CN113930452A

CN113930452A - 基于黑猩猩腺病毒载体的重组载体、腺病毒、2019新型冠状病毒疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN113930452A
Application number: CN202011635166.2A
Authority: CN
Inventors: 高福; 戴连攀; 徐坤; 安亚玲; 韩雨旋; 严景华
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN112760341B; CN113930452B; CN112760341A

Abstract

本发明实施例涉及一种基于黑猩猩腺病毒载体的重组载体、腺病毒、2019新型冠状病毒疫苗及其制备方法，所述重组载体经过线性化包装成重组腺病毒，该重组腺病毒在人群中预存免疫较低，只能在特定的细胞系中可以复制，因此重组腺病毒在感染动物和人后可以表达外源基因，但是在动物和人体内的正常细胞内也没有复制能力，作为疫苗使用十分安全。另外，该重组腺病毒具有表达抗原能力强、可以诱导很强的抗原特异性免疫反应和易于培养生产大规模应用等特点。更重要的是，包含腺病毒的2019新型冠状病毒疫苗对小鼠抵抗新冠病毒感染引起的肺炎起到了较好的保护作用。

Description

基于黑猩猩腺病毒载体的重组载体、腺病毒、2019新型冠状病毒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种基于黑猩猩腺病毒载体的重组载体、腺病毒、2019新型冠状病毒疫苗及其制备方法。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(新冠病毒，2019-nCoV)感染所致，新冠病毒属于冠状病毒科β-冠状病毒属，是有囊膜的正链单链RNA病毒，表面的刺突糖蛋白(S蛋白)负责识别受体和膜融合。新冠病毒在感染过程中，囊膜表面的S蛋白被切割成S1和S2亚基，其中S1亚基的受体结合区(RBD)负责结合病毒受体蛋白ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)，S2亚基负责介导膜融合，因此S蛋白，尤其是其中的RBD是设计新冠病毒疫苗时重要的靶点。

在疫苗的实验研究和临床研究中，人腺病毒和黑猩猩腺病毒载体被作为广泛使用。但是部分腺病毒在人群中有较高的预存免疫，我们试图选择一个在人群中罕见的血清型，即7型黑猩猩腺病毒AdC7。此前有研究报道在中国AdC7的血清阳性率为11.8％，远远低于被广泛使用的人5型腺病毒的74.2％，表明AdC7是作为疫苗载体的一个很好选择。此外重组黑猩猩腺病毒作为疫苗也有表达抗原能力强、可以诱导很强的抗原特异性免疫反应和易于培养生产大规模应用等特点。

Hana Weingartl等和Meagan Bolles等研究者们分别报道了研究的预防SRAS的疫苗免疫动物后，在攻毒实验中疫苗组动物显示出更强的组织炎症反应加重了损伤，疫苗反而带来副作用，由于新冠病毒和SARS病毒同属于β-冠状病毒，S蛋白相似性较高，此种增强炎症反应的现象是在设计新冠疫苗时需要注意加以避免的。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

本发明的目的在于提供一种基于黑猩猩腺病毒载体的重组载体、腺病毒、2019新型冠状病毒疫苗及其制备方法。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种重组载体，所述重组载体包括骨架载体和连接在骨架载体上的包括有目的基因的核酸序列；

所述骨架载体是复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体；

所述目的基因中至少具有选自以下序列的一种：(1)编码新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列或全部氨基酸序列的核酸序列；(2)第(1)部分的核酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸获得的核酸序列，该核酸序列编码的蛋白质具有与第(1)部分所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性。

上述表述中，“目的基因中至少具有选自以下序列的一种”表示至少具有以下序列中的一种，但目的基因可以比以下序列更长。如：编码新型冠状病毒S1蛋白的核酸序列、编码新型冠状病毒全长S蛋白的核酸序列、以及编码2条相互串联的新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列或全部氨基酸序列的核酸序列，他们全都包含编码新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列或全部氨基酸序列的核酸序列。

本发明实施例中哺乳动物野生型和人体野生型细胞是指没有经过任何人工基因改造、蛋白质改造等改造过程的普通哺乳动物来源或人源细胞。

在一种可能的实现方式中，所述复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体在哺乳动物野生型细胞中不能复制或基本不能复制；可选地，所述复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体在人体野生型细胞中不能复制；

和/或，复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体上的7型黑猩猩腺病毒基因组相对于野生型7型黑猩猩腺病毒基因组缺失了与病毒复制有关的基因；

和/或，复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体上的7型黑猩猩腺病毒基因组相对于野生型7型黑猩猩腺病毒基因组缺失了野生型AdC7基因组中第458-3026位的序列和野生型AdC7基因组中第27094-31799的序列，可选地，在第458-3026位的删除区增加I-Ceu I和PI-Sce I酶切位点；进一步可选地，在第27094-31799位的删除区增加Rsr II酶切位点。

本发明实施例中使用的经过改造的7型黑猩猩腺病毒载体相对于野生型7型黑猩猩腺病毒基因组缺失了与病毒复制有关的部分E1和全部E3基因，因而以此制备的重组腺病毒在大多数的细胞系不能复制，只能在特定的细胞系如HEK 293(ATCC CRL-1573)中可以复制。因此重组腺病毒在感染动物和人后可以表达外源基因，但是在动物和人体内的正常细胞内也没有复制能力，作为疫苗使用十分安全。

在一种可能的实现方式中，新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列为新型冠状病毒S蛋白受体结合区全部氨基酸序列的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，该部分氨基酸序列编码的蛋白质具有与全部氨基酸序列所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性。

在一种可能的实现方式中，所述目的基因选自以下的一种或几种：

编码新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列或全部氨基酸序列的核酸序列；

编码新型冠状病毒S1蛋白的核酸序列；

编码新型冠状病毒全长S蛋白的核酸序列；

编码2条相互串联的新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列或全部氨基酸序列的核酸序列，其中：2条相互串联的新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列或全部氨基酸序列按照(A-B)-(A-B)样式或(A-B)-C-(A-B)样式或(A-B)-(A-B’)样式或(A-B)-C-(A-B’)样式排列，其中：A-B表示新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，C表示连接氨基酸序列，A-B’表示A-B中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个、两个或三个氨基酸获得的氨基酸序列，A-B’编码的蛋白质具有与A-B所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性，“基本相同”在本发明中意味着本领域技术人员可接受的误差范围内，如：±90％、±95％。。

编码新型冠状病毒S蛋白受体结合区R319-S530区域、R319-K537区域或R319-F541区域的核酸序列；

编码新型冠状病毒S1蛋白的核酸序列；

编码新型冠状病毒全长S蛋白的核酸序列；

编码2条相互串联的新型冠状病毒S蛋白受体结合区R319-S530区域、编码2条相互串联的新型冠状病毒S蛋白受体结合区R319-K537区域或编码2条相互串联的新型冠状病毒S蛋白受体结合区R319-F541区域的核酸序列。

可选地，所述目的基因为：编码2条相互串联的新型冠状病毒S蛋白受体结合区R319-K537区域的核酸序列。

在一种可能的实现方式中，所述目的基因为：所述目的基因选自以下的一种或几种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7。其中：SEQ ID NO：1是编码新冠病毒全长S蛋白的核酸序列(其编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列)、SEQ ID NO：3是编码新冠病毒S蛋白的S1结构域的核酸序列(其编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列)、SEQ ID NO：5是编码新冠病毒S蛋白的RBD结构域的核酸序列(其编码SEQ ID NO：6的氨基酸序列)，SEQ IDNO：7是编码新冠病毒S蛋白的sc-dimer的核酸序列(其编码SEQ ID NO：8的氨基酸序列)。SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8序列均来源于2019-nCoV的WH01株的S蛋白序列(NCBI上的GenBank：QHR63250)的一部分，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中的RBD为RBD中的R319-K537区域。

在一种可能的实现方式中，所述连接氨基酸序列包括：(GGS)n连接序列，其中n表示GGS的个数，n为≥1的整数；可选地，n为选自1-10的整数；进一步可选地，n为选自1-5的整数。GGS三个字母分别表示氨基酸G、G、S。

在一种可能的实现方式中，所述重组载体还包括位于目的基因上下游的元件序列。

本发明实施例还提供了上述重组载体的制备方法，包括以下步骤：

获得目的基因；将所述目的基因连接至穿梭载体上以获得重组穿梭载体；以连接有目的基因的重组穿梭载体为模板进行PCR扩增出含有基因转录元件的目的基因片段，将该目的基因片段连接至骨架载体复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体上。

本发明实施例还提供了一种7型黑猩猩腺病毒腺病毒，其包括：衣壳蛋白和包装在衣壳蛋白中的上述重组载体。

在一种可能的实现方式中，包装在衣壳蛋白中的上述重组载体是线性化的上述重组载体。

在一种可能的实现方式中，衣壳蛋白为腺病毒AdC7自身的衣壳蛋白。

本发明实施例还提供了上述7型黑猩猩腺病毒的制备方法，其包括以下步骤：将上述重组载体线性化后转染病毒生产细胞进行重组载体的包装。

在一种可能的实现方式中，病毒生产细胞为保藏编号为ATCC CRL-1573的人胚胎肾细胞293。保藏编号为ATCC CRL-1573的人胚胎肾细胞293是一种可商购的经过改造的细胞，通过国家实验细胞资源共享服务平台可以买到(网址http://www.cellresource.cn/)。

在一种可能的实现方式中，还包括对包装好的腺病毒进行纯化的步骤。

本发明实施例还提供了上述重组载体、上述7型黑猩猩腺病毒在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用。

