CN102512674A - 一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于防治鱼类致病性弧菌感染的广谱亚单位疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。该疫苗以副溶血弧菌表面具有保守结构的外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FlaA的融合蛋白OmpK-FlaA作为抗原成分。其特征是将副溶血弧菌的ompK和flaA基因通过重叠延伸PCR获得融合蛋白基因flaA-ompK；构建flaA-ompK－pET-28a重组质粒，经外源诱导表达并纯化获到高纯度融合蛋白FlaA-OmpK。本发明制备的疫苗安全无毒副作用，可以采用注射免疫,也可以采用口服肠溶微球疫苗免疫，可针对鱼类致病性弧菌（副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌）产生交叉免疫保护作用。

Description

一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗及制备方法

技术领域

本发明涉及一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗及制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，人工鱼类养殖规模迅速扩大，生产集约化程度不断提高。病害已经成为制约水产养殖业健康发展的瓶颈。据统计，全国水产养殖病害发病率达50%以上，损失率30%左右，每年直接损失高达百亿元之巨。在众多的细菌性病害中，弧菌病被公认为是鱼类养殖中最为严重的病害之一。主要的致病性弧菌包括：副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌。

随着水产养殖微生物病害的施虐，滥用抗生素的状况也愈发严重。抗生素残留引起的食品安全问题事关人们的身体健康和民生大事，已引起各国政府高度重视的问题。高效广谱弧菌疫苗的研发和应用有利于减少抗生素的滥用，保证水产品的食品安全; 同时可以防治致病微生物的感染，减少水产养殖病害发病率。

目前国外有近30多种商品化的鱼用疫苗。我国鱼用疫苗的研究起步较晚,获得国家新兽药证书的水产疫苗仅有3种，分别为草鱼出血病细胞灭活疫苗、嗜水气单胞菌病灭活疫苗以及牙鲆鱼溶藻弧菌、鳗弧菌、迟缓爱德华菌病多联抗独特型抗体疫苗。目前并没有一种有效地能够防治多种致病性弧菌对鱼类感染的疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗及制备方法，该疫苗疫苗具广谱性，可用于防治多种致病性弧菌引起的鱼类弧菌病。

本发明首先提供了一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，所述疫苗以副溶血弧菌外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FlaA的融合蛋白FlaA-OmpK作为抗原成分。抗原成分为FlaA和OmpK通过连接肽G1y₄Ser相连成重组融合蛋白FlaA-OmpK；重组融合蛋白FlaA-OmpK的氨基酸序列如SEQ.NO.1所示。

其中OmpK是主要的抗原成分。副溶血弧菌外膜蛋白OmpK与其他主要致病弧菌的外膜蛋白K的同源性高达95％以上。FlaA-OmpK亚单位疫苗具有良好的广谱性, 诱发产生的抗OmpK抗体对多种致病性弧菌（副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌）具有良好的交叉反应性, 可用于防治多种致病性弧菌（付溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌）对鱼类的感染。

鞭毛蛋白FlaA能够激活鱼肠道粘膜的TLR5受体，进而激活机体先天性免疫系统，具有增强免疫效果的佐剂作用。融和蛋白FLaA-OmpK具有很强的免疫原性, 诱发有效抗体的作用明显强于蛋白混合物FLaA＋OmpK以及蛋白OmpK。

本发明的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗诱发的抗体对于副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌具有良好的交叉反应性，可用于防治副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌对鱼类的感染。

所述疫苗的类型为腹腔注射疫苗或口服肠溶微球疫苗，免疫方式为腹腔注射免疫或口服免疫。

腹腔注射免疫时, 疫苗为重组融合蛋白FlaA-OmpK的生理盐水溶液,免疫剂量为80-100μg/次，按100g体重计；口服免疫时, 将口服肠溶微球疫苗掺合饵料中, 自然摄食,免疫剂量为80-200μg/天，按100g体重计, 连续2-4天口服免疫。

所述口服肠溶微球疫苗，采用丙烯酸树脂包裹融合蛋白FlaA-OmpK，使其具有肠溶功能，同时所制备的口服疫苗为微球状，粒径10－50nm。

所述口服肠溶微球疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1) 融合蛋白FlaA-OmpK 100mg溶于20mL TE-buffer中，10-30g丙烯酸树脂Ⅱ号溶于250mL乙醇中 ,这两种溶液在搅拌条件下混合均匀，作为内油相；

