CN108715866A

CN108715866A - 一种重组病毒载体、疫苗及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN108715866A
Application number: CN201810551095.4A
Authority: CN
Inventors: 郑爱华; 袁菲; 邹振; 董方方
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2018-10-30
Anticipated expiration: 2038-05-31
Also published as: CN108715866B

Abstract

本发明属于免疫技术领域，公开了一种针对SFTS病毒的重组病毒载体、疫苗及其制备方法与应用。本发明所述重组病毒载体为含有编码发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn/Gc的DNA分子的病毒载体。进一步所述重组病毒载体与病毒转录复合物等转染宿主细胞收集具有感染性的病毒颗粒即活病毒载体疫苗。与现有技术相比，本发明所述疫苗具有易于培养、高效的感染性、易使用、能刺激机体产生强烈的细胞免疫反应和体液免疫反应及较强的粘膜免疫反应、安全性好等优势。

Description

一种重组病毒载体、疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于免疫技术领域，具体涉及一种重组病毒载体、疫苗，尤其是一种针对发热伴血小板减少综合征的重组病毒载体、疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

发热伴血小板减少综合征(SFTS)，是一种新出现的出血热，其首个病例出现在中国农村地区。SFTS的病原体为SFTS病毒(SFTSV)，是一种新型的布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒，通过蜱虫叮咬传播。SFTS病毒颗粒呈球形，直径约80-100nm，外有脂质包膜，表面有长5-10nm的多肽棘突。SFTS病毒基因组由三个小、中、大负链RNA片段组成。中RNA片段有3378个核苷酸，其包含了编码糖蛋白Gn/Gc的1073个氨基酸的单个开放阅读框，这对病毒组装、病毒颗粒的形成及粘附至新的靶细胞上均有至关重要的作用。

SFTS以发热和呼吸道或消化道症状急性起病，随后出现血小板和白细胞数急性下降。SFTS的发病机制目前尚未完全清楚。布尼亚病毒科病毒常见的致病特点是：能抑制宿主的免疫反应，以病毒的快速复制和多器官衰竭为特征。自2010年首次报道以来，在我国绝大多数省份都有病例发现，平均死亡率为7.3％。2011-2012年间，中国共有2047例SFTSV感染(其中有129例死亡)，主要分布在中国东部和中部的206个县。河南、湖北和山东的病例数最多，分别占总数的48％、22％和16％。疾病流行区的农民是主要的风险人群，中国97％的SFTS患者为居住在森林和丘陵地区或在农田工作的农民，许多患者在发病前7-9天曾被蜱虫叮咬。血清监测提示丘陵地区1.0％-3.8％的检测人群有SFTSV抗体，这表明SFTSV已经在中国广泛的传播，并且仅很小一部分感染人群发病。SFTS的发病率从湖北的千分之0.03至山东的千分之0.05不等。2012年日本和韩国也曾有此病报道。

由于目前尚无SFTS的特异性治疗，所以应尽早对SFTS患者开展对症治疗和支持治疗。卧床休息，流质或半流质饮食，补充充足的水分。如果患者不能进食或处于危重状态，必需补充能量和水分以确保患者水电解质平衡，尤其对于低钠血症患者。

目前已经批准利巴韦林用于几种病毒感染的治疗，包括布尼亚病毒属裂谷热病毒和克里米亚刚果热病毒。虽然，利巴韦林在体外试验中可抑制病毒活动，但是在重症或非重症患者住院期间其对血小板数量或病毒载量无明显影响，所以利巴韦林在治疗SFTS病毒感染上作用甚微。

目前疫苗在多种病毒所致疾病的治疗中有着重要作用，例如汉坦病毒、巨细胞病毒和狂犬病病毒。其作用机制包括中和作用、激活补体、抗体依赖的细胞毒性和调理作用。给予患者中和抗体可降低病毒载量，预防病毒传播，同时可能降低预后不良的风险。

疫苗曾经的定义为：针对疾病产生免疫力的疫苗是灭活或减毒的病原体，即疫苗是由病原体制成。随着新型疫苗的发展，如亚单位疫苗、活载体疫苗和核酸疫苗等疫苗的出现，疫苗已不是完整的病原体，灭活和减毒的概念亦模糊不清。现代疫苗的定义是：疫苗是针对疾病的致病原或其相关的蛋白(多肽、肽)、多糖或核酸，以一种或多种成分直接或通过载体经免疫接种进入机体后，能诱导产生特异的体液和(或)细胞免疫，从而使机体获得预防该病的免疫力。

申请号为201510181127.2的中国专利公开了密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白基因及其核酸疫苗。申请号为CN201610324251.4的中国专利公开了携带tPA信号肽及密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗。但是由核酸疫苗引发的体液和细胞免疫达不到理想的状态和人们对其安全性的担忧使核酸疫苗的发展面临巨大问题。

活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌(常为疫苗弱毒株)构建成一个载体(或称外源基因携带者)，把外源基因(包括重组多肽、肽链抗原位点等)插入其中使之表达的活疫苗。该类疫苗免疫动物向宿主免疫系统提交免疫原性蛋白的方式与自然感染时的真实情况很接近，可诱导产生的免疫比较广泛，包括体液免疫和细胞免疫，甚至黏膜免疫，所以可以避免重组亚单位疫苗的很多缺点。如果载体中同时插入多个外源基因，就可以达到一针防多病的目的。简言之，病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点。它具有活疫苗的免疫效力高、成本低及灭活疫苗安全性好等优点。在各种疫苗形式中，活病毒载体疫苗由于能引起相对最强的免疫反应和最佳的保护效果，现已成为新型疫苗研发的重点。然而，目前尚无针对SFTS病毒的疫苗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种针对SFTS病毒的重组病毒载体、疫苗及其制备方法与应用。

一种重组病毒载体，含有编码发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn/Gc的DNA分子的病毒载体。

