CN116348132A - 基于合成的被修饰的痘苗安卡拉（smva）的冠状病毒疫苗 - Google Patents

基于合成的被修饰的痘苗安卡拉（smva）的冠状病毒疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN116348132A
CN116348132A CN202180059838.6A CN202180059838A CN116348132A CN 116348132 A CN116348132 A CN 116348132A CN 202180059838 A CN202180059838 A CN 202180059838A CN 116348132 A CN116348132 A CN 116348132A
Authority
CN
China
Prior art keywords
smva
protein
antigen
cov
sars
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180059838.6A
Other languages
English (en)
Inventor
唐·J·戴蒙德
费利克斯·乌索
弗拉维亚·奇乌佩西
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
City of Hope
Original Assignee
City of Hope
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by City of Hope filed Critical City of Hope
Publication of CN116348132A publication Critical patent/CN116348132A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20071—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

公开了用于预防或治疗冠状病毒感染的基于合成的被修饰的痘苗安卡拉(MVA)的疫苗和生产该疫苗的方法。具体而言，本公开提供了一种疫苗组合物，其包括：(i)包含MVA的整个基因组的单个合成DNA片段或两个或更多个合成DNA片段，和(ii)编码一个或多个冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的一个或多个DNA序列，插入到所述MVA的一个或多个插入位点中以预防或治疗冠状病毒感染。

Description

基于合成的被修饰的痘苗安卡拉(SMVA)的冠状病毒疫苗
优先权声明
本申请要求于2020年5月17日提交的美国临时专利申请号63/026,127，于2020年6月25日提交的美国临时专利申请号63/044,033，于2020年11月13日提交的美国临时专利申请号63/113,810，和于2021年3月15日提交的美国临时专利申请号63/161,371的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
背景技术
被修饰的痘苗安卡拉(MVA)是一种高度减毒的正痘病毒，自其亲本株绒毛膜尿囊痘苗安卡拉(CVA)在鸡胚成纤维细胞(CEF)上通过570次传代衍生而来。由于减毒过程，MVA获得了六个主要的基因组缺失(Del1–6)以及多个较短的缺失，插入，和点突变，导致基因片段化，截断，短内部缺失，和氨基酸替换。MVA严重限制了宿主细胞的嗜性(tropism)，仅允许在禽类细胞中进行生产性组装，例如，CEF和幼仓鼠肾(BHK)细胞，而在人和大多数其他哺乳动物细胞中，MVA组装由于病毒组装的后期阻滞而失败。虽然为非病原和高度减毒，但MVA仍保持出色的免疫原性，如多个动物模型和人所示。在根除天花运动的后期阶段，MVA被用作德国120,000多人的基于具有复制能力的痘苗的疫苗的启动载体，并且没有报告任何不良事件。在过去的几十年中，MVA已被开发为一种独立的(stand-alone)天花疫苗，目前美国(US)政府正在寻求将其作为更安全的替代物以代替已有的基于痘苗的疫苗库存，作为天花爆发的预防对策。FDA于2019年9月24日批准了商品名为Jynneos(巴伐利亚北欧)的MVA以预防天花和猴痘。此前，使用商品名Imvamune的相似MVA疫苗在欧洲被批准为天花疫苗。我们所知的几乎所有目前使用MVA载体或其衍生物的组织均由学术，商业，或政府实体许可或拥有，这大大限制了它们用于商业开发基于MVA的疫苗载体。
冠状病毒是一大类有包膜的，正义单链RNA病毒，可以感染人并造成严重感染甚至大流行。这种高度感染性的冠状病毒包括，例如，MERS-CoV，SARS-CoV，和SARS-CoV-2。自近期爆发新型严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2，也称为Covid-19或nCoV-2019)(PMC7095418，PMC7092803)以来，该病毒已传播到200多个国家，导致全世界有超过300万人死亡。尽管已经以前所未有的速度开发出几种有效的SARS-CoV-2疫苗并获准紧急使用，但额外的疫苗可以有助于建立针对SARS-CoV-2及其许多新出现的变体的长期和交叉反应性免疫力。因此，本公开提供使用合成MVA平台的疫苗以满足该领域的迫切需要。
发明内容
在一个方面，本文公开了一种用于预防或治疗受试者的病毒感染如冠状病毒感染的疫苗组合物，其包含：(i)包含MVA的整个基因组的单个DNA片段，或各自包含该MVA的基因组的部分序列的两个或更多个DNA片段，使得该两个或更多个DNA片段在共转染后于宿主细胞中表达时顺序组装并包含该MVA基因组的全长序列，和(ii)编码一个或多个人冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的一个或多个DNA序列插入到MVA的一个或多个插入位点中，其中该抗原，亚单位，或其片段在该一个或多个DNA片段转染后于该宿主细胞中表达。在某些实施例中，该抗原，亚单位，或其片段的DNA序列经过密码子优化以在该宿主细胞或痘苗病毒中表达。在某些实施例中，该一个或多个人冠状病毒抗原包括刺突(S)蛋白，核衣壳(N)蛋白，膜(M)蛋白，和包膜(E)蛋白，木瓜样蛋白酶，ORF1A，3CL蛋白酶，ORF1B，内切核糖核酸酶，基质，解旋酶，或其免疫原性片段。结构或非结构(1a，1b)蛋白的其他冠状病毒抗原也可以包括在内。在某些实施例中，该一个或多个人冠状病毒抗原包括SARS-CoV-2S蛋白，N蛋白，或两者。在某些实施例中，该一个或多个抗原包括该S蛋白的亚单位，如S1和S2结构域，或该S蛋白的受体结合结构域(RBD)。在某些实施例中，该一个或多个抗原包括预融合形式的该S蛋白或N蛋白或突变的S蛋白或N蛋白。例如，可以稳定该SARS-CoV-2S蛋白的预融合形式或者可以通过包含突变的弗林蛋白酶切割位点使该SARS-CoV-2S蛋白进一步稳定，从而使氨基酸残基682–685RRAR突变为GSAS。在另一个示例中，该SARS-CoV-2S蛋白的赖氨酸986和缬氨酸987被脯氨酸取代(2P)。额外的脯氨酸取代包括F817P，A892P，A899P，和A942P。相似的弗林蛋白酶切割位点突变和脯氨酸取代可以被包含在其他冠状病毒S蛋白中的相应氨基酸位置处以表达未被切割和/或2P预融合稳定的蛋白形式。在某些实施例中，该S蛋白包含选自由以下组成的组的一个或多个突变：S13I，L18F，T19R，T20N，R21T，P26S，69和70位处组氨酸和缬氨酸缺失，K77T，D80A，T95I，D138Y，G142D，144位处酪氨酸缺失，W152C，E154K，氨基酸156和157位处谷氨酸和苯丙氨酸缺失(Del156–157)，R158G，R190S，D215G，Q218H，242–244位处亮氨酸，丙氨酸，和亮氨酸缺失，R246I，K417N，K417T，N439K，L452R，Y453F，S477N，T478K，E484K，E484Q，S494P，N501Y，S520S，A570D，D614G，H655Y，P681H，P681R，RRAR682–685GSAS，A701V，T716I，D950N，S982A，K986P，V987P，T1027I，Q1071H，H1101D，D1118H，和V1176F。在某些实施例中，该N蛋白包含选自由以下组成的组的一个或多个突变：D3L，P80R，S235F，R203K，R203M，G204R，T205I，和D377Y。在某些实施例中，该S蛋白和该N蛋白是完全成熟的或完全糖基化的。在某些实施例中，该S和N蛋白被插入到一个或多个MVA插入位点中。在某些实施例中，该一个或多个抗原包含至少两个来自SARS-CoV-2的不同变体的RBD，其可以通过一个或多个GS接头连接，并且各自可以包含在N-末端处的信号肽，或在C-末端处的跨膜结构域或细胞质结构域。在某些实施例中，该一个或多个DNA片段还包含在编码该人冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的DNA序列上游的病毒启动子，在编码该人冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的DNA序列下游的转录终止信号，或两者。在某些实施例中，该启动子序列包括mH5和p7.5启动子，或任何其他合适的天然或合成的痘苗或痘病毒启动子。在某些实施例中，编码该抗原，亚单位，或其片段的该DNA序列被插入到一个或多个MVA插入位点中，如基因间区域，非必需基因和区域，和缺失位点。在某些实施例中，该疫苗组合物还包含药学上可接受的载体，佐剂，添加剂，或其组合。在某些实施例中，该受试者感染或处于感染冠状病毒如β冠状病毒的风险，包括MERS-CoV，SARS-CoV和SARS-CoV2，229E，NL63，OC43，HKU1，和其他α，β，γ，和δ冠状病毒。在某些实施例中，该受试者感染或处于感染SARS-CoV-2的风险。
在另一个方面，本文公开了一种预防或治疗受试者的病毒感染的方法，包括向该受试者施用预防或治疗有效量的疫苗组合物，其中该疫苗包含：(i)包含MVA的整个基因组的单个DNA片段，或各自包含该MVA的基因组的部分序列的两个或更多个DNA片段，使得该两个或更多个DNA片段在共转染后于宿主细胞中表达时顺序组装并包含该MVA基因组的全长序列，和(ii)编码一个或多个人冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的一个或多个DNA序列插入到MVA的一个或多个插入位点中，其中该抗原，亚单位，或其片段在该一个或多个DNA片段转染后于该宿主细胞中表达。在某些实施例中，该抗原，亚单位，或其片段的DNA序列经过密码子优化以在该宿主细胞或痘苗病毒中表达。在某些实施例中，该一个或多个人冠状病毒抗原包括刺突(S)蛋白，核衣壳(N)蛋白，膜(M)蛋白，和包膜(E)蛋白，木瓜样蛋白酶，ORF1A，3CL蛋白酶，ORF1B，内切核糖核酸酶，基质，解旋酶，或其免疫原性片段。结构或非结构(1a，1b)蛋白的其他冠状病毒抗原也可以包括在内。在某些实施例中，该一个或多个人冠状病毒抗原包括SARS-CoV-2S蛋白，N蛋白，或两者。在某些实施例中，该一个或多个抗原包括该S蛋白的亚单位，如S1和S2结构域，或该S蛋白的受体结合结构域(RBD)。在某些实施例中，该一个或多个抗原包括预融合形式的该S蛋白和突变的S蛋白。例如，可以稳定该SARS-CoV-2S蛋白的预融合形式或者可以通过包含突变的弗林蛋白酶切割位点使该SARS-CoV-2S蛋白进一步稳定，从而使氨基酸残基682–685RRAR突变为GSAS(RRAR682-685GSAS)。在另一个示例中，该SARS-CoV-2S蛋白的赖氨酸986和缬氨酸987被脯氨酸取代(2P)(K986P和V987P)。额外的脯氨酸取代包括F817P，A892P，A899P，和A942P。相似的弗林蛋白酶切割位点突变和脯氨酸取代可以被包含在其他冠状病毒S蛋白中的相应氨基酸位置处以表达未被切割和/或2P预融合稳定的蛋白形式。在某些实施例中，该S蛋白包含选自由以下组成的组的一个或多个突变：S13I，L18F，T19R，T20N，R21T，P26S，69和70位处组氨酸和缬氨酸缺失，K77T，D80A，T95I，D138Y，G142D，144位处酪氨酸缺失，W152C，E154K，氨基酸156和157位处谷氨酸和苯丙氨酸缺失(Del156–157)，R158G，R190S，D215G，Q218H，242–244位处亮氨酸，丙氨酸，和亮氨酸缺失，R246I，K417N，K417T，N439K，L452R，Y453F，S477N，T478K，E484K，E484Q，S494P，N501Y，S520S，A570D，D614G，H655Y，P681H，P681R，RRAR682–685GSAS，A701V，T716I，D950N，S982A，K986P，V987P，T1027I，Q1071H，H1101D，D1118H，和V1176F。在某些实施例中，该N蛋白包含选自由以下组成的组的一个或多个突变：D3L，P80R，S235F，R203K，R203M，G204R，T205I，和D377Y。在某些实施例中，该S蛋白和该N蛋白是完全成熟的或完全糖基化的。在某些实施例中，该一个或多个抗原包含至少两个来自SARS-CoV-2的不同变体的RBD，其可以通过一个或多个GS接头连接，并且各自可以包含在N-末端处的信号肽，或在C-末端处的跨膜结构域或细胞质结构域。在某些实施例中，该S和N蛋白被插入到一个或多个MVA插入位点中。在某些实施例中，该一个或多个DNA片段还包含在编码该人冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的DNA序列上游的病毒启动子，在编码该人冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的DNA序列下游的转录终止信号，或两者。在某些实施例中，该启动子序列包括mH5和p7.5启动子，或任何其他合适的天然或合成的痘苗或痘病毒启动子。在某些实施例中，编码该抗原，亚单位，或其片段的该DNA序列被插入到一个或多个MVA插入位点中，如基因间区域，非必需基因和区域，和缺失位点。在某些实施例中，该疫苗组合物还包含药学上可接受的载体，佐剂，添加剂，或其组合。在某些实施例中，该受试者感染或处于感染冠状病毒如β冠状病毒的风险，包括MERS-CoV，SARS-CoV和SARS-CoV2，229E，NL63，OC43，HKU1，和其他α，β，γ，和δ冠状病毒。在某些实施例中，该受试者感染或处于感染SARS-CoV-2的风险。
在另一个方面，本文公开了一种在受试者中引发免疫反应的方法，包括向该受试者施用预防或治疗有效量的疫苗组合物，其中该疫苗包含：(i)包含MVA的整个基因组的单个DNA片段，或各自包含该MVA的基因组的部分序列的两个或更多个DNA片段，使得该两个或更多个DNA片段在共转染后于宿主细胞中表达时顺序组装并包含该MVA基因组的全长序列，和(ii)编码一个或多个人冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的一个或多个DNA序列插入到MVA的一个或多个插入位点中，其中该抗原，亚单位，或其片段在该一个或多个DNA片段转染后于该宿主细胞中表达。在某些实施例中，该抗原，亚单位，或其片段的DNA序列经过密码子优化以在该宿主细胞中表达。在某些实施例中，该一个或多个人冠状病毒抗原包括刺突(S)蛋白，核衣壳(N)蛋白，膜(M)蛋白，和包膜(E)蛋白，木瓜样蛋白酶，ORF1A，3CL蛋白酶，ORF1B，内切核糖核酸酶，基质，解旋酶，或其免疫原性片段。结构或非结构(1a，1b)蛋白的其他冠状病毒抗原也可以包括在内。在某些实施例中，该一个或多个人冠状病毒抗原包括SARS-CoV-2S蛋白，N蛋白，或两者。在某些实施例中，该一个或多个抗原包括该S蛋白的亚单位，如S1和S2结构域，或该S蛋白的受体结合结构域(RBD)。在某些实施例中，该一个或多个抗原包括预融合形式的该S蛋白和突变的S蛋白。例如，可以稳定该SARS-CoV-2S蛋白的预融合形式或者可以通过包含突变的弗林蛋白酶切割位点使该SARS-CoV-2S蛋白进一步稳定，从而使氨基酸残基682–685RRAR突变为GSAS。在另一个示例中，该SARS-CoV-2S蛋白的赖氨酸986和缬氨酸987被脯氨酸取代(2P)。额外的脯氨酸取代包括F817P，A892P，A899P，和A942P。相似的弗林蛋白酶切割位点突变和脯氨酸取代可以被包含在其他冠状病毒S蛋白中的相应氨基酸位置处以表达未被切割和/或2P预融合稳定的蛋白形式。在某些实施例中，该S蛋白包含选自由以下组成的组的一个或多个突变：S13I，L18F，T19R，T20N，R21T，P26S，69和70位处组氨酸和缬氨酸缺失，K77T，D80A，T95I，D138Y，G142D，144位处酪氨酸缺失，W152C，E154K，氨基酸156和157位处谷氨酸和苯丙氨酸缺失(Del156–157)，R158G，R190S，D215G，Q218H，242–244位处亮氨酸，丙氨酸，和亮氨酸缺失，R246I，K417N，K417T，N439K，L452R，Y453F，S477N，T478K，E484K，E484Q，S494P，N501Y，S520S，A570D，D614G，H655Y，P681H，P681R，RRAR682–685GSAS，A701V，T716I，D950N，S982A，K986P，V987P，T1027I，Q1071H，H1101D，D1118H，和V1176F。在某些实施例中，该N蛋白包含选自由以下组成的组的一个或多个突变：D3L，P80R，S235F，R203K，R203M，G204R，T205I，和D377Y。在某些实施例中，该S蛋白和该N蛋白是完全成熟的或完全糖基化的。在某些实施例中，该一个或多个抗原包含至少两个来自SARS-CoV-2的不同变体的RBD，其可以通过一个或多个GS接头连接，并且各自可以包含在N-末端处的信号肽，或在C-末端处的跨膜结构域或细胞质结构域。在某些实施例中，该S和N蛋白被插入到一个或多个MVA插入位点中。在某些实施例中，该一个或多个DNA片段还包含在编码该人冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的DNA序列上游的病毒启动子，在编码该人冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的DNA序列下游的转录终止信号，或两者。在某些实施例中，该启动子序列包括mH5和p7.5启动子，或任何其他合适的天然或合成的痘苗或痘病毒启动子。在某些实施例中，编码该抗原，亚单位，或其片段的该DNA序列被插入到一个或多个MVA插入位点中，如基因间区域，非必需基因和区域，和缺失位点。在某些实施例中，该疫苗组合物还包含药学上可接受的载体，佐剂，添加剂，或其组合。在某些实施例中，该受试者感染或处于感染冠状病毒如β冠状病毒的风险，包括MERS-CoV，SARS-CoV和SARS-CoV2，229E，NL63，OC43，HKU1，和其他α，β，γ，和δ冠状病毒。在某些实施例中，该受试者感染或处于感染SARS-CoV-2的风险。
