CN108753798A

CN108753798A - 一种嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白的制备方法及应用

Info

Publication number: CN108753798A
Application number: CN201810559647.6A
Authority: CN
Inventors: 林向民; 郭壮; 林文雄; 李薇; 汪玉倩
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2018-06-02
Filing date: 2018-06-02
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2038-06-02
Also published as: CN108753798B

Abstract

本发明提供一种嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白的制备方法及应用，设计外膜蛋白基因克隆引物；通过原核重组，利用体外PCR扩增技术，扩增目的基因片段，构建pET32a原核表达载体重组质粒，转化重组质粒至BL21感受态，获得高表达菌株；通过IPTG诱导剂诱导高表达OMP P5蛋白并通过Ni‑NTA树脂柱纯化该表达蛋白；纯化后的外膜蛋白与弗氏不完全佐剂以1:1体积比完全乳化，所得样品即作为嗜水气单胞菌疫苗的疫苗蛋白。本发明中采用嗜水气单胞菌亚单位疫苗（外膜蛋白）可获得90%以上免疫保护率，相比于传统疫苗，亚单位疫苗具有毒副作用低、免疫原性强和持续时间长、抗体效价高等优点。

Description

一种嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程与免疫学领域，具体涉及一种嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白的制备及应用。

背景技术

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)属革兰氏阴性短杆菌，广泛存在于水生环境中的一种常见条件致病菌，是典型的人-畜-鱼共患病病原菌，其典型病状为使鱼类出血性败血症而受到水产学界、兽医学界和医学界的广泛重视，成为公共卫生关注的对象。作为养殖大国，嗜水气单胞菌严重损害着我国养殖业的发展，甚至威胁到人类安全。目前，针对嗜水气单胞菌等水产致病菌的治疗药物主要是抗生素，然而长期大量使用抗生素易产生耐药株，甚至是超强细菌，急切需要有效的疫苗进行替代。预防和解决由该菌引起的疾病的关键在于研制并发现有效的候选疫苗。

嗜水气单胞菌主要致病因子可以分为粘附因子、胞外产物、转铁蛋白以及各类分泌系统。目前针对其致病因子研发的疫苗主要有传统疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等，传统的疫苗通过失活或减毒嗜水气单胞菌强毒株为抗原免疫，并获得50%左右的免疫保护率（李圆圆等 2008；陈亨利等 2016）。诸如外膜蛋白、外毒素和菌毛等亚单位疫苗因接种剂量小、毒副作用小、免疫原性强和持续时间长等优点而广泛应用。外膜蛋白(outer membraneprotein, OMP)是革兰氏阴性菌外膜的主要结构，在细菌代谢物质的运输、维持细菌的形态及调节细菌有关物质合成方面起着重要作用。细菌外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可激发机体的体液免疫，而且还可诱导细胞介导的免疫应答等优点备受青睐。细菌外膜蛋白具有良好的免疫原性,不仅可激发机体的体液免疫,而且还可诱导细胞介导的免疫应答等优点备受青睐。目前研究者（孙黎等 2013；郑宗林等 2015）对外膜蛋白疫苗研究中发现60-80%免疫保护率，然而达不到90%以上。

发明内容

本发明的目的在于提供一种嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白的制备方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

利用基因工程技术，根据嗜水气单胞菌ATCC7966全基因组序列，设计外膜蛋白（Outermembrane protein P5）基因克隆引物AHA_3793-EcoRI-F:CGGGAATTCATGAATAAAACACTGATTACCTTGC；AHA_3793-HindIII-R:CCCAAGCTTTCACTGCTGAACTTCCGAGATCCCT。

通过原核重组，利用体外PCR扩增技术，扩增目的基因片段，构建pET32a原核表达载体重组质粒，（基因与pET32a质粒摩尔比为5:1）转化重组质粒至BL21感受态，获得高表达菌株。通过IPTG诱导剂诱导高表达OMP P5蛋白并通过Ni-NTA树脂柱纯化该表达蛋白。纯化后的外膜蛋白与弗氏不完全佐剂1:1体积比完全乳化所得样品即可作为嗜水气单胞菌疫苗的疫苗蛋白。