(2)内油相在10000r/min搅拌条件下缓慢加入1000mL液体石蜡，所述液体石蜡含0.1-1.0mL卵磷脂和0.1-0.6% Span80，乳化30min后，改为常规搅拌600r/min，持续搅拌至乙醇完全挥发，微球固化；

(3)离心收集微球颗粒，用乙醇洗涤数次，60℃干燥4h，即得口服肠溶微球疫苗。按照鱼的个体重量和摄食习惯，将所需剂量的口服肠溶疫苗微球与粉状鱼饲料按一定的比例混合，挤压成型，即可直接投料喂养，达到口服免疫效果。

所述融合蛋白FlaA-OmpK的制备包括如下步骤：

(1)以副溶血弧菌的DNA为模板, 进行PCR扩增，分别获得目标基因flaA和ompK；

(2)采用重叠延伸PCR技术，获得融合蛋白基因flaA-ompK；

(3)选用表达载体pET-28a，构建重组质粒flaA-ompK—pET-28a；转入感受态大肠杆菌BL21，筛选转化子；在IPTG诱导下表达目标蛋白；经镍柱亲和层析法纯化得到融合蛋白FlaA-OmpK。

本发明的优点：

1、本发明构建副溶血弧菌外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FLaA的融合蛋白FLaA-OmpK,并以融合蛋白作为疫苗的抗原成分。融和蛋白FLaA-OmpK诱发有效抗体的作用显著强于蛋白混合物Flaw＋OmpK。在相同免疫剂量(100μg/100g体重)的条件下, 融和蛋白FLaA-OmpK免疫组产生的有效抗体的效价是混合蛋白 FLaA＋OmpK免疫组的4倍。

2、OmpK是主要抗原成分。副溶血弧菌外膜蛋白OmpK与其他主要致病弧菌的外膜蛋白K的同源性高达95％以上。FLaA-OmpK亚单位疫苗具广谱性，可应用于防治包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌，鳗弧菌和创伤弧菌等同源性较高的致病弧菌引起的鱼类弧菌病。

3、鞭毛蛋白FlaA能够激活鱼肠道粘膜的TLR5受体，进而激活机体先天性免疫系统，从而显著增强鱼类机体对弧菌的抵抗能力。FlaA作为抗原成分，具有明显的增强免疫效果的佐剂作用。在相同免疫剂量(100μg/100g体重)的条件下, FLaA-OmpK组(不含佐剂)产生的抗OmpK抗体滴度明显高于OmpK组(含有增强佐剂)。

4、本发明所制备的FLaA-OmpK亚单位疫苗，可通过注射或口服方式进行给药免疫。口服疫苗采用丙烯酸树脂Ⅱ号包裹融合蛋白FLaA-OmpK，具有肠溶功能，避免了胃蛋白酶的降解作用。口服微球疫苗粒径10－50nm，其中10－30nm的粒子占70％以上，有利于鱼肠后段对微球的吸收。

附图说明

图1为PCR扩增flaA和ompK产物电泳分析图；1- ompk PCR扩增产物  2-flaA PCR扩增产物 3-Marker。

图2为PCR扩增融合基因flaA-ompK产物电泳分析图；1- Marker，2－PCR扩增产物。 

具体实施方式

以下所用生化试剂如无特别提及，均为常规试剂。

实施例1  FlaA-OmpK亚单位疫苗的制备

(1)副溶血弧菌 flaA和ompK目的基因的克隆

设计克隆flaA基因的引物：

上游：5-GGATCCATGGCGATTAACGTT-3（BamH I）

下游：5-CTCGAGGCCCAACAAGCTTAg-3 (Xho I)

设计克隆ompK基因的引物：  

上游： 5-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3（BanH I）

下游： 5-CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3（Hind III）

以副溶血弧菌(标准株ATCC17802）总DNA为模板，分别采用设计的引物进行鞭毛蛋白A基因片段和外膜蛋白K基因片段的PCR扩增。PCR产物进行电泳分析，可观察到明显的特异性条带。采用flaA引物的PCR产物约1150bp，采用ompK引物的PCR产物约730bp，电泳结果如图1所示。

