化
将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，使用OMEGA公司的Gelextraction kit对目的基因进行回收纯化，具体操作步骤参照说明书。
5.2 PCR产物与克隆载体连接
(1)将回收的PCR产物与克隆载体pMD-19T连接，体系如下表所示：
Figure BDA0002452852620000062
Figure BDA0002452852620000071
(2)用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心，4℃静置过夜
5.3感受态细胞的制备
(1)甘油菌复苏，37℃过夜振荡培养；
(2)次日按1：100将菌液转接入不含抗生素的LB液体培养基中，37℃180r/min培养2-3h至菌液OD值达到0.4-0.6；
(3)分装菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min，4℃，5000rpm离心5min；
(4)弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，去除残留的培养液，每管加入1mL预冷的0.1mol/L氯化钙溶液，轻轻重悬菌体，冰浴30min；
(5)4℃，5000rpm离心5min；
(6)弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，去除残留的培养液，每管加入200μL预冷的0.1mol/L氯化钙溶液(含15％甘油)，轻轻重悬菌体，4℃保存，24-48h使用转化效果最好，如暂时不用，—70℃保存。
5.4连接产物的转化
(1)将5.2中的10μL连接产物加入到200μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀；
(2)冰浴30min，在42℃水浴锅中热击90s，冰浴2min；
(3)加入800μL无抗性的LB液体培养基，37℃150rpm振荡培养50-60min；
(4)4℃离心机5000rpm离心5min，弃去800μL上清，剩余菌体沉淀用移液器轻轻吹打重悬，滴于含Amp(100μg/mL)的LB固体平板上，然后用灼烧过的涂布棒均匀涂布；
(5)平板用封口膜封口，37℃培养箱倒置培养12-16h。
5.5重组质粒双酶切鉴定
(1)从平板上随机挑取几个单菌落，接种于5mL加有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃180rpm振荡培养12-16h；
(2)使用OMEGA公司的plasmid mini kit抽提菌液中的质粒，具体步骤参照说明书；
(3)用内切酶进行双酶切鉴定，37℃酶切4h，体系如下表所示：
Figure BDA0002452852620000072
Figure BDA0002452852620000081
(4)经1％琼脂糖凝胶电泳检验后，将插入片段大小正确的阳性克隆送至苏州金唯智生物公司测序，获得正确的阳性质粒pMD-19T-ARF1。
6.构建原核表达载体
(1)对测序正确的重组质粒和表达载体pET-32a(+)进行大量抽提，选用相同的内切酶进行双酶切，体系如下表所示：
Figure BDA0002452852620000082
(2)37℃酶切4h后，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用OMEGA公司的gel extractionkit分别回收目的基因片段和pET-32a(+)载体片段，测定浓度；
(3)用T4连接酶将目的基因与pET-32a(+)载体进行连接，连接体系如下表，根据目的基因与载体片段的浓度确定相应体积。
Figure BDA0002452852620000083
(4)用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心，16℃静置过夜；
(5)将连接产物转化到BL21(DE3)感受态细胞中，方法同5.4，氨苄平板在37℃培养箱中倒置16h后从中随机挑取单克隆，提取质粒，双酶切鉴定，方法同5.5，把插入片段大小正确的阳性克隆送至苏州金唯智生物公司测序，获得正确的重组质粒pET-32a-ARF1。
7.重组表达质粒的诱导表达
7.1重组蛋白的时相表达分析
取6中含正确重组表达质粒pET-32a-ARF1的菌液100μL接种到10mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃180rpm振荡培养2h左右使菌液OD值达到0.4-0.6，取出1mL菌液后加入IPTG(终浓度为1mM)进行诱导，期间每隔1h、2h、3h、4h、5h各取1mL菌液，制备样品，进行SDS-PAGE，确定重组蛋白的最佳诱导时间。
7.2重组蛋白的分布