在又一个方面，本公开涉及一种产生MVA载体或重组MVA载体的方法。该方法需要将一个或多个DNA片段转染到宿主细胞中的步骤，其中该一个或多个DNA片段包含MVA物种的整个基因组DNA序列，使得该MVA病毒在该宿主细胞中重构。在某些实施例中，将两个或更多个DNA片段共转染到该宿主细胞中，每个DNA片段包含该MVA基因组的部分序列，使得该两个或更多个DNA片段在该宿主细胞中重构时通过同源重组顺序组装并包含该MVA基因组的全长序列。在某些实施例中，该方法还需要在转染该一个或多个DNA片段之前，期间，或之后用辅助病毒感染该宿主细胞以启动该一个或多个DNA片段的转录。在某些实施例中，该辅助病毒是禽痘病毒(FPV)或任何其他刺激MVA，痘苗，或痘病毒转录的辅助病毒。在某些实施例中，该一个或多个DNA片段在转染之前被环化或以环状形式转染到该宿主细胞中。在某些实施例中，将该一个或多个DNA片段克隆到质粒或细菌人工染色体(BAC)载体中。在某些实施例中，该一个或多个DNA片段是天然衍生的，化学合成的，或天然衍生的和化学合成的DNA片段的组合。在某些实施例中，该MVA基因组序列包含登录号#U94848的序列。在某些实施例中，两个相邻DNA片段具有重叠序列以有助于同源重组。在某些实施例中，该重叠序列的长度在约100bp和约5000bp之间。在某些实施例中，该一个或多个DNA片段还包含反向末端重复(ITR)区。在某些实施例中，该一个或多个DNA片段还包含MVA末端发夹环(HL)序列，MVA基因组解析(CR)序列，或两者，其中该HL或该CR序列作为单链或双链DNA序列以正义或反义方向添加至该DNA片段的一端或两端。在某些实施例中，该一个或多个DNA片段还包含一个或多个HL序列和一个或多个CR序列。在某些实施例中，每个HL序列在该HL序列的两端的侧翼为两个CR序列。在某些实施例中，该一个或多个DNA片段还包含编码一个或多个抗原，亚单位，或其片段的一个或多个DNA序列。在某些实施例中，该抗原，亚单位，或其片段的DNA序列经过密码子优化以在该宿主细胞中表达，例如，在人细胞或痘苗病毒中，和/或通过沉默密码子改变以避免连续4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行密码子优化。在某些实施例中，该一个或多个抗原包括人冠状病毒抗原，如刺突(S)蛋白，核衣壳(N)蛋白，膜(M)蛋白，和包膜(E)蛋白，木瓜样蛋白酶，ORF1A，3CL蛋白酶，ORF1B，内切核糖核酸酶，基质，解旋酶，或其免疫原性片段。结构或非结构(1a，1b)蛋白的其他冠状病毒抗原也可以包括在内。在某些实施例中，该一个或多个抗原包括该S蛋白的亚单位，如S1和S2结构域，或该S蛋白的受体结合结构域(RBD)。在某些实施例中，该一个或多个抗原包括预融合形式的该S蛋白和突变的S蛋白。例如，可以稳定该SARS-CoV-2S蛋白的预融合形式或者可以通过包含突变的弗林蛋白酶切割位点使该SARS-CoV-2S蛋白进一步稳定，从而使氨基酸残基682–685RRAR突变为GSAS。在另一个示例中，该SARS-CoV-2S蛋白的赖氨酸986和缬氨酸987被脯氨酸取代(2P)。额外的脯氨酸取代包括F817P，A892P，A899P，和A942P。相似的弗林蛋白酶切割位点突变和脯氨酸取代可以被包含在其他冠状病毒S蛋白中的相应氨基酸位置处以表达未被切割和/或2P预融合稳定的蛋白形式。在某些实施例中，该S蛋白包含选自由以下组成的组的一个或多个突变：S13L，L18F，T19R，T20N，R21T，P26S，69和70位处组氨酸和缬氨酸缺失，K77T，D80A，T95I，D138Y，G142D，144位处酪氨酸缺失，W152C，E154K，氨基酸156和157位处谷氨酸和苯丙氨酸缺失(Del156–157)，R158G，R190S，D215G，Q218H，242–244位处亮氨酸，丙氨酸，和亮氨酸缺失，R246I，K417N，K417T，N439K，L452R，Y453F，S477N，E484K，E484Q，S494P，N501Y，S520S，A570D，D614G，H655Y，P681H，P681R，RRAR682–685GSAS，A701V，T716I，D950N，S982A，K986P，V987P，T1027I，Q1071H，H1101D，D1118H，和V1176F。在某些实施例中，该N蛋白包含选自由以下组成的组的一个或多个突变：D3L，P80R，S235F，R203K，R203M，G204R，T205I，和D377Y。在某些实施例中，该S蛋白和该N蛋白是完全成熟的或完全糖基化的。在某些实施例中，该一个或多个DNA片段还包含在该抗原，亚单位，或其片段的DNA序列上游的病毒启动子，在该抗原，亚单位，或其片段的DNA序列下游的转录终止信号，或两者。在某些实施例中，该启动子序列包括mH5和p7.5启动子，或任何其他合适的天然或合成的痘苗或痘病毒启动子。在某些实施例中，编码该抗原，亚单位，或其片段的该DNA序列被插入到一个或多个MVA插入位点中，如基因间区域，非必需基因和区域，和缺失位点。在另一个实施例中，该一个或多个被表达的SARS-CoV-2抗原被进一步修饰以包含一个或多个新关注变体(VOC)的突变。
附图简要说明
本申请包含至少一张彩色绘制的附图。具有一张或多张彩色附图的本申请的副本将在请求并支付必要费用后由专利商标局(the Office)提供。
图1A–1F示出了sMVA构建和表征。图1A：MVA基因组示意图。该MVA基因组的长度为约178kbp并且包含约9.6kbp反向末端重复(ITR)序列。图1B：sMVA片段。如所示三个亚基因组sMVA片段(F1–F3)包含该MVA基因组左，中间，右部分的约60kbp。sMVA F1/F2和F2/F3共享用于重组的～3kbp重叠同源序列(红色点虚线交叉线)。标示了常用MVA插入(Del2，IGR69/70，Del3)的近似基因组位置。图1C：末端CR/HL/CR序列。每个sMVA片段在两端包含序列组合物，该序列组合物包含侧翼为多联体(concatemeric)解析(CR)序列的MVA末端发夹环(HL)的双链体拷贝。BAC＝细菌人工染色体载体。图1D：sMVA重构。将sMVA片段从大肠杆菌分离并共转染到BHK-21细胞中，随后使其被作为辅助病毒的FPV感染以启动sMVA病毒重构。图1E：PCR分析。被sMVA感染的CEF由FPV HP1.441(sMVA hp)或来自两个独立病毒重构体(sMVAtv1和sMVA tv2)的TROVAC衍生，通过PCR研究了几个MVA基因组位置(ITR序列，左或右ITR过渡至内部独特区(左ITR/UR；UR/右ITR)，Del2，IGR69/70和Del3插入位点，和F1/F2和F2/F3重组位点)和缺失BAC载体序列。被wtMVA感染和未被感染的细胞，无样本(假)，或用MVA BAC进行PCR反应作为对照。图1F：限制性片段长度分析。通过KpnI和XhoI限制性酶消化比较了从纯化的sMVA(sMVA tv1和sMVA tv2)或wtMVA病毒分离的病毒DNA。
图2A–2D示出了sMVA复制特性。将由FPV HP1.441(sMVA hp)或来自两个独立sMVA病毒重构体(sMVA tv1和sMVA tv2)的TROVAC衍生的sMVA的复制特性与wtMVA进行了比较。图2A：病毒灶。使用抗痘苗多克隆抗体(αVAC)对被重构的sMVA病毒或wtMVA以低感染复数(MOI)感染的CEF进行免疫染色。图2B：复制动力学。BHK-21或CEF细胞以0.02MOI被sMVA或wtMVA感染，并测定了感染后24和48小时CEF上接种物和被感染细胞的病毒滴度。应用了Geisser-Greenhouse校正的混合效应模型；感染后24和48小时的组间差异不显著。图2C：病毒灶大小分析。BHK-21或CEF细胞单层以0.002MOI被sMVA或wtMVA感染，并在感染后24小时用αVAC抗体免疫染色后测定了病毒灶面积。图2D：宿主细胞范围分析。多个人细胞系(HEK293，A549，143b，和HeLa)，CEF，或BHK-21细胞以0.01MOI被sMVA或wtMVA感染，并测定了感染后48小时CEF上病毒滴度。点虚线表示基于0.01MOI计算的接种物的病毒滴度。图2C–2D中的组间差异使用单向ANOVA计算，然后进行Tukey(2C)或Dunnett(2D)多重比较检验。ns＝不显著。
图3A–3D显示了sMVA的体内免疫原性。通过体外分析将由FPV HP1.441(sMVA hp)或来自两个独立病毒重构体(sMVA tv1和sMVA tv2)的TROVAC衍生的sMVA与wtMVA进行了比较。C57BL/6小鼠每隔三周用低(1x107PFU)或高(5x107PFU)剂量的sMVA或wtMVA免疫两次。假免疫的小鼠用作对照。图3A：结合抗体。在第一次和第二次免疫后通过ELISA测量了由sMVA或wtMVA刺激的MVA特异性结合抗体(IgG滴度)。图3B：NAb反应。在针对表达GFP标志物的重组wtMVA的加强免疫后，测量了由sMVA或wtMVA诱导的MVA特异性NAb滴度。图3C–3D：T细胞反应。在使用B8R免疫显性肽进行离体抗原刺激后，通过流式细胞术测量了两次免疫后由sMVA或wtMVA诱导的MVA特异性IFNγ，TNFα，IL-4，和IL-10分泌CD8+(3C)和CD4+(3D)T细胞反应。使用带有Tukey多重比较检验的单向ANOVA评估了组间差异。ns＝不显著。
图4A–4D显示了sMVA的体内免疫原性。通过体外分析将由FPV株HP1.441(sMVA hp)或来自两个独立病毒重构体(sMVA tv1和sMVA tv2)的FPV株TROVAC衍生的sMVA与wtMVA进行了比较。C57BL/6小鼠(N＝4)在三周间隔内用低(1x107PFU)或高(5x107PFU)剂量的sMVA或wtMVA免疫两次。假免疫的小鼠用作对照。图4A：结合抗体。所示是在接受sMVA或wtMVA的小鼠中第一次和第二次免疫后通过ELISA测量的不同血清稀释的MVA特异性结合抗体(IgG滴度)在450nm处的吸光度。图4B：NAb反应。在针对表达GFP标志物的wtMVA的加强免疫后，测量了由sMVA或wtMVA诱导的MVA特异性NAb滴度。所示是在不同血清稀释下以平方像素(pix2x103)表示的被感染细胞的所测量GFP面积。图4C–4D：T细胞反应。在使用痘苗A19L免疫显性肽进行离体抗原刺激后，通过流式细胞术测量了用sMVA或wtMVA进行两次免疫后表达IFNγ，TNFα，IL-4，和IL-10的MVA特异性CD8+(4C)和CD4+(4D)T细胞。使用带有Tukey多重比较检验的单向ANOVA评估了组间差异。ns＝不显著。
图5A–5E示出了sMVA-CoV2载体的构建和表征。图5A：载体构建的示意图示。通过大肠杆菌中的细菌重组方法将S和N抗原序列(红色球和绿色三角形)插入到sMVA片段F2和F3中。将带有所插入的抗原序列的F1和F2的被修饰的sMVA片段和未被修饰的sMVA片段F1从大肠杆菌分离，并共转染到FPV感染的BHK-21细胞中以启动病毒重构。图5B：具有插入到常用MVA插入位点(Del2，IGR69/70，Del3)中的S和N抗原序列的单(sMVA-S，sMVA-N)和双(sMVA-N/S，sMVA-S/N)重组sMVA-CoV2载体的示意图。所有抗原均经由痘苗mH5启动子表达。ITR代表反向末端重复。图5C：PCR分析。用对含有(harbor)该N和S抗原序列的Del2和Del3插入位点特异性的引物或对F1/F2和F2/F3重组位点特异性的引物通过PCR评估了被sMVA-CoV2载体感染的CEF。图5D：蛋白质印迹。使用抗S1和N抗体(αS1和αN Abs)通过蛋白质印迹评估了被衍生自FPV HP1.441(sMVA-S/Nhp，sMVA-N/S hp)或TROVAC(sMVA-S/N tv，sMVA-N/S tv，sMVA-S tv，sMVA-N tv)的单和双重组sMVA-Cov2载体感染的BHK-21细胞的抗原表达。痘苗B5R蛋白被验证为感染对照。较高和较低分子量的条带可能代表成熟和不成熟的蛋白质种类。图5E：流式细胞术染色。使用抗S1，S2，和N抗体(αS1，αS2，和αN Abs)通过细胞表面和细胞内流式染色评估了被疫苗载体感染的HeLa细胞。活细胞用于评估细胞表面抗原表达。所固定的和渗透化细胞用于评估细胞内抗原表达。抗痘苗病毒抗体(αVAC)用作染色对照以验证MVA蛋白表达。如所示将被sMVA或wtMVA感染的细胞或未被感染的细胞用作C，D，和E实验的对照。C，D，和E的实验进行了两次，结果相似。
图6A–6D示出了sMVA-CoV2载体的体外表征。图6A–6C：免疫荧光成像。使用N和S特异性抗体通过免疫荧光共聚焦成像评估了均衍生自FPV HP1.441的单(sMVA-S和sMVA-N)和双(sMVA-S/N和sMVA-N/S)重组疫苗sMVA-CoV2载体在BHK-21(6A和6B)或HeLa(6C)细胞中的S和N抗原表达。在6B和6C中使用荧光缀合的小麦胚芽凝集素(WGA)对细胞膜进行染色。放大的插图位于图像下方。6A中的比例尺为50μm。6B和6C中的比例尺为10μm。所有图像代表具有相似结果的两个独立实验。图6D：流式细胞术双重染色。使用小鼠抗S2和兔抗N单克隆抗体然后是抗小鼠Alexa Fluor 488和抗兔Alexa Fluor 647进行双重染色通过细胞内流式细胞术分析对被衍生自FPV TROVAC(tv)或HP1.441(hp)的单(sMVA-N，sMVA-S)或双(sMVA-N/S，sMVA-S/N)重组sMVA-CoV2载体感染的HeLa细胞进行了分析。被S和N特异性抗体双重染色的细胞百分比显示在右上象限(Q2)。
图7A–7H显示了由sMVA-CoV2载体刺激的体液免疫反应。评估了用5x107PFU的衍生自FPV HP1.441(sMVA-S/N hp和sMVA-N/S hp)或TROVAC(sMVA-S/N tv，sMVA-N/S tv，sMVA-S tv，sMVA-N tv)的单和双重组sMVA-CoV2载体在三周间隔内免疫两次的Balb/c小鼠的SARS-CoV-2特异性体液免疫反应。图7A–7B：结合抗体。通过ELISA评估了在第一次(7A)和第二次(7B)免疫后由疫苗载体诱导的S，RBD，和N特异性结合抗体。7A和7B中的虚线表示在恢复期人血清中测量的中值结合抗体终点滴度(图9)。使用带有Tukey多重比较检验的单向ANOVA评估结合抗体终点滴度之间的差异。图7C：IgG2a/IgG1同型比率。使用1:10,000的血清稀释在第二次免疫后测量了IgG2a和IgG1同型的S，RBD，和N特异性结合抗体，并使用吸光度读数计算IgG2a/IgG1抗体比率。使用带有Dunnett多重比较检验的单向ANOVA比较每组平均IgG2a/IgG1比率与1的比率(平衡的Th1/Th2反应)。图7D–7G：NAb反应。在针对SARS-CoV-2假病毒(pv)(7D–7E)或免疫的小鼠的合并(pooled)血清中的感染性真(authentic)SARS-CoV-2病毒(7F–7G)进行第一次(7D，7F)和第二次(7E，7G)免疫后测量了由疫苗载体诱导的SARS-CoV-2特异性NAb(NT90滴度)。所示为在一式两份(7D–7E)或一式三份(7F–7G)感染中测量的平均NT90。N/A＝样本质量控制失败。点虚线表示分析中包含的最低抗体稀释。图7H：SARS-CoV-2/SARS-CoV-2pv相关性分析。使用感染性SARS-CoV-2病毒和SARS-CoV-2pv进行一次和两次免疫后小鼠血清中测量的NT90的相关性分析。皮尔逊相关系数(r)在H中计算。*p<0.05。ns＝不显著。