本发明实施例还提供了一种2019新型冠状病毒疫苗，其包括上述7型黑猩猩腺病毒，以及药学上可接受的辅料。

在一种可能的实现方式中，所述2019新型冠状病毒疫苗的制剂形式为喷雾剂、口服剂或注射剂。

在一种可能的实现方式中，使用2019新型冠状病毒疫苗进行两次免疫。

有益效果

本发明实施例中基于作为骨架载体的复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体获得了一种重组载体，该重组载体中的目的基因中至少具有编码新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列或全部氨基酸序列的核酸序列或其类似序列，将所述重组载体经过线性化包装成重组腺病毒，该重组腺病毒在中国人群中预存免疫较低，并且其在大多数的细胞系不能复制，只能在特定的细胞系如HEK 293(ATCC CRL-1573)中可以复制，因此重组腺病毒在感染动物和人后可以表达外源基因，但是在动物和人体内的正常细胞内也没有复制能力，作为疫苗使用十分安全。另外，该重组腺病毒具有表达抗原能力强、可以诱导很强的抗原特异性免疫反应和细胞免疫反应和易于培养生产大规模应用等特点。

更重要的是，包含腺病毒的2019新型冠状病毒疫苗AdC7-sc-dimer对小鼠抵抗新冠病毒感染引起的肺炎起到了较好的保护作用，免疫小鼠血清中的中和抗体滴度与S蛋白结合抗体滴度的比值高、抗体的质量高，同时该疫苗主要刺激了Th1型T细胞反应而非Th2型T细胞反应，更为安全有效。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1为本发明实施例1中设计的四种基于AdC7载体的COVID-19疫苗示意图。

图2为本发明实施例4中ELISA实验检测不同剂量的四种腺病毒疫苗通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠后诱导产生的抗体水平。

图3为本发明实施例5中，新冠病毒假病毒中和实验检测不同剂量的四种腺病毒疫苗通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠诱导产生的中和抗体水平。

图4为本发明实施例6中，新冠病毒假病毒中和实验检测三种腺病毒疫苗通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠诱导产生的中和抗体水平。Prime为小鼠一次免疫后样品，Prime-Boost为小鼠二次免疫后样品。

图5为本发明实施例7中，重组AdC7疫苗通过肌肉免疫BALB/c鼠诱导的抗体质量评价的结果图。Neutralizing:binding ratio为小鼠的假病毒中和抗体滴度与结合新冠病毒胞外段S蛋白的IgG抗体滴度的比值。图5中没有Sham对照组的原因是：纵坐标的数据是用中和抗体滴度值除以结合抗体滴度值(ELISA测出来的)，对照组所有样品均没有检测到中和活性，因此滴度值低于检测限，以这样的滴度值计算抗体质量没有意义，所以此处没有Sham对照组。

图6为本发明实施例8中，通过ELISPOT实验评价三种腺病毒疫苗通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠诱导的细胞免疫反应。SFCs为斑点形成细胞数。

图7为本发明实施例8中，通过胞内细胞因子染色实验检测三种腺病毒疫苗通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠诱导的CD8+T细胞免疫反应。

图8为本发明实施例8中，通过胞内细胞因子染色实验检测三种腺病毒疫苗通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠诱导的CD4+T细胞免疫反应。

图9为本发明实施例9中，hACE2转基因小鼠的免疫和新冠病毒攻毒实验流程示意图。

图10为本发明实施例9中，ELISA实验检测腺病毒疫苗通过肌肉注射免疫hACE2转基因小鼠后诱导产生的抗体水平。

图11为本发明实施例9中，新冠病毒假病毒中和实验检测腺病毒疫苗通过肌肉注射免疫hACE2转基因小鼠后诱导产生的中和抗体水平。

图12为本发明实施例9中，将免疫后的hACE2转基因鼠通过滴鼻方式进行新冠病毒攻毒，感染后第三天解剖小鼠取出肺组织，检测肺组织中的病毒载量。

图13为本发明实施例9中，将hACE2转基因鼠的肺组织经过苏木精伊红染色，检测病理变化。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

实施例1：疫苗设计构思

新冠病毒S蛋白由S1和S2两个亚基组成，其中S1亚基的RBD负责结合病毒受体蛋白ACE2，S2亚基负责介导膜融合，因此S蛋白，尤其是其中的RBD是疫苗设计的重要靶点。发明人前期的研究发现二聚体形式的RBD蛋白可以比单体RBD诱导小鼠产生更高水平的抗体，因此设计了单链二聚体(sc-dimer)形式的新冠病毒RBD蛋白，将表达的蛋白纯化后与铝佐剂或者Addavax佐剂混合免疫小鼠，sc-dimer诱导小鼠产生的抗体水平显著高于RBD单体蛋白(Dai,L.,et al.,A universal design of betacoronavirus vaccines against COVID-19,MERS and SARS,Cell,2020)。

我们选择了四种不同的构建同时进行实验，包括新冠病毒全长S基因(命名为S，SEQ ID NO：1)、S1片段(命名为S1，SEQ ID NO：3)和RBD片段(命名为RBD，SEQ ID NO：5)和单链二聚体RBD(命名为sc-dimer，SEQ ID NO：7)构建疫苗。示意图如图1所示。按照人源密码子优化序列，然后在金唯智公司合成S全长基因和sc-dimer基因，S1基因是以S全长基因为模板经过常规的亚克隆方式得到，RBD单体基因是以sc-dimer基因为模板经过常规的亚克隆方式得到。

实施例2：疫苗制备

本发明实施例中使用的经过改造的7型黑猩猩腺病毒载体pAdC7相对于野生型7型黑猩猩腺病毒基因组缺失了与病毒复制有关的部分E1和全部E3基因，因而以此制备的重组腺病毒在大多数的细胞系不能复制，只能在特定的细胞系如HEK 293(ATCC CRL-1573)中可以繁殖，重组腺病毒在感染动物和人后可以表达外源基因，但是在动物和人体内的正常细胞内也没有复制能力，因此作为疫苗使用十分安全，该载体的改造方法记载在Zhou D,ZhouX,Bian A,et al.An efficient method of directly cloning chimpanzee adenovirusas a vaccine vector.Nat Protoc.2010；5(11):1775-1785.doi:10.1038/nprot.2010.134以及专利文件CN103923943A中，同时专利文件CN103923943A中SEQ ID NO:1中也给出了该载体的全序列，该载体应用酶切位点I-Ceu I和PI-Sce作为外源基因的插入位点，从而不会导致在腺病毒表达载体的其他位置造成剪切。

1、重组腺病毒穿梭载体pshuttle-S和pshuttle-S1的获得：以金唯智公司合成的S全长基因(SEQ ID NO：1)为模板，使PCR过程中所得的S全长基因和S1的多核苷酸序列的5’端加入XbaI酶切位点、Kozak序列(GCCACC)和编码信号肽序列，使所得的S全长基因和S1的多核苷酸序列的3’端加入KpnI酶切位点。信号肽氨基酸序列来源于中东呼吸综合征冠状病毒的S蛋白信号肽序列，使用的信号肽DNA序列是：ATGATCCACTCAGTGTTTCTCTTAATGTTTCTACTAACTCCCACGGAGTCG，信号肽氨基酸序列是：MIHSVFLLMFLLTPTES。通过分子克隆方法将所得多核苷酸序列分别克隆进pshuttle载体，得到质粒pshuttle-S和pshuttle-S1。

重组腺病毒穿梭载体pshuttle-sc-dimer和pshuttle-RBD的获得：以金唯智公司合成的sc-dimer基因(SEQ ID NO：7)为模板，使PCR过程中所得的sc-dimer基因和编码RBD的多核苷酸序列的5’端加入XbaI酶切位点、Kozak序列(GCCACC)和编码信号肽序列，使所得的sc-dimer基因和编码RBD的多核苷酸序列的3’端加入KpnI酶切位点。通过分子克隆方法将所得多核苷酸序列分别克隆进pshuttle载体，得到质粒pshuttle-sc-dimer和pshuttle-RBD。

2、重组腺病毒质粒的获得：将经过改造的7型黑猩猩腺病毒载体pAdC7载体经PI-SceI和I-CeuI双酶切，得到带有粘性末端的线性载体，56度加热20分钟把内切酶灭活。

以质粒pshuttle-S，pshuttle-S1，pshuttle-RBD和pshuttle-sc-dimer为模板，进行PCR，引物序列如下：

正向引物序列是：GTATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAA(SEQ ID NO:9)；

反向引物序列是：TCATTACCTCTTTCTCCGCACCCGACATAG(SEQ ID NO:10)。

通过PCR扩增出目的基因片段和两侧的非编码序列(即含有与基因转录相关的元件序列的目的基因片段)，基因3’端和5’端含有与基因转录相关的元件序列，包括增强子、启动子和终止子，将4种含有与基因转录相关的元件序列的目的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳和回收纯化。然后将目的基因片段分别与带有粘性末端的pAdC7线性载体混合，使用

HD Cloning Kit进行重组反应。转化Stbl2感受态细胞，鉴定阳性克隆，然后提质粒，得到质粒pAdC7-S(通过I-CeuI和PI-SceI酶切位点重组到pAdC7载体的、含有转录元件的新冠病毒全长S目的基因序列如SEQ ID NO:13)，pAdC7-S1(通过I-CeuI和PI-SceI酶切位点重组到pAdC7载体的、含有转录元件的新冠病毒S1目的基因序列如SEQ ID NO:14)，pAdC7-RBD(通过I-CeuI和PI-SceI酶切位点重组到pAdC7载体的、含有转录元件的新冠病毒RBD的基因序列如SEQ ID NO:15)和pAdC7-sc-dimer(通过I-CeuI和PI-SceI酶切位点插入到pAdC7载体的、含有转录元件的新冠病毒sc-dimer目的基因序列如SEQ ID NO:16)。