分别将ompK 和 flaA的PCR产物用纯化试剂盒纯化后，连接pMD-19-T simple载体，构建pMD-19T-ompK和pMD19T-flaA重组质粒，转化至感受态E. coliDH5α, 蓝白筛选获得阳性重组菌。重组菌扩大培养后，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒。

将pMD-19T-OmpK重组质粒送上海生工进行测序鉴定，测序结果表明：ompK基因大小为732bp。所测序列用blast搜索比对，与副溶血弧菌所报导ompK序列（GenBank登录号D61392.1）同源性达100%，表明所得到的PCR产物是目标基因ompK。

将pMD-19T-FlaA重组质粒送上海生工进行测序鉴定，测序结果表明：flaA基因大小为1128bp。所测序列用blast搜索比对，和已登录的副溶血弧菌(RIMD2210633)鞭毛蛋白A(GenBank登录NP798640.1)基因的同源性高达99%，表明所得到的PCR产物是目的基因flaA。

 (2)融合蛋白基因 flaA-ompK的构建

设计重叠延伸PCR引物：

克隆融合片段flaA基因的引物：

FPA：5’-CGGGATCCATGGCGATTAACGTT -3’ （BamH I）

RPA：5’-GCTACCGCCACCGCCGCCCAACAAGCTTAG -3’

克隆融合片段ompK基因的引物：

FPK：5’-GGCGGTGGCGGTAGCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT- 3’

RPK：5’-CCGCTCGAG TTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA- 3’ (Xho I)

采用设计的PCR引物，以上述获得的flaA和ompK片段为模板，实施重叠延伸PCR操作，拼接扩增得融合基因flaA-ompK。延伸PCR产物进行电泳分析，可观察到目的片段，融合基因flaA-ompK片段的大小约为1800bp左右，与预计目的基因flaA-ompK（1875bp）相符合。

分别将载体质粒pET-28a(+)和融合基因flaA-ompK片段实施XhoI和BamHI双酶切，T4DNA连接酶连接，构建pET-28a-FlaA-Ompk重组质粒。将重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21，在含卡那霉素的LB培养基中经蓝白筛选获得重组菌。扩培重组菌, 收集重组质粒。

将pET28a-FlaA-OmpK重组质粒送上海生工进行测序鉴定，测序结果表明：融合基因flaA-ompK大小为1875bp，其中flaA基因片段为1128bp，ompK基因片段为732bp，连接头为15bp片段。将DNA测序结果用BLAST软件搜索比对，结果如下：融合基因flaA-ompK的序列与预测的融合基因序列比对，相似度为100%。

(3)重组蛋白Ompk、FlaA、FlaA-Ompk的表达与纯化

将鉴定后的含重组表达载体的E.coli BL21，接种于含50μg/mL卡那霉素LB培养基中，37℃培养至OD600约为0.5-0.8, 加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续培养5h。4℃，6000g 离心收集菌体。

将离心收集的菌体用适量预冷的PBS重悬，置冰浴中超声波破碎。4℃，6000g离心20min, 沉淀即为包涵体。根据Qiagen公司蛋白纯化说明书进行重组蛋白纯化。

将纯化产物置于透析袋，用TE缓冲液（100mmolL^-1,Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA)透析，透析液每6h换一次，透析6次。采用PEG20000进行浓缩。

重组蛋白FlaA-Ompk C端带有6个His标签，可用Ni-NTA亲和层析柱进行分离纯化。从图2的SDS-PAGE电泳分析表明，纯化后的重组蛋白FlaA-Ompk呈单一条带，达到电泳纯。

在本专利中作为参照物的重组蛋白Ompk、FlaA同理制备, 均达到电泳纯。

(4)重组蛋白FlaA-Ompk亚单位疫苗的制备

抗原蛋白冻干后, 4℃保存备用。

采用注射免疫方式时, 将冻干的抗原蛋白FlaA-Ompk直接用生理盐水溶解, 即可进行注射免疫。采用口服免疫方式时, 需制备成口服肠溶微球疫苗。

实施例2  FlaA-OmpK口服肠溶微球疫苗的制备

称取100mg FlaA-OmpK蛋白, 溶于20mL TE-buffer中，15g丙烯酸树脂Ⅱ号溶于250mL乙醇中, 这两种溶液磁力搅拌混合均匀，作为内油相。