上述菌液大量诱导，4500rpm离心15min，弃上清，收集菌体沉淀，PBS清洗两次，用40mL左右的上清Binding Buffer重悬沉淀，－20℃过夜，次日用超声仪进行破碎，功率600W，工作2s，间隔5s，超声30min，4℃，8000rpm离心20min，分别收集上清和沉淀，其中沉淀用包涵体Binding Buffer 4℃过夜溶解，然后进行SDS-PAGE，确定重组蛋白的分布情况(图3)。
8.重组蛋白的纯化和复性
将菌体超声并离心后的沉淀用包涵体Binding Buffer溶解，4℃8000rpm离心20min，收集上清，0.22μm滤器过滤备用，5-10倍树脂体积的包涵体Binding Buffer平衡His蛋白亲和层析柱，过滤好的蛋白样品缓慢通过层析柱，5-10倍树脂体积的包涵体BindingBuffer冲洗杂蛋白，最后用30mL包涵体Elution Buffer缓慢洗脱目的蛋白。SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。将纯化较好的包涵体蛋白装入沸水煮过的透析袋中，浸入含梯度浓度(6M、4M、2M、0M)尿素的复性缓冲液中复性，最后在无钾PBS中透析。透析完成后，均放入PEG20000中浓缩至适量体积，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，过滤除菌并分装蛋白，－70℃保存备用。
9.rARF1 PLGA纳米颗粒的制备
(1)在无菌条件下制备聚合物纳米颗粒，将蛋白质rARF1(1mg/mL)溶于6％(w/v)PVA溶液中以形成内部水相(2mL PVA溶液中溶解2mg蛋白质rARF1)。
(2)每50mg PLGA溶解在在1mL二氯甲烷中得到5％(w/v)PLGA二氯甲烷溶液作为有机相。
(3)为了形成w/o乳液，将内部水相和有机相合并，用超声处理器于冰浴中超声4min(40w，5s，5s)。
(4)然后将该w/o乳液转移到含有溶解在去离子水中的6％(w/v)PVA的外部水相中，并且再次超声处理4min(40w，5s，5s)以获得最终的w/o/w乳液。最后，在室温下搅拌4h将有机溶剂蒸发以形成纳米颗粒。
(5)将纳米颗粒的溶液在4℃以40000rpm离心40min，然后收集上清液，使用BCA蛋白质测定试剂盒测定上清中蛋白质的量而计算蛋白质加载效率，然后用超纯水洗涤沉淀的纳米颗粒两次并离心。
(6)之后，将纳米颗粒置于冷冻干燥机中24h，随后在使用前将疫苗储存在-80度冰箱中。重组蛋白ARF1-PLGA纳米颗粒电镜观察结果见图4，其粒径在63-125nm。
实施例2.一种捻转血矛线虫重组蛋白ARF1免疫作用的检测
1.实验设计
将ICR小鼠随机分配为3组，每组8只，并在0天仅接种一次。在第14天对小鼠致死。3组分别为PBS组，rARF1组，rARF1-PLGA组。使用1mL疫苗(含量20μg rARF1蛋白)进行多点皮下(SC)注射。。
2.免疫保护效果的观察
2.1血清中抗体的检测
(1)在第14天收集小鼠抗血清然后并处死。通过ELISA进行抗体测试。根据制造商的说明书(HengYuan，Shanghai，China)，用小鼠ELISA试剂盒测定血清样品中IgG1，IgM和IgG2a的水平。
(2)简言之，用纯化的抗体(抗小鼠IgG1，IgG2a或IgM)包被96孔微量滴定板的孔，PBS稀释的小鼠血清样品中加入孔中，37℃，30min。
(3)用PBST洗涤后，将孔与HRP缀合的抗小鼠抗体一起温育，其分别用于测定抗体水平和同种型分析。
(4)加入200μl底物溶液后，用2M H2SO4终止其反应。每个平板都包括阳性和阴性对照。最后，在450nm的吸光度下观察结果。
2.2血清中细胞因子的检测
根据制造商的说明，用商业ELISA试剂盒(HengYuan，Shanghai，China)测量来自不同组的血清中所含的细胞因子IL-4，IL-12，IL-17，IFN-γ和TGF-β的含量。
表1小鼠免疫保护性试验结果
Figure BDA0002452852620000101
2.3树突状细胞表型的分析
使用小鼠脾脏淋巴细胞分离试剂盒分离脾细胞，然后将混合物细胞培养过夜。然后，舍弃细胞上清，PBS洗涤。之后，轻轻吹打贴壁细胞，并通过离心收集贴壁细胞，PBS洗涤2次，最后通过FACS Calibur流式细胞仪观察。DC上CD83的含量用anti-CD11c-APC和anti-CD83-PE检测。DC上CD86的含量用anti-CD11c-APC和anti-CD86-PE检测。
表2树突状细胞表型的分析结果
Figure BDA0002452852620000111
结果显示，rARF1、rARF1-PLGA免疫能刺激小鼠产生更高水平的体液(IgG1 IgG2a,IgM)和细胞介导的免疫反应(IFN-γ、IL-4、IL-12和IL-17)。