3、重组腺病毒质粒的包装：将4种重组腺病毒质粒pAdC7-S，pAdC7-S1，pAdC7-RBD和pAdC7-sc-dimer使用PacI酶酶切，形成线性化的DNA，将其转染HEK 293细胞(ATCC CRL-1573)，10天左右可以见到空斑，说明已经包装出了重组腺病毒。

4、重组腺病毒质粒的培养：收集腺病毒后保存在-80度冰箱，之后再在室温融化，反复冻融3次，促进细胞破裂，释放腺病毒。接着再感染HEK 293细胞(ATCC CRL-1573)，1盘细胞收集的腺病毒可以感染20盘细胞，按此比例扩大培养，最后收集40个15cm盘的细胞用于纯化。

5、重组腺病毒质粒的纯化：将收集的重组腺病毒从-80度冰箱取出融化，5000rpm离心20分钟，沉淀细胞碎片，取出上清使用40μm筛网过滤，留取上清。使用氯化铯密度梯度离心，设置Beckman离心机转子为SW 41，温度为4度，转速为25000rpm，时间为2.5小时。在密度梯度离心条件下，腺病毒会形成白色条带，吸取该条带处的液体，接着进行脱盐实验，去掉溶液中的氯化铯。用Nanodrop检测OD 260，计算vp值(使用OD260数值乘以1.1x10¹²)，得到的数值单位是vp/ml。

得到纯化后的重组腺病毒AdC7-S，AdC7-S1，AdC7-RBD和AdC7-sc-dimer，包装得到的腺病毒的衣壳蛋白还是腺病毒AdC7自身的衣壳蛋白，之后提取重组腺病毒DNA，PCR抗原序列，引物序列如下：

正向引物序列是：AGAACCCACTGCTTACTGGC(SEQ ID NO:11)；

反向引物序列是：GAGGGGCAAACAACAGATGG(SEQ ID NO:12)。

并将PCR产物测序，确定抗原基因稳定存在于重组腺病毒基因组中。

实施例3：抗COVID-19的重组腺病毒疫苗免疫BALB/c鼠

纯化后的重组腺病毒保存在-80冰箱，使用时取出融化，使用PBS溶液稀释至需要的浓度，然后就可以直接作为疫苗免疫小鼠(以下腺病毒疫苗即采用此方法获得)。当然，在工业化生产时，腺病毒疫苗还可以使用其他药学上可接受的辅料。

将这四种腺病毒疫苗通过肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠，同时每种疫苗分为3个不同的剂量组，分别是1x10¹¹vp、1x10⁹vp和1x10⁷vp，免疫PBS作为阴性对照，小鼠分组见表1。

表1评价疫苗刺激BALB/c小鼠的抗体反应实验分组

所有小鼠在免疫后28天后取血分离血清，用于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中的特异性抗体滴度，新冠病毒假病毒微量中和实验检测中和抗体滴度。第32天再次免疫相同剂量的疫苗，二次免疫后第14天采集二免后血液分离血清，用于ELISA检测特异性抗体滴度和假病毒中和抗体滴度。

实施例4：ELISA检测疫苗诱导BALB/c鼠产生的抗原特异性抗体滴度

ELISA实验方法为：

(1)将新冠病毒的RBD单体蛋白用ELISA包被液(索莱宝,C1050)稀释至3μg/ml，96孔ELISA板(Coring，3590)每孔加入100μl，4℃放置12小时。

(2)倒掉包被液，加入PBS，洗一遍。使用PBS配置的5％脱脂牛奶作为封闭液，加入96孔板中，每孔100μl，封闭，室温放置1小时。封闭完后用PBS溶液洗一遍。

(3)封闭期间稀释小鼠血清。血清样品也用封闭液稀释。血清样品从20倍起始按照3倍梯度依次稀释。稀释完之后在ELISA板中每孔加入100μl，阴性对照为加入封闭液，37度孵育2小时，之后使用PBST洗4遍。

(4)加入使用封闭液1:2000稀释的偶联HRP的羊抗鼠二抗(Abcam，ab6789)，37℃孵育1.5小时，之后PBST洗5-6遍。加入60μl TMB显色液显色，反应适当时间后加入60μl 2M盐酸终止反应，在酶标仪上检测OD450读值。抗体滴度值被定义为反应值大于2.5倍阴性对照值的血清最高稀释倍数。当最低稀释倍数(检测限)的反应值仍小于2.5倍背景值时，该样品的滴度定义为最低稀释倍数的一半即1:10。

将实施例3中的一次免疫后的血清和二次免疫后的血清使用ELISA实验，检测血清中的抗原特异性抗体滴度，结果如图2所示，其中AdC7-S，AdC7-RBD和AdC7-sc-dimer可以诱导相对较高的抗体水平。对于AdC7-S，AdC7-RBD和AdC7-sc-dimer疫苗不同剂量免疫小鼠，1x10¹¹vp、1x10⁹vp和1x10⁷vp剂量诱导小鼠产生的抗体水平均值依次降低，说明AdC7-S，AdC7-RBD和AdC7-sc-dimer疫苗免疫小鼠1x10¹¹vp效果较好。

实施例5：新冠病毒假病毒中和实验检测疫苗诱导BALB/c鼠产生的中和抗体滴度

新冠病毒假病毒中和实验方法为：

将小鼠血清在96孔板中倍比稀释，10倍稀释起始，2倍梯度，每个孔含有血清50μL，空白对照组为50μL细胞培养基。然后将血清与100TCID50新冠病毒假病毒(新冠病毒假病毒的制备方法见论文Establishment and validation of a pseudovirus neutralizationassay for SARS-CoV-2(PMID:32207377)，与论文中记录的方法相同。)混合，37℃共孵育1小时。将混合液加入到已铺满Huh7细胞的96孔板中。24小时后，弃掉培养液，PBS洗涤细胞2次，加入细胞裂解液，检测荧光素酶活性值。假病毒表面带有刺突蛋白，假病毒感染细胞释放DNA，表达荧光素酶，但不复制。如果有中和抗体存在的情况下，假病毒就无法感染细胞，则不表达荧光素酶。以此方法来检验血清的中和滴度。中和滴度定义为与空白对照组相比，样品组能够将荧光强度降低90％所需的最高血清稀释倍数，即NT₉₀，如果血清在最小稀释倍数相应的反应仍无法将荧光强度降低到空白对照组的10％以内，则将该样品的中和抗体滴度值定义为最小稀释倍数的二分之一。

将实施例3中的一次免疫后的血清和二次免疫后的血清使用新冠病毒假病毒中和实验进行检测，结果如图3所示，AdC7-S，AdC7-RBD和AdC7-sc-dimer疫苗可以诱导小鼠产生一定水平的中和抗体，这三个疫苗的1x10¹¹vp剂量免疫小鼠后诱导的中和抗体滴度均大于1x10⁹vp和1x10⁷vp剂量。其中1x10¹¹vp的AdC7-sc-dimer疫苗免疫小鼠第二次后，中和抗体滴度有显著提高(图3)。

实施例6：重复BALB/c小鼠免疫实验评价抗体反应

为了进一步确定疫苗的免疫原性，我们挑选了实施例3中BALB/c小鼠免疫实验的部分分组进行了一次重复实验，阴性对照组为免疫不表达外源基因的空载AdC7(AdC7-empty，Sham组)，小鼠分组如下：

表2评价疫苗免疫BALB/c小鼠的抗体反应实验分组

将小鼠通过肌肉注射方式免疫相应的疫苗，以第一次免疫的时间作为第0天。第21天采集初次免疫(Prime)后的血液，分离血清。第28天进行第二次免疫(Boost)。第42天采集第二次免疫后后的血液，分离血清。

通过如实施例5中所述的假病毒中和实验检测小鼠血清的中和抗体滴度，结果分别如图4所示，三种疫苗可以诱导小鼠产生一定滴度的中和抗体(图4)，一免后血清和二免后血清中和抗体滴度平均值最高的是AdC7-sc-dimer，且与AdC7-S和AdC7-RBD两组都具有显著性差异(图4)。实施例3的小鼠实验结果和本实施例小鼠实验结果都证明了这三种疫苗可以诱导小鼠的体液免疫反应，在二次免疫后，中和抗体滴度均值最高的是AdC7-sc-dimer组。

实施例7：评价三种重组AdC7疫苗通过肌肉注射免疫BALB/c鼠的诱导的抗体质量

新冠病毒S蛋白由S1亚基和S2亚基组成，S1中的RBD介导受体识别，S2主要负责膜融合，新冠病毒感染人后大多数诱导产生的中和抗体都是结合RBD，中和抗体在抑制病毒和免疫保护中起到了关键作用。因此，在疫苗免疫后所诱导产生的中和抗体占所有诱导产生的抗原特异性抗体的比例反映了抗体质量，因此，我们使用肌肉注射免疫小鼠后的血清中和抗体滴度与结合新冠病毒胞外段S蛋白的IgG抗体滴度的比值来比较不同疫苗的抗体质量，该比值越高，说明中和抗体在S蛋白结合抗体中的比例越高，抗体的质量也就越高。

在实施例6中设计的小鼠实验，将采集的二次免疫后的血清通过ELISA实验检测血清中的结合胞外段S蛋白(检测方法与实施例4相同，只是用胞外段S蛋白替换新冠病毒的RBD单体蛋白，该胞外段S蛋白购自北京义翘神州，货号40589-V08B1)的IgG抗体滴度，然后计算假病毒中和抗体滴度与结合胞外段S蛋白IgG抗体滴度的比值，结果如图5所示，AdC7-sc-dimer疫苗诱导小鼠产生的抗体质量显著高于AdC7-S，说明了AdC7-sc-dimer是一个较好的新冠肺炎候选疫苗。

