CN101240019B - 肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a1重组蛋白及表达方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白，其包括1)肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白和表达载体片段；或2)肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白羧基端经一个或几个氨基端缺失或添加获得的与Stx2a₁蛋白具有相似功能的蛋白和表达载体片段；本发明还公开了上述肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白的制备方法及其在制备检测试剂盒和制备防治EHEC O157:H7感染的亚单位疫苗中的应用。

Description

肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a1重组蛋白及表达方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白的表达方法及应用。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7于1975年被首次分离，因其能产生致死性志贺毒素(Shiga toxin，Stx)，1982年被确认为严重人兽共患致病菌。其感染具有暴发流行趋势、强烈的致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点，已经成为全球公共卫生问题，对人类健康构成了巨大威胁。同时，EHEC O157:H7培养容易、感染力强、传播途径多样，使其极有可能作为未来军事战争的细菌武器和生物恐怖战剂；EHEC O157:H7的烈性致病因子还有可能用于基因重组新型生物武器——基因武器的构建。美国疾病控制中心(CDC)已将EHEC O157:H7列为B类生物恐怖病原体严加防范。

近年来，O157:H7 EHEC感染的暴发流行在世界各地接连发生，尤其是日本、美国等。美国食品和药品监督管理局(FDA)近期宣布，于2006年9月14日爆发的大规模大肠杆菌感染经流行病学调查已证实，病原菌即为EHEC O157:H7型。感染病例数上升迅速，发现感染病例的地区也已扩大到全美20个州。

中国江苏、安徽省曾于1999年暴发流行EHEC O157:H7感染性腹泻，患者超过2万例，死亡177例，流行时间7个月(http://www.szed.com/n/ca505201.htm)。这可能是迄今为止世界上流行规模最大的一次。2001年上述地区又发生疫情，并且范围扩大到西部、中原地区，甚至在东北、华北及华东少数地区也发生散发的O157:H7感染。目前中国已处于高发流行期，疫情不可能短期消失，必须引起全社会的高度重视。基于这种严峻的形势，中国已将肠出血性大肠杆菌列为21世纪可能对国人卫生健康有重 大影响的12种病原微生物之一。

EHEC O157:H7多为食源性或水源性感染，人与人之间或人与家畜之间通过粪口途径传播。感染该菌可使人患腹泻、出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis，HC)，还可引发溶血性尿毒综合症(Hemolytic uremic syndrom，HUS)及血栓性血小板减少紫癜(Thromboric thromobocytopenic porpura，TTP)等严重并发症，致死率达5～10％。临床研究证实：使用抗生素可促使O157:H7菌体破裂，“爆发性”释放致死性志贺毒素(Stx)，从而使患者死亡的危险性增加。因此，2002年中国卫生部制定的EHEC O157:H7感染性腹泻应急处理预案第5条有关病人的隔离治疗规定：“EHEC O157:H7病人和疑似病人(包括粪便标本O157:H7抗原胶体金方法检测阳性的腹泻病人)禁止使用抗生素，疫区内的其他一般腹泻病人应慎用抗生素。”。目前国内外尚无可用于治疗人EHEC O157:H7感染的特效药物。因此，寻求特异有效的O157疫苗来防治O157:H7感染已迫在眉睫。

