KR20180064158A - 구제역 바이러스의 가용성 다가 항원단백질 및 이의 용도 - Google Patents

구제역 바이러스의 가용성 다가 항원단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈청형이 서로 다른 구제역 바이러스의 VP1 단백질 내 주요 항원성 에피토프들을 코돈 최적화하여 연결한 후 특이 미생물 발현시스템을 이용하여 융합단백질 항원 (Multi-VP1 epitopes)을 가용성의 단백질 (Soluble protein)로 발현시키는 벡터, 이에 의해 형질전환 된 미생물, 상기 미생물로부터 발현·정제된 가용성 Multi-VP1 epitope 단백질 및 상기 단백질의 백신목적으로의 이용에 대한 것으로, 더욱 자세하게는 대장균의 코돈에 최적화되게 유전자 서열을 변환한 O, A, Asia1 type 구제역 바이러스 혹은 각각의 동일 혈청형 내 서로 다른 지역형 구제역 바이러스의 VP1 단백질 내 주요 항원 에피토프들을 연결한 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터, 상기의 벡터로 형질전환 된 특이 재조합 대장균 및, 상기의 대장균으로부터 발현 및 정제된 가용성의 Multi-VP1 epitope 단백질을 유효성분으로 하는 구제역 바이러스 감염예방을 위한 백신에 관한 것이다.

Description

구제역 바이러스의 가용성 다가 항원단백질 및 이의 용도{Soluble Multi-Epitope Antigen of Foot-and-Mouth Disease Virus and Uses Thereof}
본 발명은 혈청형이 서로 다른 구제역 바이러스의 VP1 단백질 내 주요 항원성 에피토프들을 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 융합단백질 항원 (Multi-VP1 epitopes)을 특이 대장균 발현시스템을 이용하여 가용성의 단백질 (Soluble protein)로 발현시키는 벡터, 상기 벡터로 형질전환 된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물로부터 수득된 가용성 융합단백질 항원을 유효성분으로 함유하는 구제역 바이러스 감염의 예방용 백신에 관한 것이다.
구제역 바이러스 (Foot and Mouth Disease virus)는 단일가닥의 양극성 RNA 바이러스로 Picornaviridae과 Aphthovirus속에 속하는 바이러스로 막(Envelope)이 없이 구조단백질로 이루어진 캡시드 (capsid)에 쌓인채로 존재하는 바이러스이다. 7개의 혈청형 즉 A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2 및 SAT3형으로 분류되고 이 주요 혈청형은 다시 200여종의 여러 가지 아형으로 나뉘며 혈청형 또는 혈청아형 내에서 변이가 잘 일어나지만 혈청형 간의 교차 면역은 이루어지지 않기 때문에 그 예방 및 질병 발생의 조절이 매우 어려운 질병이다.
현재 구제역백신은 불활화 백신이 전 세계적으로 널리 사용되고 있다. 그러나 구제역 불활화 백신은 첫째, 구제역 병원체를 이용해 만들어진다는 점에서 그 위험성이 남아 있다는 문제점이 있다. 백신접종으로 인해 상피세포에서 바이러스의 증식이 조금이나마 일어날 가능성이 있고, 이로 인해 백신을 접종한 가축이 추후 실제 구제역 바이러스 감염에 대해 캐리어 상태로 남아있을 가능성 역시 존재한다. 둘째, 구제역 바이러스를 직접 이용해서 만드는 문제점의 연장선상에서, 기존의 백신은 제조공정에 있어 높은 방역수준을 갖춘 시설이 필요하다는 단점이 있다. 실험실이나 백신 제조 공장에서 이용되는 바이러스가 밖으로 퍼져 나가 감염원으로 작용할 수 있기 때문에 그 자체로 문제가 될 수 있으며 구제역이 발생하지 않는 청정국에서는 쉽게 백신제조를 결정하기가 힘들다. 셋째, 백신의 효능이나 위험성을 검증하기 힘들다는 단점이 있다. 즉, 위험성 검증을 위해 차폐된 시설에서의 동물실험이 항상 필요하고 각각 제조된 백신마다 그 성능을 일정하게 유지하기 어려운 점이 있다. 마지막으로, 기존의 백신은 구제역 바이러스를 감염시킨 세포의 상층액을 농축시켜 만들기 때문에 많은 양의 non-structural protein을 함유하고 있고 실제로 구제역 바이러스에 감염된 동물과 백신 접종되어 면역성을 가진 동물을 구별하는 NSP-antibody test가 어려울 수 있다. 따라서 구제역 바이러스에 대한 차세대 백신의 개발이 필요하며, 그 백신은 구제역 바이러스 전체를 이용해 만들지 않으므로 특수시설이 필요 없고, 균일한 성능의 백신 제조가 가능하며, 백신 접종된 동물과 자연감염 동물을 구별할 수 있는 방향으로 진행되어야 한다.
구제역 바이러스는 유전적 복잡성 및 다양성으로 혈청형 사이에 여러 변종이 있을 뿐 아니라 한 혈청형 내에서도 많은 변종이 존재하기 때문에 백신 생산에 어려움이 있다. 또한, 한 혈청형에 대한 백신은 다른 혈청형에 대하여 방어면역 효능이 없고 같은 혈청형에 속하는 두 주(strain)가 가진 유전자 서열에서 전체 유전자의 30%까지 차이가 있는 경우도 있어 구제역 백신은 혈청형마다 적용되어야 한다는 것이 중론이다. 그렇기 때문에 구제역 백신은 발생 주변지역에서 유행하는 바이러스 혈청형을 확인하고 그 혈청형에 따라 백신을 제조해야 하는 빠른 대처가 중요하다. 이를 위해서는 현재의 구제역 불활화 백신 개발과 생산 방법을 개선해야 할 필요가 있다. 따라서, 기존의 불활화 백신의 문제점을 보완하고, 장점은 부각시킬 수 있는 다른 형태의 백신 개발이 필요하다. 즉, 혈청형에 따른 빠른 재생산이 가능하고, 특수시설이 필요 없으며 균일한 성능의 백신 제조가 가능한 구제역 백신의 개발이 필요하다.
현재까지 기존 불활화 백신의 단점들을 극복하기 위해 국제적으로 차세대 백신을 위한 다양한 연구가 수행되고 있다. 예로서 구제역 cDNA 재조합 바이러스를 이용한 백신, 바이러스 입자로부터 정제된 VP1(Challa et al., Vaccine 25:3328-3337, 2007) 생물공학으로 제조된 VP1, 화학적으로 합성된 VP1 펩티드(Zhang et al., Virology journal 8:268, 2011), VP1 에피토프 펩티드(Gao et al., Virologica Sinica 25:18-26, 2010), VP1 에피토프를 발현하는 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 식물벡터(Andrianova et al., Biochemistry 76:339-346, 2011), VP1 에피토프를 코딩하는 DNA 백신(Wang et al., Vaccine 26:5135-5144, 2008), 복제 결함 인간 아데노바이러스 벡터를 통한 VP1-VP4 캡시드 전달 혹은 VP1 에피토프의 전달 (Lu et al., Vaccine 26:48-53, 2008) 등이 알려져 있다. 이들 개발하고 있는 차세대 백신들 중 구제역 항원의 주요 에피토프를 대장균에서 재조합으로 대량생산 정제하여 백신으로 이용하려는 노력이 있어 왔다(Xin et al., African Journal of Microbiology Research 5:486-495, 2011). 그러나 대장균 내 발현 시 불용성단백질 (Insoluble form)로의 발현에 따른 정제 및 대량생산의 어려움 등에 의해 현재까지 재조합 구제역백신으로서의 개발에 한계가 있다.
Challa, S. et al. Non-toxic Pseudomonas aeruginosa exotoxin A expressing the FMDV VP1 G-H loop for mucosal vaccination of swine against foot and mouth disease virus. Vaccine 25, 3328-3337, doi:10.1016/j.vaccine.2007.01.006(2007).
이에 본 발명자들은 재조합 구제역 백신의 개발을 위한 가장 기초적인 단계로서 Multi-VP1e 항원단백질을 대량으로 발현하고자 연구하던 중, 코돈변형 된 형태의 Multi-VP1e 항원단백질이 특정 숙주세포에서 응집(aggregation)되지 않고 높은 용해성을 보이며, 상용화 백신과 항체 생성능이 유사하게 높음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 다양한 구제역 바이러스 서브타입에 대해 강력한 면역반응을 유도할 수 있는 Multi-VP1e 항원단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 Multi-VP1e 항원단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 Multi-VP1e 항원단백질을 가용단백질(Soluble protein) 형태로 다량발현하고, 이를 정제할 수 있는 항원 발현시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 Multi-VP1e 항원단백질을 유효성분으로 함유하는 구제역 바이러스 감염 예방 백신을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 구제역 바이러스(FMDV) VP1 단백질의 혈청형에 따른 복수개의 에피토프를 포함하는 가용성 Multi-Vp1e 항원단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 가용성 Multi-VP1e 항원단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 Multi-VP1e 항원단백질을 가용단백질(Soluble protein) 형태로 다량발현하고, 이를 정제할 수 있는 항원 발현시스템을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항원 발현시스템을 이용하여 Multi-VP1e 항원단백질을 대량생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 가용성 Multi-VP1e 항원단백질을 유효성분으로 포함하는 구제역 바이러스 예방 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 가용성 Multi-VP1e 항원단백질을 우제류에 투여하는 것을 포함하는 구제역 바이러스에 대한 면역력을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 Multi-VP1e 항원단백질은 다양한 구제역 바이러스의 서브타입에 우수한 면역반응을 유발한다.