其中，所述发热伴血小板减少综合征病毒包括但不限于发热伴血小板减少综合征病毒AH12毒株、发热伴血小板减少综合征病毒YG1毒株。

在一些实施方案中，所述DNA分子为人源化优化的编码发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn/Gc的核苷酸序列。

在进一步的一些实施方案中，所述DNA分子如SEQ ID NO：1所示。

病毒载体的选择是疫苗成功的关键。本发明所述重组病毒载体，所述病毒载体包括但不限于水疱性口炎病毒、痘病毒或腺病毒。

其中，作为优选，所述病毒载体为水疱性口炎病毒。水疱性口炎病毒(VesicularStomatitis Virus,VSV)是弹状病毒科的代表模式毒种，被广泛用作研究有囊膜RNA病毒入侵细胞、复制和装配等机制。VSV为单股负链不分节段RNA病毒，基因组长约11Kb，结构简单，从3'到5'依次转录出5条mRNA，分别编码5种蛋白：核衣壳蛋白N(nucleocapsid protein)、磷蛋白P(phosphoprotein)、基质蛋白M(matrix protein)、糖蛋白G(glycoprotein)、大聚合酶L(large protein)。G蛋白是I型整合膜蛋白，在病毒粒子表面以三聚体形式存在，行使与靶细胞受体结合及膜融合的功能。在感染了VSV的动物体内，所产生的抗体绝大部分是针对G蛋白。VSV病毒引起的水疱性口炎是接触性传染的良性疾病，主要感染啮齿类动物如牛、猪和马，也能感染人类和其它动物。人只偶然感染，但常不显症状或仅轻微发热。VSV病毒具有人群中血清阳性率低；能诱导粘膜免疫；基因组简单，易于规模化生产等突出的优点，被认为是最具有开发潜力的病毒疫苗载体之一。

对VSV病毒进行分子遗传学研究需要建立一个体系，把DNA恢复成有感染性的病毒。通过转染编码病毒转录复合物(N，P，M，L，G)和T7聚合酶的质粒，同时转染的还有编码全长病毒反义基因组的T7启动子质粒。收获的细胞上清被证明含有感染性的病毒颗粒。成功的从DNA恢复出VSV病毒，使得对VSV进行遗传操作变为可能。带有合适胞质尾的外源病毒功能囊膜蛋白可以有效包装到病毒的囊膜，形成各种包装异源囊膜蛋白的嵌合重组VSV。重组VSV各转录单元之间的非编码区可耐受长达4.5kb外源基因的插入并获得高效表达。另外，由于VSV囊膜蛋白同时具有受体识别和膜融合功能，其识别受体广泛存在于各种组织细胞膜表面，使得VSV具极为广泛的组织嗜性。这些特性赋予了VSV作为新型表达载体和活病毒疫苗载体的应用潜力。

本发明还提供了上述重组病毒载体的制备方法，将敲除表达糖蛋白序列的水疱性口炎病毒质粒与表达病毒转录复合物和T7聚合酶的质粒混合，共转染人肾上皮细胞系，48小时后，收取细胞上清获得感染性病毒颗粒即为重组病毒载体；其中，重组病毒载体的报告基因GFP是插在表达N蛋白序列的上游。

本发明还提供了上述重组病毒载体在制备预防和/或治疗发热伴血小板减少综合征的药物中的应用。

本发明所述重组病毒载体可通过与编码病毒转录复合物(N，P，M，L，G)和T7聚合酶的质粒共同转染宿主细胞获得含有感染性的病毒颗粒，从而制得活病毒疫苗。因此，本发明还提供了用上述重组病毒载体制备的疫苗。

所述疫苗的制备方法为将上述重组病毒载体以及表达病毒转录复合物和T7聚合酶的质粒共同转染宿主细胞，收集细胞培养上清液中的病毒颗粒。

在一些实施方案中，所述重组病毒载体中的病毒载体为VSV，所述病毒转录复合物为病毒的N、P、M、L、G蛋白；所述宿主细胞为293T细胞或BHK细胞。

由上述技术方案可知，本发明提供一种针对SFTS病毒的重组病毒载体、疫苗及其制备方法与应用。本发明所述重组病毒载体为含有编码发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn/Gc的DNA分子的病毒载体。进一步所述重组病毒载体与病毒转录复合物等转染宿主细胞收集具有感染性的病毒颗粒即活病毒载体疫苗。与现有技术相比，本发明所述疫苗具有如下至少一种优势：

(1)易于培养：在大多数哺乳动物细胞上都可获得很高滴度，容易大量制备；

(2)高效性：在感染的小鼠模型中，10个感染性病毒颗粒诱导的免疫应答和10⁵个感染性颗粒引起的免疫应答一样显著；

(3)易使用：可通过多种接种途径进行免疫，往往一次接种即可引起强烈的免疫应答反应；

(4)能刺激机体产生强烈的细胞免疫反应和体液免疫反应，还能引起较强的粘膜免疫反应，特别适合于通过粘膜感染的呼吸道病原体的疫苗；

(5)安全性好：作为优选的病毒载体，VSV病毒完全在细胞质中复制，仅从RNA→RNA，不会整合到宿主细胞的DNA中，最终会被宿主免疫系统清除。而且通过反向遗传操作进行基因组突变、修饰，可对VSV病毒进行适当的致弱，使之成为更安全的重组疫苗载体。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示rVSV重组病毒的特性描述，其中，图A为检测SFTSV Gn/Gc嵌入rVSV载体的蛋白印迹结果图；