图8A–8G显示了由sMVA-CoV2载体诱导的体液免疫反应。所示为用5x107PFU的衍生自FPV HP1.441(sMVA-S/N hp和sMVA-N/S hp)或TROVAC(sMVA-S/N tv，sMVA-N/S tv，sMVA-S tv，sMVA-N tv)的单或双重组sMVA-CoV2载体在三周间隔内免疫两次的Balb/c小鼠(N＝5)中的抗体测量。图8A–8B：结合抗体。所示为使用在初免后两周(8A)或加强后一周(8B)收集的血清的连续稀释在450nm处进行的S，RBD，和N特异性ELISA测量。图8C：IgG2a/IgG1同型比率。使用1:10,000的稀释在加强后的小鼠血清中测量了IgG2a和IgG1同型的结合抗体。图8D–8G：NAb反应。所示为在从每组免疫的小鼠的合并血清中测量的SARS-CoV-2pv(8D–8E)和感染性真SARS-CoV-2(8F–8G)中和的百分比(％)。所示为在不同血清稀释下测得的一式两份(8D–8E)或一式三份(8F–8G)感染的平均％中和。由于质量控制失败，用sMVA tv和PBS(假)免疫的疫苗组未包括在8G所示的分析中。点虚线标记用于计算图7中的NT90的90％中和。
图9A–9C显示了恢复期免疫血清中的SARS-CoV-2特异性体液免疫反应。使用来自SARS-CoV-2恢复期个体的血浆样本的连续稀释经由ELISA测量了S，RBD，和N特异性结合抗体。图9A：来自单个样本(N＝19)的结合抗体曲线。图9B：将SARS-CoV-2恢复期血浆结合曲线组在一起并与来自SARS-CoV-2阴性个体的样本(N＝2)中测量的结合进行比较。图9C：在单个血浆样本中计算了对S，RBD，和N的终点结合抗体滴度。线代表中值终点滴度。由于评估的SARS-CoV-2阴性样本数量有限，因此未进行统计分析。
图10A–10B显示了由sMVA-CoV2载体诱导的体液免疫反应。用5x107PFU的衍生自FPV HP1.441(sMVA-S/N hp和sMVA-N/S hp)或TROVAC(sMVA-S/N tv，sMVA-N/S tv，sMVA-Stv，sMVA-N tv)的单和双重组sMVA-CoV2载体在三周间隔内免疫两次C57BL/6Nramp1小鼠(N＝5)并评估了SARS-CoV-2特异性体液免疫反应。图10A–10B：结合抗体。通过ELISA评估了在第一次免疫后两周(10A)和第二次免疫后一周(10B)的疫苗载体诱导的S，RBD，和N特异性结合抗体。10A和10B中的虚线表示在恢复期人血清中测量的中值结合抗体终点滴度(图9)。10A和10B中的数据表示为平均值+/-SD。使用带有Tukey多重比较检验的单向ANOVA比较用不同疫苗载体免疫的小鼠中结合抗体终点滴度之间的差异。图10C：IgG2c/IgG1同型比率。使用1:10,000的血清稀释在第二次免疫后测量了IgG2c和IgG1同型的S，RBD，和N特异性结合抗体，并使用吸光度读数计算IgG2c/IgG1抗体比率。使用带有Dunnett多重比较检验的单向ANOVA比较每组平均IgG2c/IgG1比率与1的比率(平衡的Th1/Th2反应)。线代表中值。*0.05<p<0.01，**0.01<p<0.001，***0.001<p<0.0001，****p<0.0001。ns＝不显著。
图11示出了评估用5x10^7PFU的衍生自FPV HP1.441(sMVA-S/N hp和sMVA-N/Shp)或TROVAC(sMVA-S/N tv，sMVA-N/S tv，sMVA-S tv，sMVA-N tv)的单和双重组sMVA-CoV2载体免疫的Balb/c小鼠的免疫血清的ADE效应。sMVA-COV2载体均未诱导感染的抗体依赖性增强(ADE)，包括临床株COH04S1的亲本分离物，sMVA-N/S tv。评估了中和(1:5,000)和非中和(1:50,000)稀释(在稳定转导的表达ACE2的HEK293T(HEK/ACE2)细胞上试验)促进SARS-CoV-2假病毒(pv)感染THP-1单核细胞表达荧光素酶。VSV-G pv用作感染对照。在感染后48小时一式两份地测量相对光单位(RLU)。点虚线代表阴性对照(在没有pv的情况下在细胞中测量的平均相对光单位(RLU))。虚线代表阳性对照(在没有血清且存在pv的情况下在细胞中测量的平均RLU)。使用带有Dunnett多重比较检验的双向ANOVA比较每组和血清稀释与阳性对照中的平均RLU。ns＝不显著；*p<0.05。
图12A–12D显示了由sMVA-CoV2载体刺激的细胞免疫反应。评估了用5x107PFU的衍生自FPV HP1.441(sMVA-S/N hp和sMVA-N/S hp)或TROVAC(sMVA-S/N tv，sMVA-N/S tv，sMVA-S tv，sMVA-N tv)的单或双重组sMVA-CoV2载体在三周间隔内免疫两次的Balb/c小鼠的SARS-CoV-2特异性细胞免疫反应。在使用SARS-CoV-2S和N特异性肽库进行离体抗原刺激后，通过流式细胞术评估了两次免疫后疫苗载体诱导的抗原特异性CD8+(12A和12B)和CD4+(12C和12D)T细胞反应的IFNγ，TNFα，IL-4，和IL-10分泌。由于技术问题，1–3只动物/组未包括在12C和12D的CD4/TNFα分析中。使用带有Tukey多重比较检验的单向ANOVA比较组间细胞因子特异性T-细胞百分比的差异。*p<0.05。ns＝不显著。
图13A–13C示出了流式细胞术门控策略。图13A：使用包括淋巴细胞>单细胞(singlets)>CD3+T-细胞>CD4+T-细胞和CD8+T-细胞>细胞因子阳性细胞的分级门控策略对用S和N肽库刺激的小鼠脾细胞进行细胞内染色分析。图13B–13C：对细胞因子阳性CD8+T-细胞(13B)和CD4+T-细胞(13C)进行门控的示例。用双重组sMVA-CoV2载体sMVA-N/S免疫的小鼠的脾细胞或不处理(无肽)，或用S或N肽池刺激16小时。每个点状图中的数字表示门控区域中的细胞百分比。
图14示出了sMVA-CoV2免疫的小鼠的T-细胞分泌的TNFα。评估了用5x107PFU的衍生自FPV HP1.441(sMVA-S/N hp和sMVA-N/S hp)或TROVAC(sMVA-S/N tv，sMVA-N/S tv，sMVA-S tv，sMVA-N tv)的单和双重组sMVA-CoV2载体免疫的Balb/c小鼠的脾细胞的TNFα分泌。用S或N肽库刺激小鼠脾细胞，48小时后通过ELISA测量了细胞培养上清液中的TNFα。从每个肽刺激样本中减去未刺激样本中定量的TNFα的量。与使用带有Dunnett多重比较检验的单向ANOVA的假免疫小鼠相比，*p<0.05。
图15A–15E显示了由sMVA-CoV2载体诱导的体液免疫反应。在单独或组合用单重组sMVA-CoV2载体sMVA-S和sMVA-N免疫的小鼠中评估了SARS-CoV-2特异性体液免疫反应。Balb/c小鼠(N＝5)在三周间隔内用高(5x107PFU)或低(1x107PFU)剂量的sMVA-S和sMVA-N免疫两次。经由相同免疫方案评估了用每种疫苗载体的高剂量或低剂量的一半进行联合免疫，以评估组合的载体对S和N抗原的SARS-CoV-2特异性免疫刺激。用空sMVA载体免疫的小鼠或假免疫的小鼠用作对照。图15A–15B：结合抗体。通过ELISA测定了在第一次和第二次免疫后对S，RBD，和N的抗原特异性结合抗体。虚线表示在恢复期人血清中测量的中值结合抗体终点滴度(图9)。使用带有Tukey多重比较检验的单向ANOVA比较用不同疫苗剂量免疫的小鼠与单独或组合用疫苗载体免疫的小鼠中结合抗体终点滴度之间的差异。图15C：IgG2a/IgG1同型比率。使用来自免疫的小鼠的加强后血清对不同抗原进行同型特异性ELISA后，计算了IgG2a/IgG1结合抗体与S，RBD，和N的比率。使用带有Dunnett多重比较检验的单向ANOVA比较每组平均值与1的比率(平衡的Th1/Th2反应)。图15D–15E：NAb滴度。通过使用SARS-CoV-2假病毒的中和试验在第二次免疫后的合并血清中测量了SARS-CoV-2特异性NAb反应。图15D示出的是预防90％ SARS-CoV-2假病毒感染的中和抗体滴度(NT90)。点虚线基线代表分析中包含的最小稀释。NT90<基线的组示出在基线处。E示出了使用合并血清的连续稀释测量的中和百分比。E中的点虚线标记90％中和。*p<0.05。
图16A–16B显示了sMVA-CoV2载体的体内免疫原性的细胞免疫反应。在单独或组合用sMVA-CoV2单重组载体sMVA-S和sMVA-N免疫的小鼠中评估了SARS-CoV-2特异性细胞免疫反应。Balb/c小鼠(N＝5)在三周间隔内用高(5x107PFU)或低(1x107PFU)剂量的sMVA-CoV2单重组sMVA-S和sMVA-N免疫两次。经由相同免疫方案评估了用每种疫苗载体的高剂量或低剂量的一半进行联合免疫，以评估组合的疫苗载体对S和N抗原的SARS-CoV-2特异性免疫刺激。用空sMVA载体免疫的小鼠或假免疫的小鼠用作对照。在使用SARS-CoV-2特异性S和N肽库进行离体抗原刺激后，通过流式细胞术染色评估了表达IFNγ，TNFα，和IL-2的抗原特异性CD8+T细胞和表达IFNγ的CD4+T细胞。单向ANOVA和Dunnett多重比较检验用于比较每组平均值与假免疫的小鼠的平均值。*p<0.05。ns＝不显著。
图17示出了SARS-CoV-2临床候选疫苗COH04S1，一种表达SARS-CoV-2S和N抗原的基于MVA病毒载体的合成疫苗(sMVA-N/S)。如所示编码该S和N抗原的基因序列被插入到Del3和Del2插入位点中。mH5＝被修饰的痘苗H5启动子；ITR＝反向末端重复；UR＝内部独特区。
图18显示了C46(又名sMVA-S/N)在临床前啮齿动物模型中诱导的针对SARS-CoV-2的有效结合抗体反应。虚线表示在恢复期人血清中测量的中值结合抗体终点滴度。绿色菱形代表C46(又名sMVA-S/N)，它是表达刺突抗原和核衣壳抗原的sMVA-CoV2双重组疫苗。蓝色圆圈代表sMVA-S，它是仅具有刺突抗原的单重组sMVA。红色方块代表sMVA-N，它是仅具有核衣壳抗原的sMVA-CoV2单重组体。棕色倒三角形代表没有SARS-CoV-2抗原的sMVA病毒载体。藏青三角形代表假疫苗接种。
图19显示了临床候选物COH04S1在临床前啮齿动物模型中诱导的有效细胞(T细胞)免疫反应。将由COH04S1(C35，sMVA-N/S)诱导的刺突和核衣壳特异性IFNγ，TNFα，和IL-4CD8+和CD4+反应与仅表达刺突的sMVA-CoV2单重组疫苗(sMVA-S)，空对照sMVA，假免疫动物，和用掺有明矾的刺突免疫的小鼠诱导的反应进行比较。COH04S1临床候选物诱导了稳健的(robust)刺突和核衣壳T细胞反应。
图20显示了表示Th1反应的接种C35(sMVA-N/S)的小鼠的体液和细胞反应。将用临床候选物COH04S1(sMVA-N/S)免疫的BALB/c小鼠的体液和细胞反应与仅表达刺突的sMVA(sMVA-S)，空对照sMVA，假免疫动物，和用掺有明矾的刺突免疫的小鼠诱导的反应进行比较。如趋向IgG1的抗体反应和趋向IL-4的T细胞反应所示，刺突/明矾免疫的动物在疫苗接种后产生Th2反应。临床候选物COH04S1(sMVA-N/S)免疫的小鼠表现出移向Th1的体液和细胞反应。
图21显示了临床候选物COH04S1在临床前啮齿动物模型中使用活SARS-CoV-2在HeLa-ACE2细胞上的斑块减少试验中诱导的有效SARS-CoV-2中和抗体反应。*NT50/90是示出50/90％感染中和的(含抗体)血清的稀释。
图22显示了临床候选物COH04S1在小鼠中使用真SARS-CoV-2病毒在易感细胞(VeroE6)上引发的有效SARS-CoV-2特异性中和抗体(NAb)。分析了用临床候选物COH04S1初免和初免-加强的小鼠血清的活SARS-CoV-2的中和，并将其与来自轻度至重度SARS-CoV-2感染个体的35个人血浆样本池中的中和进行了比较。
图23示出了基于sMVA的SARS-CoV2疫苗未诱导感染的抗体依赖性增强(ADE)。
图24示出了COH04S1在小鼠腹膜内(IP)和鼻内(IN)疫苗接种后诱导的强烈的免疫反应。临床候选物COH04S1用于IP或IN免疫Balb/c小鼠。将临床候选物COH04S1诱导的反应与掺有明矾的刺突蛋白和核衣壳蛋白诱导的体液和细胞反应进行比较。通过IgG和IgARBD-ELISA和真SARS-CoV-2病毒中和试验评估了初免后和加强后的抗体反应。在用S和N特异性肽库刺激脾细胞后，通过IFNγ-ELISPOT评估了T细胞反应。
图25A–25D示出了HLA转基因小鼠中SARS-CoV2sMVA构建体sMVA-N/S诱导的CD8+T-细胞反应。HLA-B*07:02(B7)转基因小鼠(n＝4)在三周间隔内用1X107PFU的SARS-CoV2sMVA构建体sMVA-N/S或sMVA对照载体(用FPV TROVAC重构)免疫两次。B7小鼠(n＝3)被假免疫作为额外的对照。加强免疫后一周评估了SARS-CoV-2特异性CD8+T细胞的产生。图25A–25D示出了细胞内细胞因子染色。分别用N肽库和S肽库进行离体抗原刺激后，通过细胞内细胞因子染色评估了核衣壳(25A和25C)和刺突特异性(25B和25D)CD8+T细胞的IFNγ，TNFα，和IL-4分泌。小图25A和25B示出了肽刺激后CD3+/CD8+T细胞分泌IFNγ，TNFα，或IL-4的百分比。小图25C和25D示出了肽刺激后CD8+T细胞分泌一种或多种细胞因子的相对频率。CD3+/CD8+群内细胞因子分泌细胞的总百分比显示在每个饼图中。25A和25B使用带有Dunnett多重比较检验的单向ANOVA。25A和25B中的数据表示为平均值±SD，*0.05<p<0.01，**0.01<p<0.001，***0.001<p<0.0001，****p<0.0001；ns＝不显著。
图26示出了用临床候选物COH04S1(sMVA-N/S)免疫的HLA-B*07:02(B7)转基因小鼠的T细胞反应。在用S和N肽库，S库亚池(1S1，2S1，S2)，和含有HLA-B*07:02限制性N特异性免疫显性表位SPRWYFYYL的N26肽刺激后，对分泌IFNγ的细胞进行ELISPOT分析。使用带有Dunnett多重比较检验的双向ANOVA。数据表示为平均值±SD；*0.05<p<0.01，**0.01<p<0.001，***0.001<p<0.0001，****p<0.0001；ns＝不显著。
图27示出了在用临床候选物COH04S1进行初免-加强免疫后老年小鼠产生了与年轻小鼠相当的免疫反应。临床候选物COH04S1用于免疫年轻(8周龄)，中年(40周龄)，和老年(80周龄)C57BL/6小鼠。对照动物是用掺有明矾的刺突蛋白和核衣壳蛋白免疫的同龄小鼠，和假免疫动物。使用SARS-CoV-2刺突假病毒在HEK-293/Ace2细胞上评估了中和抗体。用刺突肽亚池(1S1，2S1，和S2)和N肽刺激小鼠脾细胞后，使用小鼠IFNγELISPOT试验测量了T细胞反应。
图28示出了临床候选物COH04S1的免疫原性。COH04S1在Balb/C小鼠中表现出性别间相当的免疫原性，并且与S/N/Alum相比，对所有抗原都表现出Th1免疫力。
图29说明了仓鼠临床候选物C0H04S1疫苗研究设计。
图30示出了仓鼠在用1x10^8pfu的sMVA-CoV2疫苗构建体进行肌内(IM)或鼻内(IN)免疫后由sMVA-SARS-CoV-2载体和临床候选物COH04S1诱导的结合抗体的滴度。研究中使用的sMVA-CoV2疫苗是：C79(具有2P刺突序列的S2P/N双重组)；临床候选物COH04S1(C35/F4/B1，C35双重组体的双斑块纯化分离物)；C35/F4/D5(C35双重组体的双斑块纯化分离物)；C46/C3/F10(C46双重组体的双斑块纯化分离物)；C15(仅表达刺突的单重组体)；C35(双重组体，COH04S1临床分离物的亲本克隆)。sMVA空载体用作对照。
图31示出了在第42天测量的由sMVA-SARS-CoV-2载体和COH04S1临床候选物在仓鼠中诱导的中和抗体(PRNT)。仓鼠在第0天被初免并在第28天用1x10^8pfu的临床候选物COH04S1或sMVA-SARS-CoV-2载体进行肌内或鼻内加强。空载体sMVA免疫的仓鼠用作对照。使用Vero细胞在体外测量了中和真SARS-CoV-2病毒的抗体。PRNT试验在Bioqual(马里兰州盖瑟斯堡)使用SARS-CoV-2，分离物USA-WA1/2020进行。第42天的血清样本用于分析。
图32示出了用sMVA-CoV2载体或COH04S1免疫并在加强后两周用6x10^4pfu的真SARS-CoV-2病毒，分离物USA-WA1/2020挑战的仓鼠的体重变化。每天测量体重变化，持续10天。包括COH04S1的所有sMVA-CoV2载体均阻止了受挑战动物的严重体重减轻。