또한, 구제역 바이러스 전체를 이용하여 만들지 않아 특수시설이 아닌 일반 실험실 시설에서 항원을 제조할 수 있으며 감염성의 우려가 없어 안전하게 항원을 공급할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 미생물은 가용단백질 형태로 Multi-VP1e 항원단백질을 대량생산할 수 있어 경제적이고, 유행이 예상되는 구제역 바이러스 혈청형에 대해 단기간 내에 발현되는 항원을 교체할 수 있어 구제역 확산 방지에 효과적이다.
도 1 구제역 바이러스 O1/Manisa, A/Pocheon, Asia/Shamir VP1 단백질 내에 존재하는 2종류 에피토프의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 구제역 바이러스 O1/Manisa, A/Pocheon, Asia/Shamir의 Multi-VP1e 항원단백질 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 3은 항체제작과 ELISA에 사용된 O1/Manisa, A/Pocheon, Asia/Shamir 의 펩티드 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 정제된 구제역 바이러스 Multi-VP1e 항원단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법과 도 3의 펩티드를 사용하여 얻은 각각의 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 5는 마우스에 Multi-VP1e 항원단백질과 SEPPIC사의 ISA201을 혼합한 제제와, 상용화 백신, ISA201만을 각각 근육투여 한 뒤에 항체 생성 확인을 위한 혈청 채취 일정, 투여 이후 구제역 바이러스 ASIA1 Shamir strain 감염에 대한 실험일정을 모식화한 도이다.
도 6은 상기의 도 5의 일정대로 진행된 마우스 실험의 Multi-VP1e (O1/Manisa, A/Pocheon, Asia/Shamir) 투여 그룹을 나타낸 도이다.
도 7은 마우스에 Multi-VP1e 항원단백질과 ISA201 혼합제제를 투여한 실험군과 상용화 백신을 투여한 양성 대조군, ISA201만을 투여한 음성 대조군 그룹에서 도 5의 일정대로 혈청을 채취한 뒤, 각 타입의 구제역 바이러스 VP1 펩티드를 코팅하여 수행된 ELISA를 통해 마우스 혈청 내 항체 생성이 높은 비율로 이루어졌음을 희석 배율별로 확인한 도이다.
도 8은 불활화된 구제역 바이러스를 코팅하여 수행한 SP ELISA를 이용해 상기의 도 7에서 이용된 혈청 내 항체가 생성되었음을 각각의 타입별로 확인한 도이다.
도 9는 상기의 도 5의 일정대로 Multi-VP1e 항원단백질 혼합제제, 상용화 백신, ISA201을 투여한 이후에 구제역 바이러스 ASIA1 Shamir strain 감염에 대해 Multi-VP1e 항원단백질 혼합제제를 투여한 그룹이 높은 생존율을 나타내는 것을 확인한 도이다.
도 10은 도 9의 구제역 바이러스 ASIA1 Shamir strain 감염 이후 Multi-VP1e 항원단백질 혼합제제를 투여한 그룹에서 1일째부터 바이러스의 완전한 제거가 일어난 것을 qRT-PCR을 이용해 확인한 도이다.
도 11은 각각의 마우스 그룹에서 분리한 비장세포를 Multi-VP1e 항원단백질과 도 2에서 나타낸 각각의 VP1 펩티드로 자극해 수행된 ELISPOT을 통해 Multi-VP1e 항원단백질 투여에 의한 T면역세포의 활성화가 일어났음을 확인한 도이다.
도 12는 실험에 사용될 돼지를 PrioCHECK FMDV SP ELISA를 이용해 선별한 검사결과를 나타내는 도이다.
도 13은 농장에서 사육중인 8주령 돼지를 SP ELISA를 통해 선별한 뒤, Multi-VP1e 항원단백질 혼합제제를 용량별로 투여한 각각의 실험군과 ISA를 투여한 대조군에서 항체 생성 확인을 위해 혈청을 채취한 실험일정을 모식화한 도이다.
도 14는 상기 도 13의 일정대로 진행된 돼지의 Multi-VP1e (O1/Manisa, A/Pocheon, Asia Shamir) 투여 그룹을 나타낸 도이다.
도 15는 상기의 도 13의 일정대로 진행하여 채취한 돼지의 혈청을 비율별로 희석하여 각 타입의 구제역 바이러스 VP1 펩티드를 코팅하여 수행한 ELISA를 통해 Multi-VP1e 항원단백질 혼합제제 투여에 의한 혈청 내 항체형성이 목적동물인 돼지에서도 높은 비율로 이루어졌음을 확인한 도이다.
도 16은 상기의 도 13의 일정대로 진행하여 채취한 돼지의 혈청에서 항체가 생성되었음을 각 타입에 대한 SP ELISA를 통해 확인한 도이다.
도 17은 Multi-VP1e 항원단백질 효능 검증을 위한 돼지 선별 검사결과를 나타낸 도이다.
도 18은 농장에서 사육중인 8주령 돼지를 SP ELISA를 통해 선별한 돼지에서 Multi-VP1e 항원단백질 혼합제제와 상용화 백신, ISA201 투여 이후의 구제역 바이러스 ASIA1 Shamir strain 감염 실험일정을 모식화한 도이다.
도 19는 Multi-VP1e (O1/Manisa, A/Pocheon, Asia Shamir) 투여 돼지의 구제역 바이러스 감염에 따른 체온변화를 나타낸 도이다.
도 20은 상기의 도 18의 일정대로 진행된 구제역 바이러스 ASIA1 Shamir strain 감염 실험에서 각각의 그룹에서 나타난 임상증상을 평가하여 Multi-VP1e 항원단백질 혼합제제 투여 그룹이 바이러스 감염에 대한 임상증상이 나타나지 않았음을 확인한 도이다.
도 21은 구제역 바이러스 O/Jincheon, A/Pocheon, Asia/Shamir의 항원 부위 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 22는 현재 발생하고 있는 구제역 바이러스의 혈청형인 O/Jincheon, O/Pocheon, ASIA1/Sharmir의 VP1 epitope를 발현하는 Multi-VP1e 항원단백질 합성을 위해 pHis parallel 벡터에 재조합한 모식도를 나타낸 도이다.
도 23는 상기의 도 21의 유전자를 이용해 정제한 Multi-VP1e 항원단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법과 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다.
도 24는 상기 도 5의 일정대로 진행된 마우스 실험의 Multi-VP1e (O/Jincheon, A/Pocheon, Asia/Shamir) 투여 그룹을 나타낸 도이다.
도 25는 상기 도 5의 일정대로 정제된 Multi-VP1e 항원단백질을 투여한 마우스에서 혈청을 채취한 뒤, 각 타입의 구제역 바이러스 VP1 펩티드를 코팅하여 수행된 ELISA를 통해 마우스 혈청 내 항체 생성이 높은 비율로 이루어졌음을 희석배율별로 확인한 도이다.
도 26은 상기의 도 25의 마우스 혈청에서의 항체생성을 각각의 타입의 구제역 바이러스에 대한 SP ELISA를 이용해 측정한 도이다.
도 27은 정제된 Multi-VP1e 항원단백질과 상용화 백신, ISA201 투여한 마우스에 구제역 바이러스 ASIA1 Shamir strain 감염에 대해 Multi-VP1e 항원단백질을 투여한 그룹이 높은 생존율을 나타냄을 확인한 도이다.
도 28은 각 그룹의 마우스 비장세포를 분리한 뒤 ELISPOT을 이용해 현재 유행하는 구제역 바이러스의 혈청형을 이용한 Multi-VP1e 항원단백질 투여에 의한 T면역세포의 활성화가 일어났음을 확인한 도이다.
도 29는 구제역 바이러스 O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa의 항원 부위 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 30은 구제역 바이러스 O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa의 VP1 epitope를 발현하는 Multi-VP1e 항원단백질 합성을 위해 pHis parallel 벡터에 재조합한 모식도를 나타낸 도이다.
도 31은 정제된 구제역 바이러스 O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa의 Multi-VP1e 항원단백질을 SDS-PAGE에서의 확인하기 위해 사용된 항체의 제작과 형성된 항체의 확인을 위한 ELISA에 사용된 펩티드 서열을 각각의 타입에 대해 나타낸 도이다.
도 32는 정제된 구제역 바이러스 O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa의 Multi-VP1e 항원단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법과 도 31의 펩티드를 사용하여 얻은 각각의 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다.
도 33은 상기 도 5의 일정대로 구제역 바이러스 O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa의 Multi-VP1e 항원단백질을 투여한 마우스에서 혈청을 채취한 뒤, 각 타입의 구제역 바이러스 VP1 펩티드를 코팅하여 수행된 ELISA를 통해 마우스 혈청 내 항체 생성이 높은 비율로 이루어졌음을 희석 배율별로 확인한 도이다.
도 34는 각 그룹의 마우스 비장세포를 분리한 뒤 ELISPOT을 이용해 구제역 바이러스 O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa의 Multi-VP1e 항원단백질 투여에 의한 T면역세포의 활성화가 일어났음을 확인한 도이다.
도 35는 구제역 바이러스 A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq의 항원 부위 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 36은 구제역 바이러스 A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq의 VP1 epitope를 발현하는 Multi-VP1e 항원단백질 합성을 위해 pHis parallel 벡터에 재조합한 모식도를 나타낸 도이다.
도 37은 정제된 구제역 바이러스 A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq의 Multi-VP1e 항원단백질을 SDS-PAGE에서의 확인하기 위해 사용된 항체의 제작과 형성된 항체의 확인을 위한 ELISA에 사용된 펩티드 서열을 각각의 타입에 대해 나타낸 도이다.