图2示rVSV-SFTSV/AH12-GP免疫小鼠后血清中和抗体的量化测定结果图；

图3示单剂量rVSV-SFTSV/AH12-GP或rVSV-GFP-HRTV-GP可完全保护C57IFNAR^-/-小鼠免受致死剂量SFTSV Wuhan毒株的伤害，其中(A)6-8周C57IFNAR^-/-小鼠(n＝5)利用2×10¹～2×10⁴FFU SFTSV Wuhan毒株进行免疫接种，然后通过体重下降20％和双后腿麻痹来判断死亡率；(B)6-8周C57IFNAR^-/-小鼠(n＝5)利用2×10⁴PFU rVSV-eGFP-HTNV-GP、rVSV-SFTSV/AH12-GP或rVSV-eGFP-HRTV-GP进行免疫接种，然后在免疫接种30天后，接种2×10⁴FFU SFTSV Wuhan毒株；(C)6-8周C57IFNAR^-/-小鼠(n＝5)利用2×10¹～2×10⁴PFU rVSV-SFTSV/AH12-GP进行免疫接种，然后在免疫接种30天后，接种2×10⁴FFU SFTSV Wuhan毒株；以上数据为三项独立实验的代表数据。

具体实施方式

本发明公开了一种重组病毒载体、疫苗及其制备方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1、候选疫苗的制备

1、中国进化枝的SFTSV AH12毒株重组rVSV病毒载体质粒rVSV-SFTSV/AH12-GP的制备

为了研制SFTSV疫苗，我们将编码中国进化枝的SFTSV AH12毒株(基因库登录号ADZ04482.1)的糖蛋白Gn/Gc的序列进行人源化优化并插入rVSVΔG载体，命名为rVSV-SFTSV/AH12-GP。具体操作为：将糖蛋白Gn/Gc的蛋白序列，按照人的密码子编码进行优化，以提高蛋白在人体的表达量。

其中，插入rVSVΔG载体的SFTSV AH12毒株人源化Gn/Gc蛋白的DNA序列：如SEQ IDNO:1所示：

atgatgaaagtgatctggttcagcagcctgatctgcctcgtgatccagtgcagcggcgacagcggccctatcatctgtgccggacccatccacagcaacaagagcgccgacatcccccatctgctgggctacagcgagaagatttgccagatcgaccggctgatccacgtgtcctcttggctgcggaaccacagccagttccagggctacgtgggacagagaggcggcagatcccaggtgtcctactacccagctgaaaacagctacagccggtggagcggcctgctgagcccttgtgatgctgactggctgggcatgctggtcgtgaagaaggccaagggcagcgacatgatcgtgcctggccctagctacaagggcaaggtgttcttcgagcggcccaccttcgacggctatgtgggctggggatgtggcagcggcaagagcagaacagagtccggcgagctgtgcagcagcgattctggcacaagctctggcctgctgcccagcgacagagtgctgtggattggcgacgtggcctgccagcccatgacccctatccccgaggaaacctttctggaactgaagtccttcagccagagcgagttccccgacatctgcaagatcgacggcatcgtgttcaaccagtgcgagggcgagagcctgccccagccttttgatgtggcctggatggacgtgggccactcccacaagatcatcatgcgcgagcacaagaccaaatgggtgcaggaaagcagcagcaaggacttcgtgtgctacaaagagggcaccggcccctgcagcgagagcgaggaaaagacctgcaagaccagcggctcctgcagaggcgacatgcagttctgcaaggtggccggatgcgagcacggcgaagaggccagcgaggccaagtgcagatgtagcctggtgcacaagcccggcgaggtggtggtgtcttacggcggaatgagagtgcggcccaagtgctacggcttcagccggatgatggccaccctggaagtgaaccagcccgagcagagaatcggccagtgtaccggctgccacctggaatgcatcaatggcggcgtgcggctgatcaccctgaccagcgaactgaaaagcgccaccgtgtgcgccagccacttctgtagcagcgccacctccggcaagaagtccaccgagatccagttccacagcggcagcctcgtgggcaagacagccatccatgtgaagggggccctggtggacggcaccgaattcacctttgagggctcttgcatgttccccgatggctgcgacgccgtggactgtaccttctgcagagagttcctgaagaacccccagtgctaccccgccaagaaatggctgttcatcatcatcgtgatcctgctgggatacgccggcctgatgctgctgaccaacgtgctgaaggccatcggcgtgtggggctcttgggtcatcgcccctgtgaagctggtgttcgccatcatcaagaaactgatgcggaccgtgtcctgcctgatgggcaagctgatggaccggggcagacaagtgatccacgaggaaatcggcgagaacagagagggcaaccaggacgacgtgcggatcgagatggccagacctagacgcgtgcggcactggatgtacagcccagtgatcctgaccatcctggccatcggactggccgagggctgtgacgaaatggtgcacgccgacagcaaactggtgtcctgcagacagggctccggcaacatgaaggaatgcgtgaccaccggcagagccctgctgcctgctgtgaaccctggacaggaagcctgcctgcactttaccgcccctggcagccctgacagcaagtgcctgaagatcaaagtgaagcggatcaacctgaagtgcaagaaaagcagctcctacttcgtgcccgacgcccggtccagatgtaccagcgtgcggagatgtagatgggcaggcgattgccagagcggctgccctcctcacttcaccagcaacagcttcagcgacgactgggccggcaagatggacagagccggactgggctttagcggctgctctgatggatgtggcggagccgcctgcggctgctttaatgccgcccctagctgcatcttctggcggaaatgggtggaaaacccccacggcatcatctggaaggtgtccccatgtgccgcctgggtgccatctgccgtgatcgagctgacaatgcccagcggcgaagtgcggaccttccaccctatgagcggcatccccacccaggtgttcaagggcgtgtccgtgacatacctgggctccgacatggaagtgtccggcctgaccgacctgtgcgagattgaggaactgaaatccaagaagctggccctggccccctgtaaccaggccggaatgggagtcgtgggaaaagtgggcgagattcagtgcagctccgaggaaagcgcccggaccatcaagaaggacggctgcatctggaacgccgacctcgtgggaattgagctgagagtggatgacgccgtgtgttacagcaagatcaccagcgtggaagccgtggccaactacagcgccatccctaccacaatcggcggcctgagattcgagcggagccacgatagccagggcaagatcagcggaagccccctggacatcaccgccatcaggggcagctttagcgtgaactaccggggcctgagactgagcctgagcgagatcacagccacctgtaccggggaagtgaccaatgtgtccggctgctactcctgcatgaccggcgccaaggtgtccatcaagctgcactccagcaagaacagcaccgcccacgtgcggtgcaagggcgacgagacagccttctctgtgctggaaggcgtgcacagctacaccgtgtccctgagcttcgaccacgccgtggtggatgagcagtgccaactgaactgtggcggccacgagtcccaagtgaccctgaagggaaacctgatcttcctggacgtgcccaagttcgtggacggctcctacatgcagacctaccacagcaccgtgcccacaggcgccaacatccctagccctaccgactggctgaacgccctgttcggcaacggcctgagcagatggatcctgggcgtgatcggagtgctgctgggaggactggccctgttcttcctgatcatgagcctgttcaagctgggcaccaaacaggtgttccggtcccggacaaagctggccgga

