CN111732640A - 一种重组鳗弧菌OmpA蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于疫苗学技术领域，具体涉及一种重组鳗弧菌OmpA蛋白及其制备方法和应用。该所述重组鳗弧菌OmpA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，可用于增强水产动物对鳗弧菌的免疫，免疫效果好。

Description

一种重组鳗弧菌OmpA蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于疫苗学技术领域，具体涉及一种重组鳗弧菌OmpA蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种革兰氏阴性菌，能够感染包括鱼类、虾类、贝类等多种水产动物，鳗弧菌感染可导致弧菌病，该病是世界流行性疾病，可发生在任何季节，多年来给世界产业养殖造成了严重的经济损失。
常见报道的鱼类疫苗有灭活疫苗、减毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等。亚单位疫苗因其接种剂量小、免疫原性强、抗体出现早、滴度高、持续时间长和毒副作用小等优点而得到关注。中国专利文献CN 102988968A即公开了一种利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其应用，其以鳗弧菌C312为模板进行PCR扩增，并通过大肠杆菌表达系统表达得到了重组鳗弧菌鞭毛蛋白FlaB，该重组鳗弧菌鞭毛蛋白FlaB与佐剂混合后用于免疫牙鲆，对免疫后的牙鲆进行终浓度为5x106cfu/ml的鳗弧菌悬液100uL的攻毒实验，该疫苗的相对免疫保护效率可达78％。其中，重组鳗弧菌鞭毛蛋白的用量为15μg。
重组的外膜蛋白能够保持天然的免疫原性，刺激鱼体后产生特异性抗体，对病原菌的感染产生一定的免疫保护效率，某些还能够显著的增强宿主吞噬细胞的吞噬活性，因此逐步成为鱼类亚单位疫苗研究的热点。
细菌外膜蛋白虽然是一个很重要的免疫原，在疫苗中的应用报道很多，但并不是所有外膜蛋白都具有免疫保护效应，并且在不同菌株中同一种外膜蛋白的免疫保护效应也有一定差异。
发明内容
本发明提供一种重组鳗弧菌OmpA蛋白，以解决现有技术中鳗弧菌外膜蛋白免疫原性弱的问题。该重组鳗弧菌OmpA蛋白可在用量更少的情况下取得与上述重组鳗弧菌鞭毛蛋白FlaB相当的免疫保护效果。
本发明的目的之二在于提供了所述重组鳗弧菌OmpA蛋白的制备方法。
本发明的目的之三在于提供了一种鳗弧菌疫苗。
本发明的目的还在于提供了所述重组鳗弧菌OmpA蛋白的用途。
本发明的重组鳗弧菌OmpA蛋白采用如下技术方案：一种重组鳗弧菌OmpA蛋白，所述重组鳗弧菌OmpA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组鳗弧菌OmpA蛋白用于增强水产动物对鳗弧菌的免疫。
优选的，编码所述重组鳗弧菌OmpA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的重组鳗弧菌OmpA蛋白的制备方法采用如下技术方案：包括下述步骤：(1)以鳗弧菌C312为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增外膜蛋白OmpA基因；(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物与pEASY-T1 simple载体连接，连接液转化大肠杆菌DH5a，筛选质粒为OmpA-Ts；(3)利用限制性内切酶SmaI对所述OmpA-Ts载体进行酶切，酶切产物纯化，回收得到OmpA基因片段；(4)将载体pET259用SwaI酶切后回收并将其与步骤(3)回收得到的OmpA基因片段用T4 DNA连接酶连接后连接液转化大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pEtOmpA；(5)再将所述质粒pEtOmpA分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，表达即为SEQ ID NO.1中的氨基酸序列所示的重组鳗弧菌OmpA蛋白；所述引物为
F1:5’-CCCGGGATGATAACGATAAATAGGAAAG–3’；
R1:5’-CCCGGG TTTCACTTCATAATCAAAGCT-3’；
所述鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNO.6250。
本发明的鳗弧菌疫苗采用如下技术方案：所述鳗弧菌疫苗的原料包括如上述任意一项所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白。
优选的，采用腹腔注射所述鳗弧菌疫苗的方式进行免疫，所述重组鳗弧菌OmpA蛋白的用量为10μg/次，免疫一次后采用lx107cfu/ml的鳗弧菌对被免疫水产动物进行攻毒，相对免疫保护效率可达74％。正常情况下，疫苗中具有免疫原性的重组鳗弧菌OmpA蛋白的用量越大，免疫效果更好，实际使用中可对疫苗中重组鳗弧菌OmpA蛋白的用量进行适当增减，以达到更好的免疫效果。
优选的，所述鳗弧菌疫苗的原料还包括佐剂。
优选的，所述佐剂为Al(OH)3，所述佐剂由5wt％NaOH和5wt％Al2(SO4)3以2:5的体积比混合、离心后，将离心所得沉淀悬浮于PBS中至0.2mg/ml制备得到；所述鳗弧菌疫苗中重组鳗弧菌OmpA蛋白与佐剂的质量比为1:1。
本发明的重组鳗弧菌OmpA蛋白的用途采用下述技术方案：如上述任意一项所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白在制备增强水产动物免疫力的药物中的应用。