도 38은 정제된 구제역 바이러스 A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq의 Multi-VP1e 항원단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법과 도 37의 펩티드를 사용하여 얻은 각각의 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다.
도 39는 상기 도 5의 일정대로 구제역 바이러스 A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq의 Multi-VP1e 항원단백질을 투여한 마우스에서 혈청을 채취한 뒤, 각 타입의 구제역 바이러스 VP1 펩티드를 코팅하여 수행된 ELISA를 통해 마우스 혈청내 항체 생성이 높은 비율로 이루어졌음을 희석배율별로 확인한 도이다.
도 40은 각 그룹의 마우스 비장세포를 분리한 뒤 ELISPOT을 이용해 구제역 바이러스 A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq의 Multi-VP1e 항원단백질 투여에 의한 T면역세포의 활성화가 일어났음을 확인한 도이다.
도 41는 구제역 바이러스 Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04의 항원 부위 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 42는 구제역 바이러스 Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04의 VP1 epitope를 발현하는 Multi-VP1e 항원단백질 합성을 위해 pHis parallel 벡터에 재조합한 모식도를 나타낸 도이다.
도 43은 정제된 구제역 바이러스 Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04의 Multi-VP1e 항원단백질을 SDS-PAGE에서의 확인하기 위해 사용된 항체의 제작과 형성된 항체의 확인을 위한 ELISA에 사용된 펩티드 서열을 각각의 타입에 대해 나타낸 도이다.
도 44는 정제된 구제역 바이러스 Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04의 Multi-VP1e 항원단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법과 도 43의 펩티드를 사용하여 얻은 각각의 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다.
도 45는 상기 도 5의 일정대로 구제역 바이러스 Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04의 Multi-VP1e 항원단백질을 투여한 마우스에서 혈청을 채취한 뒤, 각 타입의 구제역 바이러스 VP1 펩티드를 코팅하여 수행된 ELISA를 통해 마우스 혈청내 항체 생성이 높은 비율로 이루어졌음을 희석배율별로 확인한 도이다.
도 46은 각 그룹의 마우스 비장세포를 분리한 뒤 ELISPOT을 이용해 구제역 바이러스 Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04의 Multi-VP1e 항원단백질 투여에 의한 T면역세포의 활성화가 일어났음을 확인한 도이다.
본 발명은 구제역 바이러스(FMDV) 혈청형별 VP1 단백질의 복수개의 에피토프가 동시에 발현된 Multi-Vp1e 항원단백질을 제공한다.
본 발명에 있어서, Multi-Vp1e 항원단백질은 3개의 혈청형에 따른 RGD 모티프 및 C-터미너스(terminus) 에피토프가 무작위적으로 배열될 수 있다. 예를 들어 상기 구제역 바이러스의 Multi-VP1e 항원단백질은 도 1과 같은 형태로 구제역 바이러스 VP1 단백질의 RGD motif와 C-terminus로 구성될 수 있지만 도 1의 O1/Manisa, A/Pocheon, Asia/Shamir 와 같이 구제역 바이러스의 특정한 혈청형에 한정되는 것은 아니고 도 21과 같이 당시 유행중인 특정 혈청형 O/Jincheon, A/Pocheon, Asia/Shamir에 대한 VP1 에피토프를 포함하는 형태로 변형되어 적용되는 모든 기능적 동등물을 포함한다.
본 발명에서 용어 "기능적 동등물"이란 다양한 타입의 구제역 바이러스에 대한 VP1 에피토프를 포함하는 정제 항원단백질을 의미하며 이는 최소한으로 1개 혈청형의 VP1 에피토프에 대해, 바람직하게는 3개 혈청형 또는 그 이상의 혈청형에 대해서 합성되어 사용될 수 있는 다양한 형태의 정제 항원단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 재조합 단백질의 구축에 유용한 FMDV VP1 단백질의 항원 에피토프는 FMDV VP1 단백질의 아미노산 잔기 132-162 및 192-212(서열번호: 1 내지 6, 서열번호: 9 내지 14, 서열번호: 17 내지 22 및 서열번호: 33 내지 40)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 Multi-VP1e 항원단백질은 RGD motif와 C-terminus 이외에 숙주 내에서 면역성을 나타내는 다양한 종류의 VP1 epitope를 포함하며 바이러스의 유행에 따른 각 타입의 단백질 변이에 따른 변이체를 포함한다. 본 발명에서 용어 "변이체"는 바이러스의 시기별 유행에 따라 특정 혈청형이 발현하는 VP1 단백질의 epitope의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 복합적으로 나타나는 것을 의미한다.
본 발명의 항원단백질의 바람직한 실시양태에서, 재조합 Multi-VP1e 항원단백질의 상기 무작위적으로 배열되는 에피토프는 서로 펩티드 링커를 통해 연결되어 있다. 항원 에피토프 사이의 펩티드 링커는 항원 에피토프의 선형 구조에 영향을 미치지 않아야만 한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 펩티드 링커는 예를 들면 GPGPG(서열 번호:41), GGGPGGGGP(서열 번호:42) 및 GGGGP (서열 번호:43)이며, 바람직하게는 GPGPG이다. 본원에 제공된 실험 데이터는 상기 "GP 링커"가 본 발명에서 재조합 Multi-VP1e 단백질에서 무작위적으로 배열된 항원 에피토프의 선형 구조에 영향을 미치지 않고 재조합 Multi-VP1e 단백질이 동물에서 보호 항체의 생산을 유도할 수 있는 펩티드 링커로서 이용될 수 있음을 나타낸다.
본 발명에 있어서, Multi-VP1e 항원단백질이 서열번호: 8, 16, 24 및 40으 로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Multi-VP1e 항원단백질은 목적 동물에서 체액성 면역반응 또는 세포성 면역반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 Multi-VP1e 항원단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 Multi-VP1e 항원단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들면 폴리뉴클레오티드 분자는 화학적 합성을 통해 직접적으로 제조될 수 있다. 다르게는, 먼저, 방어하고자 하는 혈청형에 따른 다양한 항원 에피토프들을 암호화하는 각각의 핵산 분자를 수득하고, 펩티드 링커를 암호화하는 서열을 첨가한 후, 이들을 함께 연결하여 전체 Multi-VP1e 항원단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 형성하는 것이 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 폴리뉴클레오티드는 대장균의 코돈 사용빈도(codon usage)에 맞게 변형되는 것을 특징으로 한다. 재조합 항원의 폴리뉴클레오티드를 대장균에서 사용빈도가 높은 코돈(major codon)으로 구성하여 대장균(Escherichia coli)에 발현을 시키면 가용성 단백질로의 발현 확률과 발현량이 현저히 증가 (Sorensen, M. A., Kurland, C. G. & Pedersen, Journal of molecular biology 207, 365-377, 1989, Zhang, S. P., Zubay, G. & Goldman, Gene 105, 61-72 1991, Rosano, G. L. & Ceccarelli, E. A. Microbial cell factories 8, 41, 2009)할 뿐 아니라 사용빈도가 낮은 코돈(minor codon)의 폴리뉴클레오티드를 이용한 단백질 발현 시 생길 수 있는 문제를 피할 수 있다. 즉, 대장균에서 사용빈도가 낮은 코돈을 이용해 단백질을 발현시키면 번역과정(translation)이 중단되거나 뉴클레오티드의 서열이 바뀔 수 있고 (frame shifting) 아미노산이 제대로 구조를 이루지 못하여 (mis-incorporation of amino acids) 원하는 단백질이 발현되지 않을 수 있다 (Robinson, M. et al. Nucleic acids research 12, 6663-6671, 1984). 또한 대장균에서 사용빈도가 낮은 코돈을 이용하는 경우, 대장균 (Escherichia coli)의 성장에 영향을 주어 단백질 발현량에 문제를 일으킬 수 있다 (V Emilsson & C G Kurland EMBO Journal 9(13), 4359-4366, 1990).
본 발명의 상기 코돈 변형된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 7, 15, 23 및 31 로 구성된 군에서 선택되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 도입하는데 사용될 수 있는 발현 벡터, 예를 들면 원핵 발현 벡터 또는 진핵 발현 벡터는 당 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환 된 재조합 미생물에 관한 것이다. 재조합 미생물(숙주세포)에 따라서 목적 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하는 것이 단백질의 대량생산을 위해 중요하다.
본 발명의 Multi-VP1e 항원단백질을 발현하는데 사용될 수 있는 재조합 미생물(숙주 세포)은 바람직하게 대장균(Escherichia coli)일 수 있다. 상기 본 발명의 대장균 균주로 예를 들어 BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL, BL21-Codon Plus(DE3)-RG, OverExpress™ C41(DE3) and C43(DE3) Competent Cells, Value 107 HIT-21, DH5α™Competent Cells 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL 일 수 있다.