该内油相于高速搅拌（≥10000r/min）下缓缓加入含1000mL含0. 5mL卵磷脂和0.35%Span80的液体石蜡中，乳化30min，后改为磁力搅拌（600r/min），持续搅拌使乙醇完全挥发，微球固化。离心收集沉淀，石油醚洗涤数次，减压干燥12h，即得最终产品。

所制备肠溶微球，其载药量为1%，包封率达77.5%±3.7%。电镜观察，粒子近球状，粒径分布10-50nm,  粒径10-30 nm 的粒子占70%。

按照鱼的个体重量和摄食习惯，将所需剂量的口服肠溶疫苗微球与粉状鱼饲料按一定的比例混合，挤压成型，即可直接投料喂养。

实施例3  FlaA-OmpK亚单位疫苗对海水养殖黑石斑鱼的免疫原性研究

3.1  FlaA-OmpK亚单位疫苗对海水养殖黑石斑鱼的免疫原性研究

健康的美洲黑石斑鱼(100±10g/尾)随机挑选分组, 完全适应养殖池环境后，进行免疫试验。

注射免疫方式, 分为4个免疫组（OmpK组,融合蛋白FlaA-OmpK高剂量组, 融合蛋白FlaA-OmpK低剂量组和混合蛋白组（OmpK +FlaA），每组各25尾。上述实验组每尾鱼给药量(0.2ml)分别为OmpK（100μg）、FlaA-OmpK（230μg）、FlaA-OmpK（100μg）、OmpK+FlaA等摩尔混合物（100μg）。OmpK组免疫时, 药物成分与弗氏完全佐剂（第一次免疫）/弗氏不完全佐剂（第二次免疫）按1:1混合, 完全乳化后，腹腔注射。含FlaA蛋白的免疫组, 均不添加佐剂。对照组注射0.2mL无菌生理盐水。首次免疫20天后，各组鱼按首免剂量和方式加强免疫一次。首次免疫后每十天随机挑选每组3尾石斑鱼断尾采血，分离血清，-20℃保存备用。

口服免疫方式, 将石斑鱼随机分为二组，每组各25尾，分别投喂含有微球疫苗和未加疫苗的饵料。含有微球疫苗的自制饵料中重组蛋白含量为100μg/g饵料。第一次免疫，按0.8g饵料/尾投喂石斑鱼，即每次每只石斑鱼免疫剂量为80μg左右，连续投喂(自然摄食)3天。首次免疫后第20天加强免疫一次，口服免疫剂量与第一次免疫相同。

与对照组相比，各重组蛋白免疫组均产生了显著的特异性抗体效价。实验结果(表1)表明:

（1） 在相同给药剂量(100μg/尾鱼)条件下，注射FlaA-OmpK组的抗体效价最高。FlaA-OmpK组的抗OmpK抗体效价是FlaA+OmpK组的4倍,表明融合蛋白FlaA-OmpK的免疫原性显著高于混合蛋白OmpK +FlaA。FlaA-OmpK组(不含佐剂)的抗OmpK抗体效价是OmpK组(含有免疫增强佐剂)的2倍,表明融合蛋白FlaA-OmpK中的FlaA具有明显的免疫增强作用。

（2）在试验给药的剂量范围内，注射FlaA-OmpK高剂量组和低剂量组的血清抗体效价没有差异，表明在低剂量FlaA-OmpK (100μg/尾鱼)时已足以引起石斑鱼的强烈的免疫反应。

（3）口服疫苗组的抗体效价在第30-40天达到最高值, 明显高于对照组，抗体效价达到1280，表明口服疫苗已诱发免疫反应，尽管抗体效价低于注射组的抗体效价。

 