志贺毒素(Shiga toxin，Stx)是EHEC的一种最为重要的毒力因子，是导致EHEC O157:H7 EHEC感染病人出现HC、HUS的主要原因，也是EHEC O157:H7重要的保护性抗原之一，包括Stx1和Stx2两个亚类，均由1个A亚单位和5个B亚单位组成，A亚基为毒力亚单位，具有细胞内毒性，能与28SrRNA作用导致蛋白质合成停止，是大肠杆菌O157:H7引起临床表现的病理基础；B亚基为结合亚单位，无毒而具有细胞结合特性，能与细胞表面糖鞘脂受体(Gb3)特异结合，从而引导A亚单位发挥作用，其均具有较强的免疫原性。同时，公布的Stx2全毒素的晶体结构解析显示，A亚单位由A₁和A₂两部分通过二硫键连接组成，毒性的活性中心位于A₁片段的第77位的酪氨酸，此外，A₂片段形成螺旋结构插入5个B亚基形成的小孔中(Marie E.Fraser，Masao，Fujinaga MaiaM.Cherney.Structure of Shiga toxin type2(stx2)from Escherichia coliO157:H7.[J].Biological Chemistry，2004，279(26)：27511-27517)。因此，作为毒素主要毒力片段的Stx2A₁是优选的治疗药物设计靶点。申请人实验室前期将Stx2A₁全长序列分别构建在pET-22b、pET-28a、pET-32a、pET-41a、pQE-30、PMXB10等表达载体上，但均未表达(见附图1)。原因可能是Stx2A₁羧基端的疏水性、其本身的空间构象或者是宿主菌中存在一种蛋白抑制其表达等等造成的，同时也与不同的E.coli菌株间发生DNA转移时存在一种DNA酶抗性融合机制 以及具有不同的限制-修饰系统有关。目前国内外尚无Stx2A₁全长序列构建表达的相关研究报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白，其包括

1)肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白和表达载体片段；

或

2)肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白羧基端经一个或几个氨基端缺失或添加获得的与Stx2a₁蛋白具有相似功能的蛋白和表达载体片段。

其中，上述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的较佳实施例中，上述的表达载体为pET-22b。

本发明的另一目的是提供上述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白的表达方法，其是将截短去掉肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位羧基端1～20个氨基酸后对应的核苷酸序列片段与表达载体连接，然后转化宿主菌进行表达。

本发明的较佳实施例中，上述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白表达方法，其是将截短去掉肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位羧基端15个氨基酸后对应的核苷酸序列片段与表达载体连接，然后转化宿主菌进行表达。

上述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白表达方法，具体包含以下步骤：

1)通过生物信息学软件分析肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单 位，截短去掉其羧基端1～20个氨基酸后，根据截短后的氨基酸序列对应的核苷酸序列片段设计引物；

2)以步骤1)设计的引物、通过PCR扩增肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白基因；

3)将所述出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白基因克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；

4)诱导表达Stx2a₁蛋白；

5)纯化步骤4)得到的Stx2a₁蛋白；

6)纯化后的Stx2a₁蛋白的免疫原性的检测。

其中步骤1)中设计得到的引物为SEQ ID NO：4-5；步骤2)中的PCR模板优选为为含志贺毒素2的菌株99A021；步骤3)中所述的表达载体优选为pET-22b，宿主菌优选为BL21，其中步骤3)中得到的宿主菌BL21中导入了包含肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白的编码核苷酸序列SEQ ID NO：2的表达载体pET-22b；步骤5)中优选采用免疫亲和层析法纯化所述Stx2a₁蛋白。

本发明的另一目的是提供上述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白的应用，其可用于制备检测试剂盒或抗肠出血性大肠杆菌O157:H7感染的亚单位疫苗。

本发明人应用生物信息学对Stx2A₁全长氨基酸序列进行综合分析，其羧基端约20个氨基酸的抗原性及亲水性较弱，在不改变其抗原性的前提下将其羧基端分别截短1-20个氨基酸后对Stx2A₁活性片段进行克隆、表达和保护性免疫的研究，将Stx2A₁羧基端截短氨基酸后的片段命名为Stx2a₁。

本发明公开的此截短的EHEC O157:H7 Stx2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白的纯化方法，纯化出的Stx2a₁蛋白含量达98％以上。本发明人对Stx2a₁的免疫性进行评价，发现构建的活性片段能高效表达并且可以用于疫苗，并且动物实验中显示有良好的免疫原性。

用纯化出的截短的EHEC O157:H7 Stx2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白免 疫5-6周龄的Balb/C小鼠，每次每只小鼠皮下多点及腹部注射蛋白100μg，首次免疫两周后第二次免疫，以后隔一周免疫一次，共四次，末次免疫后4天取尾血ELISA检测血清特异性抗体效价，末次免疫后10天进行免疫动物攻毒保护试验。

