CN111218459A - 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种以人5型复制缺陷腺病毒为载体的新型冠状病毒疫苗。所述疫苗以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，携带的保护性抗原基因是经过优化设计的2019新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)S蛋白基因(Ad5‑nCoV)。S蛋白基因经优化后，在转染细胞中的表达水平显著升高。该疫苗在小鼠和豚鼠模型上均具有良好的免疫原性，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应。hACE2转基因小鼠上的保护效果研究显示，单次免疫Ad5‑nCoV14天后能够明显降低肺组织内部的病毒载量，说明该疫苗对2019新型冠状病毒具有良好的免疫保护效果。此外，该疫苗制备快速简便，可在短期内实现大规模生产用于应对突发疫情。

Description

一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗
技术领域
本发明涉及一种重组新型冠状病毒疫苗，目的在于预防新型冠状病毒疫情。本发明属于生物工程技术领域。
背景技术
2019新型冠状病毒，即SARS‑CoV‑2(也被称为2019‑nCoV)，2020年1月12日被世界卫生组织命名。它是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。该病毒为第七个可以感染人的冠状病毒(CoV)。人感染2019‑nCoV的潜伏期一般为1～14天，感染2019‑nCoV后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。截止到2020年3月17日，我国报告确诊病例81116人，死亡病例3231例；世界其他国家报告病例98486例，累计死亡3848例，平均死亡率3.94％。
新型冠状病毒属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140nm。病毒全基因组系统发育分析(29,903个核苷酸)表明该病毒与一组以前在中国蝙蝠身上发现过的SARS样冠状病毒(genus Betacoronavirus,subgenus Sarbecovirus)关系最密切(89.1％的核苷酸相似性)。在S基因进化树中，2019-nCoV与蝙蝠冠状病毒bat-SL-CoVZC45存在最为密切的亲缘关系，氨基酸一致性为82.3％，而与SARS-CoV的氨基酸一致性大约为77.2％。2019-nCoV进入人体细胞时结合的受体与SARS-CoV的相同，均为血管紧张素转换酶2(ACE2)。
冠状病毒是一个大型的病毒家族，迄今引起人群感染暴发主要是SARS-CoV、MERS-CoV以及SARS-CoV-2。有关SARS-CoV-2的结构、功能、感染关键靶点、作用机制及疫苗开发的报道并不多，很多研究主要集中在SARS-CoV、MERS-CoV疫苗上，主要研发类型有病毒载体疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、灭活疫苗及减毒活疫苗等。重组冠状病毒疫苗的靶抗原一般都是采用全长S蛋白和截短型S蛋白(S1和RBD)形式。关于新型冠状病毒疫苗在研的种类包括腺病毒载体疫苗、mRNA疫苗、DNA疫苗、重组蛋白疫苗和灭活疫苗，研究结果还未见报道。本发明的目的就是提供一种重组新型冠状病毒疫苗。
发明内容
基于上述目的，本发明首先提供了一种用于编码新型冠状病毒疫苗的S蛋白基因优化的多核苷酸，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:1所示。所述多核苷酸以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，经包装获得重组腺病毒载体新型冠状病毒疫苗。
本发明还提供了含有上述多核苷酸的载体。
在一个优选的实施方案中，所述载体为pDC316。
本发明还提供了一种能够表达上述多核苷酸的人复制缺陷重组腺病毒。
在一个优选的实施方案中，所述重组腺病毒来源于AdMax腺病毒系统。
本发明还提供了上述重组腺病毒在制备预防新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。
在一个优选的实施方案中，上述应用中，所述重组腺病毒被制备为注射剂、滴鼻剂或喷雾剂。
在一个更为优选的实施方案中，所述重组腺病毒被制备为肌肉注射剂。
最后，本发明提供了一种制备上述的可表达新型冠状病毒S蛋白的重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建含有编码2019新型冠状病毒S蛋白的多核苷酸的穿梭质粒载体；
(2)将步骤(1)所述穿梭质粒载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞；
(3)培养步骤(2)所述宿主细胞；
(4)收获从步骤(3)所述细胞中释放的人复制缺陷重组腺病毒；
(5)对步聚(4)中的重组腺病毒进行扩大培养；
(6)对步聚(5)中的培养产物进行纯化。
优选的，步骤(1)所述穿梭质粒载体为pDC316。
优选的，步骤(2)所述骨架质粒为pBHGlox_E1,3Cre，两种质粒均属于AdMax腺病毒系统，共同用于在宿主细胞中进行含有编码新型冠状病毒S蛋白的多核苷酸的重组腺病毒包装。
优选的，步骤(3)所述细胞为HEK293细胞。
优选的，步骤(5)所述扩大培养方法为悬浮培养。
优选的，步骤(6)所述纯化方法为Source 30Q层析法。
本发明提供的可表达新型冠状病毒S蛋白的重组腺病毒作为新型冠状病毒疫苗(Ad5-nCoV)，其在小鼠和豚鼠模型上均具有良好的免疫原性，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应。在hACE2转基因小鼠上的保护效果研究显示，单次免疫Ad5-nCoV14天后能够明显降低肺组织内的病毒载量。说明该疫苗对2019新型冠状病毒具有良好的免疫保护效果。该疫苗制备方法快速简便，可在短期内实现大规模生产用于应对突发疫情。
附图说明
图1.穿梭质粒pDC316-nCoV_Sopt图谱；
图2.S蛋白细胞内表达Western blot鉴定图谱；
图3.重组新型冠状病毒疫苗候选株原代毒种目标抗原表达Western blot鉴定图谱；
图4.小鼠肌肉注射免疫Ad5-nCoV第9天血清IgG抗体水平比较图；
图5.小鼠肌肉注射免疫Ad5-nCoV第9天和14天血清IgG抗体水平比较图；
图6.小鼠肌肉注射免疫不同构建重组腺病毒血清IgG抗体水平比较图；
图7.小鼠免疫重组腺病毒第14天不同免疫方式诱导的血清抗体水平比较图；
图8.Ad5-nCoV诱导产生的CD8+T细胞免疫反应比较图；