表1  ELISA检测第四十天鱼血清抗体效价

3.2  FlaA-OmpK免疫黑石斑鱼抗血清对不同弧菌的交叉反应性研究

分别将副溶血弧菌(标准株、野生株)、哈维氏弧菌(标准株、野生株)、鳗弧菌(标准株、野生株)、溶藻弧菌(标准株、野生株)以及2株创伤弧菌包被96孔酶标板，采用间接ELISA测定黑石斑鱼FlaA–OmpK抗血清对5种弧菌的交叉反应性。

实验结果表明, 黑石斑鱼FlaA–OmpK抗血清对于副溶血弧菌(标准株、野生株)、哈维氏弧菌(标准株、野生株) 、溶藻弧菌(标准株、野生株)和鳗弧菌(标准株、野生株)均具有良好的交叉反应性。实验稀释度250-4000时, 其P/N≥2.1。

创伤弧菌分为表面有荚膜型和表面无荚膜型。FlaA-OmpK免疫的黑石斑鱼抗血清对表面无荚膜的创伤弧菌具有明显的交叉反应性, 但对表面有荚膜的创伤弧菌反应性较弱。创伤弧菌表面荚膜影响了抗血清中抗体与创伤弧菌外膜蛋白的接触。

表2  FlaA-OmpK免疫的黑石斑鱼抗血清对不同弧菌的交叉反应性(滴度)

实施例4  FlaA-OmpK亚单位疫苗对黑石斑鱼预防副溶血弧菌(Vp89)感染的免疫保护作用

攻击病原菌为副溶血弧菌野生株(Vp89), 首先试验确定半致死量LD₅₀。随机将黑石斑鱼(100±10g/尾)分成3组，每组10尾。Vp89活菌液按照梯度稀释，每只黑石斑鱼腹腔注射0.2mL菌液，观察14天，记录死亡的个数。测定Vp89的LD₅₀为2.53×10⁶，攻毒菌数采用10×LD₅₀，即2.53×10⁷。

对照组的黑石斑鱼人工感染后表现出典型的急性细菌出血性败血病症状:皮肤和鳍溃烂出血，腹部肿胀，眼球突出，鳃丝和肠道充血，少量腹水，肝脏肿大，具出血点，肠道充血发红，胆囊萎缩，性腺发炎，后肾肿大，大多数在感染后2-4日内死亡。从濒死的鱼体中分离病菌重新鉴定证明与用于人工感染的菌株相同。

本实施例考察了FlaA-OmpK亚单位疫苗在不同给药方式时对副溶血弧菌感染的预防保护作用。免疫剂量与实施例3相同, 即注射组, 免疫剂量为100μg/尾鱼, 20天后再免疫第2次; 口服微球疫苗组, 平均每天每尾鱼投喂饵料0.8g, 其中含肠溶微球疫苗80μg, 自然摄食, 连续3天投喂含肠溶微球疫苗的饵料, 20天后再免疫第2次。

用融合蛋白FlaA-OmpK免疫过的黑石斑鱼对于副溶血弧菌Vp89的攻击均表现出较高的抵抗能力。FlaA-OmpK注射组对于10倍LD₅₀剂量副溶血弧菌Vp89的攻击,保护率仍高达80%; 口服 FlaA–Ompk保护率为50%，虽然低于注射组，但也达到较理想的效果。本专利所提供的FlaA-OmpK亚单位疫苗, 无论采用注射免疫方式或口服肠溶微球疫苗免疫方式, 均能有效地发挥免疫保护作用, 预防副溶血弧菌感染。

 

表3  FlaA –OmpK免疫的黑石斑鱼对副溶血弧菌Vp89攻击的免疫保护作用

实施例5  FlaA-OmpK亚单位疫苗对欧洲鳗鲡预防鳗弧菌(SMW5)感染的免疫交叉保护作用

攻击病原菌为鳗弧菌野生株(SMW5), 首先试验确定半致死量。随机将欧洲鳗鲡(100±10g/尾)分成4组，每组14尾。SMW5活菌液按照梯度稀释，每只欧洲鳗鲡腹腔注射0.2mL菌液，观察14天，记录死亡的个数。测定SMW5的LD₅₀为1.26×10⁶，攻毒菌数采用10×LD₅₀，即1.26×10⁷。