SEQ ID NO:1所示DNA编码的SFTSV AH12毒株Gn/Gc蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示：

MMKVIWFSSLICLVIQCSGDSGPIICAGPIHSNKSADIPHLLGYSEKICQIDRLIHVSSWLRNHSQFQGYVGQRGGRSQVSYYPAENSYSRWSGLLSPCDADWLGMLVVKKAKGSDMIVPGPSYKGKVFFERPTFDGYVGWGCGSGKSRTESGELCSSDSGTSSGLLPSDRVLWIGDVACQPMTPIPEETFLELKSFSQSEFPDICKIDGIVFNQCEGESLPQPFDVAWMDVGHSHKIIMREHKTKWVQESSSKDFVCYKEGTGPCSESEEKTCKTSGSCRGDMQFCKVAGCEHGEEASEAKCRCSLVHKPGEVVVSYGGMRVRPKCYGFSRMMATLEVNQPEQRIGQCTGCHLECINGGVRLITLTSELKSATVCASHFCSSATSGKKSTEIQFHSGSLVGKTAIHVKGALVDGTEFTFEGSCMFPDGCDAVDCTFCREFLKNPQCYPAKKWLFIIIVILLGYAGLMLLTNVLKAIGVWGSWVIAPVKLVFAIIKKLMRTVSCLMGKLMDRGRQVIHEEIGENREGNQDDVRIEMARPRRVRHWMYSPVILTILAIGLAEGCDEMVHADSKLVSCRQGSGNMKECVTTGRALLPAVNPGQEACLHFTAPGSPDSKCLKIKVKRINLKCKKSSSYFVPDARSRCTSVRRCRWAGDCQSGCPPHFTSNSFSDDWAGKMDRAGLGFSGCSDGCGGAACGCFNAAPSCIFWRKWVENPHGIIWKVSPCAAWVPSAVIELTMPSGEVRTFHPMSGIPTQVFKGVSVTYLGSDMEVSGLTDLCEIEELKSKKLALAPCNQAGMGVVGKVGEIQCSSEESARTIKKDGCIWNADLVGIELRVDDAVCYSKITSVEAVANYSAIPTTIGGLRFERSHDSQGKISGSPLDITAIRGSFSVNYRGLRLSLSEITATCTGEVTNVSGCYSCMTGAKVSIKLHSSKNSTAHVRCKGDETAFSVLEGVHSYTVSLSFDHAVVDEQCQLNCGGHESQVTLKGNLIFLDVPKFVDGSYMQTYHSTVPTGANIPSPTDWLNALFGNGLSRWILGVIGVLLGGLALFFLIMSLFKLGTKQVFRSRTKLAG

2、日本进化枝的SFTSV YG1毒株重组rVSV病毒载体质粒rVSV-SFTSV/YG1-GP的制备

代表日本进化枝的SFTSV YG1毒株的人源化Gn/Gc(基因库登录号BAN58185.1)，与中国进化枝的SFTSV AH12毒株氨基酸序列有98.5％的相似度。按照前述重组rVSV病毒载体质粒构建方法，将编码日本进化枝的SFTSV YG1毒株的的Gn/Gc的序列进行人源化优化并插入rVSVΔG载体，命名为rVSV-SFTSV/AH12-GP。

3、rVSV-eGFP-SFTSV/AH12-GP和rVSV-eGFP-SFTSV/YG1-GP的制备

分别在rVSV-SFTSV/AH12-GP和rVSV-SFTSV/AH12-GP插入表达GFP的报告基因获得rVSV-eGFP-SFTSV/AH12-GP和rVSV-eGFP-SFTSV/YG1-GP重组rVSV病毒载体质粒。具体操作为：GFP报告基因插在表达转录蛋白N的上游。

4、HRTV Missouri毒株重组rVSV病毒载体质粒rVSV-GFP-HRTV-GP的制备

根据氨基酸序列比对，HRTV Missouri毒株的人源化Gn/Gc(基因库登录号AFP33393.1)，与AH12的人源化Gn/Gc氨基酸序列有62.0％的相似度。按照前述重组rVSV病毒载体质粒构建方法，将编码HRTV Missouri毒株的Gn/Gc的序列进行人源化优化并插入rVSVΔG载体，同上插入表达GFP的报告基因获得rVSV-eGFP-HRTV-GP重组rVSV病毒载体质粒。

5、病毒颗粒的制备

用上述三个表达GFP的报告基因的重组rVSV病毒来评价rVSV-SFTSV/AH12-GP的中和活性。

分别将重组rVSV病毒载体质粒及表达VSV的N、P、M、L、G蛋白和T7聚合酶的辅助质粒共同转染293T细胞，恢复病毒颗粒。具体操作为：

适用：6cm培养皿，对数期生长的细胞约80％-90％左右(实验中涉及的数值可根据自身实验需要进行比例放大或缩小)

(1)计算：Mix DNA总量约12μg(根据质粒浓度和适宜体积进行稀释)