本发明的主要优点在于：用生物信息学预测及分析，Stx2a₁经克隆构建获得高表达的可溶蛋白，经纯化后纯度高达98％，动物实验证明Stx2a₁可刺激机体产生高效的免疫应答和免疫预防保护作用，说明此活性片段具有良好的免疫原性，特异性好。作为毒素主要毒力片段的Stx2A₁是优选的治疗药物设计靶点，因此Stx2A₁活性片段的构建表达对今后关于EHEC O157:H7的实验研究及疫苗和治疗制剂、诊断试剂盒等的研制均有重要的意义。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1：空载体pQE-30与Stx2A₁全长蛋白重组质粒诱导表达分析(pET-22b、pET-28a、pET-32a、pET-41a等载体与此相同)，其中

1、2、3、4：空载体pQE-30经IPTG诱导0小时、1小时、3小时、5小时的表达产物

6、7、8、9：重组目的蛋白经IPTG诱导0小时、1小时、3小时、5小时的表达产物

M：蛋白marker；

图2：DNAstar软件分析EHEC O157:H7 Stx2A₁亚单位的基因序列；

图3：截短的EHEC O157:H7 Stx2A₁亚单位活性片段Stx2a₁ PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

1.DNA marker    2.Stx2a₁的PCR扩增产物；

图4：pMD18-T/stx2a₁经NdeI、XhoI双酶切鉴定

M：100bp marker 1：pMD18-T/stx2a₁(质粒1) 2：pMD18-T/stx2a₁(质粒2)；

图5：原核重组质粒pET-22b/stx2a₁经NdeI、XhoI双酶切鉴定

M：100bp marker

1：pET-22b/stx2a₁(原核重组质粒1)

2：pET-22b/stx2a₁(原核重组质粒2)；

图6：pET-22b/BL21空载体与重组质粒pET-22b/stx2a₁/BL21诱导表达分析

1.蛋白Marker

2、3、4、5.：pET-22b/BL21空载体经IPTG诱导0小时、1小时、3小时、5小时的表达产物

6、7、8、9.：重组质粒pET-22b/stx2a₁/BL21经IPTG诱导0小时、1小时、3小时、5小时的表达产物；

图7：16℃低温诱导后可溶性表达分析

M：蛋白marker

1：16℃诱导的破菌后的上清

2：16℃诱导的破菌后的沉淀；

图8：pET-22b/stx2a₁/BL21原核表达的纯化产物的SDS-PAGE分析

M：蛋白marker    1：流穿    2-7：目的蛋白洗脱；

图9：表达产物纯化层析峰形图；

图10：Western blot分析截短的EHEC O157:H7 Stx2A₁亚单位活性片段Stx2a₁表达产物的免疫活性；

M：预染蛋白marker

1：纯化的Stx2a₁目的蛋白显色条带

2：纯化的O157天然毒素显色条带。

具体实施方式

以下实施方式结合附图进一步加以描述(以截短Stx2A₁羧基端15个氨基酸为例)。

实施例1：肠出血性大肠杆菌O157:H7 Stx2A₁亚单位活性片段Stx2a₁的克隆

1.菌株与试剂

大肠杆菌99A021由江苏省疾病控制中心提供，

质粒pET-22b和大肠杆菌BL21、DH5α为申请人实验室保存，

ExTaqDNA聚合酶、限制性核酸内切酶Xho I和Nde I、T₄连接酶及DNAmarker均为大连TaKaRa公司产品；

质粒抽提试剂盒为OMEGA公司产品；

胶回收试剂盒为BBI公司产品；

细菌基因组DNA提取试剂盒为天根公司产品。

2.根据EHEC O157:H7 Stx2A₁亚单位全长基因序列，如SEQ ID NIO：3所示。

应用DNAstar软件分析：见附图2说明。

3.引物的设计与合成(下划线是酶切位点)

根据DNAstar软件分析表明其羧基端约20个氨基酸抗原性较低，且根据其活性中心位于77和167位氨基酸上及其抗原性、可塑性、亲水性、柔韧性等分析，将其羧基端去掉15个氨基酸，所得的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其对应的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

依照酶切位点检索和引物设计原则，应用软件Primer5.0根据此修改后的核酸序列设计引物为P₁(SEQ ID NO：4)，P₂(SEQ ID NO：5)，上游引物5’端引入Nde I酶切位点，下游引物的3’端引入Xho I酶切位点