优选的，所述水产动物包括但不限于鱼类、虾类和贝类。例如，常见的鲑鱼、虹鳟、鳗鲡、香鱼、鲈鱼、鳕鱼、大菱鲆、牙鲆、黄鱼等。
优选的，所述水产动物为牙鲆。
本发明的有益效果是：本发明的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重组鳗弧菌OmpA蛋白可在用量更少的情况下取得与上述重组鳗弧菌鞭毛蛋白FlaB相当的免疫保护效果。外膜蛋白OmpA在革兰氏阴性菌细胞外膜上含量最多，在不同菌种中具有高度保守性，OmpA具有较强的免疫原性，可作为先天免疫靶标，激活宿主的先天免疫和适应性免疫，加强杀菌效果。
本发明的重组鳗弧菌OmpA蛋白用于免疫动物时，在用量为10μg/次，免疫一次后采用lx107cfu/ml的鳗弧菌对被免疫水产动物进行攻毒的情况下，相对免疫保护效率即可达74％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的纯化后的重组鳗弧菌OmpA外膜蛋白。泳道M，分子量标准；泳道1，纯化后的重组鳗弧菌OmpA蛋白。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
(1)质粒提取、DNA(PCR)产物纯化和DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司的相应试剂盒”；
(2)质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell:Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Press 2001)；
(3)所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
1.1本发明的重组鳗弧菌OmpA蛋白的氨基酸序列为：
SEQ ID NO.1：
MITINRKGKSMKKLAAAAVSMALVFASSAAMAEVYVGAKVGKSWLDDACRAGDVCEDESSTVGAYLGYQAFNWLSLEAGYDYLGKFSGAGLNDEKVTAITLAPKVSLPLTDAIALYAKVGGAYVDYGNKDDYSYLGAAGIEFNTDNNVTLRLEYQSLTDINNDLVRAAGNSATLGVSYKFGGSKAEPAPVIVQEVFVEEVVQPMVEPVVIPQEPETVVKHVPFQRLDSSSFAHNSTKLTAESTNQLDKLVKYLQAYPQADAEIIGHTDSTGAAAYNQKLSEKRAQVVADVVIAKGVDANRLTVKGEGENSPIASNDTVEGRKQNRRVDIVIPSFDYEVK
(a)序列特征:
长度:339
类型:氨基酸序列
链型:单链
拓扑结构:线性
(b)分子类型:蛋白质
(c)假设:否
(d)反义:否
(e)最初来源:鳗弧菌
(f)结构特点:该蛋白预期含有一个类似OmpA结构域(11-329)。
1.2编码该重组鳗弧菌OmpA蛋白的核苷酸序列为：
SEQ ID NO.2：
ATGATAACGATAAATAGGAAAGGAAAAAGTATGAAAAAGTTAGCAGCAGCAGCAGTTTCAATGGCGCTTGTTTTTGCATCTTCTGCCGCAATGGCTGAAGTATACGTAGGTGCTAAAGTTGGTAAATCTTGGCTTGATGACGCTTGTCGTGCTGGAGATGTGTGTGAAGATGAATCTTCTACCGTCGGTGCTTACCTTGGTTACCAAGCGTTTAATTGGCTTTCATTAGAGGCAGGTTACGATTACTTGGGCAAATTTAGTGGTGCGGGGCTGAATGATGAAAAAGTAACGGCCATTACACTCGCACCGAAAGTCAGCCTTCCTTTGACTGATGCCATTGCCTTATATGCTAAAGTCGGCGGTGCTTATGTTGACTATGGCAATAAAGATGATTACTCATATTTAGGTGCCGCTGGTATTGAGTTCAACACCGATAATAACGTCACTTTACGTTTGGAATATCAAAGCCTCACCGATATTAATAACGATCTTGTCCGAGCGGCAGGTAACTCGGCTACCTTAGGTGTTTCGTATAAATTTGGTGGAAGTAAAGCAGAACCTGCGCCAGTCATCGTGCAAGAGGTGTTTGTTGAAGAAGTTGTACAGCCAATGGTTGAGCCTGTCGTTATTCCCCAAGAACCTGAAACAGTTGTTAAGCATGTGCCATTTCAACGTTTGGACAGCAGTAGCTTTGCCCATAACAGTACTAAGCTAACAGCAGAGAGTACTAACCAGCTTGATAAACTAGTGAAATATTTGCAAGCTTACCCACAAGCCGATGCTGAAATTATTGGTCACACTGACTCAACTGGCGCTGCGGCTTACAACCAGAAACTATCAGAAAAACGCGCACAAGTTGTTGCTGATGTTGTGATTGCTAAAGGTGTGGATGCGAACCGTCTTACCGTAAAAGGTGAAGGGGAAAATAGCCCAATCGCATCGAACGATACAGTAGAAGGTCGAAAGCAAAATCGTCGTGTTGATATCGTTATTCCAAGCTTTGATTATGAAGTGAAATAA
实施例2鳗弧菌外膜蛋白OmpA表达载体的构建方法：