본 발명자들은 코돈 변형된 Multi-VP1e 항원단백질이 높은 용해성을 가지는 형태로 발현되는 대장균 숙주세포 시스템을 찾기 위해 상기 BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL, BL21-Codon Plus(DE3)-RG, OverExpress™ C41(DE3) and C43(DE3) Competent Cells, Value 107 HIT-21 및 DH5α™Competent Cells 에 다양하게 코돈 변형된 폴리뉴클레오티드를 도입하여 실험하였다. 그 결과, OverExpress™ C41(DE3) and C43(DE3) Competent Cells 및 Value 107 HIT-21, DH5α™Competent Cells의 경우는 Multi-VP1e 항원단백질이 수용성의 형태로 발현되지 않았으며 BL21-Codon Plus(DE3)-RG 세포의 경우는 적은 양의 Multi-VP1e 항원단백질이 수용성으로 발현되었으나 BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL 세포에 비해 10배 이상 낮은 수율로 발현되어 최종적으로 BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL 세포가 가장 높은 수율로 가용성 단백질을 발현함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
상기와 같은 결과는 BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL 세포가 tRNA를 추가로 발현하는 유전자를 포함하여 보다 효율적으로 Multi-VP1e 항원단백질을 발현할 수 있기 때문인 것으로 사료된다. 또한, BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL 세포는 tRNA 유전자 뿐 아니라 argU, ileY, LeuW와 같은 유전자를 발현하며 이들은 AT- or GC-rich genome의 단백질 발현을 용이하게 하여 VP1 단백질의 발현을 보다 효율적으로 매개할 수 있는 것으로 사료된다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 가용성 Multi-VP1e 항원단백질의 대량생산방법을 제공한다. 구체적으로 상기 가용성 Multi-VP1e 항원단백질의 대량생산방법은
(a) Multi-VP1e 항원단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 벡터로 대장균을 형질전환시키고 배양하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 배양된 대장균을 파쇄하여 Multi-VP1e 항원단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 가용성 Multi-VP1e 항원단백질의 대량생산방법일 수 있다.
상기 (b)단계에서 배양된 형질전환 미생물로부터 Multi-VP1e 단백질 발현을 유도하는 온도는, 바람직하게 15℃ 내지 25℃ 온도 범위일 수 있고, 가장 바람직하게 18℃ 내지 22℃일 수 있다. (b)단계와 같이, 특정 온도에서 Multi-VP1e 항원단백질 발현을 유도하면, 높은 용해성을 가지는 Multi-VP1e 항원단백질 발현량이 증가된다.
본 발명자들은 예비실험에서 Multi-VP1e 항원단백질을 코딩하는 재조합 벡터로 형질전환된 BL21-Codon Plus(DE3)-RG, OverExpress™ C41(DE3) and C43(DE3) Competent Cells, Value 107 HIT-21, DH5α™Competent Cells 및 BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL의 서로 다른 대장균에 대하여, 각각 37℃ 및 20℃에서 단백질 발현을 유도한 후 상기 Multi-VP1e 항원단백질의 발현 및 용해성 정도를 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과 20℃에서 발현 유도된 Multi-VP1e 항원단백질이 37℃에서 발현 유도된 단백질보다 높은 용해성을 갖는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 Multi-VP1e 항원단백질을 유효성분으로 포함하는 구제역 바이러스 예방 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적합한 담체 및/또는 보조제는 무기 보조제로서 예를 들면 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트; 유기 보조제로서 예를 들면 CpG DNA 또는 폴리 A; 미생물과 이의 추출물; 및 오일 보조제 등이 있으며, 본 발명에서 사용된 보조제는 ISA201이나 어떤 특정한 종류의 보조제에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 Multi-VP1e 항원단백질 또는 백신 조성물의 효과량을 이를 필요로하는 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 구제역 바이러스에 대한 면역력을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 백신은 단백질 백신의 투여에 적합한 임의의 경로로 투여될 수 있고, 예를 들면 피하, 근육 내, 복강 내 또는 정맥 내 주사에 의해 투여될 수 있고, 바람직하게는 목적동물에 하루 2회 근육접종으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "효과량"은 백신의 성분이 백신접종 되는 동물에서 FMDV에 특이적인 면역 반응을 유도하기에 충분한 양임을 의미한다. 효과량은 당 분야의 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 예를 들면 동물에서의 통상적인 실험을 통해 결정될 수 있다. 본 발명의 백신의 단백질 성분은 100 내지 2000㎍, 바람직하게는 200 내지 1000㎍의 총 양으로 투여될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 구제역 바이러스의 세 가지 혈청형인 O1/Manisa/Turkey/69, A/Pocheon/001/KOR/2010, ASIA/Shamir/89의 VP1의 두 가지 epitope(도 1:서열번호 1-6)를 pHis-parallel vector에 합성하여 대장균 발현 시스템을 이용해 수용성으로 정제하였으며, 정제된 Multi-VP1e 항원단백질이 마우스에 투여되었을 때 각각의 혈청형에 대한 항체가 형성되는 것을 ELISA와 SP ELISA를 통해, T 면역세포의 활성화에 관여하는 것을 ELIPOT을 통해 확인하였고, 투여 이후의 구제역 바이러스 감염에 대해 높은 생존율과 낮은 바이러스의 증식을 확인하여 성공적인 백신 효과를 나타내는 것을 증명하였다(도 4-11).
또한, 본 발명자들은 상기의 실험에서 이용된 세 종류의 혈청형 이외에 현재 유행중인 혈청형인 O/Jincheon, A/Pocheon, ASIA1/Sharmir(도 21: 서열번호 9-14)을 발현 벡터에 합성하여 정제한 Multi-VP1e 항원단백질을 같은 방법으로 마우스에 접종해 확인한 결과, 다른 종류의 혈청형으로 이루어진 Multi-VP1e 항원단백질이 혈청 내 항체형성과 T 면역세포 활성화를 통해 구제역 바이러스 감염에 대해서 역시 백신으로서의 효능을 나타내는 것을 확인하였다(도 21-28).
또한, 본 발명자들은 특정 타입의 바이러스에 대한 VP1 multiepitope을 발현 벡터에 합성하여 Multi-VP1e 항원단백질을 발현해 본 발명이 특정 타입의 바이러스에 대한 집약적인 효과를 갖는 백신으로 사용될 수 있음을 확인하였다. 구제역 바이러스 O 타입의 O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa(도 29: 서열번호 17-22), 구제역 바이러스 A 타입의 A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq(도 35: 서열번호 25-30), 구제역 바이러스Asia 타입의 Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04(도 41: 서열번호 33-38)을 각 Multi-VP1e 항원단백질의 합성을 위해 이용하였고, 모든 타입의 Multi-VP1e 항원단백질을 이용한 실험에서 마우스 혈청 내 항체형성과 T 면역세포의 활성화를 확인하였다(도 29-46).
본 발명자들은 구제역 바이러스의 대상 동물인 돼지에서의 Multi-VP1e 항원단백질의 효능을 확인하기 위해 농장에서 SP ELISA를 통해 선별된 돼지에 Multi-VP1e 항원단백질을 투여한 다음 혈청을 분리해 ELISA와 SP ELISA를 이용해 Multi-VP1e 항원단백질 투여에 의한 항체형성을 확인하였고, 같은 방법으로 선별된 돼지에 Multi-VP1e 항원단백질을 투여하고 구제역 바이러스를 감염시켜 감염 후에 나타나는 구제역 바이러스의 임상증상을 평가함으로써 Multi-VP1e 항원단백질에 의한 백신 효과를 증명하였다(도 12-20).
따라서, 본 발명의 Multi-VP1e 항원단백질은 다양한 종류의 혈청형의 구제역 바이러스의 감염에 대한 백신으로써 구제역 바이러스에 감수성을 가지는 동물들에 대해 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. O1 manisa , A pocheon , Asia1 shamir 각 혈청형의 주요항원 부위를 연결한 재조합 Multi - VP1e 유전자 제작
FMDV의 구조 단백질 중에서 가장 면역원성이 강하다고 알려진 VP1 단백질을 목적 항원단백질로 선택하였다. 그리고 O1/Manisa/Turkey/69, A/Pocheon/001/KOR/2010 및 Asia1/Shamir/89의 각 혈청형에 대한 면역원성을 동시에 증강 시킬 수 있는 하나의 항원을 제작하기 위해 좀 더 세분화하였다. VP1 단백질 중에서 면역원성에 가장 큰 기여를 한다고 알려져 있으며, 혈청형 사이에서 매우 잘 보존된 RGD motif를 지니고 있는 G-H loop (VP1 amino acid 132~162)와 면역원성에 기여하는 다른 부위인 C-terminus(VP1 amino acid 192~212)를 선택하였다 (도 1).
각 부위의 연결은 링커 (Linker amino acid sequence: GPGPG)을 이용하여 연결하여 유전자 서열을 작성하였고 이를 유전자 합성하여 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 유전자(서열번호 8)로 명명하였다.
실시예 2. His tag - Multi - VP1e (O/ Manisa -A/ Pocheon - Asia / Shamir ) 대장균 발현 벡터의 제작
합성한 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 유전자는 연쇄중합반응 (PCR)을 이용하여 5’ 말단에 EcoRI과 3’ 말단에 XhoI 부위를 삽입하여 변형시켰다. T Easy Vector (Invitrogen, Korea)에 라이게이션 후, 5’과 3’에 삽입된 제한효소로 절단하여, pHis parallel 벡터에 다시 라이게이션 하였다. 제작된 His tag-Multi-VP1e (O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) plasmid는 E. coli DH5a에 형질 전환시키고 증폭하였으며, 증폭된 plasmid 단백질 발현 E. coli(E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL Competent Cells (Agilent technology, #230280))에 형질전환 시켜 목표 단백질이 발현될 수 있도록 유도하였다(도 2).