图9.Ad5-nCoV诱导产生的CD4+T细胞免疫反应比较图；
图10.肌肉注射组细胞免疫反应代表图；
图11.滴鼻免疫组细胞免疫反应代表图；
图12.对照组细胞免疫反应代表图；
图13.Ad5-nCoV免疫后14天肺洗液抗体水平比较图；
图14.Ad5-nCoV豚鼠模型免疫原性检测比较图；
图15.SARS-CoV-2攻毒后小鼠体重下降百分比比较图；
图16.SARS-CoV-2攻毒后小鼠肺组织病毒载量比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
实施例1.以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗的制备
1.S蛋白基因优化及合成
重组新型冠状病毒疫苗的目标抗原为新型冠状病毒毒株(Genebank编号：NC_045512.2)的S蛋白。通过对S蛋白基因进行优化，提高S蛋白的表达水平，从而提高了疫苗的免疫原性。
首先，使用Upgene软件(Gao,W.Rzewski,A.Sun,H.Robbins,P.D.&Gambotto,A.UpGene:Application of a web-based DNA codon optimizationalgorithm.Biotechnol Prog,2004.20(2):p.443-8.)进行密码子优化，将S蛋白基因的大部分稀有密码子更改为高使用频率密码子。其次，考虑到软件优化可能机械地将密码子更改为最高使用频率的密码子，受到tRNA使用效率、mRNA二级结构等影响，蛋白翻译效率可能并不会显著提升。在此情况下，我们采用人工分析替换部分高频和低频密码子的方法，同时将高频密码子和低频密码子均匀分布于S蛋白基因。同时考虑到提高mRNA中GC含量，有助于增强mRNA的稳定性，我们适当地提高了S蛋白基因的GC含量，并将G、C核苷酸在整个GP基因中尽可能均衡分布。再次，我们将S蛋白的原始信号肽(1aa-12aa)更改为组织纤溶酶原激活物信号肽tPA，以进一步提升S蛋白的表达水平。
基因优化前，新型冠状病毒S蛋白基因的稀有密码子(使用频率<70％)的含量为34％，高使用频率密码子(使用频率>90％)的含量为23％，GC含量为36％。基因优化后，稀有密码子含量下降至3％，高频率密码子含量提升至81％，GC含量提升至58％，与原始S蛋白基因序列的同源性为70.4％。
S蛋白基因优化之后，在翻译起始密码子前面加入Kozak序列，并在整个序列上游插入酶切位点EcoRI，下游插入酶切位点HindIII，对基因序列进行合成。与此同时，作为对照，将S蛋白基因的原始序列进行合成。S蛋白基因优化序列(酶切位点为EcoRI和HindIII)见SEQ ID NO:1，S蛋白原始基因序列(酶切位点为SmaI和SalI)见SEQ ID NO:2。
2.载体构建和S蛋白体外表达鉴定
2.1载体构建
以上合成的基因序列，分别用HindIII和SalI，或SmaI和SalI进行双酶切，回收目的基因片段，将其连接至AdMax腺病毒系统(加拿大Microbix Biosystems Inc.)的穿梭质粒pDC316上，转化DH5-α感受态，涂布Ampr LB平板，挑单克隆进行菌落PCR鉴定，并对PCR鉴定为阳性的克隆进行测序验证。S蛋白基因序列未进行优化的质粒记为pDC316-nCoV_S，S蛋白基因优化后的质粒记为pDC316-nCoV_Sopt。pDC316-nCoV_Sopt质粒图谱如图1所示。
同时，使用重叠延伸PCR的方法，扩增原始信号肽S蛋白基因优化序列，连接至pDC316载体，记为pDC316-nCoV_oriSIP-Sopt；扩增tPA信号肽S蛋白基因未优化序列，连接至pDC316载体，记为pDC316-nCoV_tPA-S；tPA信号肽S1蛋白(S1蛋白为S蛋白的12-685位氨基酸的截短型蛋白)基因优化序列(相应的基因优化序列为SEQ ID NO:1的第25bp至2103bp)，连接至pDC316载体，记为pDC316-nCoV_S1opt；以及tPA信号肽S1蛋白基因原始序列，连接至pDC316载体，记为pDC316-nCoV_S1。
2.2S蛋白的体外表达鉴定
将以上构建的6个穿梭质粒和pDC316载体，使用转染试剂TurboFectTransfection Reagent(Thermo Scientific,REF,R0531)转染至HEK293细胞，48小时后收细胞进行WB检测。实验方法如下：
转染：实验前一天，HEK293细胞以8×105细胞/孔接种6孔板，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。转染前1小时，将培养基换成新鲜的含2％FBS的DMEM培养基，每孔2mL。转染时，每个转染孔取对应质粒2μg，加入到200μL无FBS的DMEM培养基中，混匀，加入转染试剂3μL，轻轻混匀，室温放置15分钟。将质粒和转染试剂混合液轻轻滴加到6孔板中，轻摇混匀。细胞于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，5小时后将培养基换成新鲜的含10％FBS的DMEM培养基，48小时后收集细胞，制备样品，进行WB检测。
样品制备：转染48小时后，小心地吸弃培养基，用PBS重悬细胞，500g离心5分钟，弃清。细胞用200μL RIPA缓冲液(Thermo Scientific,Prod#89900，另外添加适量蛋白酶抑制剂和核酸酶)重悬，冰浴15分钟，4℃12000rpm离心5分钟，取上清，加入1/3体积含有200mmol/L DTT的4×SDS-PAGE上样缓冲液，95℃加热5分钟，冻存，用于WB检测。
Western blot检测：使用10孔的4-20％SDS-PAGE梯度胶进行SDS-PAGE，上样量每孔30μL。电泳条件：80V，15min；180V，直到溴酚蓝刚好从凝胶中出来为此。将SDS-PAGE胶上的蛋白质通过电转仪转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为300mA，1小时。电转完成后，将硝酸纤维素膜用5％脱脂奶粉封闭1小时，然后以1:2000的稀释度加入抗S蛋白兔多克隆抗体(义翘神州，货号40150-T52)，4℃放置过夜。将膜用WB洗涤液洗涤4次，每次于摇床上摇动5分钟。然后加入以1:10000稀释于5％脱脂奶粉的HRP标记的羊抗兔IgG抗体(CST,7074S)，室温孵育1小时。用WB洗涤液将膜洗涤4次，使用ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRPSubsrate(MILLIPORE,Cat.No.WBKLS0500)进行化学发光反应，使用化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像。