本发明所要解决的问题是通过与佐剂乳化完全后的外膜蛋白疫苗免疫模式生物斑马鱼对嗜水气单胞菌可获得90%以上免疫保护率。

本发明的优点在于：

本发明中采用嗜水气单胞菌亚单位疫苗（外膜蛋白）相比于传统疫苗，亚单位疫苗具有毒副作用低、免疫原性强和持续时间长、抗体效价高等优点，属于新型疫苗。并且通过与弗氏不完全佐剂乳化后，观察了不同剂量下OMP P5 外膜蛋白免疫模式生物斑马鱼后对抗嗜水气单胞菌免疫保护率，发现在5μg剂量时获得90%以上免疫保护率，并显著提高宿主的免疫反应，为进一步研究嗜水气单胞菌等水产致病菌疫苗候选成分提供依据。

附图说明

图1. PCR扩增结果图。

图2.重组表达质粒pET-32a（+）-OMP P5 图与PCR 鉴定图。

图3.重组OMP P5蛋白表达纯化图。

图4. OMP P5蛋白与佐剂乳化后免疫3周模式生物斑马鱼对嗜水气单胞菌免疫保护率图。

图5. OMP P5免疫模式生物斑马鱼4周后内脏RNA提取、反转cDNA后qPCR检测免疫相关基因表达变化。

具体实施方式

实施例1

1、材料方法

实验材料 BamHIII、EcoRI购自Thermo scientific 公司；嗜水气单胞菌ATCC 7966由中山大学彭宣宪教授惠赠；嗜水气单胞菌LP-2（Aeromonas hydrophila LP-2），该菌株已于2018年5月 18日保藏在广东省微生物菌种保藏中心GDMCC，其保藏号为GDMCC No:60370，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼9楼）。大肠杆菌BL21（DE3）（E.coli BL21）购自北京全氏金生物技术有限公司。其他的相关试剂及培养基分别购于中国国药集团化学有限公司与英国OXOID公司。引物合成和序列测定由上海铂尚生物技术有限公司完成；

2、实验步骤

2.1 嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP P5）基因克隆：

所述外膜蛋白OMP P5氨基酸序列为MNKTLITLLVSGLLAANAQAAGQDNTWYGGAKLGWSNFYGVDHNQAIKDDYAISEEDKNDVGAGAFLGYQINQNLGVELGYDWLGKYKYTATDKLIPTDISRDEIKAQLAQLTMKIGLPVSESLDLYTRLGGAYAWTDSKQLDNDNGAAFVGALGAEYAFNRDWAARLEYQYTTPLGDKALDKTGAELDNGLLAVGVVYRFGQVAPVVAAPVPAPAPEPVVVDKQFTLSSDVLFDFNKATLKPAAGQALDNLYSQIEQARPKDGVATVIGYTDRIGSDAYNQKLSEQRARTVADYLVGKGLPAGKVNVEGRGKGNPVTGDSCTSKSKKELIVCLAPDRRVEVKVEGISEVQQ。

首先，提取嗜水气单胞菌总DNA，根据OMP P5蛋白基因序列设计特异性引物，所述引物为：上游引物：F:CGGGAATTCATGAATAAAACACTGATTACCTTGC；下游引物为R:CCCAAGCTTTCACTGCTGAACTTCCGAGATCCCT。其次，进行PCR扩增反应，所述PCR体系为20μl：Primer Star Mix 10μL，DNA模板1μL，上下游引物各1μL，补充ddH2O至20μL。PCR扩增条件为：98 ℃，预变性 3mins；95℃，变性 30secs；55℃，退火 15secs；72 ℃，延伸 1min/Kbp；循环30 次；72 ℃，延伸 10min；12 ℃保存，所得PCR产物通过核酸胶检测如图1。pET-32a质粒通过BamHIII、EcoRI双酶切后保存至-20 ℃。所述PCR产物通过T4连接酶与双酶切后pET-32a（5:1 摩尔比）室温连接1h，所得连接产物转化至大肠杆菌BL21感受态，37 ℃孵育1h，涂布于100μg/mL氨苄青霉素平板，筛选阳性克隆。

2.2 pET-32a（+）-OMP P5阳性单菌落验证与重组质粒提取：

从上述氨苄青霉素平板中挑取菌落，转移到5mL 液体培养基中，37 ℃，200rpm，孵育过夜，取20μL菌液，制备全菌DNA模板。PCR鉴定菌落，所述PCR体系为20μL：2×Taq Master Mix10μL，DNA模板1μL，上下游引物各1μL，补充ddH₂O至20μL。PCR扩增条件为：95℃，预变性5mins；95℃，变性 30secs；55 ℃，退火30secs；72℃，延伸 1min/Kbp；循环30 次；72℃，延伸 10min；12 ℃保存，所得PCR鉴定结果如图2。重组pET-32a（+）-OMP P5菌液质粒提取（OMEGA Plasmid Mini Kit）如图2。