图33示出了用sMVA-CoV2载体肌内或鼻内免疫并在加强后两周用6x10^4pfu的真SARS-CoV-2病毒，分离物USA-WA1/2020挑战的仓鼠的体重变化。每天测量体重变化，持续10天。动物按免疫途径(上)或性别(下)分组。
图34示出了由临床候选物COH04S1在仓鼠中诱导的结合抗体和中和抗体。仓鼠在第0天被初免并在第28天用1x10^8pfu的临床候选物COH04S1进行肌内或鼻内加强。空载体sMVA免疫的仓鼠用作对照。所示为初免后(第28天)和加强后(第42天)在免疫的仓鼠中测量的对刺突，RBD，和核衣壳的终点结合抗体滴度(总IgG)。所示为IgG2/3和IgG1免疫球蛋白滴度与刺突，RBD，和核衣壳的比率，表明临床候选物COH04S1免疫的仓鼠中趋向Th1的反应。使用Vero细胞在体外测量了中和真SARS-CoV-2病毒的血清抗体。PRNT试验在Bioqual使用SARS-CoV-2，分离物USA-WA1/2020进行。第42天的血清样本用于分析。
图35示出了成功保护接种临床候选物COH04S1的仓鼠免受真SARS-CoV-2病毒的亚致死性挑战。仓鼠在加强免疫后两周用SARS-CoV-2，分离物USA-WA1/2020挑战，并每天测量体重变化，持续10天。粗线表示中值重量损失值。细线表示单个动物的体重减轻。
图36示出了挑战后第10天的病毒载量分析。在挑战后10天收集肺和鼻甲洗液，并分析SARS-CoV-2基因组RNA(gRNA)(图36A)和亚基因组RNA(sgRNA，图36B)的存在。肌内(IM)或鼻内(IN)给予临床候选物COH04S1成功阻止了SARS-CoV-2病毒在肺的复制并降低了鼻甲中的病毒载量。
图37示出了在雪貂中用临床候选物COH04S1进行肌内(IM)和鼻内(IN)疫苗接种诱导的强烈免疫反应。使用S-，RBD-，和N-IgG ELISA评估了结合抗体。使用真SARS-CoV-2病毒在VeroE6细胞上测量了中和抗体的滴度。使用雪貂IFNγ-ELISPOT测量了雪貂PBMC中的T细胞IFNγ反应。
图38说明了非洲绿猴(AGM)中的临床候选物COH04S1研究设计。用临床候选物COH04S1对AGM进行一次或两次免疫。仅初免研究(研究2)中的动物用2.5x10^8pfu免疫。初免-加强研究(研究1)中的AGM用1x10^8pfu免疫。
图39示出了在临床候选物COH04S1免疫的AGM中评估了T细胞反应。在用S和N肽库刺激新鲜分离的PBMC后，通过ELISPOT定量识别刺突(S)和核衣壳(N)的IFNγT细胞的水平。
图40示出了研究1(初免-加强)细胞反应。通过ELISPOT测量了来自初免-加强的AGM的加强后2周和5周(挑战时间)的新鲜分离的PBMC中IFNγ，IL-2，和IL-4对刺突(S)，核衣壳(N)，和膜(M)蛋白的反应。
图41示出了研究2(仅初免)细胞反应。通过ELISPOT测量了来自初免的AGM的初免后2周和5周(挑战时间)的新鲜分离的PBMC中IFNγ，IL-2，和IL-4对刺突(S)，核衣壳(N)，和膜(M)蛋白的反应。
图42示出了挑战后第2天和第4天通过qPCR对支气管肺泡灌洗(BAL)中基因组RNA(gRNA)的定量。
图43示出了研究1和研究2的挑战后第2，4，和7天通过TCID50终点稀释试验对支气管肺泡灌洗(BAL)中病毒载量的定量。
图44示出了假，sMVA，和临床候选物COH04S1初免和初免-加强的AGM中挑战后BAL病毒载量(TCID50)的比较。
图45A示出了直至第120天的DL1标记(sentinels)中S，RBD，和N特异性结合抗体终点滴度。图45B示出了直至第90天的DL2标记中S，RBD，和N特异性结合抗体终点滴度。图45C示出了直至第56天的DL3标记中S，RBD，和N特异性结合抗体终点滴度。
图46示出了直至初免后第120天的临床候选物COH04S1DL1/DL2/DL3标记中测量的针对S，RBD，和N的结合抗体终点滴度。在疫苗后第60天和第90天对11名接受了两剂基于刺突的EUA Pfizer-BioNTech SARS-CoV-2mRNA EUA疫苗的个体的血清进行了分析，且将来自35名在样本采集前出现轻度至重度SARS-CoV-2症状的SARS-CoV-2恢复期个体池的抗体滴度纳入比较。DL1＝4个标记d120，DL2＝5个标记d90，DL3＝6个标记d56，EUA＝14个样本d60，12个样本d90，康复者＝35个样本。
图47示出了DL1，DL2，和DL3标记中通过ELISA定量的对刺突(Wuhan D614G株)和刺突P.1巴西关注变体(VOC)的结合抗体随时间的比较(上图)。第56–60天针对DL1/DL2/DL3标记和EUA Pfizer/BioNTech疫苗接受者中的Wuhan D614G刺突和P.1刺突测量了ELISA终点滴度(下图)。
图48示出了使用来自具有D614G突变(D614G)和关注变体(VOC)B.1.1.7(UK)，B.1.351(RSA)和P.1(BRA)的SARS-CoV-2Wuhan株的刺突假病毒在DL1，DL2，和DL3标记中测量的直至引物免疫后90天的中和抗体滴度。
图49示出了使用来自具有D614G突变(D614G)和关注变体(VOC)B.1.1.7(UK)，B.1.351(RSA)和P.1(BRA)的SARS-CoV-2Wuhan株的刺突假病毒测量的中和抗体滴度。DL1和DL2标记在第56天进行了评估，DL3标记在第42天或第56天(如果可用)进行了评估，EUA-Pfizer疫苗接受者在第60天进行了评估。
图50示出了在初步分析中用临床候选物COH04S1(DL1)免疫的健康成年人产生了对S和N抗原的功能性T细胞反应。
图51示出了使用IFNγ/IL-4荧光斑点对用临床候选物COH04S1进行引物免疫后测量的DL1标记直至第120天，DL2标记直至第90天，和DL3标记直至第56天的S，N，和M特异性IFN-γ和IL-4T细胞反应。PBMC在刺突，核衣壳，或膜肽池存在的情况下体外培养48小时。
图52示出了用临床候选物COH04S1进行引物免疫后在DL1，DL2，和DL3标记中测量的直至120天的S，N，和M特异性IFN-γ和IL-4T细胞反应。
图53示出了引物免疫后第56–60天(上图)和第90天(下图)在临床候选物COH04S1标记和Pfizer/BioNTech疫苗接受者池中测量的IFN-γ和IL-4对S和N抗原的反应。COH04S1：d56/d90，EUA：d60/d90，减去D0反应。
图54A–54D示出了SARS-CoV-2VOC疫苗载体C163和C164的抗原表达。用VOC sMVA载体C163和C164或原始COH04S1sMVA-CoV2载体(C35)感染CEF细胞，并使用对S蛋白的S1和S2结构域具有特异性的抗体(αS1和αS2)或对N具有特异性的抗体(αN)通过蛋白质印迹进行了评估。分析了未感染的CEF细胞和用空sMVA载体感染的CEF细胞作为对照。检测了痘苗B5R蛋白(αB5R)以验证疫苗载体之间相似的感染水平。
图55A–55C示出了SARS-CoV-2VOC疫苗载体C170的抗原表达。用VOC sMVA载体C170或原始CIG04S1sMVA疫苗构建体(C35)感染CEF细胞，并使用对S蛋白的S1结构域具有特异性的抗体(αS1)或对N具有特异性的抗体(αN)通过蛋白质印迹进行了评估。分析了未感染的CEF细胞和用空sMVA载体感染的CEF细胞作为对照。检测了痘苗B5R蛋白(αB5R)以验证疫苗载体之间相似的感染水平。
图56说明了临床前疫苗生产过程的概况。
图57是图56的延伸并说明了从原始C35sMVA-N/S疫苗载体到临床疫苗候选物COH04S1的衍生。
图58示出了sMVA-N/S的序列(以登录号MW036243保藏于NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW036243.1/)。
图59示出了sMVA-S/N的序列(以登录号MW030460保藏于NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW030460.1/)。
图60示出了基于NCBI SARS-CoV-2参考株(#NC_045512)，分离的Wuhan-Hu-1的基因组序列的刺突(S)抗原序列的DNA序列/开放阅读框(ORF)(5’至3’端)。
图61示出了基于NCBI SARS-CoV-2参考株(#NC_045512)，分离的Wuhan-Hu-1的基因组序列的刺突(S)抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)。
图62示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的SARS-CoV-2S抗原序列的DNA序列/开放阅读框(ORF)(5’至3’端)，并通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化。
图63示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的SARS-CoV-2S抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)，并通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化。
图64示出了基于NCBI SARS-CoV-2参考株(#NC_045512)，分离的Wuhan-Hu-1的基因组序列的核衣壳(N)抗原序列的DNA序列/开放阅读框(ORF)(5’至3’端)。
图65示出了基于NCBI SARS-CoV-2参考株(#NC_045512)，分离的Wuhan-Hu-1的基因组序列的核衣壳(N)抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)。
图66示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的SARS-CoV-2N抗原序列的DNA序列/开放阅读框(ORF)(5’至3’端)，并通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化。
图67示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的SARS-CoV-2N抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)，并通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化。
图68示出了上面公开的密码子优化的S抗原序列的DNA序列/开放阅读框(ORF)(5’至3’端)(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行优化)，其被进一步修饰以编码具有2P改变(氨基酸986和987位的赖氨酸和缬氨酸被脯氨酸取代)的预融合稳定的S抗原。
图69示出了上面公开的密码子优化的S抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行优化)，其被进一步修饰以编码具有2P改变(氨基酸986和987位的赖氨酸和缬氨酸被脯氨酸取代)的预融合稳定的S抗原。
图70示出了上面公开的密码子优化的S抗原序列的DNA序列/ORF(5’至3’端)(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行优化)，其被进一步修饰以编码具有2P改变(氨基酸986和987位的赖氨酸和缬氨酸被脯氨酸取代)和突变的弗林蛋白酶切割位点(682–685位的RRAR氨基酸被GSAS取代)的预融合稳定的S抗原。
图71示出了上面公开的密码子优化的S抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行优化)，其被进一步修饰以编码具有2P改变(氨基酸986和987位的赖氨酸和缬氨酸被脯氨酸取代)和突变的弗林蛋白酶切割位点(682–685位的RRAR氨基酸被GSAS取代)的预融合稳定的S抗原。
图72示出了上面公开的密码子优化的S抗原序列的DNA序列/ORF(5’至3’端)(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行优化)，其被进一步修饰以编码具有2P改变(氨基酸986和987位的赖氨酸和缬氨酸被脯氨酸取代)，突变的弗林蛋白酶切割位点(682–685位的RRAR氨基酸被GSAS取代)，和在C-末端处缺失19个氨基酸残基以防止内质网滞留并增强细胞表面表达的预融合稳定的S抗原。
图73示出了上面公开的密码子优化的S抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行优化)，其被进一步修饰以编码具有2P改变(氨基酸986和987位的赖氨酸和缬氨酸被脯氨酸取代)，突变的弗林蛋白酶切割位点(682–685位的RRAR氨基酸被GSAS取代)，和在C-末端处缺失19个氨基酸残基以防止内质网滞留并增强细胞表面表达的预融合稳定的S抗原。
图74示出了SARS-CoV-2S抗原序列，其针对人表达进行了完全密码子优化，另外地通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化，并编码具有突变的弗林蛋白酶切割位点和稳定2P突变的S抗原。
图75示出了SARS-CoV-2S抗原序列，其针对痘苗病毒表达进行了完全密码子优化，另外地通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化，并编码具有突变的弗林蛋白酶切割位点和稳定2P突变的S抗原。
图76示出了SARS-CoV-2N抗原序列，其针对人表达进行了完全密码子优化，另外地通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化。
图77示出了SARS-CoV-2N抗原序列，其针对痘苗病毒表达进行了完全密码子优化，另外地通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化。
图78示出了基于Wuhan参考株(#NC_045512)的包含SARS-CoV-2S抗原的N-末端698个氨基酸残基的S1结构域的DNA序列/ORF(5’至3’端)且针对痘苗中的稳定性进行了优化。
图79示出了基于Wuhan参考株(#NC_045512)的包含SARS-CoV-2S抗原的N-末端698个氨基酸残基的S1结构域的所编码蛋白序列(N-至C-末端)且针对痘苗中的稳定性进行了优化。
图80示出了基于Wuhan参考株(#NC_045512)的包含SARS-CoV-2S抗原的N-末端680个氨基酸残基的S1结构域的DNA序列/ORF(5’至3’端)且针对痘苗中的稳定性进行了优化。
图81示出了基于Wuhan参考株(#NC_045512)的包含SARS-CoV-2S抗原的N-末端680个氨基酸残基的S1结构域的所编码蛋白序列(N-至C-末端)且针对痘苗中的稳定性进行了优化。
图82示出了基于Wuhan参考株(#NC_045512)的包含SARS-CoV-2S抗原的氨基酸残基331–524的RBD的DNA序列/ORF(5’至3’端)且针对融合至S抗原的信号肽(C-末端13个氨基酸)的痘苗中的稳定性进行了优化。
图83示出了基于Wuhan参考株(#NC_045512)的包含SARS-CoV-2S抗原的氨基酸残基331–524的RBD的所编码蛋白序列(N-至C-末端)且针对融合至S抗原的信号肽(C-末端13个氨基酸)的痘苗中的稳定性进行了优化。
图84示出了基于Wuhan参考株(#NC_045512)的包含SARS-CoV-2S抗原的氨基酸残基319–541的RBD的DNA序列/ORF(5’至3’端)且针对融合至S抗原的信号肽(C-末端13个氨基酸)的痘苗中的稳定性进行了优化。
图85示出了基于Wuhan参考株(#NC_045512)的包含SARS-CoV-2S抗原的氨基酸残基319–541的RBD的所编码蛋白序列(N-至C-末端)且针对融合至S抗原的信号肽(C-末端13个氨基酸)的痘苗中的稳定性进行了优化。
图86示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列的DNA序列/ORF(5’至3’端)并针对痘苗进行了优化，其被进一步修饰以编码包括在南非识别的B.1.351变异谱系的突变(N501Y，E484K，K417N，L18F，D80A，D215G，Del242–244，R246I，D614G，A701I)的S抗原。
图87示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)并针对痘苗进行了优化，其被进一步修饰以编码包括在南非识别的B.1.351变异谱系的突变(N501Y，E484K，K417N，L18F，D80A，D215G，Del242–244，R246I，D614G，A701I)的S抗原。