实施例3.一种捻转血矛线虫重组蛋白ARF1纳米材料亚单位疫苗的免疫保护检测
1.实验设计
将15头山羊(3～6月龄)分3个组，每组5头羊，分别为捻转血矛线虫纳米材料亚单位疫苗rARF1组(既免疫又攻虫)，阳性对照组(只攻虫不免疫)，阴性对照组(不攻虫也不免疫)。
实验组在第0天和第14天用500μg的捻转血矛线虫纳米材料亚单位疫苗溶于1mL的PBS中分别进行首次免疫和加强免疫。在第28天，对实验组和阳性对照组的山羊感染8000条捻转血矛线虫三期幼虫。在第63天屠宰山羊。攻虫后密切观察羊的采食情况，被毛及精神状态。
2.免疫保护效果的观察
2.1虫卵排出减少率
分别在实验的第50、52、54、56、58、60、62天对山羊直肠采集粪便，采用麦氏计数法对采集的粪便进行计数，并统计虫卵的排出动态。
虫卵减少率＝(阳性对照组平均每克粪虫卵数-rARF1实验组平均每克粪虫卵数)/阳性对照组平均每克粪虫卵数×100％。
结果(图5)显示，捻转血矛线虫纳米材料亚单位疫苗免疫组在实验的第50天开始有虫卵排除，然后一直增加，在第54天达到了虫卵排出量顶峰，之后开始回落。在整个实验过程中，与阳性对照组相比，捻转血矛线虫纳米材料亚单位疫苗免疫组的平均虫卵排出量降低了44.1％(P<0.001)。
2.2成虫减少率
在实验的第63天宰杀山羊，并挑取皱胃中的成虫，统计雌雄成虫和成虫总数。
雄虫减少率＝(阳性对照组平均雄虫数-rARF1实验组平均雄虫数)/阳性对照组平均雄虫数×100％。
雌虫减少率＝(阳性对照组平均雌虫数-rARF1实验组平均雌虫数)/阳性对照组平均雌虫数×100％。
成虫减少率＝(阳性对照组平均成虫数-rARF1实验组平均成虫数)/阳性对照组平均成虫数×100％。
结果显示，与阳性对照组相比，rARF1组山羊皱胃内雌虫数降低了53.6％(P<0.01)，雄虫数降低了59.79％(P<0.01)，成虫总数数降低了55.7％(P<0.01)。
表3山羊皱胃荷虫量
Figure BDA0002452852620000121
注：实验结果代表rHCA59和阳性对照组内5只山羊皱胃荷虫量。
数据用mean±SD显示，与阳性对照组的组间差异表示为(*P<0.05)。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种捻转血矛线虫重组ARF1 蛋白纳米亚单位疫苗及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 181
<212> PRT
<213> 捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)
<400> 1
Met Gly Asn Ile Phe Gly Asn Pro Phe Lys Gly Leu Phe Gly Lys Lys
1 5 10 15
Glu Met Arg Ile Leu Met Val Gly Leu Asp Ala Ala Gly Lys Thr Thr
20 25 30
Ile Leu Tyr Lys Leu Lys Leu Gly Glu Ile Val Thr Thr Ile Pro Thr
35 40 45
Ile Gly Phe Asn Val Glu Thr Val Glu Tyr Lys Asn Ile Ser Phe Thr
50 55 60
Val Trp Asp Val Gly Gly Gln Asp Lys Ile Arg Pro Leu Trp Arg His
65 70 75 80
Tyr Phe Gln Asn Thr Gln Gly Leu Ile Phe Val Val Asp Ser Asn Asp
85 90 95
Arg Glu Arg Val Gly Glu Ala Arg Glu Glu Leu Met Arg Met Leu Ala
100 105 110
Glu Asp Glu Leu Arg Asp Ala Val Leu Leu Val Phe Ala Asn Lys Gln
115 120 125
Asp Leu Pro Asn Ala Met Ser Ala Ala Glu Val Thr Asp Lys Leu Gly
130 135 140
Leu His Thr Leu Arg Asn Arg Ser Trp Tyr Ile Gln Ala Thr Cys Ala
145 150 155 160
Thr Ser Gly Asp Gly Leu Tyr Glu Gly Leu Asp Trp Leu Ser Asn Arg
165 170 175
Leu Lys Asn Arg Gly
180
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatccatgg gtaacatttt cgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcgagttat cctctgtttt tca 23