实施例8：ELISPOT实验和胞内细胞因子检测实验评价疫苗免疫BALB/c小鼠诱导的细胞免疫反应

根据文献报道，新冠病毒感染后会刺激细胞免疫反应，可以起到抗病毒作用(Notjust antibodies:B cells and T cells mediate immunity to COVID-19，PMID:32839569；SARS-CoV-2-reactive T cells in healthy donors and patients withCOVID-19，PMID:32726801)。为了评价疫苗诱导BALB/c小鼠产生的细胞免疫反应，将实施例6中的小鼠在第42天采血完毕后，进行安乐死，然后取出脾，研磨成单细胞，分别使用酶联免疫斑点检测实验(ELISPOT)和胞内细胞因子检测实验(ICS)评价疫苗诱导的细胞免疫反应。

ELISPOT实验方法如下：

(1)96孔ELISPOT板中包被100μL的10μg/ml anti-mouse IFN-γAb(BDBiosciences,USA)，在4℃孵育过夜。

(2)第二天弃去液体，加入含有10％FBS的1640培养基在室温封闭2小时。

(3)将小鼠脾淋巴细胞加入ELISPOT板中，然后加入新冠病毒S蛋白的多肽库，该多肽库使用了在线网站(https://www.hiv.lanl.gov/cgi-bin/PEPTGEN/PeptGen.cgi)，输入新冠病毒(病毒株GenBank号为NC_045512.2)S蛋白全长氨基酸序列，设置多肽长度为15-18个氨基酸，相邻肽段间重叠11个氨基酸，并避免C端出现G,P,S,T,C,D,Q,N,E这几种氨基酸，进行分析得到多肽序列并合成，将多肽用DMSO溶解后等比例混合在一起，每条多肽的工作浓度是2μg/ml，在细胞培养箱中培养24小时。

(4)检测的步骤完全按照BD公司提供的ELISPOT Set试剂盒说明书操作。

实验结果如图6所示，AdC7-S，AdC7-RBD和AdC7-sc-dimer组与Sham对照组结果均有显著性差异，表明三种腺病毒疫苗都可以诱导小鼠产生细胞免疫反应。

ICS实验方法如下：

(1)在培养细胞的96孔板中加入小鼠脾淋巴细胞，然后加入新冠病毒S蛋白的多肽库(多肽库同上)，多肽的工作浓度是2μg/ml。

(2)刺激5小时后，加入GolgiStop后接着在细胞培养箱中培养。

(3)6小时后，离心收集细胞，进行抗体染色，其中操作步骤完全按照BD公司Cytofix/Cytoperm^TMFixation/Permeabilization Kit说明书操作。之后在BD FACSAria^TM流式细胞仪上检测细胞荧光。

实验结果如图7和图8所示，AdC7-S，AdC7-RBD和AdC7-sc-dimer组多肽刺激小鼠脾淋巴细胞产生IFN的CD8+T细胞比例与Sham对照组均有显著性差异(图7)，AdC7-S，AdC7-RBD和AdC7-sc-dimer组多肽刺激小鼠脾淋巴细胞产生TNF的CD8+T细胞比例与Sham对照组均有显著性差异(图7)。说明了AdC7-S，AdC7-RBD和AdC7-sc-dimer可以刺激小鼠的T细胞免疫反应。此外，AdC7-S，AdC7-RBD和AdC7-sc-dimer疫苗组的CD4+IL-4+T细胞和CD4+IL-10+T细胞比例与Sham对照组均没有显著性差异(图8)。根据对非典型肺炎的研究报道，轻度的患者通常伴随着Th1细胞反应的激活，而疫苗诱导的Th2型的反应会可能会在随后的感染中增强肺部疾病，因此新冠疫苗在设计中应尽可能诱导Th1型细胞反应。IFN、TNF、IL-2代表Th1反应(其中IFN是最重要的考虑指标)，IL-4、IL-10代表Th2反应(其中IL-4是最重要的考虑指标)。AdC7-S，AdC7-RBD和AdC7-sc-dimer疫苗组的IL-4+T细胞及IL-10+T细胞比例与Sham对照组均没有显著性差异(图8)，综合以上结果证明了AdC7-S，AdC7-RBD和AdC7-sc-dimer疫苗主要刺激了Th1型T细胞反应。

实施例9：使用hACE2转基因鼠评价AdC7-sc-dimer的保护效果

根据文献报导(Sun,S.-H.,et al.,A mouse model of SARS-CoV-2 infectionand pathogenesis,Cell Host and Microbe,2020)，转入人ACE2基因的小鼠可以做新冠病毒的感染模型，因此我们进一步使用ICR背景的hACE2转基因小鼠进行免疫和攻毒实验评价疫苗保护效果，小鼠从北京华阜康生物科技股份有限公司购买，由于小鼠数量十分有限，我们仅能从四种新冠病毒腺病毒疫苗中选择部分进行实验，由于在免疫BALB/c小鼠后，1x10¹¹vp的AdC7-sc-dimer疫苗诱导小鼠产生的抗体水平均值最高，且AdC7-sc-dimer疫苗抗原基因仅含有新冠病毒S基因的RBD区域，可以实现免疫聚焦，因此我们优先选择了AdC7-sc-dimer疫苗进行hACE2转基因鼠的免疫和攻毒实验。

小鼠分组见表3，小鼠的实验流程如图9所示，在第0天和第32天各免疫小鼠一次，在第28天和46天分别收集小鼠一次免疫后和二次免疫后的血清，用于抗体检测。在第58天进行新冠病毒的攻毒实验，攻毒前将每只小鼠称重，然后把小鼠使用三溴乙醇麻醉，通过滴鼻的方式感染新冠病毒5x10⁵TCID₅₀，之后每天监测体重变化。在病毒感染后的第三天解剖小鼠，取出肺组织，剪下部分肺泡在4％多聚甲醛中固定，之后用于切片和苏木精伊红染色，观察病理变化及炎症反应等。剩余的肺放置于管子中称重，然后研磨，提RNA，使用qRT-PCR方法检测肺组织中的病毒载量。

表3hACE2转基因鼠的免疫攻毒实验分组

实验的结果如下：

(1)通过ELISA实验检测，AdC7-sc-dimer免疫hACE2转基因鼠诱导了强烈的的抗体反应，IgG抗体滴度均值超过了10⁵(图10)。

(2)通过新冠病毒假病毒中和实验发现，AdC7-sc-dimer免疫可以诱导hACE2转基因鼠产生较高滴度的中和抗体，二次免疫后中和抗体滴度均值已经超过1000(图11)。

(3)将免疫后的小鼠进行新冠病毒攻毒，攻毒后的第三天取出肺组织，使用生科原的Novel coronavirus(2019-nCoV)Detection Kit通过qRT-PCR实验检测病毒载量，发现AdC7-sc-dimer组小鼠的肺组织病毒载量均值比对照组降低100倍左右，具有显著性差异(图12)，说明腺病毒疫苗AdC7-sc-dimer具有较好的保护效果。

(4)将小鼠肺组织切片后苏木精伊红染色，观察病理变化，如图13所示，PBS对照组的三只鼠均呈现不同程度的肺炎，症状包括验证细胞浸润、支气管壁细胞脱落和肺泡间隔增厚等，对照组三只小鼠的肺炎症状程度均是严重/中等。而免疫组小鼠出现了更轻的症状，3只小鼠程度分别是轻症、中等/轻症和轻症，说明了AdC7-sc-dimer疫苗对小鼠抵抗新冠病毒感染引起的肺炎起到了较好的保护作用。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 基于黑猩猩腺病毒载体的重组载体、腺病毒、2019新型冠状病毒疫苗及其制

备方法

<130> 1087-200512F

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3774

<212> DNA

<213> 2019-nCoV

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3774)

