CN103041386A

CN103041386A - 一种鳗弧菌重组蛋白的应用

Info

Publication number: CN103041386A
Application number: CN2012104452757A
Authority: CN
Inventors: 孙黎; 贾盼盼; 胡永华
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2012-11-08
Filing date: 2012-11-08
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2032-11-08
Also published as: CN103041386B

Abstract

本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种鳗弧菌重组蛋白的应用。鳗弧菌重组鞭毛蛋白FlaE作为非特异性免疫疫苗佐剂的应用。重组鞭毛蛋白FlaE构建过程为以鳗弧菌C312为模板，采用PCR扩增鞭毛蛋白基因,PCR产物与载体pET259连接，获质粒pEFlaE，将其转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达鞭毛蛋白的菌株BL21/pEFlaE，通过亲和层析纯化获得重组鞭毛蛋白。本发明的鳗弧菌鞭毛蛋白作为佐剂可提高疫苗的保护效应至20％以上。

Description

一种鳗弧菌重组蛋白的应用

技术领域

本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种鳗弧菌重组蛋白的应用。

背景技术

国际水产养殖业的发展表明疫苗是养殖鱼类病害防控最为有效的措施之一。目前鱼类疫苗主要包括灭活疫苗、重组亚单位疫苗、核酸疫苗、减毒疫苗等类型，其中亚单位疫苗的应用通常需要免疫佐剂。疫苗佐剂是非特异性的免疫因子/试剂，其主要功能是协助疫苗刺激免疫系统产生反应，从而增强疫苗诱发的特异性免疫保护效应。研究表明细菌的鞭毛蛋白能够通过与Toll样受体结合而激活天然免疫系统，因此具有免疫佐剂的潜能。鳗弧菌（Vibrio anguillarum）属于革兰氏阴性菌，是弧菌病的诱发因子。鳗弧菌表达5个鞭毛蛋白，即FlaA，FlaB，FlaC，FlaD，和FlaE，但这些鞭毛蛋白的免疫效应尚不清楚。我们在前期研究中发现鳗弧菌鞭毛蛋白FlaE能够显著提高亚单位疫苗的免疫保护效应，因此具有良好的疫苗佐剂功能。

发明内容

本发明目的在于提供一种鳗弧菌重组蛋白的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为

一种鳗弧菌重组蛋白的应用，鳗弧菌重组鞭毛蛋白FlaE作为非特异性免疫疫苗佐剂的应用。

所述鳗弧菌重组鞭毛蛋白FlaE重组过程为，以鳗弧菌C312为模板，采用EF/ER为引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pET259连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，筛选质粒pEFlaE，质粒pEFlaE转化大肠杆菌BL21(DE3)，即得到鞭毛蛋白FlaE；所述引物为FE：5’-CCCGGGATGGCAATTACCGTTAATAC-3’；RE：5’-CCCGGG GCGAAGTAAGGCCAATG-3’。

本发明具有如下优点：本发明的鳗弧菌鞭毛蛋白作为佐剂可提高疫苗的保护效应至20％以上。

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化的鞭毛蛋白（泳道2）。泳道1，分子量标准。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001）；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。

实施例1

鳗弧菌鞭毛蛋白为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示（参见序列表1）。

序列表1

MAITVNTNVSALIAQRHLGSASEMLNQSLERLASGKRINSAKDDAAGLQISNRLESQMRGLDVAVRNANDGISIMQTAEGAMQETTSLLQRMRDLSLQSANGANSKADRQALQEEMGALNDELNRIAETTSFGGRKLLNGSFGQSSFQIGASSGEAVQVSLKNMRSDSLDMGGFSYVAAGMADSQWRVTQDNRQLTMSYTDAKGKQHNIQIQAKVGDDIEELATYINGQTDKVSASVNDKGQLQLFMAGKETSGTIDFKGSLANQLQMNVTGYEAVDTLDITEVGGAQRAVAVIDTAMQYVDSHRSELGALQNRFNHAINNLDNVHENLASSNSRIKDTDYAKETTQMVKQQILQQVSTSILAQAKKQPNLALALLR

（a）序列特征：

●长度：377

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：鳗弧菌C312

（f）特异性名称：鞭毛蛋白FlaE

结构特征：该蛋白具有一个Flagellin_N结构（氨基酸5－143），一个Flagellin_IN结构（氨基酸194-249）和一个Flagellin_C结构（氨基酸291-376）。