上游：P₁ 5′TCCATATGCGGGAGTTTACGATAGAC 3

                      Nde I

下游：P₂ 5′TGCTCGAGAAAGGATATTCTCCCCAC 3′

               Xho I

4.模板的准备

无菌接种环蘸取保存的99A021菌株三线法接种于LB平板，37℃培养12小时，挑取单个菌落接种于5mlLB培养液中，37℃摇床培养8小时按TIANampBacteria DNA Kit说明提取大肠杆菌99A021基因组DNA，-20℃保存备用。

5.PCR扩增

PCR扩增体系(50μl)。PCR条件为94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃完全延伸10分钟。

PCR体系如下：

模板DNA                               1μl

P1(25pmol/μl)                        1μl

P2(25pmol/μl)                        1μl

dNTPs(2.5mmol/l each)                 4μl

10×PCR缓冲液                         10μl

MgCl₂(25mmol/l)                       5μl

Ex-Taq DNA聚合酶                      0.25μl

ddH₂O                                 32.75μl

PCR产物(取3μl)经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定分子量大小

PCR扩增效果如附图3所示。

6.PCR产物的纯化回收：参照EZ-10 Spin column DNA Gel Entiaction Kit说明进行

7.PCR产物的克隆与鉴定：

采用TA克隆方法克隆PCR产物，经Nde I、Xho I双酶切鉴定：见附图4

8.PCR产物与pET-22b载体酶切回收：

将pET-22b载体和已克隆的PCR产物分别用Nde I和Xho I酶切，酶切体系为50μl，于37℃酶切4小时得到酶切产物。

9.酶切产物的纯化回收：参照EZ-10 Spin column DNA Gel Entiaction Kit说明进行。

10.连接目的基因与pET-22b载体：连接反应按T₄DNA连接酶的说明书进行，反应体系为10μl，于22℃连接过夜。

11.重组质粒pET-22b/stx2a₁连接鉴定：

目的基因与pET-22b载体经T₄DNA连接酶连接过夜后转化感受态大肠杆菌BL21，转化产物涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于5ml的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜，抽提质粒，经Nde I、Xho I双酶切鉴定和测序(见附图5)。

结果：

此截短的目的基因stx2a₁与表达载体pET-22b连接转化宿主菌后经Nde I和Xho I双酶切鉴定，证明已连接上表达载体此截短的目的基因构建成功，测序结果与理论的225个氨基酸序列一致。

实施例2：EHEC O157:H7 Stx2A₁亚单位活性片段Stx2a₁在大肠杆菌中的表达与纯化

1.目的基因的诱导表达：

将经Nde I、Xho I双酶切和测序鉴定正确的活性片段Stx2a₁重组菌种和pET-22b载体/BL21菌液接种至含氨苄青霉素的LB液体培养液中，按常规方法诱导表达，(37℃摇床培养至A₆₀₀为0.6-0.8，各取样加入SDS-PAGE上样缓冲液冻存，加入IPTG至终浓度为0.1mmol)，37℃摇分别于1小时、3小时、5小时取样加入SDS-PAGE上样缓冲液冻存，沸水煮5分钟后按常规方法进行SDS-PAGE凝胶电泳分析(见附图5)。

结果显示与pET-22b空载体对比，重组Stx2a₁蛋白在25kDa大小左右有明显条带，表明EHEC O157:H7 Stx2A₁亚单位活性片段Stx2a₁在大肠杆菌中表达。

2.表达形式的鉴定：

将鉴定正确的重组菌种按常规方法诱导表达，37℃摇床培养至A₆₀₀为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.1mmol，16℃摇床培养12小时，收集菌液 5000rpm离心15分钟，弃上清后加入30mlTris-HCl(pH7.5)悬浮沉淀物，将悬浮物超声破菌(功率300W，超声8秒，间隔6秒，循环99次)，制成裂解液，12000rpm离心30分钟，取破菌后上清和沉淀，按常规方法进行SDS-PAGE凝胶电泳分析(见附图6)。

结果显示在16℃用终浓度为0.1mmol的IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达，Stx2a₁重组蛋白为可溶性表达，且表达量达40％。