以β-actin作为样品检测内参，结果如图2所示，其中1：转染pDC316-nCoV_S细胞；2：转染pDC316-nCoV_tPA-S细胞；3：转染pDC316-nCoV_oriSIP-Sopt细胞；4：转染pDC316-nCoV_Sopt细胞；5：转染pDC316空载体细胞；6：预染Marker；7：转染pDC316空载体细胞；8：转染pDC316-nCoV_S1细胞；9：转染pDC316-nCoV_S1opt细胞。结果显示没有进行基因优化的序列，无论是S全长基因还是S1基因，其质粒转染的细胞均没有检测到相关蛋白的表达；S蛋白基因优化后，可检测到S蛋白表达；将S蛋白原始信号肽更改为tPA信号肽之后，S蛋白的表达水平进一步提升；同时，S1蛋白基因优化后也可以检测到有明显的S1蛋白的表达。
3.重组腺病毒包装、制备和鉴定
3.1重组腺病毒包装
将以上构建好的载体pDC316-nCoV_Sopt、pDC316-nCoV_oriSIP-Sopt和pDC316-nCoV_S1opt分别与AdMax腺病毒系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞进行重组腺病毒的包装。过程如下：
a)转染前一天，将HEK293细胞接种于六孔板中，每孔8×105个细胞,培养基为MEM+10％FBS，置37℃含5％CO2细胞培养箱中培养过夜。
b)转染当天换液，用新鲜的含10％FBS的MEM培养基继续培养。待细胞生长至底面积的80-90％时，取骨架质粒(pBHGlox_E1,3Cre)和穿梭质粒，用TurboFect转染试剂(Thermo scientific,REF,R0531)按其所附说明书进行转染。具体步骤为：
(1)每个转染孔取骨架质粒3.2μg，穿梭质粒0.8μg，混和均匀；质粒用400μL Opti-MEM培养基进行稀释。
(2)取6μL TurboFect转染试剂加入到稀释于Opti-MEM培养基的质粒中，轻轻混匀。
(3)将转染试剂和质粒混合物室温放置20min，然后加入到细胞中。
c)转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm2细胞培养瓶中，用含5％FBS的MEM培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75cm2细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落时进行收毒。
d)将出毒的细胞重悬，500g离心10分钟，弃上清，细胞用2mL PBS重悬，先后置于-70℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融三次。12000g离心10分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。
将表达tPA信号肽S全长蛋白基因优化序列的毒种标记为Ad5-nCoV_Sopt，表达原始信号肽S全长蛋白基因优化序列的毒种标记为Ad5-nCoV_oriSIP-Sopt，表达tPA信号肽S1蛋白基因优化序列的毒种标记为Ad5-nCoV_S1opt。
3.2重组腺病毒鉴定
3.2.1 PCR扩增S及S1全序列及测序鉴定
使用pDC316载体的通用引物，扩增S或S1蛋白的全序列，引物序列如下：
pDC316-F:ACGTGGGTATAAGAGGCG
pDC316-R:CGATGCTAGACGATCCAG
取50μL疫苗候选株毒种液，加入2μL蛋白酶K，50℃消化30min释放病毒基因组，以此为模版扩增S蛋白和S1蛋白基因序列。
PCR扩增条件为：
Figure BDA0002416789430000081
反应程序为：
Figure BDA0002416789430000082
琼脂糖凝胶电泳结果显示三个毒种均能扩增到单一目的条带，片段大小正确。将目的条带进行胶回收并测序，比对结果表明，测序结果序列完全正确。
3.2.2目标抗原表达鉴定
将不同构建重组腺病毒感染HEK293细胞，48小时后收集细胞进行目标抗原的Western blot检测，三个毒种Ad5-nCoV_Sopt、Ad5-nCoV_oriSIP-Sopt和Ad5-nCoV_S1opt均可检测到目标蛋白的明显表达。结果如图3所示，其中1：预染Marker；2和3：Ad5-nCoV_oriSIP-Sopt感染细胞；4和5：Ad5-nCoV_Sopt；6：Ad5-nCoV_S1opt感染细胞。7和8：空白细胞。
3.2.3重组腺病毒培养
HEK293细胞在37℃、5％CO2条件下120rpm悬浮培养。毒种接种时，将活度大于95％的细胞稀释至1.0×106cells/mL，终体积为300mL。P5代重组腺病毒以MOI 10感染HEK293细胞，37℃，5％CO2，130rpm摇动培养。每隔24小时取样，检测细胞活度和密度。
毒种接种72小时后，当细胞活度下降到40％以下时，将细胞摇瓶先后置于-70℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融两次。加入Benzonase(20U/mL)，34-36℃水浴酶解2小时。12000g离心10分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。
3.2.4重组腺病毒纯化
用5×平衡缓冲液调节病毒上清液至电导值为18mS/cm，pH7.5。采用Source 30Q分离纯化腺病毒颗粒，层析柱用A液(20mmol/L Tris+150mmol/L NaCl+2mmol/LMgCl2pH7.5。)平衡，上样，上样流速为5mL/min；上样结束，用A液平衡至Uv基线，10mL/min,50min,0％B-20％B梯度洗脱，分管收集洗脱峰，最后100％B洗脱，B液为20mmol/L Tris+2mol/L NaCl+2mmol/L MgCl2pH7.5。
3.3Ad5-nCoV的鉴定和滴度测定
3.3.1PCR扩增目标蛋白基因全序列和测序鉴定
实验方法和过程同3.2.1。琼脂糖凝胶电泳结果显示三个毒种均能扩增到单一目的条带，片段大小正确。将目的条带进行胶回收并测序，比对结果表明，测序结果序列完全正确。
3.3.2感染滴度测定
使用Clontech Adeno-XTM Rapid Titer Kit进行重组腺病毒滴度的测定。操作按试剂盒所附说明书进行，具体方法如下：
a)将HEK293细胞接种于24孔板。细胞密度为5×105cells/mL，每孔接种0.5mL，培养基为MEM+10％FBS。
b)使用培养基把将要检测的病毒从10-2至10-6进行10倍稀释，制备一系列稀释度的病毒样品，每孔50μL加入到细胞中。
c)细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养48小时。
d)吸弃细胞的培养基，让细胞稍微晾干(不要过干)。每孔轻轻加入0.5mL冰甲醇，于-20℃放置10分钟，对细胞进行固定。