图88示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列的DNA序列/ORF(5’至3’端)并针对痘苗进行了优化，其被进一步修饰以编码包括在UK识别的B.1.1.7变异谱系的突变(N501Y，Del69/70，Del144，A570D，D614G，P681H，T716I，S982A，D1118H)的S抗原。
图89示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)并针对痘苗进行了优化，其被进一步修饰以编码包括在UK识别的B.1.1.7变异谱系的突变(N501Y，Del69/70，Del144，A570D，D614G，P681H，T716I，S982A，D1118H)的S抗原。
图90示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列的DNA序列/ORF(5’至3’端)并针对痘苗进行了优化，其被进一步修饰以编码包括在加利福尼亚识别的B.1.429+B.1.427变异谱系的突变(D614G，L452R，S13I，W152C)的S抗原。
图91示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)并针对痘苗进行了优化，其被进一步修饰以编码包括在加利福尼亚识别的B.1.429+B.1.427变异谱系的突变(D614G，L452R，S13I，W152C)的S抗原。
图92示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列的DNA序列/ORF(5’至3’端)并针对痘苗进行了优化，其被进一步修饰以编码包括在巴西识别的P.1变异谱系的突变(N501Y，E484K，K417T，L18F，T20N，P26S，D138Y，R190S，H655Y，T1027I，V1176F)的S抗原。
图93示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)并针对痘苗进行了优化，其被进一步修饰以编码包括在巴西识别的P.1变异谱系的突变(N501Y，E484K，K417T，L18F，T20N，P26S，D138Y，R190S，H655Y，T1027I，V1176F)的S抗原。
图94示出了编码Wuhan-Hu-1参考株S抗原的序列。
图95示出了编码南非变体B.1.351的S抗原的序列。
图96示出了编码UK变体B.1.1.7的S抗原的序列。
图97示出了由三重多顺反子表达构建体共表达的Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域的DNA序列/ORF(5’至3’端)，该三重多顺反子表达构建体在N-末端处包含S抗原的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)，其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS连接。
图98示出了由三重多顺反子表达构建体共表达的Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域的所编码蛋白序列(N-至C-末端)，该三重多顺反子表达构建体在N-末端处包含S抗原的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)，其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS连接。
图99示出了由三重多顺反子表达构建体共表达的Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域的DNA序列/ORF(5’至3’端)，该三重多顺反子表达构建体在N-末端处包含S抗原的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)且在C-末端处包含T4折叠子结构域(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)，其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS连接。
图100示出了由三重多顺反子表达构建体共表达的Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域的所编码蛋白序列(N-至C-末端)，该三重多顺反子表达构建体在N-末端处包含S抗原的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)且在C-末端处包含T4折叠子结构域(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)，其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS连接。
图101示出了由多顺反子表达构建体共表达的Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域的DNA序列/ORF(5’至3’端)，其中每个RBD结构域在N-末端处包含S抗原的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)，并且其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS和P2A和T2A肽连接。
图102示出了由多顺反子表达构建体共表达的Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域的所编码蛋白序列(N-至C-末端)，其中每个RBD结构域在N-末端处包含S抗原的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)，并且其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS和P2A和T2A肽连接。
图103示出了由多顺反子表达构建体共表达的Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域的DNA序列/ORF(5’至3’端)，其中该RBD结构域通过GS接头(GSGSGS)和P2A和T2A肽连接，并且其中每个RBD结构域在N-末端处与S信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)融合，在C-末端处与T4折叠子结构域(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)融合。
图104示出了由多顺反子表达构建体共表达的Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域的所编码蛋白序列(N-至C-末端)，其中该RBD结构域通过GS接头(GSGSGS)和P2A和T2A肽连接，并且其中每个RBD结构域在N-末端处与S信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)融合，在C-末端处与T4折叠子结构域(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)融合。
图105示出了由多顺反子表达构建体共表达的Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域的DNA序列/ORF(5’至3’端)，其中该多顺反子表达构建体在N-末端处包含S抗原的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)，在C-末端处包含S抗原的TM和CT结构域(没有最后19个氨基酸)，并且其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS连接。
图106示出了由多顺反子表达构建体共表达的Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域的所编码蛋白序列(N-至C-末端)，其中该多顺反子表达构建体在N-末端处包含S抗原的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)，在C-末端处包含S抗原的TM和CT结构域(没有最后19个氨基酸)，并且其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS连接。
图107示出了由多顺反子表达构建体共表达的Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域的DNA序列/ORF(5’至3’端)，其中每个RBD结构域在N-末端处包含S蛋白的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)，在C-末端处包含S抗原的TM和CT结构域(没有最后19个氨基酸)，并且其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS和P2A和T2A肽序列连接。
图108示出了由多顺反子表达构建体共表达的Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域的所编码蛋白序列(N-至C-末端)，其中每个RBD结构域在N-末端处包含S蛋白的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)，在C-末端处包含S抗原的TM和CT结构域(没有最后19个氨基酸)，并且其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS和P2A和T2A肽序列连接。
图109示出了密码子优化的N抗原的DNA序列/ORF(5’至3’端)，包括在UK识别的B.1.1.7变异谱系中的N特异性突变，包括N蛋白氨基酸3位的天冬氨酸至亮氨酸的取代(D3L)，N蛋白氨基酸235位的丝氨酸至苯丙氨酸的取代(S235F)，N蛋白氨基酸203位的精氨酸至赖氨酸的取代(R203K)，N蛋白氨基酸204位的甘氨酸至精氨酸的取代(G204R)。
图110示出了密码子优化的N抗原的所编码蛋白序列(N-至C-末端)，包括在UK识别的B.1.1.7变异谱系中的N特异性突变，包括N蛋白氨基酸3位的天冬氨酸至亮氨酸的取代(D3L)，N蛋白氨基酸235位的丝氨酸至苯丙氨酸的取代(S235F)，N蛋白氨基酸203位的精氨酸至赖氨酸的取代(R203K)，N蛋白氨基酸204位的甘氨酸至精氨酸的取代(G204R)。
图111示出了密码子优化的N抗原的DNA序列/ORF(5’至3’端)，包括在南非识别的B.1.351变异谱系中的N特异性突变，包括N蛋白氨基酸205位的苏氨酸至异亮氨酸的取代(T205I)。
图112示出了密码子优化的N抗原的所编码蛋白序列(N-至C-末端)，包括在南非识别的B.1.351变异谱系中的N特异性突变，包括N蛋白氨基酸205位的苏氨酸至异亮氨酸的取代(T205I)。
图113示出了密码子优化的N抗原的DNA序列/ORF(5’至3’端)，包括在巴西识别的P.1变异谱系中的N特异性突变，包括N蛋白氨基酸80位的脯氨酸至精氨酸的取代(P80R)以及R203K和G204R。
图114示出了密码子优化的N抗原的所编码蛋白序列(N-至C-末端)，包括在巴西识别的P.1变异谱系中的N特异性突变，包括N蛋白氨基酸80位的脯氨酸至精氨酸的取代(P80R)以及R203K和G204R。
图115示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列的DNA序列/ORF(5’至3’端)并针对痘苗进行了优化，其被进一步修饰以编码S抗原，该S抗原包括在印度识别的B.1.617变异谱系的突变，包括RBD结构域中的L452R和E484Q突变，D614G，S蛋白氨基酸142位的甘氨酸至天冬氨酸的取代(G142D)，S蛋白氨基酸154位的谷氨酸至赖氨酸的取代(E154K)，S蛋白氨基酸681位的脯氨酸至赖氨酸的取代(P681R)，S蛋白氨基酸1071位的谷氨酰胺至组氨酸的取代(Q1071H)，和S蛋白氨基酸1101位的组氨酸至天冬氨酸的取代(H1101D)。
图116示出了基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)的密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)并针对痘苗进行了优化，其被进一步修饰以编码S抗原，该S抗原包括在印度识别的B.1.617变异谱系的突变，包括RBD结构域中的L452R和E484Q突变，D614G，S蛋白氨基酸142位的甘氨酸至天冬氨酸的取代(G142D)，S蛋白氨基酸154位的谷氨酸至赖氨酸的取代(E154K)，S蛋白氨基酸681位的脯氨酸至赖氨酸的取代(P681R)，S蛋白氨基酸1071位的谷氨酰胺至组氨酸的取代(Q1071H)，和S蛋白氨基酸1101位的组氨酸至天冬氨酸的取代(H1101D)。
图117示出了密码子优化的SARS-CoV-2N抗原序列的DNA序列/ORF(5’至3’端)，其编码的N抗原包括在印度识别的B.1.617变异谱系中的N特异性突变，包括N蛋白氨基酸203位的精氨酸至甲硫氨酸的取代(R203M)和N蛋白氨基酸377位的天冬氨酸至酪氨酸的取代(D377Y)。
图118示出了密码子优化的SARS-CoV-2N抗原序列的所编码蛋白序列(N-至C-末端)，其编码的N抗原包括在印度识别的B.1.617变异谱系中的N特异性突变，包括N蛋白氨基酸203位的精氨酸至甲硫氨酸的取代(R203M)和N蛋白氨基酸377位的天冬氨酸至酪氨酸的取代(D377Y)。
发明详述
本文公开了产生表达一个或多个编码冠状病毒抗原的异源基因序列的重组sMVA(rsMVA)的方法。在PCT申请号PCT/US21/16247中产生并公开了来自环化或线性化合成DNA片段的MVA的完全合成形式(sMVA)，其内容通过引用整体并入本文。sMVA或rsMVA可用作预防和治疗多种病症如冠状病毒感染和相关疾病的疫苗。
自2019年12月爆发新型严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)以来，该病毒已传播到全球200多个国家，造成全球范围内的大流行，导致超过300万人死亡。目前正在快速开发许多疫苗候选物以控制这一全球大流行，其中一些已以前所未有的速度进入临床试验。大多数这些方法都采用刺突(S)蛋白的抗原形式，因为它被认为是保护性免疫的主要目标16,20–22。S蛋白通过与血管紧张素转换酶2(ACE)结合介导SARS-CoV-2进入宿主细胞，并且是中和抗体(NAb)的主要靶标23–25。对恒河猴的研究表明，基于S抗原的疫苗策略可以在该相关动物模型中预防SARS-CoV-2感染和疾病18，这表明S抗原可能足以作为疫苗免疫原来引发保护性免疫。然而，最近的一项研究表明，即使没有可测量的NAb的患者也可以从SARS-CoV-2感染恢复，这表明针对SARS-CoV-2感染的保护通过对多种免疫显性抗原(包括S和核衣壳(N)抗原)的体液和细胞免疫介导20,26。在本公开中，术语“S蛋白”和“S抗原”可互换使用，术语“N蛋白”和“N抗原”可互换使用。
本文公开了一种基于独特设计的三质粒系统的新型疫苗平台，可从化学合成的DNA有效地生成重组MVA载体。为了应对持续的全球SARS-CoV-2大流行，这种新型疫苗平台可用于快速生产共表达SARS-CoV-2S和N抗原或任何其他抗原的sMVA载体。这些用于疫苗生产的抗原可以基于Wuhan参考株，或包括一个或多个基于新出现VOC的突变。如工作示例所示，这些sMVA载体在小鼠体内诱导了有效的SARS-CoV-2抗原特异性体液和细胞免疫，包括有效的NAb。这些结果强调从化学合成的DNA有效产生重组MVA载体和快速开发基于合成痘病毒的疫苗候选物以预防SARS-CoV-2感染的可行性。
本文公开了MVA的合成形式和使用化学合成的DNA产生其的方法，这不同于最近描述的产生合成马痘病毒疫苗载体的方法42。在某些实施例中，单个DNA片段衍生自病毒DNA或为化学合成的并且包含MVA的整个基因组序列。该单个DNA片段可用于转染宿主细胞，从而重构MVA。在其他实施例中，使用两个或更多个天然衍生或化学合成的DNA片段或其组合来共转染宿主细胞，其中每个DNA片段包含MVA基因组DNA的部分序列，两个相邻的DNA片段的末端处具有重叠序列，使得当该两个或更多个DNA片段被共转染到该宿主细胞中时，它们通过同源重组彼此组装以形成包含想要的MVA基因组的全长序列的MVA。在某些实施例中，该重叠序列的长度在约100bp和约5000bp之间。
在某些实施例中，可以进一步修饰包含MVA基因组或亚基因组DNA的一个或多个天然衍生或化学合成的DNA片段以形成由天然和合成的MVA基因组DNA序列组成的人工杂交片段。