3.基因表达产物的纯化：

用缓冲液A(20mM Tris+0.5MNaCl，pH 7.5)平衡10个床体积，流速为1ml/分钟，将20ml超声破菌上清经0.45μm滤膜过滤，上样，流速为0.5ml/分钟，用缓冲液A再洗10个柱床体积，流速为1ml/分钟，用分别含100、150、500mM咪唑的缓冲液B(缓冲液A+0.5M咪唑+0.5MNaCl，pH 7.5)进行阶段洗脱，流速为1ml/分钟，收集各阶段的洗脱峰，用SDS-PAGE检测蛋白的分子量大小和纯度(见附图7、8)。

SDS-PAGE结果显示纯化后的蛋白分子量大小约为25kDa与理论大小相符，纯度为98％。

4.Western blot检测表达产物的抗原性：

将纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE(12％)电泳，然后以100mA电转移1小时，将目的蛋白转移到NC膜上，加入5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，TTBS洗膜5分钟×4，加入由本实验室构建的抗EHEC O157:H7 Stx2A₁亚单位的单克隆抗体S₁D₈(1∶1000)，37℃孵育1小时，TTBS洗膜5分钟×4，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG)，孵育1小时，TTBS洗膜5分钟×4，加入DAB底物显色5分钟，水洗终止反应，扫描记录，同时作天然毒素Stx2与S₁D₈的Western blot作为对照试验。见附图9。

结果：印记显示本实验室纯化的天然毒素与一抗S₁D₈在32kDa大小左右有明显显色条带，重组目的蛋白Stx2a₁与一抗S₁D₈在25kDa大小左右有明显显色条带，表明EHEC O157:H7 Stx2A₁亚单位活性片段Stx2a₁具有免疫反应性。

实施例3：酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测EHEC O157:H7类毒素免疫小鼠的抗体的产生：

1.EHEC O157:H7类毒素制备：

采用福尔马林灭活法将本实验室纯化出的天然EHEC O157:H7毒素蛋白加入甲醛终浓度1％，37℃灭活5天。

2.免疫程序：

免疫5-6周龄的Balb/c小鼠五只，100μg/只，100μl灭活的天然毒素首次免疫加等量免疫原弗氏佐剂，此后加不完全弗氏佐剂注射小鼠腹部和腹股沟皮下免疫。首次免疫后两周进行第二次免疫，以后每周一次，于免疫四次后第七天取小鼠的血液上清检测产生的抗体。

3.采用EHEC O157:H7 Stx2A₁亚单位活性片段Stx2a₁具有免疫反应性重组蛋白包被的ELISA板检测纯化的EHEC O157:H7天然毒素蛋白免疫的Balb/c小鼠产生的抗体，步骤如下：

1)酶标板的预处理：将新购酶标板用双蒸水浸泡过夜，晾干后备用。

2)用包被液将抗原稀释为合适的浓度：纯化的EHEC O157:H7天然毒素蛋白稀释浓度分别为0.25μg/ml，0.5μg/ml，0.75μg/ml，1μg/ml。

3)包被：酶标板加100μl/孔上述抗原液，4℃过夜，洗涤液洗涤5遍，空干。

4)封闭：加封闭液300μl/孔，4℃过夜，洗涤5遍，空干，密封4℃保存备用。

5)采血及稀释：小鼠眼眶取血，离心取上清用抗体稀释1∶1000倍稀释。

6)取包被好的酶标板，加入依次稀释血清100μl/孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，空干。

7)加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体工作液(1∶20000稀释)100μl/孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，空干。

8)加底物显色液100μl/孔，室温避光反应5～10分钟。

9)加终止液50μl/孔，立即在酶标仪上以492nm波长测定OD值

10)结果判断：OD值大于或等于阴性对照(小鼠免疫前血清1∶100倍稀释) 的2.1倍时视为抗体阳性。

结果：Stx2a₁重组蛋白检测的O157:H7天然毒素免疫小鼠产生的抗体效价为1∶64000。说明本发明构建的活性片段Stx2a₁能够特异性识别并检测EHECO157:H7免疫小鼠产生的抗体。

实施例4：肠出血性大肠杆菌O157:H7 Stx2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白免疫小鼠的保护性效果观察