2.1以鳗弧菌C312为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增鳗弧菌外膜蛋白OmpA基因。PCR条件为:94℃，60S预变性模板DNA，然后94℃40S，49℃60S，72℃60S，5个循环；然后94℃40S，62℃60S，72℃60S，20个循环后再在72℃延伸反应10min。利用细菌基因组提取试剂盒提取鳗弧菌基因组，以其作为模板PCR扩增目的基因；产物同载体pEASY-T1simple(购于Transgen Biotech，北京)在室温连接1小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒OmpA-Ts，利用限制性内切酶SmaI对OmpA-Ts载体进行酶切，酶切产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化，回收的OmpA基因片段。
2.2构建重组表达质粒pEtOmpA：将载体pET259(pET259构建过程参见Zheng,W.J.,Hu,Y.H.,Sun,L.,2010.Cloning and analysis of a ferritin Subunit from turbot(Seophthalmu Smaximus).Fish.shellfish.immunol.28,829-836)用SwaI酶切后回收，将其与上述纯化的PCR片段用T4 DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(100μg/ml)的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pEtOmpA，转化感受态细胞后挑取克隆进行PCR验证，阳性克隆提取质粒进行序列测定，确保无突变和移码。再将质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，表达即为SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示的重组蛋白。
其中LB培养基具体为：组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白陈，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.6250，保藏日期2012年6月21日，分类命名为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
引物具体为F1:5-CCCGGGATGATAACGATAAATAGGAAAG-3；R1:5-CCCGGGTTTCACTTCATAATCAAAGCT-3；酶切位点为SmaI。
实施例3重组外膜蛋白OmpA的诱导表达和纯化
将实施例2制得的质粒pEtOmpA用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取转化子，将其命名为BL21/pEtOmpA。
将BL21/pEtOmpA于含有卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养；取lml过夜后的培养液，加入100ml新鲜的含有卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至0D600为0.6，加入终浓度为0.4mM的IPTG，30℃继续以转速160rpm摇动培养4-5h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白亲和层析柱His Trap HP Columns(购于美国GE Healthcare公司)回收纯化，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25-30min，随后，15v/cm电压下电泳2-2.5h)，测定其分子量大小(参见图1)。将纯化的蛋白经质谱分析，发现它的蛋白质质量与OmpA相同，证实其为具有OmpA序列的外膜蛋白。
其中，裂解液：终浓度为10mM NaH2PO4、10mM Tris和8M尿素，pH8.0。
实施例4
重组鳗弧菌OmpA蛋白作为疫苗的应用
步骤1)佐剂及疫苗混合液的制备
佐剂制备:将5％(质量比)NaOH和5％(质量比)Al2(SO4)3以2:5体积比混合，将混合物以10，000g离5分钟。将沉淀悬浮于PBS中至0.2mg/ml。
疫苗混合液制备：将上述实施例3纯化得到的重组鳗弧菌OmpA蛋白在PBS中稀释至200μg/ml。将稀释后的重组鳗弧菌OmpA蛋白与佐剂等体积混合。佐剂对照液制备：将PBS与佐剂等体积混合。PBS组成成分按重量百分比计:0.8％NaCl，0.02％KCl，0.358％Na2HPO4.12H2O，0.024％NaH2PO4，余量为水。
步骤2)以重组鳗弧菌OmpA蛋白为原料制备得到的疫苗的免疫应用。将80条牙鲆(每条重约15g)随机分为2组，每组40条。将这2组分别命名为A和B组。将A组的每条鱼分别腹腔注射100μL上述步骤1)的含有重组鳗弧菌OmpA蛋白疫苗混合液，将B组的每条鱼分别腹腔注射100μL上述步骤1)的佐剂对照液。
步骤3)鳗弧菌液的制备。在LB培养基中培养鳗弧菌C312至OD600为1，然后离心(5000g，4℃)10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为lx107 cfu/ml。
步骤4)疫苗免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤3)的鳗弧菌悬液腹腔注射步骤2)的2组鱼，每条鱼的注射量为100μl。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，10条；B组，39条；利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：