在某些实施例中，在转染一个或多个包含该MVA基因组或亚基因组DNA的序列的DNA片段之前，期间，或之后，该宿主细胞被辅助病毒如FPV感染。
如本文所示，所公开的生成sMVA的技术涉及使用三个具有固有HL和CR序列的大环状DNA片段(约60kbp)(图1)，Noyce等人产生合成马痘疫苗的方法涉及使用多个较小的线性DNA片段(约10–30kbp)并添加末端HL序列42。由于这三个sMVA片段以环状形式用于sMVA重构过程，因此它们很容易作为BAC在大肠杆菌中维持，并转移至BHK-21细胞用于sMVA病毒重构，无需额外的纯化步骤或修饰。这一特征极大地有助于通过高效细菌重组技术将异源抗原序列插入sMVA DNA并产生重组sMVA疫苗载体。另外地，三质粒系统为快速产生含有插入到不同MVA插入位点中的多个抗原的重组MVA提供了灵活性，这在通过常规转染/感染过程生成重组MVA时可能特别费力3,43。三个sMVA片段有效地彼此重组并产生合成形式的MVA，它在基因组含量，复制特性，宿主细胞范围，和免疫原性方面与wtMVA几乎相同。
更具体而言，如图1A所示，MVA基因组包含内部独特区(UR)，侧翼为～9.6kbp长的反向末端重复(ITR)区。Antoine及同事公布的MVA基因组序列(登录号#U94848)，本文称为MVA株Antoine，其与1974年获得许可并可商购的国立卫生研究院克隆1(MVA NIH克隆1)的MVA基因组的不同在于内部UR中的五个碱基对，其在序列上与MVA株Acambis(登录号#AY603355)所公布的基因组序列相同。sMVA片段1(F1)包含该MVA基因组的左ITR和～50kbp的内部UR的左端；sMVA片段2(F2)包含该MVA基因组～60kbp的内部UR的中间部分；和sMVA片段3(F3)包含该MVA基因组～50kbp的内部UR的右端和右ITR(图1B)。sMVAF1和F2以及sMVAF2和F3被设计为共享～3kbp的重叠序列以允许通过同源重组重构完整的MVA基因组(图1B)。将侧翼为MVA多联体解析序列的165个核苷酸长的MVA末端发夹环(HL)的双链体拷贝添加至三个片段中的每一个的两端，以促进MVA基因组的解析和包装(图1C)。这三个sMVA片段通过称为pCCI-Brick(GeneScript)的酵母-细菌穿梭载体在大肠杆菌(DH10B，EPI300，GS1783)中克隆和维持，其包含细菌mini-F复制子元件，可用作BAC载体以在细菌中以低拷贝数稳定繁殖该三个片段(图1)。下一代测序分析证实了片段的MVA基因组序列的完整性，除了位于021L下游3bp处非编码决定区的sMVA片段F1内的未知单点突变。
当幼仓鼠肾(BHK)与含有sMVA片段F1–F3的三个质粒共转染(图1)，随后被作为辅助病毒的鸡痘病毒(FPV)感染时，该三个sMVA片段通过共享的同源序列彼此重组并启动合成MVA(sMVA)的重构(图3D)。FPV用作辅助病毒以启动sMVA DNA的转录，从而启动sMVA重构过程。在没有辅助病毒的情况下，“裸(naked)”sMVA DNA可能不会促进病毒重构，因为痘病毒DNA被认为是非感染性的。重要的是，虽然BHK-21细胞高度容许MVA感染和复制，但它们不容许生产性FPV感染，导致在BHK-21细胞中重构sMVA病毒后立即去除FPV辅助病毒。另外地，在哺乳动物细胞中用作辅助病毒的FPV促进了痘苗病毒基因组的高效和选择性包装。
还公开了使用基于sMVA的高度通用的合成疫苗平台的多抗原sMVA-CoV2疫苗。MVA是一种高度减毒的痘病毒载体，广泛用于开发感染性疾病和癌症疫苗。在人的安全性，有效性，和长期保护方面有着悠久的历史。SARS-CoV-2的新刺突变体可以快速克隆到三个质粒中的一个，重组后形成sMVA疫苗。
如本文所公开，多个抗原，其亚单位，或其片段可以使用相同的启动子或不同的启动子共表达，任选地通过2A肽连接。编码多个抗原，其亚单位，或其片段的序列可以插入到sMVA的相同插入位点或不同插入位点处。例如，包含编码至少两个S或N蛋白，S1或S2结构域，或RBD的两个或更多个抗原的该疫苗组合物使用相同的启动子或不同的启动子或相同的插入位点或不同的插入位点共表达。在另一个示例中，包含编码至少两个S或N蛋白，S1或S2结构域，或RBD的两个或更多个抗原的该疫苗组合物通过2A肽连接并通过相同启动子的多顺式构建体共表达。
在某些实施例中，本文公开的该疫苗组合物包含两个或更多个sMVA载体的混合物，其编码两个或更多个选自Wuhan-Hu-1参考株和不同VOC的不同SARS-CoV-2抗原序列。例如，该混合物中的一个sMVA载体包含编码来自Wuhan-Hu-1参考株的SARS-CoV-2抗原的序列，而该混合物中的另一个sMVA载体包含编码来自VOC的SARS-CoV-2抗原的序列。
MVA是一种高度减毒的痘苗株。哺乳动物细胞包括人细胞对MVA是容许的，繁殖仅限于鸟类细胞。MVA还具有多抗原能力(30Kb)并且可以容易被修饰以组装针对病毒变体的新疫苗，例如，UK或RSA变体。MVA是一种减毒病毒疫苗，与DNA/RNA/蛋白疫苗相比，在免疫原性方面具有优势。MVA能够产生长效的高滴度体液和高频细胞免疫反应，保持冻干物(lyophilizate)的免疫原性以消除冷链，从而降低储存和运输成本。自1970年代以来，基于MVA的疫苗的安全性和有效性在人体试验中得以确立。超过150,000人在历史研究中成功免疫，包括儿童和老人。由NIAID赞助的多项研究表明，在感染HIV的成年人中免疫后是安全的。基于FDA批准的JynneosTM(巴伐利亚-北欧)，MVA适用于提供针对天花的终身免疫力。COH已经开发并成功研究了多种基于MVA的疫苗。健康的志愿者和移植患者即使在单剂后也会产生强大的免疫力。
与目前使用的大多数其他仅依赖S抗原的SARS-CoV-2疫苗方法相比，所公开的使用sMVA的SARS-CoV-2疫苗方法采用S和N抗原的免疫刺激，两者都与保护性免疫有关20,26。观察到共表达S和N抗原的sMVA-CoV2载体可以刺激针对SARS-CoV-2假病毒和感染性真SARS-CoV2病毒体的有效NAb，这表明它们可以引发被认为可有效预防SARS-CoV-2感染和COVID-19疾病的抗体16 , 18 , 20 , 21。工作示例显示了疫苗载体刺激了趋向Th1的抗体和细胞免疫反应，这被认为是避免疫苗相关联增强呼吸疾病的首选抗病毒适应性免疫反应44 , 45。此外，没有发现疫苗诱导的免疫血清促进Fc介导的ADE的证据，这表明疫苗载体诱导的抗体反应对ADE介导的免疫病理学的风险最小，这是SARS-CoV-2疫苗开发中普遍关注的问题44 , 45。除了靶向S抗原的NAb之外，其他免疫反应可能有助于防止SARS-CoV-2感染，这一发现突显了这一点，即纵使没有可测量的NAb的患者也可以从SARS-CoV-2感染恢复20。虽然抗体对于预防最初获得SARS-CoV-2可能特别重要，但T细胞反应可能会采取额外的对策来控制病毒感染局部部位的散发性病毒传播，从而限制病毒传播。所公开的基于sMVA的双重组疫苗方法可诱导对S和N抗原的稳健体液和细胞免疫反应，与仅使用S抗原的其他疫苗方法相比，可以提供针对SARS-CoV-2感染的保护。
通过将编码一个或多个抗原或其亚单位的序列插入一个或多个MVA片段中来产生sMVA重组体。在某些实施例中，该抗原，亚单位，或其片段的DNA序列针对在该宿主细胞中的表达进行了密码子优化。在某些实施例中，该一个或多个抗原包括人冠状病毒抗原，如S蛋白，N蛋白，M蛋白，E蛋白，木瓜样蛋白酶，ORF1A，3CL蛋白酶，ORF1B，内切核糖核酸酶，基质，解旋酶，或其免疫原性片段。在某些实施例中，该一个或多个抗原包括S蛋白的亚单位，如S1和S2结构域，或S抗原的受体结合结构域(RBD)。在某些实施例中，该一个或多个抗原包括预融合形式的S抗原和突变的S抗原。例如，该SARS-CoV-2S抗原可以通过包含突变的弗林蛋白酶切割位点而进一步稳定，使得氨基酸残基682–685RRAR突变为GSAS。在另一个示例中，S抗原的赖氨酸986和缬氨酸987被脯氨酸取代。在某些实施例中，该S抗原和该N抗原是完全成熟的或完全糖基化的。
在某些实施例中，sMVA-N/S(以登录号MW036243保藏于NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW036243.1/)的序列在图58示出。
在某些实施例中，sMVA-S/N(以登录号MW030460保藏于NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW030460.1/)的序列在图59示出。
如本文所公开，可以将多个SARS-CoV-2抗原的序列插入sMVA载体中以获得该疫苗组合物。本文使用的一些抗原的序列公开如下。在一个实施例中，刺突(S)抗原序列基于NCBI SARS-CoV-2参考株(#NC_045512),分离的Wuhan-Hu-1的基因组序列，其编码包含1273个氨基酸的S蛋白。DNA序列/开放阅读框(ORF)(5’至3’端)如图60所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图61所示。
在另一个示例中，该SARS-CoV-2S抗原序列基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化。COH04SL1(也称为构建体C15，在图5中示为sMVA-S)，COH04SL3(也称为构建体C35，在图5中示为sMVA-N/S)，和COH04SL4(也称为构建体C46，在图5中示为sMVA-S/N)，以及临床构建体COH04S1(图17，如图57所示COH04S1衍生自C35sMVA-N/S疫苗构建体(图5))中使用的DNA/序列/ORF(5’至3’端)如图62所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图63所示。
在一个实施例中，该核衣壳(N)抗原序列基于NCBI SARS-CoV-2参考株(#NC_045512)，分离的Wuhan-Hu-1的基因组序列，其编码由419个氨基酸组成的N蛋白。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图64所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图65所示。
在另一个示例中，该SARS-CoV-2N抗原序列基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化。COH04SL2(也称为构建体C13，在图5中示为sMVA-N)，COH04SL3(也称为构建体C35，在图5中示为sMVA-N/S)，和COH04SL4(也称为构建体C46，在图5中示为sMVA-S/N)，以及临床构建体COH04S1(图17，如图57所示COH04S1衍生自C35sMVA-N/S疫苗构建体(图5))中使用的DNA/序列/ORF(5’至3’端)如图66所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图67所示。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2S抗原序列被修饰以编码具有2P改变(氨基酸986和987位的赖氨酸和缬氨酸被脯氨酸取代)的预融合稳定的S抗原。例如，上面公开的密码子优化的S抗原序列(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行了优化)被进一步修饰以编码这样的S抗原。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图68所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图69所示。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2S抗原序列被修饰以编码具有2P改变(氨基酸986和987位的赖氨酸和缬氨酸被脯氨酸取代)和突变的弗林蛋白酶切割位点(682–685位的RRAR氨基酸被GSAS取代)的预融合稳定的S抗原。例如，上面公开的密码子优化的S抗原序列(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行了优化)被进一步修饰以编码这样的S抗原。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图70所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图71所示。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2S抗原序列被修饰以编码具有2P改变(氨基酸986和987位的赖氨酸和缬氨酸被脯氨酸取代)，突变的弗林蛋白酶切割位点(682–685位的RRAR氨基酸被GSAS取代)，和在C-末端处缺失19个氨基酸残基(KFDEDDSEPVLKGVKLHYT)以防止内质网滞留并增强细胞表面表达的预融合稳定的S抗原。例如，上面公开的密码子优化的S抗原序列(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行了优化)被进一步修饰以编码这样的S抗原。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图72所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图73所示。
在另一个示例中，该SARS-CoV-2S抗原序列针对人表达进行了完全密码子优化，另外地通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化，并编码具有突变的弗林蛋白酶切割位点和稳定2P突变的S抗原，如图74所示。
在另一个示例中，该SARS-CoV-2S抗原序列针对痘苗病毒表达进行了完全密码子优化，另外地通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化，并编码具有突变的弗林蛋白酶切割位点和稳定2P突变的S抗原，如图75所示。
在一个示例中，该SARS-CoV-2N抗原序列针对人表达进行了完全密码子优化，另外地通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化，如图76所示。
在另一个示例中，该SARS-CoV-2N抗原序列针对痘苗病毒表达进行了完全密码子优化，另外地通过沉默密码子改变以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸而针对痘苗中的稳定性进行优化，如图77所示。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2S抗原序列仅编码包含该S蛋白N-末端的698，685，或680个氨基酸残基或甚至更短氨基酸序列的S1结构域。例如，该S抗原序列基于Wuhan参考株(#NC_045512)并如上面所公开针对痘苗中的稳定性进行了优化，其编码的S1结构域包含SARS-CoV-2S抗原N-末端的698个氨基酸残基。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图78所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图79所示。