<223> 编码新冠病毒全长S蛋白的核酸序列

<400> 1

gtgaacctga ccacacggac ccagctccct cccgcctaca caaactcttt cacccggggc 60

gtgtactacc ccgacaaggt gttccggtct agcgtgctcc actctacaca ggacctgttc 120

ctccctttct tcagcaacgt gacatggttc cacgccatcc acgtgtctgg cacaaacggc 180

acaaagcggt tcgacaaccc cgtgctccct ttcaacgacg gcgtgtactt cgccagcacc 240

gagaagtcta acattatccg gggctggatt ttcggcacca cactcgactc taagacacag 300

tccctcctga ttgtgaacaa cgccacaaac gtggtgatta aggtgtgcga gttccagttc 360

tgcaacgacc ctttcctggg cgtgtactac cacaagaaca acaagtcttg gatggagtct 420

gagttcagag tgtactctag cgccaacaac tgcaccttcg agtacgtgtc ccagcctttc 480

ctcatggacc tggagggcaa gcagggcaac ttcaagaacc tgagagagtt cgtgttcaag 540

aacattgacg gctacttcaa gatttactct aagcacaccc caattaacct cgtgagggac 600

ctccctcagg gcttctccgc cttagaacca ctggtggacc tccctattgg cattaacatc 660

acacgcttcc agacactgct cgccctccac cggtcttacc tgaccccagg cgactctagc 720

tctggctgga cagccggcgc cgccgcctac tacgtgggct acctgcagcc taggaccttc 780

ctcctgaagt acaacgagaa cggcacaatt accgacgccg tggactgcgc cctggaccca 840

ctgtccgaga caaagtgcac actgaagtcc ttcacagtgg agaagggcat ttaccagaca 900

tctaacttcc gggtgcagcc tacagagtct attgtgcggt tcccaaacat cacaaacctg 960

tgccctttcg gcgaggtgtt caacgccacc cggttcgcct ctgtgtacgc ctggaaccgg 1020

aagcggatct ctaactgcgt ggccgactac tccgtgctgt acaactccgc ctctttctct 1080

acattcaagt gctacggcgt gtcccctaca aagctgaacg acctgtgctt caccaacgtg 1140

tacgccgact ctttcgtgat tagaggcgac gaggtgaggc agattgcccc cggccagaca 1200

ggcaagatcg ccgactacaa ctacaagctg cccgacgact tcacaggctg cgtgatcgcc 1260

tggaactcta acaacctgga ctctaaggtg ggcggcaact acaactacct gtacagactg 1320

ttccggaagt ctaacctgaa gccattcgag agggacatta gcaccgagat ttaccaggcc 1380

ggctctaccc catgcaacgg cgtggagggc ttcaactgct acttcccact gcagtcctac 1440

ggcttccagc ctacaaacgg cgtgggctac cagccttacc gggtggtggt gctgtctttc 1500

gagctgctcc acgcccccgc cacagtgtgc ggcccaaaga agagcacaaa cctcgtgaag 1560

aacaagtgcg tgaacttcaa cttcaacggc ctcacaggca caggcgtgct caccgagtct 1620

aacaagaagt tcctcccttt ccagcagttc ggccgcgaca ttgccgacac caccgacgcc 1680

gtgcgggacc ctcagacact ggaaattctc gacatcaccc cttgcagctt cggcggcgtg 1740

tccgtgatca ccccaggcac aaacacatct aaccaggtgg ccgtgctgta ccaggacgtg 1800

aactgcaccg aggtgccagt ggccatccac gccgaccagc tcaccccaac atggagggtg 1860

tacagcacag gctctaacgt gttccagacc cgggccggct gcctcattgg cgccgagcac 1920

gtgaacaact cttacgagtg cgacatccct attggcgccg gcatttgcgc ctcttaccag 1980

acccagacaa actctccacg gagagcccgg tctgtggcct ctcagagcat tattgcctac 2040

accatgtctc tgggcgccga gaactctgtg gcctactcta acaactctat tgccatccct 2100

acaaacttca caatttctgt gaccaccgag attctcccag tgtctatgac caagacatct 2160

gtggactgca ccatgtacat ttgcggcgac tccaccgagt gctctaacct cctgctccag 2220

tacggctctt tctgcaccca gctcaaccgc gccctgacag gcatcgccgt ggagcaggac 2280

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gacttcggcg gcttcaactt ctctcagatt ctccccgacc catccaagcc tagcaagcgg 2400

tccttcattg aggacctcct gttcaacaag gtgacactgg ccgacgccgg cttcattaag 2460

cagtacggcg actgcctggg cgacattgcc gcccgggacc tgatttgcgc ccagaagttc 2520

aacggcctca cagtgctccc cccactgctc accgacgaga tgattgccca gtacacatct 2580

gccctcctgg ccggcacaat tacatctggc tggaccttcg gcgccggcgc cgccctgcag 2640

atccctttcg ccatgcagat ggcctaccgc ttcaacggca tcggcgtgac acagaacgtg 2700

ctgtacgaga accagaagct gatcgccaac cagttcaaca gcgccattgg caagattcag 2760

gactctctga gcagcacagc cagcgccctg ggcaagctgc aggacgtggt gaaccagaac 2820

gcccaggccc tgaacacact ggtgaagcag ctgtcttcta acttcggcgc catttctagc 2880

gtgctgaacg acattctgtc gcggctggac aaggtggagg ccgaggtgca gattgacagg 2940

ctcatcacag gcagactgca gtctctgcag acatacgtga cccagcagct gattagagcc 3000

gccgagatta gagcctccgc caacctggcc gccaccaaga tgagcgagtg cgtgctcggc 3060

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gtgtctaacg gcacccactg gttcgtgacc cagcggaact tctacgagcc tcagattatt 3300

accacagaca acacattcgt gagcggcaac tgcgacgtgg tgattggcat tgtgaacaac 3360

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ttcgacgagg acgactctga gcccgtgctg aagggcgtga agctccacta cacc 3774

<210> 2

<211> 1258

<212> PRT

<213> 2019-nCoV

<400> 2

Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser

1 5 10 15

Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val

20 25 30

Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr

35 40 45

Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe

50 55 60

Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr

65 70 75 80

Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp

85 90 95

Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val

100 105 110

Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val

115 120 125

Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe

145 150 155 160

Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu

165 170 175

Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu

195 200 205

Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln

210 215 220

Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser

225 230 235 240

Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln

245 250 255

Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp

260 265 270

Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu

275 280 285

Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg

290 295 300

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

305 310 315 320

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

325 330 335

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

340 345 350

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

355 360 365

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

370 375 380

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

385 390 395 400

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

405 410 415

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

420 425 430

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

435 440 445

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

450 455 460

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

465 470 475 480

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

485 490 495

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

500 505 510

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe

515 520 525

Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe

530 535 540

Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala

545 550 555 560

Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser

565 570 575

Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln

580 585 590

Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala

595 600 605

Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly

610 615 620

Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His

625 630 635 640

Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys

645 650 655

Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val

660 665 670

Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn

675 680 685

Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr

690 695 700

Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser

705 710 715 720

Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn

725 730 735

Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu

740 745 750

Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala

755 760 765

Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly

770 775 780

Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg

785 790 795 800

Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala

805 810 815

Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg

820 825 830

Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro

835 840 845

Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala

850 855 860

Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln

865 870 875 880

Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val

885 890 895

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900 905 910

Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser

915 920 925

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Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser

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Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val

965 970 975

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980 985 990

Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

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Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

1010 1015 1020

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro

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Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

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Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

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Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1070 1075 1080

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1085 1090 1095

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

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Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

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Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

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Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

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Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1175 1180 1185

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu

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Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met

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<210> 3

<211> 2010

<212> DNA

<213> 2019-nCoV

<220>

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<222> (1)..(2010)

<223> 编码新冠病毒S蛋白的S1结构域的核酸序列

<400> 3

gtgaacctga ccacacggac ccagctccct cccgcctaca caaactcttt cacccggggc 60

gtgtactacc ccgacaaggt gttccggtct agcgtgctcc actctacaca ggacctgttc 120

ctccctttct tcagcaacgt gacatggttc cacgccatcc acgtgtctgg cacaaacggc 180

acaaagcggt tcgacaaccc cgtgctccct ttcaacgacg gcgtgtactt cgccagcacc 240

gagaagtcta acattatccg gggctggatt ttcggcacca cactcgactc taagacacag 300

tccctcctga ttgtgaacaa cgccacaaac gtggtgatta aggtgtgcga gttccagttc 360

tgcaacgacc ctttcctggg cgtgtactac cacaagaaca acaagtcttg gatggagtct 420

gagttcagag tgtactctag cgccaacaac tgcaccttcg agtacgtgtc ccagcctttc 480

ctcatggacc tggagggcaa gcagggcaac ttcaagaacc tgagagagtt cgtgttcaag 540

aacattgacg gctacttcaa gatttactct aagcacaccc caattaacct cgtgagggac 600

ctccctcagg gcttctccgc cttagaacca ctggtggacc tccctattgg cattaacatc 660

acacgcttcc agacactgct cgccctccac cggtcttacc tgaccccagg cgactctagc 720

tctggctgga cagccggcgc cgccgcctac tacgtgggct acctgcagcc taggaccttc 780

ctcctgaagt acaacgagaa cggcacaatt accgacgccg tggactgcgc cctggaccca 840

ctgtccgaga caaagtgcac actgaagtcc ttcacagtgg agaagggcat ttaccagaca 900

tctaacttcc gggtgcagcc tacagagtct attgtgcggt tcccaaacat cacaaacctg 960

tgccctttcg gcgaggtgtt caacgccacc cggttcgcct ctgtgtacgc ctggaaccgg 1020

aagcggatct ctaactgcgt ggccgactac tccgtgctgt acaactccgc ctctttctct 1080

acattcaagt gctacggcgt gtcccctaca aagctgaacg acctgtgctt caccaacgtg 1140

tacgccgact ctttcgtgat tagaggcgac gaggtgaggc agattgcccc cggccagaca 1200

ggcaagatcg ccgactacaa ctacaagctg cccgacgact tcacaggctg cgtgatcgcc 1260

tggaactcta acaacctgga ctctaaggtg ggcggcaact acaactacct gtacagactg 1320

ttccggaagt ctaacctgaa gccattcgag agggacatta gcaccgagat ttaccaggcc 1380

ggctctaccc catgcaacgg cgtggagggc ttcaactgct acttcccact gcagtcctac 1440

ggcttccagc ctacaaacgg cgtgggctac cagccttacc gggtggtggt gctgtctttc 1500

gagctgctcc acgcccccgc cacagtgtgc ggcccaaaga agagcacaaa cctcgtgaag 1560

aacaagtgcg tgaacttcaa cttcaacggc ctcacaggca caggcgtgct caccgagtct 1620

aacaagaagt tcctcccttt ccagcagttc ggccgcgaca ttgccgacac caccgacgcc 1680

gtgcgggacc ctcagacact ggaaattctc gacatcaccc cttgcagctt cggcggcgtg 1740

tccgtgatca ccccaggcac aaacacatct aaccaggtgg ccgtgctgta ccaggacgtg 1800

aactgcaccg aggtgccagt ggccatccac gccgaccagc tcaccccaac atggagggtg 1860

tacagcacag gctctaacgt gttccagacc cgggccggct gcctcattgg cgccgagcac 1920

gtgaacaact cttacgagtg cgacatccct attggcgccg gcatttgcgc ctcttaccag 1980

acccagacaa actctccacg gagagcccgg 2010

<210> 4

<211> 670

<212> PRT

<213> 2019-nCoV

<400> 4

Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser

1 5 10 15

Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val

20 25 30

Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr

35 40 45

Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe

50 55 60

Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr

65 70 75 80

Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp

85 90 95

Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val

100 105 110

Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val

115 120 125

Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe

145 150 155 160

Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu

165 170 175

Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu

195 200 205

Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln

210 215 220

Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser

225 230 235 240

Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln

245 250 255

Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp

260 265 270

Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu

275 280 285

Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg

290 295 300

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

305 310 315 320

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

325 330 335

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

340 345 350

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

355 360 365

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

370 375 380

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

385 390 395 400

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

405 410 415

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

420 425 430

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

435 440 445

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

450 455 460

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

465 470 475 480

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

485 490 495

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

500 505 510

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe

515 520 525

Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe

530 535 540

Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala

545 550 555 560

Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser

565 570 575

Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln

580 585 590

Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala

595 600 605

Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly

610 615 620

Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His

625 630 635 640

Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys

645 650 655

Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg

660 665 670

<210> 5

<211> 657

<212> DNA

<213> 2019-nCoV

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(657)