S.No.	质粒	浓度(ng/μl)	含量(ng)	所需体积(μl)
					1	重组rVSV病毒载体质粒		1599
2	T₇	854	8100	9.4
					3	N	932.8	1286	1.4
4	P	200	639	3.2
					5	M	100	159.9	1.6
6	G	100	159.9	1.6
					7	L	100	159.9	1.6

(2)Mix DNA+25μl 2.5M CaCl₂+灭菌水，使总体积为250μl，依次加入流式管后，涡旋振荡1min；

(3)取250μl 2×HBS(PH＝7.05)逐滴加入上述混液后，涡旋振荡7次；

(4)将(3)中混合液缓慢逐滴加入到约80-90％293T细胞的6cm培养皿中，上下左右混匀后，放置于37℃5％CO₂培养箱；

(5)12小时后更换预热新鲜培养液；

(6)至转染48小时后，收集细胞培养基上清4000rpm 5min，取上清感染对数生长的Vero细胞(连收3次上清感染)；

(7)隔天观察6cm培养皿中293T细胞是否出现成片的荧光，若出现，再观察Vero细胞的感染情况。

实施例2、重组rVSV病毒的检测

收集转染后293T细胞上清液中的病毒颗粒，用超速离心机浓缩纯化恢复的rVSV-SFTSV/AH12-GP、rVSV-eGFP-SFTSV/AH12-GP和rVSV-eGFP-SFTSV/YG1-GP病毒，浓缩成颗粒状，使用能够识别被嵌入的糖蛋白Gn和Gc的SFTSV的Gn和Gc多克隆抗体识别。结果如图1A所示，对照组设为未转染的293T细胞上清液。

结果显示，通过SFTSV Gn和Gc的多克隆抗体，rVSV-SFTSV/AH12-GP、rVSV-eGFP-SFTSV/AH12-GP和rVSV-eGFP-SFTSV/YG1-GP中均可检测到Gn和Gc。

收集转染后的293T细胞上清液中的病毒颗粒，感染Vero细胞。在Vero细胞被rVSV病毒感染，感染复数为0.01时，通过噬菌斑测定方法检测感染后24小时、48小时、72小时和96小时Vero细胞上清液中的病毒滴度。结果显示，感染24小时后rVSV-GFP-G的滴定度达到高峰，然后所有细胞死亡。但是，rVSV-SFTSV/AH12-GP、rVSV-eGFP-SFTSV/AH12-GP、rVSV-eGFP-SFTSV/YG1-GP和rVSV-eGFP-HRTV-GP的滴定度缓慢增加，感染约96小时后达到最高值，细胞病变轻微。(图1B)

为了评估SFTSV Gn/Gc蛋白是否正确折叠和中和抗原表位是否曝光，在健康受试者或Vero细胞感染前患者的血清中进行rVSV-eGFPs预接种，所有的rVSV-eGFPs均通过健康血清100％进行中和测定。收集康复SFTS患者血清检测rVSVs的中和反应，结果见表1。

表1 rVSV-eGFPs对SFTS康复患者血清的中和反应结果

Virus	FRNT50titer
		rVSV-eGFP-EboV-GP	0
rVSV-eGFP-SFTSV/AH12-GP	800
		rVSV-eGFP-SFTSV/YG1-GP	800
rVSV-GFP-HRTV-GP	225

结果显示，血清可中和大部分rVSV-eGFP-SFTSV/AH12-GP和rVSV-eGFP-SFTSV/YG1-GP以及部分rVSV-eGFP-HRTV-GP，但是对rVSV-eGFP-G不产生中和作用。SFTSV YG1的半数抑制量约为800，AH12的半数抑制量高于800，而中原病毒的半数抑制量约225，但是对rVSV-eGFP-EboV-GP无中和作用。这些结果表明，SFTSV和HRTV Gn/Gc糖蛋白嵌入VSV病毒的表面，并且可通过SFTSV中和抗体检测出。以上数据为三项独立实验的代表数据。

实施例3、免疫接种rVSV-SFTSV/AH12-GP可诱导出较强的特定中和反应

为了评估rVSV-SFTSV/AH12-GP在具有免疫活性的C57/BL6小鼠模型中的免疫原性。腹腔注射单剂量2×10⁴PFU rVSV-SFTSV/AH12-GP作为实验组或WT rVSV-G作为对照组进行等剂量接种后，与模拟感染动物相比，小鼠体重并未减轻。免疫接种30天后，利用rVSV-eGFPs(rVSV-eGFP-SFTSV/AH12-GP、rVSV-eGFP-SFTSV/YG1-GP、rVSV-eGFP-HRTV-GP和对照组rVSV-eGFP-EboV-GP)作为对照与小鼠免疫后血清通过中和试验对中和抗体进行量化测定。结果见图2。

图2结果显示，在C57/BL6小鼠中rVSV-SFTSV/AH12-GP诱发较强的特异性体液免疫反应。接种rVSV-SFTSV/AH12-GP疫苗后可诱导出抗SFTSV和HRTV糖蛋白较强的广谱中和抗体，rVSV-eGFPs通过FRNT分析检测出YG1的滴定度约为227，AH12的滴定度约为228，HRTV的滴定度约为200，但是未检测出阴性对照埃博拉病毒的滴定度。以上数据为三项独立实验的代表数据。

实施例4、免疫接种rVSV-SFTSV/AH12-GP和rVSV-eGFP-HRTV-GP疫苗可产生完全的交叉保护抵抗致命性SFTSV的感染。

在进行保护试验之前，我们先对IFNAR^-/-小鼠腹腔注射2×10¹～2×10⁴FFU不同剂量的Wuhan毒株测试IFNAR^-/-小鼠对SFTSV的敏感性。所有动物均表现出临床症状，感染3-6天后死亡，表明半数致死量低于20FFU(图3A、3B)。然后，针对上述通过免疫接种具有免疫原性的实验动物进行了2×10⁴FFU(高于10³半数致死量)SFTSV Wuhan毒株等剂量攻毒试验。如图3A和3B所示，所有接种rVSV-SFTSV/AH12-GP或rVSV-eGFP-HRTV-GP的动物均存活，免疫基因缺陷的小鼠在免疫rVSV-eGFP-HRTV-GP的第三天开始出现体重少许下降，免疫一周后体重恢复正常。然而，腹腔接种DMEM或rVSV-eGFP-HTNV-GP的对照组动物均在感染3-4后天死亡。