在另一个示例中，该SARS-CoV-2S抗原序列基于Wuhan参考株(#NC_045512)并如上面所公开针对痘苗中的稳定性进行了优化，其编码的S1结构域包含该SARS-CoV-2S抗原的680个氨基酸残基。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图80所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图81所示。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2S抗原序列仅编码包含该S抗原的氨基酸残基331至524或319至541的受体结合结构域(RBD)，或其包含该RBD结构域的更长或更短的片段。例如，该S抗原序列基于Wuhan参考株(#NC_045512)并如上面所公开针对痘苗中的稳定性进行了优化，其编码的RBD包含与该S抗原的信号肽(C-末端13个氨基酸，包含MFVFLVLLPLVSS)融合的该SARS-CoV-2S抗原的氨基酸残基331–524。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图82所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图83所示。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2S抗原序列基于Wuhan参考株(#NC_045512)并如上面所公开针对痘苗中的稳定性进行了优化，其编码的RBD包含与该S抗原的信号肽(C-末端13个氨基酸，包含MFVFLVLLPLVSS)融合的该SARS-CoV-2S抗原的氨基酸残基319–541。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图84所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图85所示。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2S抗原序列编码的S抗原在该S抗原的任何氨基酸位置包含一个或多个突变或改变。这些突变或改变可包括氨基酸取代，插入，或缺失。这些突变可能涉及免疫逃避，使SARS-CoV-2对某些体液和细胞免疫反应产生抗性，包括中和抗体(NAb)。该突变可能包括RBD结构域(氨基酸残基319–541)中的一个或多个改变，其介导与宿主细胞的结合和进入宿主细胞，并且是NAb的主要靶标。例如，该RBD突变可以包括在S抗原氨基酸501位的天冬酰胺至酪氨酸的取代(N501Y)；该S抗原氨基酸484位的谷氨酸至赖氨酸的取代(E484K)；该S抗原氨基酸484位的谷氨酸至谷氨酰胺的取代(E484Q)；该S抗原氨基酸417位的赖氨酸至天冬酰胺的取代(K417N)；该S抗原氨基酸417位的赖氨酸至苏氨酸的取代(K417T)；该S抗原氨基酸452位的亮氨酸至精氨酸的取代(L452R)；该S抗原氨基酸477位的丝氨酸至天冬酰胺的取代(S477N)；该S抗原氨基酸439位的天冬酰胺至赖氨酸的取代(N439K)；该S抗原氨基酸494位的丝氨酸至脯氨酸的取代(S494P)；该S抗原氨基酸520位的丙氨酸至丝氨酸的取代(S520S)；该S抗原氨基酸453位的酪氨酸至苯丙氨酸的取代(Y453F)。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2S抗原序列编码的S抗原包含或包括发生在SARS-CoV-2及其许多新出现变体中的显性突变，即D614G突变(S抗原氨基酸614位的天冬氨酸至甘氨酸的取代)。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2抗原序列编码的S抗原包括所有突变，该突变的子集，或出现在特别关注的新出现SARS-CoV-2变体(关注变体，或VOC)中的突变组合，如在南非首次识别的B.1.351变异谱系，在英国(UK)首次识别的B.1.1.7变异谱系，在巴西首次识别的P.1变异谱系，在加利福尼亚识别的B.1.429+B.1.427变异谱系，或在印度首次识别的B.1.617变异谱系。也可以使用具有基于PANGO工具(cov-lineages.org)或GISAID(gisaid.org)描述的其他SARS-CoV-2变异谱系的突变的被修饰的抗原序列。例如，该SARS-CoV-2S抗原序列可能编码的S抗原包含在南非变体中识别的B.1.351变异谱系的突变，包括RBD结构域中的N501Y，E484K，和K417N取代，D614G突变，该S抗原氨基酸18位的亮氨酸至苯丙氨酸的取代(L18F)，该S抗原氨基酸80位的天冬氨酸至丙氨酸的取代(D80A)，该S抗原氨基酸215位的天冬氨酸至甘氨酸的取代(D215G)，该S抗原242–244位三个氨基酸(亮氨酸，丙氨酸，亮氨酸)的缺失(Del242–244)，该S抗原氨基酸246位的精氨酸至异亮氨酸的取代(R246I)，和该S抗原氨基酸701位的丙氨酸至缬氨酸的取代(A701V)。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2S抗原序列编码的S抗原包括在UK识别的B.1.1.7变异谱系的突变，包括RBD中的N501Y，D614G，该S抗原69和70位两个氨基酸(组氨酸，缬氨酸)的缺失(Del69/70)，该S抗原144位的酪氨酸残基缺失(Del144)，该S抗原氨基酸570位的丙氨酸至天冬氨酸的取代(A570D)，该S抗原氨基酸681位的脯氨酸至组氨酸的取代(P681H)，该S抗原氨基酸716位的苏氨酸至异亮氨酸的取代(T716I)，该S抗原氨基酸982位的丝氨酸至丙氨酸的取代(S982A)，和该S抗原氨基酸1118位的天冬氨酸至组氨酸的取代(D1118H)。基于UK变体的所编码S抗原可以另外地包括E484K和K417N或K417T或如上文所公开的RBD结构域中的其他突变。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2S抗原序列编码的S抗原包括在巴西识别的P.1变异谱系的突变，包括D614G，N501Y，E484K，K417T，L18F，该S抗原氨基酸20位的苏氨酸至天冬酰胺的取代(T20N)，该S抗原氨基酸26位的脯氨酸至丝氨酸的取代(P26S)，该S抗原氨基酸138位的天冬氨酸至酪氨酸的取代(D138Y)，该S抗原氨基酸190位的精氨酸至丝氨酸的取代(R190S)，该S抗原氨基酸655位的组氨酸至酪氨酸的取代(H655Y)，该S抗原氨基酸1027位的苏氨酸至异亮氨酸的取代(T1027I)，和该S抗原氨基酸1176位的缬氨酸至苯丙氨酸的取代(V1176F)。所编码的S抗原可以另外地包括如上面所公开的RBD结构域中的其他突变，如L452R或Y453F。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2S抗原序列编码的S抗原包括在加利福尼亚识别的B.1.429+B.1.427变异谱系的突变，包括D614G，RBD中的L452R，该S抗原氨基酸13位的丝氨酸至异亮氨酸的取代(S13I)，和该S抗原氨基酸152的色氨酸至半胱氨酸的突变(W152C)。基于南加州变体的所编码的S抗原可能另外地包括N501Y，E484K，E484Q，或其他RBD突变。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2抗原序列编码的S抗原包含VOC中发生的不同突变的组合。例如，该S抗原序列可编码组合突变的S抗原，或仅编码发生在以下的突变子集：B.1.429+B.1.427和B.1.1.7变异谱系，B.1.429+B.1.427和B.1.351变异谱系，B.1.429+B.1.427和P.1变异谱系，B.1.1.7和B.1.351谱系，B.1.1.7和P.1谱系，B.1.351和P.1谱系，或这些谱系的其他组合。这些突变组合可另外地包括任何如上面所公开的RBD突变，如N501Y，E484K，K417N，K417T，L452R，S477N，N439K，S520S，和Y453F。
在另一个实施例中，上面公开的该密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行了优化)被进一步修饰以编码的S抗原包含在南非识别的B.1.351变异谱系的突变(N501Y，E484K，K417N，L18F，D80A，D215G，Del242–244，R246I，D614G，A701V)。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图86所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图87所示。
在另一个示例中，上面公开的该密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行了优化)被进一步修饰以编码的S抗原包括在UK识别的B.1.1.7变异谱系的突变(N501Y，Del69/70，Del144，A570D，D614G，P681H，T716I，S982A，D1118H)。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图88所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图89所示。
在另一个示例中，上面公开的该密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行了优化)被进一步修饰以编码的S抗原包含在加利福尼亚识别的B.1.429+B.1.427变异谱系的突变(D614G，L452R，S13I，W152C)。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图90所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图91所示。
在另一个示例中，上面公开的该密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行了优化)被进一步修饰以编码的S抗原包含在巴西识别的P.1变异谱系的突变(N501Y，E484K，K417T，L18F，T20N，P26S，D138Y，R190S，H655Y，T1027I，V1176F)。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图92所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图93所示。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2S抗原序列被进一步修饰以编码基于B.1.429+B.1.427，B.1.1.7，B.1.351，或P.1变异谱系的S抗原，其另外地包括稳定2P突变(赖氨酸986和缬氨酸987被脯氨酸取代(K986P和V987P)，突变的弗林蛋白酶切割位点(682–685RRAR至GSAS)，和/或C-末端19个氨基酸残基(KFDEDDSEPVLKGVKLHYT)缺失。
在另一个实施例中，使用具有不同密码子用法的不同SARS-CoV-2抗原序列以编码基于原始Wuhan-Hu-1参考株和B.1.429+B.1.427，B.1.1.7，B.1.351，或P.1变异谱系的不同S抗原。这些抗原序列可以一起插入到一个sMVA载体中，或使用不同的插入位点(例如，Del2，Del3，IGR69/70)插入到不同的sMVA载体中。例如，以下三个抗原序列可用于共表达Wuhan-Hu-1参考株，南非变体B.1.351，和UK变体B.1.1.7的S抗原。
编码Wuhan-Hu-1参考株的该S抗原的序列如图94所示，编码南非变体B.1.351的该S抗原的序列如图95所示，编码UK变体B.1.1.7的该S抗原的序列如图96所示。
在另一个实施例中，基于原始Wuhan-Hu-1参考株，或B.1.429+B.1.427，B.1.1.7，B.1.351，P.1，或B.1.617变体，或其他新出现SARS-CoV-2变体的多个不同的SARS-CoV-2RBD结构域(氨基酸残基319–541)可以通过使用不同的密码子用法从一个载体或从不同的载体共表达。这些RBD结构域可以各自通过其一个痘苗启动子(例如，mH5)共表达，或通过多顺反子表达构建体共表达，其中各RBD结构域通过不同的接头序列(例如，GS接头)或介导核糖体跳跃的小核糖核酸病毒的2A肽连接。另外地，这些结构域中的一个或多个可以在N-末端处与SARS-CoV-2信号序列(该S蛋白的前13或16个N-末端氨基酸)融合，在N-末端或C-末端处与介导三聚化的T4纤维蛋白折叠子结构域(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)融合，和/或在C-末端处与该SARS-CoV-2S蛋白的跨膜结构域(TM)和细胞质结构域(CT)融合，其中该CT结构域最后19个氨基酸可缺失以避免ER滞留并增强细胞表面表达。
例如，Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域可以通过三重多顺反子表达构建体共表达，该三重多顺反子表达构建体在N-末端处包含该S抗原的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)并且其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS连接。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图97所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图98所示。
在另一个实施例中，Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域可以通过三重多顺反子表达构建体共表达，该三重多顺反子表达构建体在N-末端处包含该S抗原的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)，在C-末端处包含T4折叠子结构域(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)且其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS连接。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图99所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图100所示。
在另一个示例中，Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域可以通过三重多顺反子表达构建体共表达，其中各RBD结构域在N-末端处包含该S抗原的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)且其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS和P2A和T2A肽连接。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图101所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图102所示。
在另一个示例中，Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域可以通过三重多顺反子表达构建体共表达，其中该RBD结构域通过GS接头(GSGSGS)和P2A和T2A肽连接且其中各RBD结构域在N-末端处融合至S信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)且在C-末端处融合至T4折叠子结构域(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图103所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图104所示。
在另一个示例中，Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351变体的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427变体的N501Y和L452R突变的RBD结构域可以通过多顺反子表达构建体共表达，该多顺反子表达构建体在N-末端处包含该S抗原的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)，在C-末端处包含该S抗原的TM和CT结构域(没有最后19个氨基酸)，并且其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS连接。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图105所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图106所示。
在另一个示例中，Wuhan-Hu-1参考株的该RBD结构域，B.1.351VOC的该RBD结构域，和结合B.1.1.7和B.1.429+B.1.427VOC的N501Y和L452R突变的RBD结构域可以通过多顺反子表达构建体共表达，其中每个RBD结构域在N-末端处包含该S蛋白的信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCV)，在C-末端处包含该S抗原的TM和CT结构域(没有最后19个氨基酸KFDEDDSEPVLKGVKLHYT)，并且其中该RBD结构域通过GS接头如GSGSGS和P2A和T2A肽序列连接。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图107所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图108所示。
在另一个实施例中，该SARS-CoV-2N抗原序列编码的N抗原在该N蛋白的不同氨基酸位置处包含一个或多个突变。这些突变或改变可包括氨基酸取代，插入，或缺失。这些突变可能基于发生在南非VOC B.1.351，加利福尼亚变体B.1.429+B.1.427，UK变体B.1.1.7，巴西变体P.1，印度变体B.1.617，或任何其他新出现SARS-CoV-2VOC的N特异性突变。