1.试验材料

O157感染动物模型Balb/c小鼠，雌性，5-6周龄，由本实验室程建平和易勇等建立(程建平，易勇，毛旭虎等。肠出血性大肠杆菌O157:H7感染动物模型的建立。中国人兽共患病杂志，2005，21(4)：42-45。)，(人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157:H7疫苗及制备方法，王庆旭，200510057206.9)

2.动物免疫及抗体检测方法：

目的蛋白经过纯化后免疫5-6周龄的Balb/c小鼠五只，100μg/只，100μ1抗原与等量弗氏佐剂混合，注射小鼠腹部和腹股沟皮下免疫。首次免疫后两周进行第二次免疫，以后每周一次，分别于免疫3、4次后的5天采血，ELISA检测血清特异性抗体效价的改变。

结果：目的蛋白免疫3次后的抗体阳性率在90％，免疫4次后的抗体阳性率达到95％。

3.免疫动物的攻毒保护实验：

同上相同的免疫方案，免疫四次后的第10天采用致死剂量的O157:H7菌超声上清液(含Stx2毒素及其他致病物质，蛋白浓度1mg/ml)0.05ml腹腔注射对免疫小鼠及对照小鼠进行攻毒实验，观察各组小鼠的死亡情况，在30天的观察期后计算免疫小鼠的死亡/生存率如表：

表：Stx2a₁皮下及腹部免疫小鼠，O157菌超声上清攻毒—免疫保护效果

组别	攻毒后死亡情况	30天后存活数量	存活(保护率)
					3天	4天	5天	6天	7-30天

Stx2a1  免疫组  (50只)	0	2	2	1	0	45	90％
								对照组  (50只)	0	38	12	0	0	0	0

结果：Stx2a₁免疫组在攻毒实验30天后存活数量为45只，保护率达90％，而对照组在攻毒实验5天后就全部死亡，保护率为0。

通过以上实验说明本发明的活性片段Stx2a₁重组蛋白具有良好的免疫原性并且能够对EHEC O157:H7感染起到保护作用，能够诱导机体产生免疫应答，表达本发明Stx2a₁活性片段在亚单位疫苗的应用上是成功的。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白及表达方法与应用

<130>

<160>3

<210>1

<211>225

<212>PRT

<213>肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)

<220>

<223>活性片段Stx2a₁的氨基酸序列

<400>1

    Arg Glu Phe Thr Ile Asp Phe Ser Thr Gln Gln Ser Tyr Val Ser

15  1           5                 10              15

    Ser Leu Asn Ser Ile Arg Thr Glu Ile Ser Thr Pro Leu Glu His

30               20             25

    Ile Ser Gln Gly Thr Thr Ser Val Ser Val Ile Asn His Thr Pro

45              35              40

    Pro Gly Ser Tyr Phe Ala Val Asp Ile Arg Gly Leu Asp Val Tyr

60              50               55

    Gln Ala Arg Phe Asp His Leu Arg Leu Ile Ile Glu Gln Asn Asn

75               65               70

    Leu Tyr Val Ala Gly PheVal Asn Thr Ala Thr Asn Thr Phe Tyr

90               80              85

    Arg Phe Ser Asp Phe Thr His Ile Ser Val Pro Gly Val Thr Thr

105              95              100

    Val Ser Met Thr Thr Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val

120              110             115

    Ala Ala Leu Glu Arg Ser Gly Met Gln Ile Ser Arg His Ser Leu

135             125               130

    Val Ser Ser Tyr Leu Ala Leu Met Glu Phe Ser Gly Asn Thr Met

150             140              145

    Thr Arg Asp Ala Ser Arg Ala Val Leu Arg Phe Val Thr Val Thr

165              155              160

    Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Glu Phe Arg Gln

180              170             175

    Ala Leu Ser Glu Thr Ala Pro Val Tyr Thr Met Thr Pro Gly Asp

195              185             190

    Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Ile Ser Asn Val Leu Pro

210              200              205

225

    Glu Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Val Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe

                 215               220

<210>2

<211>675

<212>DNA

<213>肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)