考虑到安全性是活病毒疫苗的一个重大问题，所以我们检测了达到完全保护时rVSV-SFTSV/AH12-GP的最低免疫剂量。IFNAR^-/-小鼠等剂量免疫接种经过10倍梯度稀释的2×10⁴～2×10¹FFU rVSV-SFTSV/AH12-GP疫苗后，2×10⁴FFU(高于10³半数致死量)SFTSVWuhan毒株。结果显示即使给药剂量低至20FFU，所有接种小鼠可完全受保护避免致死(3C,3D)。

序列表

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 一种重组病毒载体、疫苗及其制备方法与应用

<130> MP1800355

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3222

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

atgatgaaag tgatctggtt cagcagcctg atctgcctcg tgatccagtg cagcggcgac 60

agcggcccta tcatctgtgc cggacccatc cacagcaaca agagcgccga catcccccat 120

ctgctgggct acagcgagaa gatttgccag atcgaccggc tgatccacgt gtcctcttgg 180

ctgcggaacc acagccagtt ccagggctac gtgggacaga gaggcggcag atcccaggtg 240

tcctactacc cagctgaaaa cagctacagc cggtggagcg gcctgctgag cccttgtgat 300

gctgactggc tgggcatgct ggtcgtgaag aaggccaagg gcagcgacat gatcgtgcct 360

ggccctagct acaagggcaa ggtgttcttc gagcggccca ccttcgacgg ctatgtgggc 420

tggggatgtg gcagcggcaa gagcagaaca gagtccggcg agctgtgcag cagcgattct 480

ggcacaagct ctggcctgct gcccagcgac agagtgctgt ggattggcga cgtggcctgc 540

cagcccatga cccctatccc cgaggaaacc tttctggaac tgaagtcctt cagccagagc 600

gagttccccg acatctgcaa gatcgacggc atcgtgttca accagtgcga gggcgagagc 660

ctgccccagc cttttgatgt ggcctggatg gacgtgggcc actcccacaa gatcatcatg 720

cgcgagcaca agaccaaatg ggtgcaggaa agcagcagca aggacttcgt gtgctacaaa 780

gagggcaccg gcccctgcag cgagagcgag gaaaagacct gcaagaccag cggctcctgc 840

agaggcgaca tgcagttctg caaggtggcc ggatgcgagc acggcgaaga ggccagcgag 900

gccaagtgca gatgtagcct ggtgcacaag cccggcgagg tggtggtgtc ttacggcgga 960

atgagagtgc ggcccaagtg ctacggcttc agccggatga tggccaccct ggaagtgaac 1020

cagcccgagc agagaatcgg ccagtgtacc ggctgccacc tggaatgcat caatggcggc 1080

gtgcggctga tcaccctgac cagcgaactg aaaagcgcca ccgtgtgcgc cagccacttc 1140

tgtagcagcg ccacctccgg caagaagtcc accgagatcc agttccacag cggcagcctc 1200

gtgggcaaga cagccatcca tgtgaagggg gccctggtgg acggcaccga attcaccttt 1260

gagggctctt gcatgttccc cgatggctgc gacgccgtgg actgtacctt ctgcagagag 1320

ttcctgaaga acccccagtg ctaccccgcc aagaaatggc tgttcatcat catcgtgatc 1380

ctgctgggat acgccggcct gatgctgctg accaacgtgc tgaaggccat cggcgtgtgg 1440

ggctcttggg tcatcgcccc tgtgaagctg gtgttcgcca tcatcaagaa actgatgcgg 1500

accgtgtcct gcctgatggg caagctgatg gaccggggca gacaagtgat ccacgaggaa 1560

atcggcgaga acagagaggg caaccaggac gacgtgcgga tcgagatggc cagacctaga 1620

cgcgtgcggc actggatgta cagcccagtg atcctgacca tcctggccat cggactggcc 1680

gagggctgtg acgaaatggt gcacgccgac agcaaactgg tgtcctgcag acagggctcc 1740

ggcaacatga aggaatgcgt gaccaccggc agagccctgc tgcctgctgt gaaccctgga 1800

caggaagcct gcctgcactt taccgcccct ggcagccctg acagcaagtg cctgaagatc 1860

aaagtgaagc ggatcaacct gaagtgcaag aaaagcagct cctacttcgt gcccgacgcc 1920

cggtccagat gtaccagcgt gcggagatgt agatgggcag gcgattgcca gagcggctgc 1980

cctcctcact tcaccagcaa cagcttcagc gacgactggg ccggcaagat ggacagagcc 2040

ggactgggct ttagcggctg ctctgatgga tgtggcggag ccgcctgcgg ctgctttaat 2100

gccgccccta gctgcatctt ctggcggaaa tgggtggaaa acccccacgg catcatctgg 2160

aaggtgtccc catgtgccgc ctgggtgcca tctgccgtga tcgagctgac aatgcccagc 2220

ggcgaagtgc ggaccttcca ccctatgagc ggcatcccca cccaggtgtt caagggcgtg 2280

tccgtgacat acctgggctc cgacatggaa gtgtccggcc tgaccgacct gtgcgagatt 2340

gaggaactga aatccaagaa gctggccctg gccccctgta accaggccgg aatgggagtc 2400

gtgggaaaag tgggcgagat tcagtgcagc tccgaggaaa gcgcccggac catcaagaag 2460

gacggctgca tctggaacgc cgacctcgtg ggaattgagc tgagagtgga tgacgccgtg 2520

tgttacagca agatcaccag cgtggaagcc gtggccaact acagcgccat ccctaccaca 2580

atcggcggcc tgagattcga gcggagccac gatagccagg gcaagatcag cggaagcccc 2640

ctggacatca ccgccatcag gggcagcttt agcgtgaact accggggcct gagactgagc 2700

ctgagcgaga tcacagccac ctgtaccggg gaagtgacca atgtgtccgg ctgctactcc 2760

tgcatgaccg gcgccaaggt gtccatcaag ctgcactcca gcaagaacag caccgcccac 2820

gtgcggtgca agggcgacga gacagccttc tctgtgctgg aaggcgtgca cagctacacc 2880

gtgtccctga gcttcgacca cgccgtggtg gatgagcagt gccaactgaa ctgtggcggc 2940

cacgagtccc aagtgaccct gaagggaaac ctgatcttcc tggacgtgcc caagttcgtg 3000

gacggctcct acatgcagac ctaccacagc accgtgccca caggcgccaa catccctagc 3060

cctaccgact ggctgaacgc cctgttcggc aacggcctga gcagatggat cctgggcgtg 3120

atcggagtgc tgctgggagg actggccctg ttcttcctga tcatgagcct gttcaagctg 3180

ggcaccaaac aggtgttccg gtcccggaca aagctggccg ga 3222

<210> 2

<211> 1074

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Met Met Lys Val Ile Trp Phe Ser Ser Leu Ile Cys Leu Val Ile Gln