本实施例随机选择18只100±10g/尾欧洲鳗鲡,分为3组,1组为对照组, 另2组为实验组。2个实验组分别注射100μg/尾鱼和3000μg/尾剂量的FlaA-OmpK,考察FlaA-OmpK疫苗的安全性。在实验过程中, 未观察到死亡或其他生长异常情况。实验表明, FlaA-OmpK亚单位疫苗具有安全性。

考察了FlaA-OmpK亚单位疫苗不同给药方式免疫的欧洲鳗鲡对鳗弧菌野生株(SMW5)感染的免疫交叉保护作用。注射疫苗组, 每次免疫剂量100μg/尾鱼; 口服微球疫苗组, 免疫剂量80μg/尾鱼.天, 连续3天。免疫后第21天进行鳗弧菌野生株(SMW5)的攻毒实验。实验结果(表4)表明：一次注射融合蛋白FlaA-Ompk, 使欧洲鳗鲡对鳗弧菌的攻击产生较好的保护作用，保护率可达到76.8%。口服FlaA-Ompk微球疫苗组一次口服免疫的保护率也达到42.9%。

 

表4  FlaA –OmpK免疫的欧洲鳗鲡对鳗弧菌SMW5攻击的免疫保护作用

<110>  福州大学

<120>  一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗及制备方法

<160>  1    

 

<210>  1

<211>  624

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<221> 连接肽

<222> (377)...(381)

<400>  1

 

Met Ala Ile Asn Val Asn Thr Asn Val Ser Ala Met Thr Ala Gln Arg

1 5 10 15

Tyr Leu Asn His Ala Ala Lys Gly Gln Gln Lys Ser Met Glu Arg Leu

20 25 30

Ser Ser Gly Tyr Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

35 40 45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Ala Gln Ser Arg Gly Leu Asp Met Ala

50 55 60

Val Lys Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Val Ala Glu Gly

65 70 75 80

Ala Met Asn Glu Ser Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

85 90 95

Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ala Glu Arg Val Ala Ile

100 105 110

Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

115 120 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

130 135 140

Gln Ser Phe Gln Ile Gly Ala Asp Ser Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

145 150 155 160

Met Gly Ser Leu Arg Ser Asp Thr Ser Ala Met Gly Gly Lys Ser Tyr

165 170 175

Ser Ala Glu Glu Gly Lys Asp Ala Ser Trp Thr Val Gly Asp Lys Thr

180 185 190

Glu Leu Lys Met Ser Tyr Thr Asn Lys Gln Gly Glu Glu Lys Glu Leu

195 200 205

Thr Ile Lys Ala Lys Gln Gly Asp Asp Ile Glu Gln Leu Ala Thr Tyr

210 215 220

Ile Asn Gly Gln Ser Glu Asp Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Asp Gly

225 230 235 240

Lys Leu Gln Val Phe Ala Ser Thr Gln Lys Val Asn Gly Glu Val Glu

245 250 255

Phe Ser Gly Asn Leu Ala Gly Glu Ile Gly Phe Gly Asp Ala Lys Asp

260 265 270

Val Thr Val Lys Asp Ile Asp Val Thr Thr Val Ala Gly Ser Gln Glu

275 280 285

Ala Val Ala Val Ile Asp Gly Ala Leu Lys Ser Val Asp Ser Gln Arg

290 295 300

Ala Ser Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser Asn

305 310 315 320

Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Asn Ser Arg Ile Lys

325 330 335

Asp Thr Asp Tyr Ala Lys Glu Thr Thr Ala Met Thr Lys Ser Gln Ile

340 345 350

Leu Gln Gln Ala Ser Thr Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ser Pro