<210> 4
<211> 546
<212> DNA
<213> Haemonchus contortus
<400> 4
atgggtaaca ttttcgggaa tcctttcaaa ggcctttttg gcaaaaagga aatgcgaatt 60
ctcatggttg gattggatgc tgctggtaaa acgacaatat tgtacaagtt gaaactcgga 120
gaaatcgtca ctacgattcc aactataggt ttcaacgtcg aaactgtcga gtataagaat 180
atttctttca ccgtatggga cgttggaggt caggataaaa tcagacctct ctggaggcat 240
tacttccaaa atactcaggg acttattttt gttgtcgact caaatgatcg tgaacgagtt 300
ggggaggcaa gagaagagct tatgcgtatg cttgccgagg atgaacttag ggatgctgtt 360
ctgcttgttt tcgccaataa acaggatttg ccgaatgcta tgagtgcagc tgaagtcact 420
gacaaattag gtctacacac tttgagaaac aggtcgtggt acatccaggc tacatgcgca 480
acttcgggag atggtctcta tgaaggtctt gattggctga gcaaccggct gaaaaacaga 540
ggataa 546

Claims (5)

1.一种捻转血矛线虫重组ARF1蛋白纳米材料亚单位疫苗，该疫苗粒径为63~125nm，该疫苗由如SEQ ID NO.1所示的捻转血矛线虫重组蛋白ARF1经纳米材料PLGA包裹而制成；所述捻转血矛线虫重组ARF1蛋白纳米材料亚单位疫苗通过以下方法制备而成:
1）制备SEQ ID NO.1所示的重组ARF1蛋白；
2）将重组ARF1蛋白溶于4%~6%重量体积比的PVA溶液中形成内部水相，其中重组ARF1蛋白浓度为0.5~1mg/mL；
3）将PLGA溶解于二氯甲烷中得到浓度为50~55mg/mL的PLGA二氯甲烷溶液，将所述PLGA二氯甲烷溶液作为有机相；
4）将内部水相和有机相合并，用超声处理形成w/o乳液；
5）将所述w/o乳液转移到含有溶解在去离子水中的4%~6％重量体积比的PVA溶液的外部水相中，并且再次超声处理获得最终的w/o/w乳液；在25~28℃下搅拌将有机溶剂蒸发形成纳米颗粒；
6）将纳米颗粒的溶液再离心，然后用超纯水洗涤沉淀的纳米颗粒两次并离心，将获取的纳米颗粒冷冻干燥得到所述的捻转血矛线虫重组ARF1蛋白纳米材料亚单位疫苗；所述超声处理的条件为超声功率30~50W，超声5~10s，间隔5~10s，超声时间为4~5min。
2.权利要求1所述的捻转血矛线虫重组ARF1蛋白纳米材料亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包含以下步骤:
1）制备序列如SEQ ID NO.1所示的重组ARF1蛋白；
2）将重组ARF1蛋白溶于4%~6%重量体积比的PVA溶液中形成内部水相，其中重组ARF1蛋白浓度为0.5~1mg/mL；
3）将PLGA溶解于二氯甲烷中得到浓度为50~55mg/mL的PLGA二氯甲烷溶液，将所述PLGA二氯甲烷溶液作为有机相；
4）将内部水相和有机相合并，用超声处理形成w/o乳液；
5）将所述w/o乳液转移到含有溶解在去离子水中的4%~6％重量体积比的PVA溶液的外部水相中，并且再次超声处理获得最终的w/o/w乳液；在25~28℃下搅拌将有机溶剂蒸发形成纳米颗粒；
6）将纳米颗粒的溶液再离心，然后用超纯水洗涤沉淀的纳米颗粒两次并离心，将获取的纳米颗粒冷冻干燥得到所述的捻转血矛线虫重组ARF1蛋白纳米材料亚单位疫苗；所述超声处理的条件为超声功率30~50W，超声5~10s，间隔5~10s，超声时间为4~5min。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述PVA溶液浓度为6%；PLGA二氯甲烷溶液的浓度为50mg/mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在用超纯水洗涤前将所述纳米颗粒的溶液在4℃以40000rpm离心40min，然后收集上清液，使用BCA蛋白质测定试剂盒测定上清中蛋白质的量来计算蛋白质加载效率。
5.权利要求1所述的捻转血矛线虫重组ARF1纳米材料亚单位疫苗在制备预防羊捻转血矛线虫病的药物中的应用。
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