e)吸弃甲醇，用PBS+1％BSA将细胞轻轻地洗3次。每孔加入0.25mL抗-Hexon抗体稀释液(1:1000稀释)，37℃孵育1小时。
f)吸弃抗-Hexon抗体，用PBS+1％BSA将细胞轻轻洗3次，每孔加入0.25mL HRP标记的Rat Anti-Mouse Antibody(1:500稀释)，37℃孵育1小时。
g)在吸弃0.25mL HRP标记的Rat Anti-Mouse Antibody之前，将10×DAB底物用1×Stable Peroxidase Buffer稀释成1×DAB工作液，让其达到室温。
h)吸弃Rat Anti-Mouse Antibody稀释液，用PBS+1％BSA将细胞轻轻地洗3次。每孔加入0.25mL DAB工作液，室温放置10分钟。
i)吸弃DAB工作液，用PBS将细胞轻轻地洗2次。
j)于显微镜下对棕色/黑色的阳性细胞进行计数。每孔至少随机计数3个视野，计算其平均阳性细胞数。
k)计算感染滴度(ifu/mL)。公式如下：
感染滴度(ifu/mL)＝视野的阳性细胞数×每孔视野数/(病毒体积(mL)×稀释度)
滴度测定结果显示，纯化的重组腺病毒经浓缩后，感染滴度达1.0×1010ifu/mL以上。
3.3.3病毒颗粒数测定
将20mmol/L Tris-Cl、2mmol/L EDTA(pH 7.5)溶液和2.0％SDS溶液等体积混合，配置成病毒裂解液。取适当体积待测病毒样品，加入1/19体积病毒裂解液，用移液器反复吹打10次混匀，涡旋1分钟。置于56℃恒温水浴中摇动消化10分钟，12000rpm离心5分钟，取上清，测定260nm和280nm下的OD值。计算腺病毒颗粒数。
病毒颗粒数测定结果显示，纯化的重组腺病毒经浓缩后均达到1.0×1011VP/mL以上。
实施例2.不同构建重组腺病毒在小鼠模型上的免疫学评价
1.疫苗体液免疫反应检测
100只SPF级雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)，随机分成10组，每组10只。根据表1所示分组情况对小鼠进行Ad5-nCoV免疫。肌肉注射方式为后大腿内侧注射100μL，滴鼻免疫方式为将小鼠用异氟烷麻醉，经鼻腔滴入20μL。分组情况如表1所示。
表1.疫苗体液免疫反应检测小鼠分组情况
Figure BDA0002416789430000101
Figure BDA0002416789430000111
小鼠于免疫后特定时间点采血，分离血清，使用ELISA法检测血清中针对新型冠状病毒S蛋白的IgG抗体滴度。检测结果如图4至图7所示(ns,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001)。
小鼠肌肉注射Ad5-nCoV_Sopt第9天即可产生较高的血清IgG抗体，其中高剂量组抗体滴度平均值达105以上；Ad5-nCoV_Sopt肌肉注射诱导产生的血清IgG抗体水平呈现明显的剂量依赖关系，剂量越高，血清IgG抗体水平越高(图4)。从免疫后第9天至免疫后第14天，血清抗体水平进一步提升，其中高剂量组和低剂量组血清IgG抗体滴度在免疫后第14天显著高于第9天(图5)。
对Ad5-nCoV_Sopt、Ad5-nCoV_oriSIP-Sopt和Ad5-nCoV_S1opt三个重组腺病毒肌肉注射诱导产生的血清IgG抗体水平进行分析，结果如图6所示，其中A，免疫后第9天血清IgG抗体滴度；B，免疫后第14天血清IgG抗体滴度。结果显示，三个重组腺病毒之间，以Ad5-nCoV_Sopt诱导产生的免疫反应最为迅速，免疫后第9天，Ad5-nCoV_Sopt产生的血清IgG抗体水平显著高于Ad5-nCoV_oriSIP-Sopt和Ad5-nCoV_S1opt(图6，A)。免疫后第14天，Ad5-nCoV_oriSIP-Sopt的血清抗体水平有所提升(图6，B)，但是Ad5-nCoV_S1opt诱导产生的血清IgG抗体水平无论在免疫后第9天还是第14天均显著低于另外两个疫苗候选株。结果说明，三个重组腺病毒之间，以Ad5-nCoV_Sopt诱导产生的血清IgG抗体滴度最为快速，其免疫原性最好。
对免疫后第14天肌肉注射或滴鼻免疫Ad5-nCoV_Sopt诱导的血清抗体滴度进行比较分析，结果如图7所示，无论是高剂量，中剂量还是低剂量组，两种免疫诱导产生的血清IgG抗体水平均无显著性差异。
2.细胞免疫反应检测
30只6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，随机分成三组，每组10只。分别经肌肉注射(im.)或滴鼻免疫(in.)接种5×108VP的Ad5-nCoV_Sopt；并以同样的免疫方式接种1×107ifu的Ad5载体作为对照，对照组每种免疫方式各5只。肌肉注射方式为后大腿内侧注射100μL，滴鼻免疫方式为将小鼠用异氟烷麻醉，经鼻腔滴入20μL。实验分组情况如表2所示。
表2.Ad5-nCoV_Sopt小鼠模型细胞免疫反应检测实验分组情况
Figure BDA0002416789430000121
免疫后14天处死小鼠，分离脾淋巴细胞，使用S蛋白重叠肽库刺激培养6小时，同时加入蛋白分泌阻断剂阻断细胞因子分泌。6小时后，阻断Fc受体，对死细胞和细胞表面分子标志物进行染色，细胞经固定和穿孔之后，对细胞内细胞因子进行染色。细胞表面标志物包括CD3、CD4、CD8和CD107a分子，细胞内细胞因子包括IFNγ、TNFα和IL2。使用流式细胞仪(BDFACS CantoTM)分析CD4+T细胞和CD8+T细胞经特异性肽刺激后表达IFNγ、TNFα、IL2和CD107a的水平。
Ad5-nCoV_Sopt诱导的CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫反应如图8和图9所示，代表性结果如图10至图12所示，其中图10为肌肉注射组细胞免疫反应代表图，图11为滴鼻免疫组细胞免疫反应代表图，图12为对照组细胞免疫反应代表图。结果显示，无论是肌肉注射还是滴鼻免疫，Ad5-nCoV_Sopt均可诱导其免疫小鼠产生明显的细胞免疫反应。小鼠免疫后14天，脾细胞经S蛋白重叠肽库刺激后，无论是CD8+T细胞还是CD4+T细胞，其表达的IFNγ、TNFα和IL2水平均显著高于Ad5载体对照组(Control)(P<0.05)。与此同时，相比于滴鼻免疫(in.)，肌肉注射(im.)可诱导产生更加强烈的细胞免疫反应。肌肉注射诱导CD8+T细胞和CD4+T细胞产生的IFNγ、TNFα和IL2水平均显著高于滴鼻免疫。
3.肺洗液抗体水平检测
进行细胞免疫反应检测的小鼠，处死时同时采集肺洗液，使用ELISA法检测肺洗液中针对新型冠状病毒S1蛋白的IgG和IgA抗体水平。实验分组如表2所示，检测结果如图13所示(****,P<0.0001)，其中A，肺洗液IgG抗体水平；B，肺洗液IgA抗体水平。结果显示，Ad5-nCoV_Sopt免疫后14天，滴鼻免疫小鼠可诱导产生较高水平的肺洗液IgG抗体和IgA抗体滴度，显著高于肌肉注射组和对照组。而肌肉注射组仅能检测到低水平的肺洗液IgG抗体滴度，未能检测到肺洗液IgA抗体。