2.3 嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP P5）的诱导表达与纯化：

将上述菌液划线氨苄青霉素平板，挑取单菌落至5mL LB培养基中37^oC过夜培养，次日按1%（v/v）转接至200mL液体LB中，37℃200rpm 培养至OD600=0.3-0.6，加入IPTG（1mmoL/L）诱导6-8h。所得菌液离心、PBS洗涤2次，结合液（25mM Na₂HPO₄•12H₂O, 10mM NaH₂PO₄•2H₂O,500mM NaCl, 5mM imidazole）重悬、超声破碎30min，离心取上清；所述上清液液与Ni-NTA树脂柱结合过夜，结合液洗涤20mL后洗脱液I（25mM Na₂HPO₄•12H₂O, 10mM NaH₂PO₄•2H₂O,500mM NaCl, 20mM imidazole）洗涤5mL，洗脱液II（25mM Na₂HPO₄•12H₂O, 10mM NaH₂PO₄•2H₂O, 500mM NaCl, 300mM imidazole）收集5mL。上述收集液取20μL与5×loadingbuffer混匀12% SDS-PAGE检测结果如图3。

2.4 本发明中嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP P5）疫苗抗嗜水气单胞菌相对免疫保护率如图4所示。所述疫苗的制备方法为：纯化的OMP蛋白以不同剂量（1、2、3、5μg）与弗氏不完全佐剂以1:1体积比完全乳化，并且分别以BSA和PBS作为对照组。免疫2周模式生物斑马鱼后加强免疫一次，一周后，嗜水气单胞菌LP-2感染斑马鱼，观察2周，计算相对免疫保护率。如图所示，相对免疫保护率为纵坐标，时间为横坐标，相对注射BSA对照组，不同剂量（1、2、3、5μg）免疫后相对免疫保护率分别为66.67%、87.50%、88.30%、94.15%。

2.5 本发明中嗜水气单胞菌免疫斑马鱼后免疫相关基因表达qPCR检测结果如图5所示。所述斑马鱼RNA提取为：免疫28天后，采集斑马鱼的胰岛组织样品（每组五尾）并立即在液氮中冷冻，使用RNAiso Plus试剂盒（TaKaRa Bio，Tokyo，Japan）提取总RNA。将提取的RNA样品稀释在无RNase的水中，并通过Molecular Devices SpectraMax i3（MolecularDevices，Sunnyvale，CA）检测RNA含量。使用PrimeScript TM RT试剂盒（Takara Shuzo，Otsu，Japan）将RNA（1μg）逆转录为cDNA，所述cDNA与SYBR®预混合Ex Taq™II（Tli RNaseHPlus）（Takara Shuzo，Otsu，日本），并使用CFX96 Touch TM实时PCR检测系统（Bio-Rad，USA）进行qRT-PCR。以β-actin基因作为对照，检测7种免疫相关基因结果由图5中可发现各免疫相关基因都有较高的表达，也进一步证实该疫苗的高效性。所述7种免疫相关基因引物信息列于表1。

表1：7种免疫相关基因引物信息

综上所述，利用嗜水气单胞菌亚单位疫苗免疫模式生物斑马鱼可显著提高宿主免疫反应，并产生90%以上相对免疫保护率，为今后疫苗研制，规模化生产提供理论依据与技术支持。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白的制备方法及应用

<130> 19

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgggaattca tgaataaaac actgattacc ttg 33

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccaagcttt cactgctgaa cttccgagat ccct 34

<210> 3

<211> 352

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Asn Lys Thr Leu Ile Thr Leu Leu Val Ser Gly Leu Leu Ala Ala