실시예 3. E. coli BL21- Codon Plus (DE3)- RIPL Competent Cell 내 목표단백질 발현과 정제
His tag-Multi-VP1e (O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) plasmid로 형질 전환된 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL Competent Cells (Agilent technology, #230280)을 ampicillin이 함유된 LB plate에 백금이를 이용하여 streaking하고 37℃에서 하루 동안 배양시켜 콜로니 형성을 유도하였다. 이 콜로니를 5ml의 LB broth에 seeding하여 37℃에서 하루 동안 예비 배양시킨 후 이를 3L의 LB broth에 옮겨 본 배양을 하였다. 본 배양 시 OD600의 값이 약 0.6이 되었을 때 IPTG의 최종 농도가 1mM이 되도록 넣어주었다. IPTG를 이용하여 락토오즈 작동유전자를 자극시켜 단백질 형성을 유도하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이를 원심분리를 이용하여 대장균만을 얻어내고 버퍼용액 (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)을 이용하여 세척한 뒤 같은 버퍼용액으로 재 부유를 시켜준 후 sonication을 이용하여 대장균으로부터 목표 단백질을 용출시켰고, 원심분리 기(12,000rpm/30min/4 ℃)를 이용하여 분리한 뒤 상층액 만을 얻어 수용성 단백질을 얻어냈다. 이 수용성 단백질 분획을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법으로 발현 정도를 확인하였다. 확인된 수용성 His tag-Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질을 FPLC와 IMAC을 이용하여 목적단백질 항원만을 정제하였다.
실시예 4. 정제된 His tag - Multi - VP1e (O/ Manisa -A/ Pocheon - Asia / Shamir ) 단백질 확인
정제된 목표 단백질인 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질은 12% SDS-PAGE로 전기영동 하였고, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법을 이용하여 확인하였다. 또한, 웨스턴 블롯을 이용하여 확인하였다. 이때 사용한 항체는 O1 manisa, A pocheon, Asia1 shamir 각 혈청형의 VP1내 RGD 모티프를 포함한 펩티드(도 3)를 이용하여 제작한 항체를 이용하였다. 이 항체들을 웨스턴 블롯시에 각각 1:1000의 비율로 PBST에 혼합하여 반응하였고, His tag(3Kda)과 Multi-VP1e(20Kda) 항원단백질이 합쳐진 크기인 약 25 Kda에서 항원단백질을 확인할 수 있었다 (도 4).
실시예 5. 항원단백질 과 면역증강제를 혼합하여 백신 제조
SEPPIC 사로부터 제공받은 ISA201가 선행실험을 통해 가장 좋은 면역증강 효과를 이끌어냄을 확인하여 이를 이용하여 본 실험을 실시하였다. 항원단백질인 Multi-VP1e단백질과 면역증강제 혼합은 1:1의 중량비로 혼합하였고, 1ml 주사기와 3 way stopcock를 이용하였다. SEPPIC 사에서 권장하는 방법대로 혼합 후 1시간 실온 보관 뒤 4℃에서 하루 동안 보관한 뒤 사용하였다.
실시예 6. 마우스에 FMDV 백신 접종 후 면역반응 유도 분석
마우스는 5주령의 female C57BL/6N crljori를 오리엔탈바이오(한국)에서 구입하여 사용하였다. 면역증강제와 혼합된 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질을 접종 계획은 도 5와 같이 진행하였고, 도 6과 같이 마우스의 그룹을 나누었다. 실험은 3개의 실험군 마우스로 실시하여 각각 실험군은 1) ISA 201과 PBS 버퍼의 혼합제 투여군, 2) 구제역 다가항원단백질(Multi-VP1e)과 ISA 201 혼합제 투여군, 3) 상용화된 4가 백신 투여군으로 분리하여 구제역 다가항원단백질 백신의 효능을 실험하였다.
각 실험군은 각각 13마리씩 분리하였고, 1)번 그룹은 PBS 40ul와 ISA201 40ul, 2)번 그룹은 Multi-VP1e 40ug과 ISA201 40ul를 혼합하여 1주일 간격을 두고 2회 근육주사 하였다. 3)번 그룹은 농림축산검역본부 구제역진단과에서 사용하는 방식대로 상용화 백신 100ul를 1회 근육주사 하였다. 이후 21일째에서 얻은 혈청을 이용하여 O1 manisa, A pocheon, Asia1 shamir에 대한 항원 펩티드 혹은 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 단백질로 코팅하여 수행한 ELISA를 통해 OD450nm에서 항체생성율을 분석하였다 (도 7). 또한 더욱 정확한 분석을 위해 불활화된 FMDV를 코팅하여 수행하는 PrioCHECK® FMDV Type SP Antibody ELISA Kit (Life technology)를 각 혈청형 별로 수행하였다 (도 8).
OD 450nm에서 분석 결과와 PrioCHECK® FMDV Type Antibody ELISA 분석 결과 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir)와 ISA 201 혼합제가 상용화 백신과 유사하거나 더 높은 항체 생성을 유도하는 것을 확인하였다.
실시예 7. FMDV 감염에 대한 백신의 효능 분석
마우스에 마지막으로 Multi-VP1e 항원단백질을 접종한 후 2주 뒤에 FMDV Asia1 shamir 바이러스 10LD50 양을 마우스의 복강 내로 투여하여 감염을 유도하였다. 마우스 바이러스 감염실험에 사용되는 바이러스는 Asia1/shamir/89의 혈청형이 사용되었으며, 이는 농립축산검역원의 구제역진단과의 차폐실에서 진행되었다. 바이러스의 양은 10LC50으로 사용하였다.
감염 후 8일 동안 생존율을 분석한 결과 대조군 마우스는 3일 이내에 모두 사망하였고, Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir)와 ISA 201 혼합제 투여군과 상용화 백신 투여군은 모두 생존하였다 (도 9).
FMDV Asia1 shamir 바이러스 감염 후 1일과 3일째 얻어낸 마우스 혈청 샘플을 통해 qRT-PCR을 진행하여 바이러스 양 측정 결과 상용화 백신 투여군에서는 3일째부터 바이러스의 완전한 제거가 일어난 반면, Multi-VP1e 다가항원단백질 투여군은 1일째부터 완전한 제거가 일어난 것으로 확인되었다 (도 10). 이를 통해 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질의 백신 효능이 우수함을 확인하였다.
실시예 8. 마우스 비장세포에서 사이토카인 생산 분석
Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질에 의해 T 면역세포가 반응하여 면역작용에 관여하였는지를 알아보기 위해 Multi-VP1e 항원단백질로 접종된 마우스의 비장 내 비장세포를 분리하고, 이에 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 단백질, O1/Manisa/Turkey/69, A/Pocheon/001/KOR/2010 및 Asia1/Shamir/89등 각각의 VP1 peptide로 자극하는 방법을 이용하여 T-면역세포 반응 실험을 실시하였다.
BDTM ELISPOT set을 이용하여 실험을 진행하였다. 먼저 purified IFN-r antibody와 purified IL-4 antibody를 PBS에 1:200으로 희석하여 100ul/well로 분주하여 coating하였다. 다음날 비장을 분리하여 비장세포를 얻어내고, 이에 ACK lysis buffer를 이용하여 적혈구 세포를 제거하여 준 다음 RPMI media를 이용하여 washing을 한 뒤 재부유 시켜주었다. media에 있는 세포의 수를 세어 각 개체로부터 얻은 비장세포를 7x105/100ul의 농도로 동일하게 맞추어 준 뒤 100ul/well로 분주하였다. 상기 자극제(VP1 peptide)들을 3ug/100ul의 농도로 RPMI media(10% FBS)동일하게 희석한 뒤 100ul/well로 분주하였다. 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에 보관한 뒤 Detection antibody와 Streptabidin-HRP를 반응시켰다. 마지막으로 이를 AEC buffer를 이용하여 발색시켜 IFN-r와 IL-4로 인해 발생된 점의 개수를 측정하여 그래프로 표현하였다 (도 11). 양성 대조군인 Mitogen 자극제 (1ug/well)과 음성 대조군인 media only를 통해 실험이 올바르게 진행되었음을 확인하였으며, 백신 그룹에서만 IFN-r와 IL-4가 생성되어 발색으로 인한 점의 생성이 확인되었음을 확인하였다. 위 실험을 통해 Multi-VP1e 항원단백질에 의해 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질에 대한 T 면역세포의 활성화 면역작용에 기여하였음을 확인하였다.
실시예 9. 돼지에 Multi - VP1e 항원단백질 접종 후 면역원성 분석
농장에서 사육되고 있는 8주령 돼지 20마리의 혈청을 대상으로 PrioCHECK® FMDV Type O SP Atibody ELISA Kit를 이용하여 선별검사를 수행하였다 (도 12). 선별검사 결과 높은 PI(percentage inhibition)값이 나온 돼지를 제외하여 12마리를 선별하고, 3마리씩 4가지 그룹으로 나누었다. 면역증강제와 PBS버퍼의 혼합물을 투여하여 대조군을 설정하였고, Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질을 100ug, 200ug, 300ug으로 세 가지 용량을 설정하여 3가지 실험군을 설정하였다 (도 14).
도 13의 투여일정에 따라 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질의 접종은 0주차와 4주차에 실시하였고, 채혈은 3주차와 6주차에 진행하였다. 돼지 혈액은 4℃에서 1시간 보관 후 원심분리기를 이용하여 혈청을 얻었다. 6주차의 돼지 혈청을 이용하여 항원코팅 ELISA를 수행하였다. 혈청을 1:50 비율부터 2배로 순차 희석하여 1:1600까지 희석배수를 설정하였다.
백신 그룹이 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질과 O1 manisa, A pocheon, Asia1 shamir 바이러스의 VP1 펩티드 등 모든 항원에 대하여 높은 항체 값을 나타내었고, 모든 혈청 희석 배수에서도 높은 항체값을 나타내었다 (도 15). 돼지 혈청을 대상으로 PrioCHECK® FMDV Type SP Antibody ELISA을 이용하여 O, A, Asia 각각의 혈청형 별로 진행하였다. 1차 접종과 2차 접종 후 ELISA 결과 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질 접종 그룹이 높은 값을 나타내었고, 개체 차이도 줄어들었음을 확인할 수 있었다 (도 16).