4. 4.小鼠模型免疫原性评价小结
Ad5-nCoV_Sopt、Ad5-nCoV_oriSIP-Sopt和Ad5-nCoV_S1opt三个重组腺病毒均具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生高水平的血清IgG抗体。其中以Ad5-nCoV_Sopt诱导产生的血清IgG抗体滴度最为快速，其免疫原性最好。选择Ad5-nCoV_Sopt作为重组新型冠状病毒疫苗最佳候选，将其记为Ad5-nCoV。细胞免疫反应检测结果说明，肌肉注射和滴鼻免疫Ad5-nCoV均可诱导其免疫的小鼠产生特异性细胞免疫反应，其中肌肉注射免疫方式可诱导强烈的特异性细胞免疫反应。肺洗液抗体检测结果说明，滴鼻免疫可诱导产生较高水平的肺洗液IgG和IgA抗体。
实施例3.Ad5-nCoV在豚鼠模型上的免疫学评价
56只SPF级豚鼠，体重200至250克，随机分成4组，每组14只，雌雄各半。根据表3所示分组情况对豚鼠进行Ad5-nCoV免疫。免疫方式为后大腿内侧肌肉注射200μL。
表3.Ad5-nCoV豚鼠免疫原性检测分组情况
Figure BDA0002416789430000131
豚鼠于免疫后特定时间点采血，分离血清，使用ELISA法检测血清中针对新型冠状病毒S蛋白的IgG抗体滴度。检测结果如图14所示(ns,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001)。结果显示，Ad5-nCoV免疫豚鼠14天后，检测到高水平的血清IgG抗体滴度。中剂量组与高剂量组之间抗体滴度无显著性差异，低剂量组血清IgG抗体水平较低，显著低于高剂量组与低剂量组。检测结果表明，Ad5-nCoV在豚鼠模型上具有良好的免疫原性。
实施例4.Ad5-nCoV在hACE2转基因小鼠模型上的保护效果评价
在生物安全3级实验室中进行SARS-CoV-2(SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN)活病毒攻毒试验。
实验分为3组(表4)，分别后腿肌肉注射Ad5-nCoV 5×109VP或5×108VP，注射体积为100μL，或肌肉注射等量体积的PBS。免疫后2周将小鼠转移至生物安全3级实验室，进行SARS-CoV-2攻毒，攻毒方式为滴鼻(105TCID50/只。小鼠攻毒后连续观察3天，记录体重变化。感染后第3天安乐死全部小鼠，检测肺组织病毒载量。
表4.Ad5-nCoV动物保护试验分组情况。
Figure BDA0002416789430000141
模型组小鼠感染后出现体重下降，平均下降百分比最高为3.36％。与模型组比较，高剂量组小鼠感染后第3天体重有一定程度升高，平均升高百分比为2.55％。低剂量组小鼠感染后第3天体重平均下降百分比为4.72％。显示给予高剂量组小鼠感染后无明显症状(图15)。在病毒载量方面，如图16所示，模型组小鼠感染后3天肺组织病毒载量检测结果为106.18copies/mL。高剂量组小鼠感染后3天肺组织病毒载量为103.11copies/mL，显著低于模型组(p<0.001)。低剂量组小鼠感染后3天肺组织病毒载量为103.90copies/mL，显著低于与模型组(p<0.001)。显示高剂量Ad5-nCoV接种后肺组织病毒载量下降3.07lg值，低剂量Ad5-nCoV免疫接种后肺组织病毒载量下降2.28lg值。研究结果提示Ad5-nCoV对感染小鼠有明显保护作用。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
康希诺生物股份公司
<120> 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3876
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcgccg ccaccatgga cgccatgaag cggggcctct gctgtgttct gctgctctgc 60
ggcgccgtgt tcgtgagtaa ctcgagccag tgcgtgaacc tgacaacaag gacacagctg 120
ccccctgcct acacaaacag cttcactagg ggcgtgtact accccgacaa ggtgttcagg 180
tccagcgtgc tgcacagcac acaggacctg ttcctgccct tcttcagcaa cgtgacatgg 240
ttccacgcca ttcacgtgag cgggaccaac gggaccaagc ggttcgataa ccctgtcttg 300
cccttcaacg atggcgtgta ctttgccagc accgagaagt ccaacatcat caggggctgg 360
atctttggca caaccctgga cagcaagacc cagagcctcc tgatcgtcaa caacgccaca 420
aacgtcgtga tcaaggtgtg cgagttccag ttctgcaacg atccattcct gggcgtgtac 480
taccataaga acaacaagtc ctggatggag agcgagttcc gggtctactc cagcgccaac 540
aactgcacct tcgagtacgt gagccagccc ttcctgatgg acttggaggg gaagcagggc 600
aacttcaaga acctccggga gttcgtcttt aagaacattg acggctactt caagatctac 660
tccaagcaca cccccatcaa cctcgtcagg gatctgcccc aggggtttag cgccctggag 720
cccctggtcg atctgccaat cggcatcaac atcacacggt ttcagaccct gctggccctg 780
caccggtcct acctcacccc tggcgatagc agctccggct ggacagccgg ggccgccgcc 840
tactacgtcg gctacctcca gcctcggact ttcctgctga agtacaacga gaacgggaca 900
atcaccgatg ccgtggactg cgccctggat cccctcagcg agaccaagtg cacactgaag 960
tcctttactg tggagaaggg gatctaccag acatccaact ttagggtgca gcccaccgag 1020
agcattgtca ggttccccaa catcacaaac ctgtgcccct ttggcgaggt gttcaacgcc 1080
acaagattcg cttccgtgta cgcctggaac aggaagcgga tcagcaactg cgtggccgat 1140