RPS＝100％x(1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)根据此公式算出OmpA的免疫保护效率为74％，因此，所得疫苗能够有效保护牙鲆抵御鳗弧菌侵染。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南阳师范学院
<120> 一种重组鳗弧菌OmpA蛋白及其制备方法和应用
<130> AJ202992
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 339
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ile Thr Ile Asn Arg Lys Gly Lys Ser Met Lys Lys Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Val Ser Met Ala Leu Val Phe Ala Ser Ser Ala Ala Met Ala
20 25 30
Glu Val Tyr Val Gly Ala Lys Val Gly Lys Ser Trp Leu Asp Asp Ala
35 40 45
Cys Arg Ala Gly Asp Val Cys Glu Asp Glu Ser Ser Thr Val Gly Ala
50 55 60
Tyr Leu Gly Tyr Gln Ala Phe Asn Trp Leu Ser Leu Glu Ala Gly Tyr
65 70 75 80
Asp Tyr Leu Gly Lys Phe Ser Gly Ala Gly Leu Asn Asp Glu Lys Val
85 90 95
Thr Ala Ile Thr Leu Ala Pro Lys Val Ser Leu Pro Leu Thr Asp Ala
100 105 110
Ile Ala Leu Tyr Ala Lys Val Gly Gly Ala Tyr Val Asp Tyr Gly Asn
115 120 125
Lys Asp Asp Tyr Ser Tyr Leu Gly Ala Ala Gly Ile Glu Phe Asn Thr
130 135 140
Asp Asn Asn Val Thr Leu Arg Leu Glu Tyr Gln Ser Leu Thr Asp Ile
145 150 155 160
Asn Asn Asp Leu Val Arg Ala Ala Gly Asn Ser Ala Thr Leu Gly Val
165 170 175
Ser Tyr Lys Phe Gly Gly Ser Lys Ala Glu Pro Ala Pro Val Ile Val
180 185 190
Gln Glu Val Phe Val Glu Glu Val Val Gln Pro Met Val Glu Pro Val
195 200 205
Val Ile Pro Gln Glu Pro Glu Thr Val Val Lys His Val Pro Phe Gln
210 215 220
Arg Leu Asp Ser Ser Ser Phe Ala His Asn Ser Thr Lys Leu Thr Ala
225 230 235 240
Glu Ser Thr Asn Gln Leu Asp Lys Leu Val Lys Tyr Leu Gln Ala Tyr
245 250 255
Pro Gln Ala Asp Ala Glu Ile Ile Gly His Thr Asp Ser Thr Gly Ala
260 265 270
Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Lys Arg Ala Gln Val Val Ala
275 280 285
Asp Val Val Ile Ala Lys Gly Val Asp Ala Asn Arg Leu Thr Val Lys
290 295 300
Gly Glu Gly Glu Asn Ser Pro Ile Ala Ser Asn Asp Thr Val Glu Gly
305 310 315 320
Arg Lys Gln Asn Arg Arg Val Asp Ile Val Ile Pro Ser Phe Asp Tyr
325 330 335
Glu Val Lys
<210> 2
<211> 1020
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgataacga taaataggaa aggaaaaagt atgaaaaagt tagcagcagc agcagtttca 60
atggcgcttg tttttgcatc ttctgccgca atggctgaag tatacgtagg tgctaaagtt 120
ggtaaatctt ggcttgatga cgcttgtcgt gctggagatg tgtgtgaaga tgaatcttct 180
accgtcggtg cttaccttgg ttaccaagcg tttaattggc tttcattaga ggcaggttac 240
gattacttgg gcaaatttag tggtgcgggg ctgaatgatg aaaaagtaac ggccattaca 300
ctcgcaccga aagtcagcct tcctttgact gatgccattg ccttatatgc taaagtcggc 360