1 5 10 15

Cys Ser Gly Asp Ser Gly Pro Ile Ile Cys Ala Gly Pro Ile His Ser

20 25 30

Asn Lys Ser Ala Asp Ile Pro His Leu Leu Gly Tyr Ser Glu Lys Ile

35 40 45

Cys Gln Ile Asp Arg Leu Ile His Val Ser Ser Trp Leu Arg Asn His

50 55 60

Ser Gln Phe Gln Gly Tyr Val Gly Gln Arg Gly Gly Arg Ser Gln Val

65 70 75 80

Ser Tyr Tyr Pro Ala Glu Asn Ser Tyr Ser Arg Trp Ser Gly Leu Leu

85 90 95

Ser Pro Cys Asp Ala Asp Trp Leu Gly Met Leu Val Val Lys Lys Ala

100 105 110

Lys Gly Ser Asp Met Ile Val Pro Gly Pro Ser Tyr Lys Gly Lys Val

115 120 125

Phe Phe Glu Arg Pro Thr Phe Asp Gly Tyr Val Gly Trp Gly Cys Gly

130 135 140

Ser Gly Lys Ser Arg Thr Glu Ser Gly Glu Leu Cys Ser Ser Asp Ser

145 150 155 160

Gly Thr Ser Ser Gly Leu Leu Pro Ser Asp Arg Val Leu Trp Ile Gly

165 170 175

Asp Val Ala Cys Gln Pro Met Thr Pro Ile Pro Glu Glu Thr Phe Leu

180 185 190

Glu Leu Lys Ser Phe Ser Gln Ser Glu Phe Pro Asp Ile Cys Lys Ile

195 200 205

Asp Gly Ile Val Phe Asn Gln Cys Glu Gly Glu Ser Leu Pro Gln Pro

210 215 220

Phe Asp Val Ala Trp Met Asp Val Gly His Ser His Lys Ile Ile Met

225 230 235 240

Arg Glu His Lys Thr Lys Trp Val Gln Glu Ser Ser Ser Lys Asp Phe

245 250 255

Val Cys Tyr Lys Glu Gly Thr Gly Pro Cys Ser Glu Ser Glu Glu Lys

260 265 270

Thr Cys Lys Thr Ser Gly Ser Cys Arg Gly Asp Met Gln Phe Cys Lys

275 280 285

Val Ala Gly Cys Glu His Gly Glu Glu Ala Ser Glu Ala Lys Cys Arg

290 295 300

Cys Ser Leu Val His Lys Pro Gly Glu Val Val Val Ser Tyr Gly Gly

305 310 315 320

Met Arg Val Arg Pro Lys Cys Tyr Gly Phe Ser Arg Met Met Ala Thr

325 330 335

Leu Glu Val Asn Gln Pro Glu Gln Arg Ile Gly Gln Cys Thr Gly Cys

340 345 350

His Leu Glu Cys Ile Asn Gly Gly Val Arg Leu Ile Thr Leu Thr Ser

355 360 365

Glu Leu Lys Ser Ala Thr Val Cys Ala Ser His Phe Cys Ser Ser Ala

370 375 380

Thr Ser Gly Lys Lys Ser Thr Glu Ile Gln Phe His Ser Gly Ser Leu

385 390 395 400

Val Gly Lys Thr Ala Ile His Val Lys Gly Ala Leu Val Asp Gly Thr

405 410 415

Glu Phe Thr Phe Glu Gly Ser Cys Met Phe Pro Asp Gly Cys Asp Ala

420 425 430

Val Asp Cys Thr Phe Cys Arg Glu Phe Leu Lys Asn Pro Gln Cys Tyr

435 440 445

Pro Ala Lys Lys Trp Leu Phe Ile Ile Ile Val Ile Leu Leu Gly Tyr

450 455 460

Ala Gly Leu Met Leu Leu Thr Asn Val Leu Lys Ala Ile Gly Val Trp

465 470 475 480

Gly Ser Trp Val Ile Ala Pro Val Lys Leu Val Phe Ala Ile Ile Lys

485 490 495

Lys Leu Met Arg Thr Val Ser Cys Leu Met Gly Lys Leu Met Asp Arg

500 505 510

Gly Arg Gln Val Ile His Glu Glu Ile Gly Glu Asn Arg Glu Gly Asn

515 520 525

Gln Asp Asp Val Arg Ile Glu Met Ala Arg Pro Arg Arg Val Arg His

530 535 540

Trp Met Tyr Ser Pro Val Ile Leu Thr Ile Leu Ala Ile Gly Leu Ala

545 550 555 560

Glu Gly Cys Asp Glu Met Val His Ala Asp Ser Lys Leu Val Ser Cys

565 570 575

Arg Gln Gly Ser Gly Asn Met Lys Glu Cys Val Thr Thr Gly Arg Ala

580 585 590

Leu Leu Pro Ala Val Asn Pro Gly Gln Glu Ala Cys Leu His Phe Thr

595 600 605

Ala Pro Gly Ser Pro Asp Ser Lys Cys Leu Lys Ile Lys Val Lys Arg

610 615 620