1 5 10 15

Asn Ala Gln Ala Ala Gly Gln Asp Asn Thr Trp Tyr Gly Gly Ala Lys

20 25 30

Leu Gly Trp Ser Asn Phe Tyr Gly Val Asp His Asn Gln Ala Ile Lys

35 40 45

Asp Asp Tyr Ala Ile Ser Glu Glu Asp Lys Asn Asp Val Gly Ala Gly

50 55 60

Ala Phe Leu Gly Tyr Gln Ile Asn Gln Asn Leu Gly Val Glu Leu Gly

65 70 75 80

Tyr Asp Trp Leu Gly Lys Tyr Lys Tyr Thr Ala Thr Asp Lys Leu Ile

85 90 95

Pro Thr Asp Ile Ser Arg Asp Glu Ile Lys Ala Gln Leu Ala Gln Leu

100 105 110

Thr Met Lys Ile Gly Leu Pro Val Ser Glu Ser Leu Asp Leu Tyr Thr

115 120 125

Arg Leu Gly Gly Ala Tyr Ala Trp Thr Asp Ser Lys Gln Leu Asp Asn

130 135 140

Asp Asn Gly Ala Ala Phe Val Gly Ala Leu Gly Ala Glu Tyr Ala Phe

145 150 155 160

Asn Arg Asp Trp Ala Ala Arg Leu Glu Tyr Gln Tyr Thr Thr Pro Leu

165 170 175

Gly Asp Lys Ala Leu Asp Lys Thr Gly Ala Glu Leu Asp Asn Gly Leu

180 185 190

Leu Ala Val Gly Val Val Tyr Arg Phe Gly Gln Val Ala Pro Val Val

195 200 205

Ala Ala Pro Val Pro Ala Pro Ala Pro Glu Pro Val Val Val Asp Lys

210 215 220

Gln Phe Thr Leu Ser Ser Asp Val Leu Phe Asp Phe Asn Lys Ala Thr

225 230 235 240

Leu Lys Pro Ala Ala Gly Gln Ala Leu Asp Asn Leu Tyr Ser Gln Ile

245 250 255

Glu Gln Ala Arg Pro Lys Asp Gly Val Ala Thr Val Ile Gly Tyr Thr

260 265 270

Asp Arg Ile Gly Ser Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Gln Arg

275 280 285

Ala Arg Thr Val Ala Asp Tyr Leu Val Gly Lys Gly Leu Pro Ala Gly

290 295 300

Lys Val Asn Val Glu Gly Arg Gly Lys Gly Asn Pro Val Thr Gly Asp

305 310 315 320

Ser Cys Thr Ser Lys Ser Lys Lys Glu Leu Ile Val Cys Leu Ala Pro

325 330 335

Asp Arg Arg Val Glu Val Lys Val Glu Gly Ile Ser Glu Val Gln Gln

340 345 350

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggatgagg aaatcgctgc c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctccctgatg tctgggtcgt c 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatttgaggg attctccatt gg 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgtagtcct tccccgtatc a 21

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<211> 21

<212> DNA

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tggacttcgc agcacaaaat g 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gttcacttca cgctcttgga tg 22

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ggagttcacc ttgcttatgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ccctctgacc cattcttgt 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgactcaact gtccgtgata 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccattagcca tctccatagt g 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtcgctgcat tgaaacagaa 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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cttaacccat ggagcagagg 20

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<212> DNA

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tcacgtcatg aacgagatcc 20

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<211> 22

<212> DNA

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cctcttgcat ttcaccatat cc 22

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acagaggaag aagcctacag 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gcgatgaaga cgagaaagag 20

Claims

1.一种嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白的制备方法，其特征在于：设计外膜蛋白基因克隆引物AHA_3793-EcoRI-F:CGGGAATTCATGAATAAAACACTGATTACCTTGC；AHA_3793-HindIII-R:CCCAAGCTTTCACTGCTGAACTTCCGAGATCCCT；通过原核重组，利用体外PCR扩增技术，扩增目的基因片段，构建pET32a原核表达载体重组质粒，转化重组质粒至BL21感受态，获得高表达菌株；通过IPTG诱导剂诱导高表达OMP P5蛋白并通过Ni-NTA树脂柱纯化获得嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白。

2.如权利要求1所述的方法制备获得嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白。

3.含权利要求2所述的蛋白的疫苗蛋白。

4.根据权利要求3所述的疫苗蛋白，其特征在于：将嗜水气单胞菌疫苗候选外膜蛋白与弗氏不完全佐剂以1:1体积比完全乳化，所得样品即作为嗜水气单胞菌疫苗的疫苗蛋白。

5.如权利要求3的疫苗蛋白在抗嗜水气单胞菌免疫中的应用。