실시예 10. 돼지에서 Multi - VP1e 항원단백질 의 백신 효능 분석
농장에서 사육되고 있는 8주령 돼지 50마리의 혈청을 대상으로 PrioCHECK® FMDV Type O SP Antibody ELISA Kit를 이용하여 선별검사를 수행하였다. (도 17). 선별검사 결과 높은 PI 값이 나온 돼지를 제외하여 11마리를 선별하고, 도 18과 같이 실험계획을 수립하였다. 상용화 백신과 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon- sia/Shamir) 항원단백질의 접종은 0주차와 4주차에 실시하였고, 5주차를 지난 시점에서 Asia 1 type Shamir strain을 감염시켰다.
도 19 에서와 같이, 감염 후 9일 동안의 체온변화를 지켜 본 결과 상용화 백신 그룹과 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질 접종 그룹의 체온상승이 확인되지 않았다. 그리고 Asia 1 type Shamir strain 접종 후 10일 동안 입이나 발에 수포형성여부, 식욕저하, 다리절음, 기립불능 등의 임상증상을 확인한 결과, 도 20과 같이, Adjuvant only 그룹에서 보이는 상기 임상증상이 상용화 백신 그룹과 Multi-VP1e (O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질 접종 그룹에서는 보이지 않았다.
본 실험결과에 의해 Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질 300ug을 ISA201 VG와 혼합하여 준비한 vaccine candidate는 마우스 모델에서뿐 만 아니라 목적동물인 돼지에서도 FMDV 공격접종에 방어할 수 있는 면역능을 유도할 수 있음을 확인하였다.
실시예 11- 14. 다양한 구제역 바이러스 서브타입에 대한 방어 효과
실시예 11. 새로운 구제역 발생주에 대한 효능 확인
11-1. 새로운 구제역 발생주의 Multi - VP1e 항원단백질 제작
현재 발생하고 있는 구제역 바이러스의 VP1 내 epitope으로 새로운 Multi-VP1e를 제작하여 백신 효능을 검증하고 실제 적용하여 구제역 예방에 사용할 수 있는 백신을 제작할 수 있다. 실시예 1의 혈청형 중 O1 manisa 를 현재 발생하고 있는 O type 혈청형인 진천 발생주(O/Jincheon)로 교체하여 3가지 혈청형의 O/Jincheon, A/Pocheon, Asia1/Shamir의 G-H loop (VP1 amino acid 132~162)와 C-terminus(VP1 amino acid 192~212)를 포함한 항원 부위를 결정하고 (도 21), 유전자를 제작하였으며 이를 Multi-VP1e(O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir) 유전자로 명명하였다.
11-2. His tag - Multi - VP1e (O/ Jincheon -A/ Pocheon - Asia / Shamir ) 대장균 발현 벡터제작, 목표단백질 발현 및 정제
5’ 말단에 EcoRI과 3’ 말단에 XhoI 부위를 삽입하여 연쇄중합반응 (PCR)를 하여 실시예 2와 같이 His tag-JC-Multi-VP1 plasmid를 만들고 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL Competent Cells (Agilent technology, #230280) (Agilent technology)에 형질전환 시켜 목표 단백질이 발현 될 수 있도록 유도하였다. 실시예 3의 방법을 통해 대장균으로부터 수용성 목표 단백질을 분리하고 발현정도를 확인하였다. 확인된 수용성 His tag-Multi-VP1e (O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질을 FPLC와 IMAC을 이용하여 정제하였다.
11-3. 정제된 His tag - Multi - VP1e (O/ Jincheon -A/ Pocheon - Asia / Shamir ) 단백질 확인
정제된 목표 단백질인 Multi-VP1e(O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질을 실시예 4와 같이 쿠미시 브릴리언트 블루 염색법으로 확인하였고, 실시예 4에서 사용한 A VP1, Asia1 VP1내 RGD 모티프 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 통해 항원단백질의 발현을 확인하였다 (도 23).
11-4. 마우스 내 구제역 항원에 대한 면역원성 확인
실시예 5와 같이 Multi-VP1e(O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir)단백질과 면역증강제를 1:1의 중량비로 혼합하고 도 24과 같이 마우스 그룹을 나누고 접종 계획은 도 5와 같이 진행하였다. 실시예 6과 같이 접종 시작 후 21일째 각 마우스로부터 혈청을 얻어 O jincheon, A pocheon, Asia1 shamir에 대한 항원 펩티드 혹은 Multi-VP1e(O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir) 단백질로 코팅하여 수행한 ELISA를 통해 OD450nm에서 항체생성율을 분석하였다 (도 25). 또한 Type SP Antibody ELISA Kit (Life technology)를 각 혈청형 별로 수행하였다 (도 26). 두 가지 항체 생성 분석 결과 Multi-VP1e(O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir)와 ISA 201 혼합제가 상용화 백신과 유사한 높은 항체 생성 유도를 확인하였다.
11-5. 항원단백질 의 백신 효능 분석
마우스에 Multi-VP1e(O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질을 접종한 마지막 날로부터 2주 뒤에 FMDV Asia1 shamir 바이러스 10LD50 양을 마우스의 복강 내로 투여하여 감염을 유도하였다. 감염 후 8일 동안 생존율을 분석한 결과 대조군 마우스는 2일째에 모두 사망하였고, Multi-VP1e(O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir)와 ISA 201 혼합제 투여군은 한 마리만 사망하고 상용화 백신 투여군은 모두 생존하였다 (도 27). 이를 통해 Multi-VP1e 항원단백질의 백신 효능이 우수함을 확인하였다.
11-6. 마우스 비장세포에서 사이토카인 생성 분석
Multi-VP1e(O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질에 의해 T 면역세포가 반응하여 면역작용에 관여하였는지를 알아보기 위해 실시예 8과 같이 Multi-VP1e(O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질으로 접종된 마우스의 비장내 비장세포를 분리하고, Multi-VP1e(O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir) 단백질, O/Jincheon, A/Pocheon/001/KOR/2010 그리고 Asia1/Shamir/89을 이용하여 ELISPOT을 진행하였다. IFN-r와 IL-4의 분비 정도를 측정한 결과 백신 그룹에서만 IFN-r와 IL-4가 생성됨을 확인하였다(도 28). 위 실험을 통해 Multi-VP1e(O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir) 항원단백질에 의해 Multi-VP1e(O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir) 및 O jincheon, A pocheon, Asia1 shamir 항원단백질에 대한 T 면역세포의 활성화 면역작용에 기여하였음을 확인하였다. 이 실험을 통하여 당시 발생하는 구제역 바이러스에 맞추어 새로운 Multi-VP1e를 적용하여 구제역 예방에 사용할 수 있는 백신의 제작이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 12. 구제역 바이러스 O type에 대한 백신 효능 확인
12-1. 구제역 바이러스 O type의 Multi - VP1e 항원단백질 제작
특정 타입 구제역 바이러스의 VP1 epitope으로 새로운 Multi-VP1e를 제작하여 백신 효능을 검증하고 실제 적용하여 구제역 예방에 사용할 수 있는 백신을 제작할 수 있다. O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa 세 종류의 구제역 바이러스 O 타입의 G-H loop (VP1 amino acid 132~162)와 C-terminus(VP1 amino acid 192~212)를 포함한 항원 부위를 결정하고 (도 29), 유전자를 제작하였으며 이를 Multi-VP1e(O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa) 유전자로 명명하였다.
12-2. His tag - Multi - VP1e (O/ Jincheon , O/ Andong , O/ Manisa ) 대장균 발현 벡터제작, 목표단백질 발현, 정제 및 확인
5’ 말단에 EcoRI과 3’ 말단에 XhoI 부위를 삽입하여 연쇄중합반응 (PCR)를 하여 His tag-JC-Multi-VP1 plasmid를 만들고 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL Competent Cells (Agilent technology, #230280)에 형질전환시켜 목표 단백질이 발현될 수 있도록 유도하였다. 실시예 3의 방법을 통해 대장균으로부터 수용성 목표 단백질을 분리하고 발현 정도를 확인하였다. 확인된 수용성 His tag-Multi-VP1e(O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa) 항원단백질을 FPLC와 IMAC을 이용하여 정제하였다. 정제된 목표 단백질인 Multi-VP1e (O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa) 항원단백질을 실시예 4와 같이 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법으로 확인하였고, O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa VP1 내 RGD 모티프 항체를 이용하여 (도 31), 웨스턴 블롯을 통해 항원단백질의 발현을 확인하였다 (도 32).
12-3. 마우스 내 구제역 항원에 대한 면역원성 분석
실시예 5와 같이 Multi-VP1e(O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa)단백질과 면역증강제를 1:1의 중량비로 혼합하고 도 5의 일정과 동일하게 실험을 진행하였다. 실시예 6과 같이 접종 시작 후 21일째 각 마우스로부터 혈청을 얻어 O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa에 대한 항원 펩티드 혹은 Multi-VP1e(O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa) 단백질로 코팅하여 수행한 ELISA를 통해 OD450nm에서 항체생성율을 분석하였다 (도 33). 항체 생성 분석 결과 Multi-VP1e (O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir)와 ISA 201 혼합제가 상용화 백신과 유사하게 항체 생성이 많음을 확인하였다. 또한, 실시예 8과 같은 방법으로 T 면역세포의 반응을 분석하여 Multi-VP1e (O/Jincheon-A/Pocheon-Asia/Shamir)에 의한 특이 T 면역세포의 면역반응이 유도되는 것을 확인하였다 (도 34).