ggtgcttatg ttgactatgg caataaagat gattactcat atttaggtgc cgctggtatt 420
gagttcaaca ccgataataa cgtcacttta cgtttggaat atcaaagcct caccgatatt 480
aataacgatc ttgtccgagc ggcaggtaac tcggctacct taggtgtttc gtataaattt 540
ggtggaagta aagcagaacc tgcgccagtc atcgtgcaag aggtgtttgt tgaagaagtt 600
gtacagccaa tggttgagcc tgtcgttatt ccccaagaac ctgaaacagt tgttaagcat 660
gtgccatttc aacgtttgga cagcagtagc tttgcccata acagtactaa gctaacagca 720
gagagtacta accagcttga taaactagtg aaatatttgc aagcttaccc acaagccgat 780
gctgaaatta ttggtcacac tgactcaact ggcgctgcgg cttacaacca gaaactatca 840
gaaaaacgcg cacaagttgt tgctgatgtt gtgattgcta aaggtgtgga tgcgaaccgt 900
cttaccgtaa aaggtgaagg ggaaaatagc ccaatcgcat cgaacgatac agtagaaggt 960
cgaaagcaaa atcgtcgtgt tgatatcgtt attccaagct ttgattatga agtgaaataa 1020
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccgggatga taacgataaa taggaaag 28
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccgggtttc acttcataat caaagct 27

Claims (10)

1.一种重组鳗弧菌OmpA蛋白，其特征在于，所述重组鳗弧菌OmpA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组鳗弧菌OmpA蛋白用于增强水产动物对鳗弧菌的免疫。
2.根据权利要求1所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白，其特征在于，编码所述重组鳗弧菌OmpA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)以鳗弧菌C312为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增外膜蛋白OmpA基因；(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物与pEASY-T1 simple载体连接，连接液转化大肠杆菌DH5a，筛选质粒为OmpA-Ts；(3)利用限制性内切酶SmaI对所述OmpA-Ts载体进行酶切，酶切产物纯化，回收得到OmpA基因片段；(4)将载体pET259用SwaI酶切后回收并将其与步骤(3)回收得到的OmpA基因片段用T4 DNA连接酶连接后连接液转化大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pEtOmpA；(5)再将所述质粒pEtOmpA转化大肠杆菌BL21(DE3)，表达即为SEQ ID NO.1中的氨基酸序列所示的重组鳗弧菌OmpA蛋白；
所述引物为F1:5’-CCCGGGATGATAACGATAAATAGGAAAG–3’；
R1:5’-CCCGGG TTTCACTTCATAATCAAAGCT-3’；
所述鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNO.6250。
4.一种鳗弧菌疫苗，其特征在于，所述鳗弧菌疫苗的原料包括如权利要求1或2所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白。
5.根据权利要求4所述的鳗弧菌疫苗，其特征在于，采用腹腔注射所述鳗弧菌疫苗的方式进行免疫，所述重组鳗弧菌OmpA蛋白的用量为10μg/次，免疫一次后采用lx107cfu/ml的鳗弧菌对被免疫水产动物进行攻毒，相对免疫保护效率可达74％。
6.根据权利要求4或5所述的鳗弧菌疫苗，其特征在于，所述鳗弧菌疫苗的原料还包括佐剂。
7.根据权利要求6所述的鳗弧菌疫苗，其特征在于，所述佐剂为Al(OH)3，所述佐剂由5wt％NaOH和5wt％Al2(SO4)3以2:5的体积比混合、离心后，将离心所得沉淀悬浮于PBS中至0.2mg/ml制备得到；所述鳗弧菌疫苗中重组鳗弧菌OmpA蛋白与佐剂的质量比为1:1。
8.根据权利要求1或2所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白在制备增强水产动物免疫力的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白的应用，其特征在于，所述水产动物包括但不限于鱼类、虾类和贝类。
10.根据权利要求9所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白的应用，其特征在于，所述水产动物为牙鲆。
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