tactccgtcc tgtacaacag cgcctccttc tccaccttca agtgctacgg cgtgtccccc 1200
accaagctga acgatctgtg ctttactaac gtgtacgctg acagcttcgt gatcagaggc 1260
gatgaggtgc ggcagatcgc ccctgggcag acagggaaga tcgccgacta caactacaag 1320
ctgcccgatg acttcacagg gtgcgtgatc gcctggaact ccaacaacct cgatagcaag 1380
gtgggcggca actacaacta cctctacagg ctgtttagga agtccaacct gaagcccttt 1440
gagcgggata ttagcaccga gatctaccag gccgggagca ccccttgtaa cggcgtcgag 1500
gggtttaact gctactttcc tctgcagagc tacgggttcc agcccaccaa cggggtcggg 1560
taccagccat accgggtggt ggtgctgagc ttcgagctgc tgcacgcccc agccaccgtc 1620
tgcggcccca agaagtccac taacctggtg aagaacaagt gcgtgaactt caacttcaac 1680
ggcctgacag ggacaggcgt gctgacagag tccaacaaga agttcctccc cttccagcag 1740
tttgggcggg acattgccga cacaaccgat gccgtgcggg acccacagac cctggagatc 1800
ctggacatca caccctgcag cttcggcggg gtgagcgtga ttacacccgg cacaaacacc 1860
tccaaccagg tggccgtgct gtaccaggat gtgaactgca cagaggtccc cgtggccatt 1920
cacgccgatc agctgacccc cacctggcgg gtgtacagca ccggctccaa cgtgttccag 1980
actagggccg gctgcctgat cggggccgag cacgtgaaca acagctacga gtgcgacatc 2040
cccattgggg ccgggatctg cgcctcctac cagacacaga caaacagccc taggcgggcc 2100
aggtcggtgg ccagccagtc catcatcgcc tacaccatga gcctgggcgc cgagaacagc 2160
gtggcctaca gcaacaacag catcgctatc ccaacaaact ttaccatctc cgtgaccacc 2220
gagatcctgc ccgtcagcat gactaagaca tccgtcgact gcaccatgta catctgcggg 2280
gacagcaccg agtgctccaa cctgctgctg cagtacgggt ccttctgcac ccagctgaac 2340
agggccctga ctggcattgc cgtcgagcag gataagaaca cacaggaggt ctttgcccag 2400
gtgaagcaga tctacaagac acccccaatt aaggacttcg gcggcttcaa cttctcccag 2460
attctgcctg accccagcaa gcccagcaag cggtccttca tcgaggacct gctgttcaac 2520
aaggtgacac tggccgacgc cggctttatc aagcagtacg gcgactgcct cggcgacatc 2580
gccgctaggg acctgatctg cgcccagaag ttcaacggcc tgacagtgct gccccctctg 2640
ctgacagacg agatgatcgc ccagtacaca agcgccctgc tggccggcac catcacctcc 2700
gggtggacat tcggggccgg ggccgccctg cagatcccct ttgccatgca gatggcctac 2760
aggttcaacg gcattggcgt gacacagaac gtgctgtacg agaaccagaa gctgatcgcc 2820
aaccagttta actccgccat cgggaagatc caggattccc tgagcagcac cgccagcgcc 2880
ctgggcaagc tccaggatgt ggtgaaccag aacgcccagg ccctcaacac cctggtgaag 2940
cagctgtcct ccaacttcgg cgccattagc tccgtgctga acgacatcct gagccggctg 3000
gacaaggtgg aggccgaggt gcagattgac cggctgatta ccggacggct gcagtccctg 3060
cagacctacg tgacacagca gctcatccgg gccgccgaga tccgcgcctc cgccaacctg 3120
gccgccacta agatgtccga gtgcgtgctc ggccagagca agagggtgga tttctgcggg 3180
aagggctacc acctgatgag cttcccccag agcgcccccc atggggtggt gttcctgcac 3240
gtgacatacg tgcctgccca ggagaagaac ttcaccaccg ccccagccat ttgccacgac 3300
ggcaaggccc acttccctag ggagggcgtg ttcgtgagca acgggacaca ctggttcgtg 3360
acccagcgga acttctacga gccccagatt atcaccacag ataacacctt tgtgtccggg 3420
aactgcgatg tcgtgattgg gatcgtcaac aacacagtct acgaccccct gcagcccgag 3480
ctcgatagct ttaaggagga gctggataag tactttaaga accacacctc ccctgatgtg 3540
gacctggggg atatcagcgg catcaacgcc agcgtggtga acatccagaa ggagatcgat 3600
aggctgaacg aggtggccaa gaacctgaac gagtccctga tcgacctgca ggagctgggg 3660