실시예 13. 구제역 바이러스 A type에 대한 백신 효능 확인
13-1. 구제역 바이러스 A type의 Multi - VP1e 항원단백질 제작
A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq 세 종류의 구제역 바이러스 O 타입의 G-H loop (VP1 amino acid 132~162)와 C-terminus(VP1 amino acid 192~212)를 포함한 항원 부위를 결정하고 (도 35), 유전자를 제작하였다. 이를 Multi-VP1e(A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq) 유전자로 명명하였다.
13-2. His tag - Multi - VP1e (A/ Pocheon , A/ Malay97 , A/ Iraq ) 대장균 발현 벡터제작, 목표단백질 발현, 정제 및 확인
5’ 말단에 EcoRI과 3’ 말단에 XhoI 부위를 삽입하여 연쇄중합반응 (PCR)를 하여 His tag-JC-Multi-VP1 plasmid를 만들고 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL Competent Cells (Agilent technology, #230280)에 형질전환시켜 목표 단백질이 발현될 수 있도록 유도하였다. 실시예 3의 방법을 통해 대장균으로부터 수용성 목표 단백질을 분리하고 발현 정도를 확인하였다. 확인된 수용성 His tag-Multi-VP1e(A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq) 항원단백질을 FPLC와 IMAC을 이용하여 정제하였다. 정제된 목표 단백질인 Multi-VP1e (A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq) 항원단백질을 실시예 4와 같이 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법으로 확인하였고, A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq VP1 내 RGD 모티프 항체를 이용하여 (도 37), 웨스턴 블롯을 통해 항원단백질의 발현을 확인하였다 (도 38).
13-3. 마우스 내 구제역 항원에 대한 면역원성 분석
실시예 5와 같이 Multi-VP1e(A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq)단백질과 면역증강제를 1:1의 중량비로 혼합하고, 도 4의 일정으로 실험을 진행하였다. 실시예 6과 같이 접종 시작 후 21일째 각 마우스로부터 혈청을 얻어 A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq에 대한 항원 펩티드 혹은 Multi-VP1e(A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq) 단백질로 코팅하여 수행한 ELISA를 통해 OD450nm에서 항체생성율을 분석하였다 (도 39). 항체 생성 분석 결과 Multi-VP1e(A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq)와 ISA 201 혼합제가 상용화 백신과 유사한 높은 항체 생성 유도를 확인하였다. 또한 실시예 8과 같은 방법으로 T 면역세포의 반응을 분석하여 Multi-VP1e (A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq)에 의한 특이 T 면역세포의 면역반응이 유도되는 것을 확인하였다 (도 40)
실시예 14. 구제역 바이러스 Asia type에 대한 백신 효능 확인
14- 1. 구제역 바이러스 Asia type의 Multi - VP1e 항원단백질 제작
Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04 세 종류의 구제역 바이러스 Asia 타입의 G-H loop (VP1 amino acid 132~162)와 C-terminus(VP1 amino acid 192~212)를 포함한 항원 부위를 결정하고 (도 41), 유전자를 제작하였으며, 이를 Multi-VP1e(Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04) 유전자로 명명하였다.
14-2. His tag - Multi - VP1e ( Asia / Shamir , Asia / Mongolia05 , Asia /LC04) 대장균 발현 벡터제작, 목표단백질 발현, 정제 및 확인
5’ 말단에 EcoRI과 3’ 말단에 XhoI 부위를 삽입하여 연쇄중합반응 (PCR)를 하여 His tag-JC-Multi-VP1 plasmid를 만들고 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL Competent Cells (Agilent technology, #230280)에 형질전환시켜 목표 단백질이 발현될 수 있도록 유도하였다. 실시예 3의 방법을 통해 대장균으로부터 수용성 목표 단백질을 분리하고 발현 정도를 확인하였다. 확인된 수용성 His tag-Multi-VP1e(Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04) 항원단백질을 FPLC와 IMAC을 이용하여 정제하였다. 정제된 목표 단백질인 Multi-VP1e (Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04) 항원단백질을 실시예 4와 같이 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법으로 확인하였고, Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04 VP1 내 RGD 모티프 항체를 이용하여 (도 43), 웨스턴 블롯을 통해 항원단백질의 발현을 확인하였다 (도 44).
14- 3. 마우스 내 구제역 항원에 대한 면역원성 분석
실시예 5와 같이 Multi-VP1e(Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04)단백질과 면역증강제를 1:1의 중량비로 혼합하고, 도 4의 일정으로 실험을 진행하였다. 실시예 6과 같이 접종 시작 후 21일째 각 마우스로부터 혈청을 얻어 Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04에 대한 항원 펩티드 혹은 Multi-VP1e(Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04) 단백질로 코팅하여 수행한 ELISA를 통해 OD450nm에서 항체생성율을 분석하였다 (도 45). 항체 생성 분석 결과 Multi-VP1e(Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04)와 ISA 201 혼합제가 상용화 백신과 유사한 높은 항체 생성 유도를 확인하였다. 또한, 실시예 8과 같은 방법으로 T 면역세포의 반응을 분석하여 Multi-VP1e (Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04)에 의한 특이 T 면역세포의 면역반응이 유도되는 것을 확인하였다 (도 46).
<110> Animal and Plant Quaratine Agency And Chungnam National University <120> Soluble Multi-Epitope Antigen of Foot-and-Mouth Disease Virus and Uses Thereof <130> 16-10602 <160> 43 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 1 Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val Arg Gly Asp 1 5 10 15 Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Ala Leu Pro Thr Ser 20 25 30 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 2 Leu Ala Ile His Pro Asp Gln Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala 1 5 10 15 Pro Val Glu Gln Leu 20 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 3 Val Tyr Asn Gly Thr Ser Arg Tyr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Arg Gly 1 5 10 15 Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala 20 25 30 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 4 Leu Leu Ala Val Glu Val Thr Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile 1 5 10 15 Ile Ala Pro Ala Lys 20 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 5 Tyr Asn Gly Lys Thr Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Ser Arg Arg Gly Asp 1 5 10 15 Met Ala Ala Leu Ala Gln Arg Leu Ser Ala Arg Leu Pro Thr Ser 20 25 30 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 6 Leu Ala Leu Asp Thr Thr Gln Asp Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala 1 5 10 15 Pro Gln Lys Gln Val 20 <210> 7 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide of Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) <400> 7 ggatccggga actgcaagta tggtgacggc acggtggcca atgtgagagg tgacctgcaa 60 gtgttggccc agaaggcggc gagagcgctg cctacctccg gtcctggtcc tggtttggcc 120 attcacccgg accaggctag acacaagcag aagattgtgg caccggtgga acagcttggt 180 cctggtcctg gtgtgtacaa cgggactagc aggtactctg cgcctgcaac acggcgaggt 240 gacttggggt ctctcgcggc gaggctcgcc gcacagcttc ctgccggtcc tggtcctggt 300 ctgctggcgg tggaggtgac gtcacaagac agacacaagc agaaaatcat tgcccctgca 360 aagggtcctg gtcctggtta caacgggaag acggcgtacg gggaaacgac ctcaaggcgc 420 ggcgacatgg cggccctcgc acaaaggttg agcgctcggc tgcccacctc cggtcctggt 480 cctggtctag cccttgacac cactcaggac cgccgcaaac aggagatcat tgcacctgag 540 aagcaggttg tcgac 555 <210> 8 <211> 555 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic protein Multi-VP1e(O/Manisa-A/Pocheon-Asia/Shamir) <400> 8 Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala 1 5 10 15 Ala Gly Thr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Gly Gly Cys Ala Cys 20 25 30 Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala Ala Thr Gly Thr Gly Ala Gly Ala 35 40 45 Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Thr Gly Thr 50 55 60 Thr Gly Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys 65 70 75 80 Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Ala Cys Cys 85 90 95 Thr Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Gly 100 105 110 Gly Thr Thr Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys 115 120 125 Gly Gly Ala Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Ala Gly Ala Cys Ala Cys 130 135 140 Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Gly Thr 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<400> 19 Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp 1 5 10 15 Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser 20 25 30 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 20 Leu Leu Ala Val Glu Val Thr Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile 1 5 10 15 Ile Ala Pro Ala Lys 20 <210> 21 <211> 31 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 21 Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val Arg Gly Asp 1 5 10 15 Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Ala Leu Pro Thr Ser 20 25 30 <210> 22 <211> 21 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 22 Leu Ala Ile His Pro Asp Gln Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala 1 5 10 15 Pro Val Glu Gln Leu 20 <210> 23 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide of Multi-VP1e(O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa) <400> 23 ggcaactgca aatataccgg cggcagctta ccgaacgtgc gcggcgattt acaggtgtta 60 gcgccgaaag cggcgcgccc gttaccgacc agcggtcctg gtcctggttt agcggtgcat 120 ccgagcgcgg cgcgccataa acagaaaatt gtggcgccgg tgaaacaggg tcctggtcct 180 ggtggcaact gcaaatatgc gggcggcagc ttaccgaacg tgcgcggcga tttacaggtg 240 ttagcgcaga aagcggcgcg cccgttaccg accagcggtc ctggtcctgg tttagcggtg 300 catccgagcg cggcgcgcca taaacagaaa attgtggcgc cggtgaaaca gagcggtcct 360 ggtcctggtg gcaactgcaa atatggcgat ggcaccgtgg cgaacgtgcg cggcgattta 420 caggtgttag cgcagaaagc ggcgcgcgcg ttaccgacca gcggtcctgg tcctggttta 480 gcgattcatc cggatcaggc gcgccataaa cagaaaattg tggcgccggt ggaacagtta 540 540 <210> 24 <211> 540 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic protein Multi-VP1e(O/Jincheon, O/Andong, O/Manisa) <400> 24 Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala 1 5 10 15 Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Cys 20 25 30 Gly Ala Ala Cys Gly Thr Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Thr 35 40 45 Thr Thr Ala Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Thr Ala Gly Cys Gly Cys 50 55 60 Cys Gly Ala Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Cys 65 70 75 80 Gly Thr Thr 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disease virus <400> 29 Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Ala Gly Gly Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu 1 5 10 15 Gly Pro Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe 20 25 30 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 30 Ala Val Glu Val Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala 1 5 10 15 Pro Ala Lys