鳗弧菌鞭毛蛋白表达载体的构建方法：质粒pEFlaE的构建：以鳗弧菌C312为模板，采用FE/RE为引物进行PCR扩增鳗弧菌鞭毛蛋白FlaE基因（该基因序列已被报道。具体参见Naka H,Dias GM,Thompson CC,Dubay C,Thompson FL,Crosa JH.Complete genome sequence of the marine fish pathogen Vibrio anguillarum harboring the pJM1 virulence plasmid and genomic comparison with other virulent strains of V.anguillarum and V.ordalii.Infect Immun 2011;79:2889–900）。PCR条件为：94°C 60s预变性模板DNA,然后94°C 40s,50°C 60s,72°C 60s,5个循环；然后94°C 40s,62°C 60s,72°C 60s,25个循环后再在72°C延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。将载体pET259（pET259构建过程参见Zheng,W.J.,Hu,Y.H.,Sun,L.,2010.Cloning and analysis of a ferritin subunit from turbot(Scophthalmus maximus).Fish.Shellfish.Immunol. 28,829–836）用SwaI酶切后回收5.4kb片段，将其与上述纯化的PCR片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素（30ug/mL）的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为质粒pEFlaE。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水；所述鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.6250，保藏日期2012.6.21，分类命名为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述引物为FE：5’-CCCGGGATGGCAATTACCGTTAATAC-3’和RE：5’-CCCGGGGCGAAGTAAGGCCAATG-3’。

实施例2

鞭毛蛋白的诱导表达和纯化：将上述的质粒pEFlaE用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)（购自于“天根生化科技有限公司”，北京），在含有卡那霉素（30ug/mL）的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取一个转化子，将其命名为BL21/pEFlaE。将BL21/pEFlaE于含有卡那霉素（30ug/mL）的LB液体培养基中过夜培养；取1mL过夜后的培养液,加入100mL新鲜的含有卡那霉素（30ug/mL）的LB液体培养基中，于37°C下转速200rpm摇动培养至OD₆₀₀为0.6,加入终浓度为0.3mM的IPTG，30℃继续以转速160rpm摇动培养5-6h，而后以5000g，4°C离心10min，收集菌液，加入5mL裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4°C离心30min，回收上清。将上清中的蛋白亲和层析柱His Trap HP Columns（购于美国GE Healthcare公司）回收纯化，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测（8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h），测定其分子量大小（参见图1）。将纯化的蛋白经质谱分析，其的蛋白质质量、结构与FlaE相同，证实其为具有FlaE序列的鞭毛蛋白。所述裂解液为终浓度的10mM NaH₂PO₄、10mM Tris和8M尿素,pH 8.0。

实施例3

鞭毛蛋白作为佐剂的应用

步骤1）佐剂及疫苗混合液的制备。

疫苗混合液制备：将上述实施例纯化的鞭毛蛋白在PBS中稀释至160ug/mL，命名为FlaE；将迟缓爱德华氏菌疫苗rEsa1（其具体制备过程见Sun Y，Liu C,Sun L.Construction and analysis of the immune effect of an Edwardsiella tarda DNA vaccine encoding a D15-like surface antigen.Fish Shellfish Immunol2011;30:273-9）在PBS中稀释至160ug/mL，命名为rEsa1；将稀释后的鞭毛佐剂与疫苗rEsa1等体积混合，经混合液命名为rEsa1＋FlaE。所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na₂HPO₄.12H₂O,0.024％NaH₂PO₄，余量为水。

步骤2）免疫应用。将120条牙鲆（每条重约12.7g）随机分为4组，每组30条。将这4组分别命名为A、B、C和D组。将A、B和C组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1）的FlaE，rEsa1和rEsa1＋FlaE，将D组的每条鱼分别腹腔注射100ul PBS（对照组）。

步骤3）迟缓爱德华氏菌悬液的制备。在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TX1至OD₆₀₀为0.8,然后离心（5000g，4°C）10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为5x10⁴cfu/mL。

所述菌株迟缓爱德华氏菌TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2330，保藏日期为2008年1月9日，分类命名为迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda），保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路。

步骤4）疫苗免疫保护效应检测。在步骤2）免疫注射后的第30天，用上述步骤3）的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤2）的4组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，18条；B组,12条；C组，5条；D组,23条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：

RPS=100x(1－免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)

根据此公式算出FlaE，rEsa1和rEsa1＋FlaE的免疫保护效率分别为21.8％，47.8％和78.2％，其中rEsa1＋FlaE的免疫保护效率（即78.2％）显著（P<0.05）高于rEsa1的免疫保护效率（即47.8％）。因此，所得重组鞭毛蛋白能显著提高疫苗的免疫保护效应。

Claims

1.一种鳗弧菌重组蛋白的应用，其特征在于：鳗弧菌重组鞭毛蛋白FlaE作为非特异性免疫疫苗佐剂的应用。

2.按权利要求1所述的鳗弧菌重组蛋白的应用，其特征在于：所述鳗弧菌重组鞭毛蛋白FlaE重组过程为，以鳗弧菌C312为模板，采用EF/ER为引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pET259连接，连接液转化入大肠杆菌DH5，筛选质粒pEFlaE，质粒pEFlaE转化大肠杆菌BL21(DE3)，即得到鞭毛蛋白FlaE；所述引物为FE：5’-CCCGGGATGGCAATTACCGTTAATAC-3’；RE：5’-CCCGGG GCGAAGTAAGGCCAATG-3’。