<223> 编码新冠病毒S蛋白的RBD R319-K537的核酸序列

<400> 5

cgagtgcagc ctaccgaaag catcgtccgt ttcccgaata ttactaatct ctgtccattc 60

ggagaagtct tcaatgccac ccgattcgct tccgtttacg cgtggaaccg taaacgaata 120

tctaattgtg ttgcggacta ttccgtgttg tacaactcag catcattctc tacttttaaa 180

tgctatggag tgtcgccgac taaactcaac gacttgtgtt tcactaatgt ttatgctgac 240

tctttcgtta ttcgtggaga cgaagttcgt caaatcgcac cagggcaaac tggcaagatt 300

gcggactata attataagct gccagatgac tttaccggat gtgtaatagc ctggaactca 360

aataatctcg acagtaaagt gggaggcaac tataattatc tttatcgact cttcagaaag 420

tctaacctta agccatttga acgtgacatt tctacagaaa tttaccaagc cggctctaca 480

ccttgcaatg gcgtggaagg gtttaactgt tatttcccat tacagtctta tggtttccag 540

ccaactaatg gtgtgggata ccaaccttac cgcgtcgttg tcctgtcgtt tgaattgctt 600

cacgcaccag ccaccgtttg tgggccaaag aagagcacta atctcgtaaa gaataaa 657

<210> 6

<211> 219

<212> PRT

<213> 2019-nCoV

<400> 6

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys

210 215

<210> 7

<211> 1314

<212> DNA

<213> 2019-nCoV

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1314)

<223> 编码2个新冠病毒S蛋白 R319-K537的sc-dimer的核酸序列

<400> 7

cgagtgcagc ctaccgaaag catcgtccgt ttcccgaata ttactaatct ctgtccattc 60

ggagaagtct tcaatgccac ccgattcgct tccgtttacg cgtggaaccg taaacgaata 120

tctaattgtg ttgcggacta ttccgtgttg tacaactcag catcattctc tacttttaaa 180

tgctatggag tgtcgccgac taaactcaac gacttgtgtt tcactaatgt ttatgctgac 240

tctttcgtta ttcgtggaga cgaagttcgt caaatcgcac cagggcaaac tggcaagatt 300

gcggactata attataagct gccagatgac tttaccggat gtgtaatagc ctggaactca 360

aataatctcg acagtaaagt gggaggcaac tataattatc tttatcgact cttcagaaag 420

tctaacctta agccatttga acgtgacatt tctacagaaa tttaccaagc cggctctaca 480

ccttgcaatg gcgtggaagg gtttaactgt tatttcccat tacagtctta tggtttccag 540

ccaactaatg gtgtgggata ccaaccttac cgcgtcgttg tcctgtcgtt tgaattgctt 600

cacgcaccag ccaccgtttg tgggccaaag aagagcacta atctcgtaaa gaataaacgt 660

gttcagccta ctgaatcgat cgtgaggttc ccaaatatta ccaatctgtg tccgttcgga 720

gaggtcttca atgcgactcg attcgcgtct gtttacgcct ggaacaggaa acggattagc 780

aattgtgtcg ctgactattc ggtcttatac aactctgcat cattctcaac cttcaagtgt 840

tatggtgtca gccctacaaa gctgaatgac ttatgtttca ccaatgttta tgcggacagt 900

ttcgtaatac gaggtgatga agtccgccaa attgcacccg gacaaaccgg caagatagcc 960

gactataatt ataagctccc tgatgacttt acgggctgtg tcatagcttg gaatagtaat 1020

aatttggact cgaaagtggg aggtaattat aattatctct atagactgtt ccggaaatca 1080

aatctcaagc cctttgaacg ggacataagt acagaaatct accaagctgg ttccacgccg 1140

tgtaatggag tcgaggggtt taactgttat ttcccgctcc agtcgtatgg gttccagcca 1200

acgaatggcg tcggatacca accttaccgc gttgtagtat taagctttga actgttgcac 1260

gcgcccgcga ctgtttgtgg cccgaagaag tcgactaatc tagtaaagaa taag 1314

<210> 8

<211> 438

<212> PRT

<213> 2019-nCoV

<400> 8

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro Thr

210 215 220

Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly

225 230 235 240

Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg

245 250 255

Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser

260 265 270

Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu

275 280 285

Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg

290 295 300

Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala

305 310 315 320

Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala

325 330 335

Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr

340 345 350

Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp

355 360 365

Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val

370 375 380

Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro

385 390 395 400

Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe

405 410 415

Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr

420 425 430

Asn Leu Val Lys Asn Lys

435

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL SEQUENCE

<400> 9

gtataactat aacggtccta aggtagcgaa 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL SEQUENCE

<400> 10

tcattacctc tttctccgca cccgacatag 30

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL SEQUENCE

<400> 11

agaacccact gcttactggc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL SEQUENCE

<400> 12

gaggggcaaa caacagatgg 20

<210> 13

<211> 5118

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL SEQUENCE

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5118)

<223> 通过I-CeuI和PI-SceI酶切位点插入到pAdC7载体的含有转录元件的新冠病毒全长

S目的基因序列

<400> 13

taactataac ggtcctaagg tagcgaaagc tcagatctcc cgatccccta tggtgcactc 60

tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tctgctccct gcttgtgtgt 120

tggaggtcgc tgagtagtgc gcgagcaaaa tttaagctac aacaaggcaa ggcttgaccg 180

acaattgcat gaagaatctg cttagggtta ggcgttttgc gctgcttcgc gatgtacggg 240

ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 300

cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 360

ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 420

taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc 480

acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 540

gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 600

agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 660

atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 720

atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 780

ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 840

tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata 900

gggagaccca agctggctag cgtttaaacg ggccctctag agccaccatg atccactcag 960

tgtttctctt aatgtttcta ctaactccca cggagtcggt gaacctgacc acacggaccc 1020

agctccctcc cgcctacaca aactctttca cccggggcgt gtactacccc gacaaggtgt 1080

tccggtctag cgtgctccac tctacacagg acctgttcct ccctttcttc agcaacgtga 1140

catggttcca cgccatccac gtgtctggca caaacggcac aaagcggttc gacaaccccg 1200

tgctcccttt caacgacggc gtgtacttcg ccagcaccga gaagtctaac attatccggg 1260

gctggatttt cggcaccaca ctcgactcta agacacagtc cctcctgatt gtgaacaacg 1320

ccacaaacgt ggtgattaag gtgtgcgagt tccagttctg caacgaccct ttcctgggcg 1380

tgtactacca caagaacaac aagtcttgga tggagtctga gttcagagtg tactctagcg 1440

ccaacaactg caccttcgag tacgtgtccc agcctttcct catggacctg gagggcaagc 1500

agggcaactt caagaacctg agagagttcg tgttcaagaa cattgacggc tacttcaaga 1560

tttactctaa gcacacccca attaacctcg tgagggacct ccctcagggc ttctccgcct 1620

tagaaccact ggtggacctc cctattggca ttaacatcac acgcttccag acactgctcg 1680

ccctccaccg gtcttacctg accccaggcg actctagctc tggctggaca gccggcgccg 1740

ccgcctacta cgtgggctac ctgcagccta ggaccttcct cctgaagtac aacgagaacg 1800

gcacaattac cgacgccgtg gactgcgccc tggacccact gtccgagaca aagtgcacac 1860

tgaagtcctt cacagtggag aagggcattt accagacatc taacttccgg gtgcagccta 1920

cagagtctat tgtgcggttc ccaaacatca caaacctgtg ccctttcggc gaggtgttca 1980

acgccacccg gttcgcctct gtgtacgcct ggaaccggaa gcggatctct aactgcgtgg 2040

ccgactactc cgtgctgtac aactccgcct ctttctctac attcaagtgc tacggcgtgt 2100

cccctacaaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta cgccgactct ttcgtgatta 2160