Gln 20 <210> 31 <211> 547 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide of Multi-VP1e(A/Pocheon, A/Malay97, A/Iraq) <400> 31 gaatccgttt ataatggaac tagcaggtac tctgcacctg caacacgtcg aggtgacctt 60 ggtagtttag ctgcgcgttt agccgcacag ttgccggctg gtcctggtcc tggtctgctg 120 gcagttgagg taacctcaca ggatagacac aaacaaaaaa taattgcacc agccaagggt 180 cctggtccgg gcggtacgtc taaatattcc acacctgggg caagacgtgg tgatttaggt 240 tcactcgcag cgagagatgc cgcacagctg cctgctagtt taacggtcct ggtcctggtg 300 tggaagtgct gtcgcaagat agacataaac agcgtatcat tgctcctgct aaacaaggtc 360 caggtccagg tggaaccagc aagtattccg caggcggaac gggtagacgg ggagacttag 420 gaccgttagc agcaagagtc gccgctcaac ttccagcatc 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Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly 370 375 380 Thr Ala Thr Thr Cys Cys Gly Cys Ala Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala 385 390 395 400 Cys Gly Gly Gly Thr Ala Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala 405 410 415 Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ala Cys Cys Gly Thr Thr Ala Gly Cys Ala 420 425 430 Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Thr Cys Gly Cys Cys Gly Cys Thr Cys 435 440 445 Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Thr Thr Ile 450 455 460 Thr Gly Gly Ala Cys Cys Gly Gly Gly Thr Cys Cys Cys Gly Gly Thr 465 470 475 480 Gly Cys Cys Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Thr Ala Thr Cys Ala Ala 485 490 495 Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Thr Ala Gly Ala Cys Ala Thr Ala Ala 500 505 510 Ala Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr Cys Gly Cys Ala 515 520 525 Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Ala Cys 530 535 540 Thr Cys Gly Ala Gly 545 <210> 33 <211> 31 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 33 Tyr Asn Gly Lys Thr Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Ser Arg Arg Gly Asp 1 5 10 15 Met Ala Ala Leu Ala Gln Arg Leu Ser Ala Arg Leu Pro Thr Ser 20 25 30 <210> 34 <211> 21 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 34 Leu Ala Leu Asp Thr Thr Gln Asp Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala 1 5 10 15 Pro Gln Lys Gln Val 20 <210> 35 <211> 31 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 35 Lys Thr Thr Tyr Gly Glu Glu Ser Ser Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Ala Arg Arg Val Asn Asn Arg Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr 20 25 30 <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 36 Asp Thr Thr Gln Asp Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu Lys 1 5 10 15 Gln <210> 37 <211> 31 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 37 Lys Thr Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Thr Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Ala Gln Arg Val Ser Arg Gln Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr 20 25 30 <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 38 Asp Thr Val Gln Asp Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu Lys 1 5 10 15 Gln <210> 39 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide of Multi-VP1e(Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04) <400> 39 gaaagctata acggcaaaac cgcgtatggc gaaaccacca gccgtcgtgg cgatatggcg 60 gcgctggcgc agcgtctgag cgcgcgtctg ccgaccagcg gcccgggccc gnnnctggcg 120 ctgcatacca cccaggatcg tcgtaaacag gaaattattg cgccgcagaa acaggtgggc 180 ccgggcccgg gcaaaaccac ctatggcgaa gaaagcagcc gtcgtggcga tctggcggcg 240 ctggcgcgtc gtgtgaacaa ccgtctgccg accagcttta actatggccc gggcccgggc 300 gataccaccn nncaggatcg tcgtaaacag gaaattattg cgccggaaaa acagggcccg 360 ggcccgggca aaaccgcgta tggcgaaacc accacccgtc gtggcgatct ggcggcgctg 420 gcgcagcgtg tgagccgtca gctgccgacc agctttaact atggcccggg cccgggcgat 480 accgtgcagg atcgtcgtaa acaggaaatt attgcgccgg aaaaacagta actggaa 537 <210> 40 <211> 537 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic protein Multi-VP1e(Asia/Shamir, Asia/Mongolia05, Asia/LC04) <400> 40 Gly Ala Ala Ala Gly Cys Thr Ala Thr Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Cys Cys Gly Cys Gly Thr Ala Thr Gly Gly Cys Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Thr Cys Gly Thr 35 40 45 Gly Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Cys 50 55 60 Thr Gly Gly Cys Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Cys Thr Gly Ala Gly 65 70 75 80 Cys Gly Cys Gly Cys Gly Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys 85 90 95 Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Asn 100 105 110 Asn Asn Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys Ala Thr Ala Cys 115 120 125 Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Thr Cys Gly Thr Cys Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr Thr Gly 145 150 155 160 Cys Gly Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala Cys Ala Gly Gly Thr 165 170 175 Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys 180 185 190 Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Thr Gly Gly Cys Gly 195 200 205 Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Thr Cys Gly 210 215 220 Thr Gly Gly Cys Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly 225 230 235 240 Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly Thr Gly Ala 245 250 255 Ala Cys Ala Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly Ala Cys 260 265 270 Cys Ala Gly Cys Thr Thr Thr Ala Ala Cys Thr Ala Thr Gly Gly Cys 275 280 285 Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Ala Thr Ala 290 295 300 Cys Cys Ala Cys Cys Asn Asn Asn Cys Ala Gly Gly Ala Thr Cys Gly 305 310 315 320 Thr Cys Gly Thr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr 325 330 335 Ala Thr Thr Gly Cys Gly Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Cys 340 345 350 Ala Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly 355 360 365 Cys Ala Ala Ala Ala Cys Cys Gly Cys Gly Thr Ala Thr Gly Gly Cys 370 375 380 Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys Gly Thr Cys 385 390 395 400 Gly Thr Gly Gly Cys Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys 405 410 415 Gly Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Thr Gly 420 425 430 Ala Gly Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Ala 435 440 445 Cys Cys Ala Gly Cys Thr Thr Thr Ala Ala Cys Thr Ala Thr Gly Gly 450 455 460 Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Ala Thr 465 470 475 480 Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Thr Cys Gly Thr Cys 485 490 495 Gly Thr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr 500 505 510 Thr Gly Cys Gly Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Gly 515 520 525 Thr Ala Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala 530 535 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 41 Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 42 Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Pro 1 5 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 43 Gly Gly Gly Gly Pro 1 5

Claims (21)

  1. 구제역 바이러스(FMDV) VP1 단백질의 혈청형에 따른 복수개의 에피토프를 포함하는 가용성 Multi-Vp1e 항원단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Multi-Vp1e 항원단백질은 3개의 혈청형에 따른 RGD 모티프 및 C-터미너스(terminus) 에피토프가 무작위적으로 배열될 수 있는, 가용성 Multi-VP1e 항원단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 에피토프가 서열번호: 1-6, 서열번호: 9-14, 서열번호: 17-22 및 서열번호: 33-40으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는, 가용성 Multi-VP1e 항원단백질.
  4. 제2항에 있어서, 상기 무작위적으로 배열되는 에피토프가 펩티드 링커를 통해 서로 연결되어 있는, 가용성 Multi-VP1e 항원단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 펩티드 링커가 Gly-Pro-Gly-Pro-Gly 서열인, 가용성 Multi-VP1e 항원단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 가용성 Multi-VP1e 항원단백질이 서열번호: 8, 16, 24 및 40으로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 가용성 Multi-VP1e 항원단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 가용성 Multi-VP1e 항원단백질은 체액성 면역반응 또는 세포성 면역반응을 유도할 수 있는 것인, 가용성 multi-VP1e 항원단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 가용성 Multi-VP1e 항원단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 대장균의 코돈 사용빈도(codon usage)에 맞게 변형된 것인, 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서, 서열번호: 7, 15, 23 및 31 로 구성된 군에서 선택되는 염기서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  12. 제11항의 벡터로 형질전환 된 재조합 미생물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 대장균은 BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL 세포인 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  15. (a) 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    (b) 상기 벡터로 대장균을 형질전환 시키고 배양하는 단계;
    (c) 상기 (b)단계에서 배양된 대장균을 파쇄하여 Multi-VP1e 항원단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 가용성 Multi-VP1e 항원단백질의 대량생산방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 7, 15, 23 및 31 로 구성된 군에서 선택되는 염기서열로 이루어지는 것인, 대량생산방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 대장균은 BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL 세포인 것을 특징으로 하는, 대량생산방법.
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 가용성 Multi-VP1e 항원단백질을 유효성분으로 포함하는 구제역 바이러스 예방 백신 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 보조제를 추가로 포함하는, 백신 조성물.
  20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 가용성 Multi-VP1e 항원단백질을 우제류에 투여하는 단계를 포함하는 구제역 바이러스에 대한 면역력을 증진시키는 방법.
  21. 제20항에 있어서 상기 투여는 목적동물에 하루 2회 근육접종하는 것을 특징으로 하는, 면역력을 증진시키는 방법.
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