aagtacgagc agtacatcaa gtggccctgg tacatctggc tgggcttcat cgccgggctg 3720
atcgccatcg tgatggtgac cattatgctc tgctgcatga ctagctgctg ctcctgcctg 3780
aaggggtgct gcagctgcgg gagctgctgc aagtttgatg aggatgatag cgagccagtg 3840
ctgaagggcg tgaagctgca ctacacctga aagctt 3876
<210> 2
<211> 3843
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
cccggggccg ccaccatgtt tgtttttctt gttttattgc cactagtctc tagtcagtgt 60
gttaatctta caaccagaac tcaattaccc cctgcataca ctaattcttt cacacgtggt 120
gtttattacc ctgacaaagt tttcagatcc tcagttttac attcaactca ggacttgttc 180
ttacctttct tttccaatgt tacttggttc catgctatac atgtctctgg gaccaatggt 240
actaagaggt ttgataaccc tgtcctacca tttaatgatg gtgtttattt tgcttccact 300
gagaagtcta acataataag aggctggatt tttggtacta ctttagattc gaagacccag 360
tccctactta ttgttaataa cgctactaat gttgttatta aagtctgtga atttcaattt 420
tgtaatgatc catttttggg tgtttattac cacaaaaaca acaaaagttg gatggaaagt 480
gagttcagag tttattctag tgcgaataat tgcacttttg aatatgtctc tcagcctttt 540
cttatggacc ttgaaggaaa acagggtaat ttcaaaaatc ttagggaatt tgtgtttaag 600
aatattgatg gttattttaa aatatattct aagcacacgc ctattaattt agtgcgtgat 660
ctccctcagg gtttttcggc tttagaacca ttggtagatt tgccaatagg tattaacatc 720
actaggtttc aaactttact tgctttacat agaagttatt tgactcctgg tgattcttct 780
tcaggttgga cagctggtgc tgcagcttat tatgtgggtt atcttcaacc taggactttt 840
ctattaaaat ataatgaaaa tggaaccatt acagatgctg tagactgtgc acttgaccct 900
ctctcagaaa caaagtgtac gttgaaatcc ttcactgtag aaaaaggaat ctatcaaact 960
tctaacttta gagtccaacc aacagaatct attgttagat ttcctaatat tacaaacttg 1020
tgcccttttg gtgaagtttt taacgccacc agatttgcat ctgtttatgc ttggaacagg 1080
aagagaatca gcaactgtgt tgctgattat tctgtcctat ataattccgc atcattttcc 1140
acttttaagt gttatggagt gtctcctact aaattaaatg atctctgctt tactaatgtc 1200
tatgcagatt catttgtaat tagaggtgat gaagtcagac aaatcgctcc agggcaaact 1260
ggaaagattg ctgattataa ttataaatta ccagatgatt ttacaggctg cgttatagct 1320
tggaattcta acaatcttga ttctaaggtt ggtggtaatt ataattacct gtatagattg 1380
tttaggaagt ctaatctcaa accttttgag agagatattt caactgaaat ctatcaggcc 1440
ggtagcacac cttgtaatgg tgttgaaggt tttaattgtt actttccttt acaatcatat 1500
ggtttccaac ccactaatgg tgttggttac caaccataca gagtagtagt actttctttt 1560
gaacttctac atgcaccagc aactgtttgt ggacctaaaa agtctactaa tttggttaaa 1620
aacaaatgtg tcaatttcaa cttcaatggt ttaacaggca caggtgttct tactgagtct 1680
aacaaaaagt ttctgccttt ccaacaattt ggcagagaca ttgctgacac tactgatgct 1740
gtccgtgatc cacagacact tgagattctt gacattacac catgttcttt tggtggtgtc 1800
agtgttataa caccaggaac aaatacttct aaccaggttg ctgttcttta tcaggatgtt 1860
aactgcacag aagtccctgt tgctattcat gcagatcaac ttactcctac ttggcgtgtt 1920
tattctacag gttctaatgt ttttcaaaca cgtgcaggct gtttaatagg ggctgaacat 1980
gtcaacaact catatgagtg tgacataccc attggtgcag gtatatgcgc tagttatcag 2040
actcagacta attctcctcg gcgggcacgt agtgtagcta gtcaatccat cattgcctac 2100
actatgtcac ttggtgcaga aaattcagtt gcttactcta ataactctat tgccataccc 2160
acaaatttta ctattagtgt taccacagaa attctaccag tgtctatgac caagacatca 2220
gtagattgta caatgtacat ttgtggtgat tcaactgaat gcagcaatct tttgttgcaa 2280