<220>

<223>活性片段Stx2a₁的核苷酸序列

<400>2

cgggagttta cgatagactt ttcgacccaa caaagttatg tctcttcgtt aaatagtata      60

cggacagaga tatcgacccc tcttgaacaa tatctcaggg gaccacatc  ggtgtctgtt     120

attaaccaca ccccaccggg cagttatttt gctgtggata tacgagggct tgatgtctat     180

caggcgcgtt ttgaccatct tcgtctgatt attgagcaaa ataatttata tgtggccggg     240

ttcgttaata cggcaacaaa tactttctac cgtttttcag attttacaca tatatcagtg     300

cccggtgtga caacggtttc catgacaacg gacagcagtt ataccactct gcaacgtgtc     360

gcagcgctgg aacgttccgg aatgcaaatc agtcgtcact cactggtttc atcatatctg     420

gcgttaatgg agttcagtgg taatacaatg accagagatg catccagagc agttctgcgt     480

tttgtcactg tcacagcaga agccttacgc ttcaggcaga tacagagaga atttcgtcag     540

gcactgtctg aaactgctcc tgtgtatacg atgacgccgg gagacgtgga cctcactctg     600

aactgggggc gaatcagcaa tgtgcttccg gagtatcggg gagaggatgg tgtcagagtg     660

gggagaatat ccttt                                                      675

<210>3

<211>720

<212>DNA

<213>肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)

<220>

<223>EHEC O157:H7Stx2A₁亚单位的核苷酸序列

<400>3

cgggagttta cgatagactt ttcgacccaa caaagttatg tctcttcgtt aaatagtata     60

cggacagaga tatcgacccc tcttgaaca  atatctcagg ggaccacatc ggtgtctgt     120

attaaccaca ccccaccggg cagttatttt gctgtggata tacgagggct tgatgtctat    180

caggcgcgtt ttgaccatct tcgtctgatt attgagcaaa ataatttata tgtggccggg    240

ttcgttaata cggcaacaaa tactttctac cgtttttcag attttacaca tatatcagtg    300

cccggtgtga caacggtttc catgacaacg gacagcagtt ataccactct gcaacgtgtc    360

gcagcgctgg aacgttccgg aatgcaaatc agtcgtcact cactggtttc atcatatctg    420

gcgttaatgg agttcagtgg taatacaatg accagagatg catccagagc agttctgcgt    480

tttgtcactg tcacagcaga agccttacgc ttcaggcaga tacagagaga atttcgtcag    540

gcactgtctg aaactgctcc tgtgtatacg atgacgccgg gagacgtgga cctcactctg    600

aactgggggc gaatcagcaa tgtgcttccg gagtatcggg gagaggatgg tgtcagagtg    660

gggagaatat cctttaataa tatatcagcg atactgggga ctgtggccgtt atactgaat    720

Claims (9)

1.一种肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白，其特征在于：所述肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白的表达方法，其特征在于将截短去掉肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位羧基端15个氨基酸后对应的核苷酸序列片段与表达载体连接，然后转化宿主菌进行表达。

3.根据权利要求2所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白表达方法，其特征在于包含以下步骤：

1)通过生物信息学软件分析肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位，截短去掉其羧基端1～20个氨基酸后，根据截短后的氨基酸序列对应的核苷酸序列片段设计引物；

2)以步骤1)设计的引物、通过PCR扩增肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白基因；

3)将所述出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁蛋白基因克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；

4)诱导表达Stx2a₁蛋白；

5)纯化步骤4)得到的Stx2a₁蛋白；

6)纯化后的Stx2a₁蛋白的免疫原性的检测。

4.根据权利要求3所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白表达方法，其特征在于步骤1)中设计得到的引物为SEQID NO：4-5。

5.根据权利要求3所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白表达方法，其特征在于步骤2)中的PCR模板为含志贺毒素2的菌株99A021的基因组DNA。

6.根据权利要求3所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白表达方法，其特征在于步骤3)中所述的表达载体为pET-22b，宿主菌为BL21。

7.根据权利要求3所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白表达方法，其特征在于步骤5)中采用免疫亲和层析法纯化所述Stx2a₁蛋白。

8.权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。

9.权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A₁亚单位活性片段Stx2a₁重组蛋白在制备抗肠出血性大肠杆菌O157:H7感染的亚单位疫苗中的应用。

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