gaggcgacga ggtgaggcag attgcccccg gccagacagg caagatcgcc gactacaact 2220

acaagctgcc cgacgacttc acaggctgcg tgatcgcctg gaactctaac aacctggact 2280

ctaaggtggg cggcaactac aactacctgt acagactgtt ccggaagtct aacctgaagc 2340

cattcgagag ggacattagc accgagattt accaggccgg ctctacccca tgcaacggcg 2400

tggagggctt caactgctac ttcccactgc agtcctacgg cttccagcct acaaacggcg 2460

tgggctacca gccttaccgg gtggtggtgc tgtctttcga gctgctccac gcccccgcca 2520

cagtgtgcgg cccaaagaag agcacaaacc tcgtgaagaa caagtgcgtg aacttcaact 2580

tcaacggcct cacaggcaca ggcgtgctca ccgagtctaa caagaagttc ctccctttcc 2640

agcagttcgg ccgcgacatt gccgacacca ccgacgccgt gcgggaccct cagacactgg 2700

aaattctcga catcacccct tgcagcttcg gcggcgtgtc cgtgatcacc ccaggcacaa 2760

acacatctaa ccaggtggcc gtgctgtacc aggacgtgaa ctgcaccgag gtgccagtgg 2820

ccatccacgc cgaccagctc accccaacat ggagggtgta cagcacaggc tctaacgtgt 2880

tccagacccg ggccggctgc ctcattggcg ccgagcacgt gaacaactct tacgagtgcg 2940

acatccctat tggcgccggc atttgcgcct cttaccagac ccagacaaac tctccacgga 3000

gagcccggtc tgtggcctct cagagcatta ttgcctacac catgtctctg ggcgccgaga 3060

actctgtggc ctactctaac aactctattg ccatccctac aaacttcaca atttctgtga 3120

ccaccgagat tctcccagtg tctatgacca agacatctgt ggactgcacc atgtacattt 3180

gcggcgactc caccgagtgc tctaacctcc tgctccagta cggctctttc tgcacccagc 3240

tcaaccgcgc cctgacaggc atcgccgtgg agcaggacaa gaacacccag gaggtgttcg 3300

cccaggtgaa gcagatttac aagacccccc caattaagga cttcggcggc ttcaacttct 3360

ctcagattct ccccgaccca tccaagccta gcaagcggtc cttcattgag gacctcctgt 3420

tcaacaaggt gacactggcc gacgccggct tcattaagca gtacggcgac tgcctgggcg 3480

acattgccgc ccgggacctg atttgcgccc agaagttcaa cggcctcaca gtgctccccc 3540

cactgctcac cgacgagatg attgcccagt acacatctgc cctcctggcc ggcacaatta 3600

catctggctg gaccttcggc gccggcgccg ccctgcagat ccctttcgcc atgcagatgg 3660

cctaccgctt caacggcatc ggcgtgacac agaacgtgct gtacgagaac cagaagctga 3720

tcgccaacca gttcaacagc gccattggca agattcagga ctctctgagc agcacagcca 3780

gcgccctggg caagctgcag gacgtggtga accagaacgc ccaggccctg aacacactgg 3840

tgaagcagct gtcttctaac ttcggcgcca tttctagcgt gctgaacgac attctgtcgc 3900

ggctggacaa ggtggaggcc gaggtgcaga ttgacaggct catcacaggc agactgcagt 3960

ctctgcagac atacgtgacc cagcagctga ttagagccgc cgagattaga gcctccgcca 4020

acctggccgc caccaagatg agcgagtgcg tgctcggcca gtctaagcgg gtggacttct 4080

gcggcaaggg ctaccacctc atgtctttcc ctcagtccgc ccctcacggc gtggtgttcc 4140

tccacgtgac atacgtgccc gcccaggaga agaacttcac cacagccccc gccatttgcc 4200

acgacggcaa ggcccacttc cctagggagg gcgtgttcgt gtctaacggc acccactggt 4260

tcgtgaccca gcggaacttc tacgagcctc agattattac cacagacaac acattcgtga 4320

gcggcaactg cgacgtggtg attggcattg tgaacaacac agtgtacgac ccactgcagc 4380

ctgagttgga ctctttcaag gaggaactcg acaagtactt caagaaccac acatctcctg 4440

acgtggacct gggcgacatt agcggcatta acgcctctgt ggtgaacatt cagaaggaga 4500

ttgacagact gaacgaggtg gccaagaacc tgaacgagtc tctcattgac ctgcaggagc 4560

tgggcaagta cgagcagtac attaagtggc cttggtacat ttggctgggc ttcattgccg 4620

gcctgatcgc cattgtgatg gtgaccatca tgctgtgctg catgacatct tgctgcagct 4680

gcctgaaggg ctgctgctct tgcggctctt gctgcaagtt cgacgaggac gactctgagc 4740

ccgtgctgaa gggcgtgaag ctccactaca cctaaggtac caagcttaag tttaaaccgc 4800

tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 4860

ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 4920

gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 4980

aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 5040

tctgaggcgg aaagaaccag cagatctgca gatctgaatt catctatgtc gggtgcggag 5100

aaagaggtaa tgaaatgg 5118

<210> 14

<211> 3354

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL SEQUENCE

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3354)

<223> 通过I-CeuI和PI-SceI酶切位点插入到pAdC7载体的含有转录元件的新冠病毒S1目的基因序列

<400> 14

taactataac ggtcctaagg tagcgaaagc tcagatctcc cgatccccta tggtgcactc 60

tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tctgctccct gcttgtgtgt 120

tggaggtcgc tgagtagtgc gcgagcaaaa tttaagctac aacaaggcaa ggcttgaccg 180

acaattgcat gaagaatctg cttagggtta ggcgttttgc gctgcttcgc gatgtacggg 240

ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 300

cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 360

ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 420

taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc 480

acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 540

gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 600

agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 660

atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 720

atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 780

ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 840

tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata 900

gggagaccca agctggctag cgtttaaacg ggccctctag agccaccatg atccactcag 960

tgtttctctt aatgtttcta ctaactccca cggagtcggt gaacctgacc acacggaccc 1020

agctccctcc cgcctacaca aactctttca cccggggcgt gtactacccc gacaaggtgt 1080

tccggtctag cgtgctccac tctacacagg acctgttcct ccctttcttc agcaacgtga 1140

catggttcca cgccatccac gtgtctggca caaacggcac aaagcggttc gacaaccccg 1200

tgctcccttt caacgacggc gtgtacttcg ccagcaccga gaagtctaac attatccggg 1260

gctggatttt cggcaccaca ctcgactcta agacacagtc cctcctgatt gtgaacaacg 1320

ccacaaacgt ggtgattaag gtgtgcgagt tccagttctg caacgaccct ttcctgggcg 1380

tgtactacca caagaacaac aagtcttgga tggagtctga gttcagagtg tactctagcg 1440

ccaacaactg caccttcgag tacgtgtccc agcctttcct catggacctg gagggcaagc 1500

agggcaactt caagaacctg agagagttcg tgttcaagaa cattgacggc tacttcaaga 1560

tttactctaa gcacacccca attaacctcg tgagggacct ccctcagggc ttctccgcct 1620

tagaaccact ggtggacctc cctattggca ttaacatcac acgcttccag acactgctcg 1680

ccctccaccg gtcttacctg accccaggcg actctagctc tggctggaca gccggcgccg 1740

ccgcctacta cgtgggctac ctgcagccta ggaccttcct cctgaagtac aacgagaacg 1800

gcacaattac cgacgccgtg gactgcgccc tggacccact gtccgagaca aagtgcacac 1860

tgaagtcctt cacagtggag aagggcattt accagacatc taacttccgg gtgcagccta 1920

cagagtctat tgtgcggttc ccaaacatca caaacctgtg ccctttcggc gaggtgttca 1980

acgccacccg gttcgcctct gtgtacgcct ggaaccggaa gcggatctct aactgcgtgg 2040

ccgactactc cgtgctgtac aactccgcct ctttctctac attcaagtgc tacggcgtgt 2100

cccctacaaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta cgccgactct ttcgtgatta 2160

gaggcgacga ggtgaggcag attgcccccg gccagacagg caagatcgcc gactacaact 2220

acaagctgcc cgacgacttc acaggctgcg tgatcgcctg gaactctaac aacctggact 2280

ctaaggtggg cggcaactac aactacctgt acagactgtt ccggaagtct aacctgaagc 2340

cattcgagag ggacattagc accgagattt accaggccgg ctctacccca tgcaacggcg 2400

tggagggctt caactgctac ttcccactgc agtcctacgg cttccagcct acaaacggcg 2460

tgggctacca gccttaccgg gtggtggtgc tgtctttcga gctgctccac gcccccgcca 2520

cagtgtgcgg cccaaagaag agcacaaacc tcgtgaagaa caagtgcgtg aacttcaact 2580

tcaacggcct cacaggcaca ggcgtgctca ccgagtctaa caagaagttc ctccctttcc 2640

agcagttcgg ccgcgacatt gccgacacca ccgacgccgt gcgggaccct cagacactgg 2700

aaattctcga catcacccct tgcagcttcg gcggcgtgtc cgtgatcacc ccaggcacaa 2760

acacatctaa ccaggtggcc gtgctgtacc aggacgtgaa ctgcaccgag gtgccagtgg 2820

ccatccacgc cgaccagctc accccaacat ggagggtgta cagcacaggc tctaacgtgt 2880

tccagacccg ggccggctgc ctcattggcg ccgagcacgt gaacaactct tacgagtgcg 2940

acatccctat tggcgccggc atttgcgcct cttaccagac ccagacaaac tctccacgga 3000

gagcccggta aggtaccaag cttaagttta aaccgctgat cagcctcgac tgtgccttct 3060

agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc 3120

actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt 3180

cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat 3240

agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag aaccagcaga 3300

tctgcagatc tgaattcatc tatgtcgggt gcggagaaag aggtaatgaa atgg 3354

<210> 15

<211> 2001

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL SEQUENCE

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2001)