355 360 365

Ser Ala Ala Leu Ser Leu Leu Gly Gly Gly Gly Gly SerAla Asp Tyr

370 375 380

Ser Asp Gly Asp Ile His Lys Asn Asp Tyr Lys Trp Met Gln Phe Asn

385 390 395 400

Leu Met Gly Ala Phe Asn Glu Leu Pro Gly Phe Pro Asp Gly Ser Asn

405 410 415

His Asp Tyr Leu Glu Met Glu Phe Gly Gly Arg Ser Gly Ile Phe Asp

420 425 430

Leu Tyr Gly Tyr Val Asp Val Phe Asn Leu Ala Ser Asp Pro Gly Ser

435 440 445

Asp Lys Ser Gly Lys Glu Lys Ile Phe Met Lys Phe Ala Pro Arg Met

450 455 460

Ser Leu Asp Ala Val Thr Gly Lys Asp Leu Ser Phe Gly Pro Val Gln

465 470 475 480

Glu Leu Tyr Val Ser Thr Leu Met Glu Trp Gly Gly Ala Ser Glu Val

485 490 495

Asn Ser Gln Lys Ile Gly Leu Gly Ser Asp Val Met Val Pro Trp Leu

500 505 510

Gly Lys Ile Gly Leu Asn Leu Tyr Gly Thr Tyr Asp Ser Asn Lys Lys

515 520 525

Asp Trp Asn Gly Tyr Gln Ile Ser Thr Asn Trp Phe Lys Pro Phe Tyr

530 535 540

Phe Phe Glu Asn Gly Ser Phe Ile Ser Tyr Gln Gly Tyr Ile Asp Trp

545 550 555 560

Gln Phe Gly Met Lys Asp Glu Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Gly Gly Ala

565 570 575

Met Phe Asn Gly Ile Tyr Trp His Ser Asp Arg Phe Ala Val Gly Tyr

580 585 590

Gly Leu Lys Gly Tyr Lys Asn Ile Tyr Gly Ile Lys Glu Val Asn Gly

595 600 605

Val Asp Ser Thr Gly Phe Gly His Tyr Ile Ala Val Thr Tyr Lys Phe

610 615 620

 

 

Claims (8)

1.一种鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗以副溶血弧菌外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FlaA的融合蛋白FlaA-OmpK作为抗原成分。

2.根据权利要求1所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于，抗原成分为FlaA和OmpK通过连接肽G1y₄Ser相连成重组融合蛋白FlaA-OmpK；重组融合蛋白FlaA-OmpK的氨基酸序列如SEQ.NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于，该疫苗用于防治副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌对鱼类的感染。

4.根据权利要求1所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗的类型为腹腔注射疫苗或口服肠溶微球疫苗，免疫方式为腹腔注射免疫或口服免疫。

5.根据权利要求4所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于：腹腔注射免疫时, 疫苗为重组融合蛋白FlaA-OmpK的生理盐水溶液,免疫剂量为80-100μg/次，按100g体重计；口服免疫时, 将口服肠溶微球疫苗掺合饵料中, 自然摄食,免疫剂量为80-200μg/天，按100g体重计, 连续2-4天口服免疫。

6.根据权利要求4所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于：所述口服肠溶微球疫苗，采用丙烯酸树脂包裹融合蛋白FlaA-OmpK，使其具有肠溶功能，同时所制备的口服疫苗为微球状，粒径10－50nm。

7.根据权利要求4或6所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于：所述口服肠溶微球疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1) 融合蛋白FlaA-OmpK 100mg溶于20mL TE-buffer中，10-30g丙烯酸树脂Ⅱ号溶于250mL乙醇中 ,这两种溶液在搅拌条件下混合均匀，作为内油相；

(2)内油相在10000r/min搅拌条件下缓慢加入1000mL液体石蜡，所述液体石蜡含0.1-1.0mL卵磷脂和0.1-0.6% Span80，乳化30min后，改为常规搅拌600r/min，持续搅拌至乙醇完全挥发，微球固化；

(3)离心收集微球颗粒，用乙醇洗涤数次，60℃干燥4h，即得口服肠溶微球疫苗。

8.根据权利要求1或2所述的鱼类广谱弧菌亚单位疫苗，其特征在于：所述融合蛋白FlaA-OmpK的制备包括如下步骤：

(1)以副溶血弧菌的DNA为模板, 进行PCR扩增，分别获得目标基因flaA和ompK；

(2)采用重叠延伸PCR技术，获得融合蛋白基因flaA-ompK；

(3)选用表达载体pET-28a，构建重组质粒flaA-ompK—pET-28a；转入感受态大肠杆菌BL21，筛选转化子；在IPTG诱导下表达目标蛋白；经镍柱亲和层析法纯化得到融合蛋白FlaA-OmpK。

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