tatggcagtt tttgtacaca attaaaccgt gctttaactg gaatagctgt tgaacaagac 2340
aaaaacaccc aagaagtttt tgcacaagtc aaacaaattt acaaaacacc accaattaaa 2400
gattttggtg gttttaattt ttcacaaata ttaccagatc catcaaaacc aagcaagagg 2460
tcatttattg aagatctact tttcaacaaa gtgacacttg cagatgctgg cttcatcaaa 2520
caatatggtg attgccttgg tgatattgct gctagagacc tcatttgtgc acaaaagttt 2580
aacggcctta ctgttttgcc acctttgctc acagatgaaa tgattgctca atacacttct 2640
gcactgttag cgggtacaat cacttctggt tggacctttg gtgcaggtgc tgcattacaa 2700
ataccatttg ctatgcaaat ggcttatagg tttaatggta ttggagttac acagaatgtt 2760
ctctatgaga accaaaaatt gattgccaac caatttaata gtgctattgg caaaattcaa 2820
gactcacttt cttccacagc aagtgcactt ggaaaacttc aagatgtggt caaccaaaat 2880
gcacaagctt taaacacgct tgttaaacaa cttagctcca attttggtgc aatttcaagt 2940
gttttaaatg atatcctttc acgtcttgac aaagttgagg ctgaagtgca aattgatagg 3000
ttgatcacag gcagacttca aagtttgcag acatatgtga ctcaacaatt aattagagct 3060
gcagaaatca gagcttctgc taatcttgct gctactaaaa tgtcagagtg tgtacttgga 3120
caatcaaaaa gagttgattt ttgtggaaag ggctatcatc ttatgtcctt ccctcagtca 3180
gcacctcatg gtgtagtctt cttgcatgtg acttatgtcc ctgcacaaga aaagaacttc 3240
acaactgctc ctgccatttg tcatgatgga aaagcacact ttcctcgtga aggtgtcttt 3300
gtttcaaatg gcacacactg gtttgtaaca caaaggaatt tttatgaacc acaaatcatt 3360
actacagaca acacatttgt gtctggtaac tgtgatgttg taataggaat tgtcaacaac 3420
acagtttatg atcctttgca acctgaatta gactcattca aggaggagtt agataaatat 3480
tttaagaatc atacatcacc agatgttgat ttaggtgaca tctctggcat taatgcttca 3540
gttgtaaaca ttcaaaaaga aattgaccgc ctcaatgagg ttgccaagaa tttaaatgaa 3600
tctctcatcg atctccaaga acttggaaag tatgagcagt atataaaatg gccatggtac 3660
atttggctag gttttatagc tggcttgatt gccatagtaa tggtgacaat tatgctttgc 3720
tgtatgacca gttgctgtag ttgtctcaag ggctgttgtt cttgtggatc ctgctgcaaa 3780
tttgatgaag acgactctga gccagtgctc aaaggagtca aattacatta cacataagtc 3840
gac 3843

Claims (14)

1.一种编码2019新型冠状病毒S蛋白的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种含有权利要求1所述多核苷酸的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为pDC316。
4.一种能够表达权利要求1所述多核苷酸的人复制缺陷重组腺病毒。
5.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒来源于AdMax腺病毒系统。
6.权利要求4和5所述重组腺病毒在制备预防2019新型冠状病毒疫苗中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组腺病毒被制备为注射剂、滴鼻剂或喷雾剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组腺病毒被制备为肌肉注射剂。
9.一种制备权利要求4或5所述的重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建含有编码2019新型冠状病毒S蛋白的多核苷酸的穿梭质粒载体；
(2)将步骤(1)所述穿梭质粒载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞；
(3)培养步骤(2)所述宿主细胞；
(4)收获从步骤(3)所述细胞中释放的人复制缺陷重组腺病毒；
(5)对步聚(4)中的重组腺病毒进行扩大培养；
(6)对步聚(5)中的培养产物进行纯化。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述载体为pDC316。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述骨架质粒为pBHGlox_E1,3Cre。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述细胞为HEK293细胞。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述扩大培养方法为悬浮培养。
14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述纯化方法为Source 30Q层析法。
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