<223> 通过I-CeuI和PI-SceI酶切位点插入到pAdC7载体的含有转录元件的新冠病毒RBD目的基因序

列

<400> 15

taactataac ggtcctaagg tagcgaaagc tcagatctcc cgatccccta tggtgcactc 60

tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tctgctccct gcttgtgtgt 120

tggaggtcgc tgagtagtgc gcgagcaaaa tttaagctac aacaaggcaa ggcttgaccg 180

acaattgcat gaagaatctg cttagggtta ggcgttttgc gctgcttcgc gatgtacggg 240

ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 300

cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 360

ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 420

taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc 480

acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 540

gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 600

agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 660

atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 720

atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 780

ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 840

tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata 900

gggagaccca agctggctag cgtttaaacg ggccctctag agccaccatg atccactcag 960

tgtttctctt aatgtttcta ctaactccca cggagtcgcg agtgcagcct accgaaagca 1020

tcgtccgttt cccgaatatt actaatctct gtccattcgg agaagtcttc aatgccaccc 1080

gattcgcttc cgtttacgcg tggaaccgta aacgaatatc taattgtgtt gcggactatt 1140

ccgtgttgta caactcagca tcattctcta cttttaaatg ctatggagtg tcgccgacta 1200

aactcaacga cttgtgtttc actaatgttt atgctgactc tttcgttatt cgtggagacg 1260

aagttcgtca aatcgcacca gggcaaactg gcaagattgc ggactataat tataagctgc 1320

cagatgactt taccggatgt gtaatagcct ggaactcaaa taatctcgac agtaaagtgg 1380

gaggcaacta taattatctt tatcgactct tcagaaagtc taaccttaag ccatttgaac 1440

gtgacatttc tacagaaatt taccaagccg gctctacacc ttgcaatggc gtggaagggt 1500

ttaactgtta tttcccatta cagtcttatg gtttccagcc aactaatggt gtgggatacc 1560

aaccttaccg cgtcgttgtc ctgtcgtttg aattgcttca cgcaccagcc accgtttgtg 1620

ggccaaagaa gagcactaat ctcgtaaaga ataaatgagg taccaagctt aagtttaaac 1680

cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 1740

gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 1800

attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 1860

agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 1920

gcttctgagg cggaaagaac cagcagatct gcagatctga attcatctat gtcgggtgcg 1980

gagaaagagg taatgaaatg g 2001

<210> 16

<211> 2658

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL SEQUENCE

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2658)

<223> 通过I-CeuI和PI-SceI酶切位点插入到pAdC7载体的含有转录元件的新冠病毒sc-dimer目的基

因序列

<400> 16

taactataac ggtcctaagg tagcgaaagc tcagatctcc cgatccccta tggtgcactc 60

tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tctgctccct gcttgtgtgt 120

tggaggtcgc tgagtagtgc gcgagcaaaa tttaagctac aacaaggcaa ggcttgaccg 180

acaattgcat gaagaatctg cttagggtta ggcgttttgc gctgcttcgc gatgtacggg 240

ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 300

cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 360

ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 420

taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc 480

acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 540

gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 600

agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 660

atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 720

atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 780

ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 840

tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata 900

gggagaccca agctggctag cgtttaaacg ggccctctag agccaccatg atccactcag 960

tgtttctctt aatgtttcta ctaactccca cggagtcgcg agtgcagcct accgaaagca 1020

tcgtccgttt cccgaatatt actaatctct gtccattcgg agaagtcttc aatgccaccc 1080

gattcgcttc cgtttacgcg tggaaccgta aacgaatatc taattgtgtt gcggactatt 1140

ccgtgttgta caactcagca tcattctcta cttttaaatg ctatggagtg tcgccgacta 1200

aactcaacga cttgtgtttc actaatgttt atgctgactc tttcgttatt cgtggagacg 1260

aagttcgtca aatcgcacca gggcaaactg gcaagattgc ggactataat tataagctgc 1320

cagatgactt taccggatgt gtaatagcct ggaactcaaa taatctcgac agtaaagtgg 1380

gaggcaacta taattatctt tatcgactct tcagaaagtc taaccttaag ccatttgaac 1440

gtgacatttc tacagaaatt taccaagccg gctctacacc ttgcaatggc gtggaagggt 1500

ttaactgtta tttcccatta cagtcttatg gtttccagcc aactaatggt gtgggatacc 1560

aaccttaccg cgtcgttgtc ctgtcgtttg aattgcttca cgcaccagcc accgtttgtg 1620

ggccaaagaa gagcactaat ctcgtaaaga ataaacgtgt tcagcctact gaatcgatcg 1680

tgaggttccc aaatattacc aatctgtgtc cgttcggaga ggtcttcaat gcgactcgat 1740

tcgcgtctgt ttacgcctgg aacaggaaac ggattagcaa ttgtgtcgct gactattcgg 1800

tcttatacaa ctctgcatca ttctcaacct tcaagtgtta tggtgtcagc cctacaaagc 1860

tgaatgactt atgtttcacc aatgtttatg cggacagttt cgtaatacga ggtgatgaag 1920

tccgccaaat tgcacccgga caaaccggca agatagccga ctataattat aagctccctg 1980

atgactttac gggctgtgtc atagcttgga atagtaataa tttggactcg aaagtgggag 2040

gtaattataa ttatctctat agactgttcc ggaaatcaaa tctcaagccc tttgaacggg 2100

acataagtac agaaatctac caagctggtt ccacgccgtg taatggagtc gaggggttta 2160

actgttattt cccgctccag tcgtatgggt tccagccaac gaatggcgtc ggataccaac 2220

cttaccgcgt tgtagtatta agctttgaac tgttgcacgc gcccgcgact gtttgtggcc 2280

cgaagaagtc gactaatcta gtaaagaata agtgaggtac caagcttaag tttaaaccgc 2340

tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 2400

ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 2460

gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 2520

aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 2580

tctgaggcgg aaagaaccag cagatctgca gatctgaatt catctatgtc gggtgcggag 2640

aaagaggtaa tgaaatgg 2658

Claims

1.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括骨架载体和连接在骨架载体上的包括有目的基因的核酸序列；

所述骨架载体是复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体；

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体在哺乳动物野生型细胞中不能复制或基本不能复制；可选地，所述复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体在人体野生型细胞中不能复制；

和/或，复制缺陷型7型黑猩猩腺病毒载体上的7型黑猩猩腺病毒基因组相对于野生型7型黑猩猩腺病毒基因组缺失了野生型AdC7基因组中第458-3026位的序列和野生型AdC7基因组中第27094-31799位的序列，可选地，在第458-3026位的删除区增加I-Ceu I和PI-SceI酶切位点；进一步可选地，在第27094-31799位的删除区增加Rsr II酶切位点。

3.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列为新型冠状病毒S蛋白受体结合区全部氨基酸序列的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，该部分氨基酸序列编码的蛋白质具有与全部氨基酸序列所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性。

4.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述目的基因选自以下的一种或几种：

编码新型冠状病毒S1蛋白的核酸序列；

编码新型冠状病毒全长S蛋白的核酸序列；

编码2条相互串联的新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列或全部氨基酸序列的核酸序列，其中：2条相互串联的新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列或全部氨基酸序列按照(A-B)-(A-B)样式或(A-B)-C-(A-B)样式或(A-B)-(A-B’)样式或(A-B)-C-(A-B’)样式排列，其中：A-B表示新型冠状病毒S蛋白受体结合区部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，C表示连接氨基酸序列，A-B’表示A-B中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个、两个或三个氨基酸获得的氨基酸序列，A-B’编码的蛋白质具有与A-B所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性。

5.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述目的基因选自以下的一种或几种：

编码新型冠状病毒S1蛋白的核酸序列；

编码新型冠状病毒全长S蛋白的核酸序列；

编码2条相互串联的新型冠状病毒S蛋白受体结合区R319-S530区域、编码2条相互串联的新型冠状病毒S蛋白受体结合区R319-K537区域或编码2条相互串联的新型冠状病毒S蛋白受体结合区R319-F541区域的核酸序列；

6.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述目的基因选自以下的一种或几种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7。

7.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述连接氨基酸序列包括：(GGS)n连接序列，其中n表示GGS的个数，n为≥1的整数；可选地，n为选自1-10的整数；进一步可选地，n为选自1-5的整数。

8.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包括位于目的基因上下游的元件序列。

9.权利要求1-8之一所述重组载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.一种7型黑猩猩腺病毒腺病毒，其特征在于，包括：衣壳蛋白和包装在衣壳蛋白中的权利要求1-8之一所述的重组载体。

11.根据权利要求10所述的7型黑猩猩腺病毒腺病毒，其特征在于，包装在衣壳蛋白中的权利要求1-8之一所述重组载体为线性化的权利要求1-8之一所述重组载体。

12.根据权利要求10所述的7型黑猩猩腺病毒腺病毒，其特征在于，衣壳蛋白为腺病毒AdC7自身的衣壳蛋白。

13.权利要求10-12之一所述的7型黑猩猩腺病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-8之一所述重组载体线性化后转染病毒生产细胞进行重组载体的包装。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，病毒生产细胞为保藏编号为ATCCCRL-1573的人胚胎肾细胞293。

15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，还包括对包装好获得的7型黑猩猩腺病毒进行纯化的步骤。

16.权利要求1-8之一所述重组载体、权利要求10-12之一所述的7型黑猩猩腺病毒在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用。

17.一种2019新型冠状病毒疫苗，其特征在于，包括：权利要求10-12之一所述的腺病毒，以及药学上可接受的辅料。

18.根据权利要求17所述的2019新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述2019新型冠状病毒疫苗的制剂形式为喷雾剂、口服剂或注射剂。

19.根据权利要求17所述的2019新型冠状病毒疫苗，其特征在于，使用2019新型冠状病毒疫苗进行两次免疫。