Ile Asn Leu Lys Cys Lys Lys Ser Ser Ser Tyr Phe Val Pro Asp Ala

625 630 635 640

Arg Ser Arg Cys Thr Ser Val Arg Arg Cys Arg Trp Ala Gly Asp Cys

645 650 655

Gln Ser Gly Cys Pro Pro His Phe Thr Ser Asn Ser Phe Ser Asp Asp

660 665 670

Trp Ala Gly Lys Met Asp Arg Ala Gly Leu Gly Phe Ser Gly Cys Ser

675 680 685

Asp Gly Cys Gly Gly Ala Ala Cys Gly Cys Phe Asn Ala Ala Pro Ser

690 695 700

Cys Ile Phe Trp Arg Lys Trp Val Glu Asn Pro His Gly Ile Ile Trp

705 710 715 720

Lys Val Ser Pro Cys Ala Ala Trp Val Pro Ser Ala Val Ile Glu Leu

725 730 735

Thr Met Pro Ser Gly Glu Val Arg Thr Phe His Pro Met Ser Gly Ile

740 745 750

Pro Thr Gln Val Phe Lys Gly Val Ser Val Thr Tyr Leu Gly Ser Asp

755 760 765

Met Glu Val Ser Gly Leu Thr Asp Leu Cys Glu Ile Glu Glu Leu Lys

770 775 780

Ser Lys Lys Leu Ala Leu Ala Pro Cys Asn Gln Ala Gly Met Gly Val

785 790 795 800

Val Gly Lys Val Gly Glu Ile Gln Cys Ser Ser Glu Glu Ser Ala Arg

805 810 815

Thr Ile Lys Lys Asp Gly Cys Ile Trp Asn Ala Asp Leu Val Gly Ile

820 825 830

Glu Leu Arg Val Asp Asp Ala Val Cys Tyr Ser Lys Ile Thr Ser Val

835 840 845

Glu Ala Val Ala Asn Tyr Ser Ala Ile Pro Thr Thr Ile Gly Gly Leu

850 855 860

Arg Phe Glu Arg Ser His Asp Ser Gln Gly Lys Ile Ser Gly Ser Pro

865 870 875 880

Leu Asp Ile Thr Ala Ile Arg Gly Ser Phe Ser Val Asn Tyr Arg Gly

885 890 895

Leu Arg Leu Ser Leu Ser Glu Ile Thr Ala Thr Cys Thr Gly Glu Val

900 905 910

Thr Asn Val Ser Gly Cys Tyr Ser Cys Met Thr Gly Ala Lys Val Ser

915 920 925

Ile Lys Leu His Ser Ser Lys Asn Ser Thr Ala His Val Arg Cys Lys

930 935 940

Gly Asp Glu Thr Ala Phe Ser Val Leu Glu Gly Val His Ser Tyr Thr

945 950 955 960

Val Ser Leu Ser Phe Asp His Ala Val Val Asp Glu Gln Cys Gln Leu

965 970 975

Asn Cys Gly Gly His Glu Ser Gln Val Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ile

980 985 990

Phe Leu Asp Val Pro Lys Phe Val Asp Gly Ser Tyr Met Gln Thr Tyr

995 1000 1005

His Ser Thr Val Pro Thr Gly Ala Asn Ile Pro Ser Pro Thr Asp Trp

1010 1015 1020

Leu Asn Ala Leu Phe Gly Asn Gly Leu Ser Arg Trp Ile Leu Gly Val

1025 1030 1035 1040

Ile Gly Val Leu Leu Gly Gly Leu Ala Leu Phe Phe Leu Ile Met Ser

1045 1050 1055

Leu Phe Lys Leu Gly Thr Lys Gln Val Phe Arg Ser Arg Thr Lys Leu

1060 1065 1070

Ala Gly

Claims

1.一种重组病毒载体，含有编码发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn/Gc的DNA分子的病毒载体。

2.根据权利要求1所述重组病毒载体，所述发热伴血小板减少综合征病毒为发热伴血小板减少综合征病毒AH12毒株、发热伴血小板减少综合征病毒YG1毒株。

3.根据权利要求1或2所述重组病毒载体，所述DNA分子为人源化优化的编码发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn/Gc的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述重组病毒载体，所述DNA分子如SEQ ID NO：1所示。

5.根据权利要求1-3任一项所述重组病毒载体，所述病毒载体为水疱性口炎病毒、痘病毒或腺病毒。

6.权利要求1-5任一项所述重组病毒载体的制备方法，将敲除表达糖蛋白序列的水疱性口炎病毒质粒与表达病毒转录复合物和T7聚合酶的质粒混合，共转染人肾上皮细胞系，48小时后，收取细胞上清获得感染性病毒颗粒即为重组病毒载体；其中，重组病毒载体的报告基因GFP是插在表达N蛋白序列的上游。

7.权利要求1-5任一项所述重组病毒载体在制备预防和/或治疗发热伴血小板减少综合征的药物中的应用。

8.用权利要求1-5任一项所述重组病毒载体制备的疫苗。

9.权利要求8所述疫苗的制备方法，将权利要求1-5任一项所述重组病毒载体以及表达病毒转录复合物和T7聚合酶的质粒共同转染宿主细胞，收集细胞培养上清液中的病毒颗粒。

10.根据权利要求9所述的制备方法，所述病毒转录复合物为病毒的N、P、M、L、G蛋白；所述宿主细胞为293T细胞。