例如，该SARS-CoV-2N抗原序列编码的N抗原包括在UK识别的B.1.1.7变异谱系中发生的N特异性突变。这些突变包括该N蛋白氨基酸3位的天冬氨酸至亮氨酸的取代(D3L)，该N蛋白氨基酸235位的丝氨酸至苯丙氨酸的取代(S235F)，该N蛋白氨基酸203位的精氨酸至赖氨酸的取代(R203K)，和该N蛋白氨基酸204位的甘氨酸至精氨酸的取代(G204R)。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图109所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图110所示。
在另一个示例中，该密码子优化的SARS-CoV-2N抗原序列编码的N抗原包括在南非识别的B.1.351变异谱系中发生的N特异性突变。这包括在该N蛋白氨基酸205位的苏氨酸至异亮氨酸的取代(T205I)。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图111所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图112所示。
在另一个示例中，该密码子优化的SARS-CoV-2N抗原序列编码的N抗原包括在巴西识别的P.1变异谱系中发生的N特异性突变。这包括在该N蛋白氨基酸80位的脯氨酸至精氨酸的取代(P80R)以及R203K和G204R。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图113所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图114所示。
在另一个实施例中，上面公开的该密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行了优化)被进一步修饰以编码的S抗原包含在印度识别的B.1.617变异谱系中的突变。这可能包括RBD结构域中的L452R和E484Q突变，D614G，该S蛋白氨基酸142位的甘氨酸至天冬氨酸的取代(G142D)，该S蛋白氨基酸154位的谷氨酸至赖氨酸的取代(E154K)，该S蛋白氨基酸681位的脯氨酸至精氨酸的取代(P681R)，该S蛋白氨基酸1071位的谷氨酰胺至组氨酸的取代(Q1071H)，和该S蛋白氨基酸1101位的组氨酸至天冬氨酸的取代(H1101D)。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图115所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图116所示。
在另一个实施例中，上面公开的该密码子优化的SARS-CoV-2S抗原序列(基于Wuhan-Hu-1参考株(#NC_045512)并针对痘苗进行了优化)被进一步修饰以编码的S抗原包含B.1.617变异谱系的突变或该突变的子集，包括L452R，E484Q，D614G，G142D，E154K，P681R，Q1071H，和H1101D，氨基酸478位的苏氨酸至赖氨酸的取代(T478K)，氨基酸95位的苏氨酸至异亮氨酸的取代(T95I)，氨基酸19位的苏氨酸至精氨酸的取代(T19R)，氨基酸77位的赖氨酸至苏氨酸的取代(K77T)，氨基酸950位的天冬氨酸至天冬酰胺的取代(D950N)，氨基酸21位的精氨酸至苏氨酸的取代(R21T)，氨基酸218位的谷氨酰胺至组氨酸的取代(Q218H)，氨基酸156位和157位的谷氨酸和苯丙氨酸的缺失(Del156–157)，和氨基酸158位的精氨酸至甘氨酸的取代(R158G)。
在另一个实施例中，该密码子优化的SARS-CoV-2N抗原序列编码的N抗原包括在印度识别的B.1.617变异谱系中发生的N特异性突变。这可能包括在该N蛋白氨基酸203位的精氨酸至甲硫氨酸的取代(R203M)和该N蛋白氨基酸377位的天冬氨酸至酪氨酸的取代(D377Y)。DNA序列/ORF(5’至3’端)如图117所示，所编码蛋白序列(N-至C-末端)如图118所示。
在某些实施例中，两个或更多个抗原，亚单位或其片段的DNA序列可被插入单个MVA插入位点或两个或更多个MVA插入位点，其可位于同一sMVA片段上或不同sMVA片段上。例如，两个或更多个抗原，亚单位或其片段的DNA序列可被插入两个不同MVA插入位点，均位于sMVA F1上。在另一个示例中，可以将两个或更多个抗原，亚单位或其片段的DNA序列插入两个不同MVA插入位点，一个位于sMVA F1上，另一个位于sMVA F2上。
这些插入位点可能包括常用的插入位点，如MVA缺失2(Del2)位点，开放阅读框(ORF)44L和45L之间的基因间区域(IGR)(IGR44/45)，ORF 69R和70L之间的IGR(IGR69/70)，64L和65L之间的IGR(IGR64/65)，胸苷激酶(TK)基因插入位点，或MVA缺失3(Del3)位点，或任何其他MVA缺失位点，基因间区域，或基因插入位点(ORF编号基于MVA株Antoine(登录号#U94848))。
本文公开的表达冠状病毒抗原的sMVA或rsMVA可为可用于治疗或预防病毒感染的方法的疫苗组合物的一部分。如本文所述的该疫苗组合物可包含治疗有效量的如本文所公开的sMVA或rsMVA，并且根据标准方法进一步包含药学上可接受的载体。可接受的载体的示例包括生理上可接受的溶液，如无菌盐水和无菌缓冲盐水。
在一些实施例中，疫苗或药物组合物可与药学有效量的佐剂组合使用以增强预防或治疗效果。任何可刺激免疫系统并增加针对疫苗的反应但本身不具有任何特异性抗原作用的免疫佐剂均可用作佐剂。许多免疫佐剂模拟进化上保守的分子，称为病原体相关联分子模式(PAMP)，并被一组称为Toll样受体(TLR)的免疫受体识别。可根据本文描述的实施例使用的佐剂的示例包括弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，双链RNA(TLR3配体)，LPS，LPS类似物，如单磷酰脂质A(MPL)(TLR4配体)，鞭毛蛋白(TLR5配体)，脂蛋白，脂肽，单链RNA，单链DNA，咪唑喹啉类似物(TLR7和TLR8配体)，CpG DNA(TLR9配体)，Ribi佐剂(单磷酰脂A/海藻糖二甲藻酸盐)，糖脂(α-GalCer类似物)，未甲基化CpG岛，油乳剂，脂质体，病毒体，皂苷(皂苷的活性部分如QS21)，胞壁酰二肽，明矾，氢氧化铝，角鲨烯，BCG，细胞因子如GM-CSF和IL-12，趋化因子如MIP 1-α和RANTES，激活的细胞表面配体如CD40L，N-乙酰胞壁胺-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)，和胸腺素α1。可以根据症状的程度合适地选择所使用的佐剂的量，所述症状如有皮肤软化，疼痛，红斑，发热，头痛，和肌肉疼痛，可作为施用这种类型的疫苗后的人或动物免疫反应的一部分被表达。
在进一步的实施例中，如上文所讨论，与本发明的疫苗一起使用多种其他佐剂，药物或添加剂可增强通过施用疫苗或药物组合物实现的治疗效果。药学上可接受的载体可含有痕量的添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。此类添加剂在所使用的剂量和浓度下应对人或其他哺乳动物受试者无毒，其示例包括缓冲剂，如磷酸，柠檬酸，琥珀酸，乙酸，和其他有机酸，及其盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(例如，少于约10个残基)多肽(例如，聚精氨酸和三肽)蛋白质(例如，血清白蛋白，明胶，和免疫球蛋白)；氨基酸(例如，甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，和精氨酸)；单糖，二糖，和其他碳水化合物(例如，纤维素及其衍生物，葡萄糖，甘露糖，和糊精)，螯合剂(例如，EDTA)；糖醇(例如，甘露醇和山梨糖醇)；抗衡离子(例如，钠)；非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯和泊洛沙姆)；抗生素；和PEG。
含有本文公开的sMVA或rsMVA的疫苗或药物组合物可作为水溶液或冻干产品储存于单位剂量或多剂量容器，如密封安瓿或小瓶。
本文公开的sMVA，rsMVA，疫苗或药物组合物可用于刺激SARS-CoV-2特异性体液(结合抗体，中和抗体)和细胞(CD4+和CD8+T细胞)免疫反应，以治疗或预防动物模型和人中的SARS-CoV-2感染。它们还可用于产生和分离可用于治疗或被动免疫SARS-CoV-2感染的抗体反应。
本文公开了sMVA疫苗组合物。COH04S1共表达SARS-CoV-2刺突和核衣壳，这两种抗原与保护性免疫有关，并在小鼠，仓鼠，雪貂，和猴中显示出非常有希望的免疫反应。收到了FDA对IND前的好评。FDA同意合成sMVA等同于传统MVA，并且不要求进行IND导向的毒性研究。希望之城(City of Hope)的cGMP生产设施为1期和2期研究生产材料。多达122名年龄在18–54岁之间的志愿者服药，其中55名志愿者接受了1或2剂。
该疫苗组合物还包含该N抗原，它会引发强烈的T细胞反应。该疫苗组合物不存在性别依赖性，并且跨年龄组有效，例如从2岁到75岁。即使在最低评估的临床剂量下也能实现强免疫原性。该疫苗组合物可保护仓鼠免受严重疾病的侵害。该疫苗组合物表现出趋向Th1的抗体和T细胞反应。
在一些实施例中，本文公开的该疫苗组合物配制用于鼻递送以保护粘膜。替代地，本文公开的该疫苗组合物配制用于腹膜内(IP)，肌内(IM)，或鼻内(IN)施用以在受试者中诱导强烈的免疫反应。在某些实施例中，该疫苗组合物以每剂1X 107PFU至10X 108PFU，每剂1–10X 108PFU，或每剂1–5X 108PFU施用。在一些实施例中，该疫苗组合物以每剂约1X107PFU，每剂约2X 107PFU，每剂约3X 107PFU，每剂约4X 107PFU，每剂约5X107PFU，每剂约6X107PFU，每剂约7X 107PFU，每剂约8X 107PFU，每剂约9X 107PFU，每剂约1X 108PFU，每剂约2X108PFU，每剂约3X 108PFU，每剂约4X 108PFU，每剂约5X 108PFU，每剂约6X 108PFU，每剂约7X108PFU，每剂约8X 108PFU，每剂约9X 108PFU，或每剂约10X 108PFU施用。在某些实施例中，该疫苗组合物以单剂施用于受试者。在某些实施例中，该疫苗组合物以第一剂量施用于受试者，随后是加强剂量。本文公开的该疫苗组合物在施用于受试者时刺激针对SARS-CoV-2的有效体液和细胞免疫反应。
如工作示例所示，用剂量为1X 107PFU的COH04S1免疫健康成人，产生了对S，RBD，N和中和抗体的结合抗体，以及对S和N抗原的功能性T细胞反应。
本文还说明了临床前疫苗生产过程，从最初的病毒重构到最终临床前病毒原种(virus stock)的产生，如图56所示。该过程包括用含有sMVA片段的质粒转染/感染，sMVA病毒重构，初级小规模扩增，初级大规模扩增，免疫原性，有效性，和安全性的初级体内测试，斑块纯化，病毒分离物扩增，二级小规模扩增，二级大规模扩增，和最终的体外和体内测试的步骤，如工作示例所示。可以使用该领域的常识根据生产需要进一步修改，改进，或优化该过程。
步骤1和2：转染/感染和sMVA病毒重构
通过碱裂解从大肠杆菌分离含有三个sMVA片段F1–F3(未被修饰，被修饰，或其组合)的三个质粒。该分离的质粒通过Fugene HD脂质基转染试剂(Roche)共转染到60–70％汇合的BHK-21细胞(
Figure BDA0004113704310000591
CCL-10TM)中，这些BHK-21细胞已经在前一天接种在6孔板组织培养格式中并在5％ CO2培养箱于37℃在含有10％胎牛血清(MEM10)的最低必需培养基(MEM，Gibco)中生长。在转染后4小时，以大约0.1至1的感染复数(MOI)的FPV(ATCC VR–2553)感染该BHK-21细胞以启动sMVA病毒转录和重构。如图56(步骤2)所示在8–12天的时间内，被转染/感染的BHK-21细胞在6孔组织培养板的MEM10中在5％ CO2培养箱于37℃温育2天，每隔一天转移，重新接种，并在更大的组织培养板中生长两天，直到大多数或所有BHK-21细胞显示出sMVA病毒感染的迹象。表明sMVA病毒重构的特征性MVA病毒斑块形成和细胞病变效应(CPE)通常在转染/感染后4–8天检测到。完全感染的BHK-21细胞单层通常在转染/感染后8–12天可见。来自被感染的BHK-21细胞单层的sMVA病毒通过3个循环的常规冷冻/解冻方法在含2％ FBS的MEM(MEM2)中制备并储存在-80℃。来自这些初始病毒原种的sMVA在BHK-21细胞上滴定并通常通过多种方法(PCR，蛋白质印迹(WB)，流式细胞术(FC))进行表征以确认sMVA重构和抗原表达。
步骤3和4：初级小规模和大规模扩增
为了在体外和体内测试中产生更大的病毒量，从初始病毒原种(步骤1和2)重构的sMVA病毒分两步过程扩增，涉及BHK-21细胞上的第一次小规模扩增和随后鸡胚成纤维(CEF)细胞上的大规模扩增。对于小规模扩增(步骤3)，在5x150mm组织培养皿中接种的BHK-21细胞可以生长到80–90％的汇合度并以0.02MOI感染来自初始病毒原种的sMVA。被感染的BHK-21细胞在5％ CO2培养箱于37℃在MEM10中温育2–3天。来自小规模扩增的病毒原种通过3个循环的冷冻/解冻制备，储存在-80℃冰箱的MEM2中，随后在BHK-21细胞上滴定。通过(PCR，WB，FC)对来自小规模扩增的sMVA病毒进行体外表征以验证同一性，基因组重构，和抗原表达。在开发过程的这一点上，也可能在CEF上繁殖5–10代后对sMVA病毒进行稳定性测试。对于大规模扩增(步骤4)，在30x150mm组织培养皿中接种的新鲜制备的CEF可以生长到70–90％的汇合度并以0.02MOI感染来自小规模扩增制备的sMVA病毒。被感染的CEF细胞在5％ CO2培养箱于37℃在MEM10中生长2–3天。来自大规模扩增的病毒通过36％蔗糖密度超速离心制备，储存在-80℃的1mM Tris-HCl(pH 9)中，随后在CEF细胞上滴定。通过PCR，WB，和FC(或其他方法)对纯化的病毒进行体外表征以确认同一性，基因组重构的保真度，和抗原表达。
步骤5：初级体内测试
在体外表征之后，来自大规模扩增的纯化的病毒用于体内研究以评估疫苗候选物在不同动物模型中的免疫原性，抗挑战保护，和安全性。这可能包括对小鼠的研究，但也包括对其他动物模型的研究，如仓鼠，雪貂，或非人灵长类动物。可以测试剂量递增和免疫途径以评估免疫原性和针对病毒挑战的保护的优化条件。
步骤6和7：斑块纯化和病毒分离物的扩增
为了过渡到临床生产，所选择的sMVA疫苗构建体(根据步骤4和5的结果选择)经过斑块纯化，扩增，并通过体外和体内研究重新测试。从这一点开始，生产过程的所有步骤都在无血清条件下使用VP-SFM培养基(Gibco)进行。对于斑块纯化过程(步骤6)，前一天接种在96孔组织培养板中的新鲜制备的CEF细胞(80–90％的汇合度)以10–100PFU/板感染来自初级小规模扩增的sMVA病毒(步骤3)。在感染后3–5天，筛选96孔板的CEF细胞的每孔的单个病毒斑块形成，并通过3个循环的冷冻/解冻方法制备来自单个孔的sMVA病毒分离物。然后通过感染接种在24孔组织培养板中的80–90％汇合的CEF细胞将从单个孔制备的病毒分离物进行扩增(1个病毒分离物/孔；步骤7，图56)。在感染后2–4天，通过冷冻/解冻方法制备在该24孔板中扩增的该病毒分离物，并在接种于60mm组织培养皿中的80–90％汇合的CEF上以1个分离物/皿进一步扩增。被感染的CEF细胞生长2–4天，扩增的病毒分离物通过冷冻/解冻方法收获并在CEF上滴定。然后使用PCR，WB，和FC通过体外测试筛选滴定的病毒分离物(5–10)以评估单个病毒分离物的同一性，基因组组成，和抗原表达。
步骤8和9：二级小规模和大规模扩增
作为下一步骤，所选择的sMVA疫苗候选物的斑块纯化的病毒分离物在两步过程中进一步扩增，包括二级小规模和二级大规模扩增，以产生大量病毒用于对最终分离物进行有力的体外和体内测试。二级扩增过程主要遵循临床前疫苗开发过程的初级扩增过程(图56，步骤3和4以及步骤8和9)，除了二级扩增过程使用仅在无血清条件(VP-SFM)下生长的CEF细胞。来自大规模扩增的病毒原种通过超速离心制备并储存在-80℃的1mM Tris-HCl(pH 9)中。最终纯化的病毒原种通过PCR，WB，和FC在体外进行表征以确认sMVA疫苗候选物的所选择的病毒分离物的身份，基因组组成，和抗原表达。
步骤10：最终的体外和体内测试
在对最终产品进行初步体外测试后，将在体外进一步评估所选择的病毒分离物的宿主范围，复制动力学，疫苗稳定性，和完整基因组的测序。另外地，还在动物模型(小鼠，或其他动物)中研究了sMVA疫苗候选物的最终病毒分离物的免疫原性，抗挑战保护，和安全性。
本文还公开了多个初免-加强过程。在一些实施例中，初免-加强过程包括通过同一sMVA载体进行的第一次和第二次免疫或额外的加强免疫，该sMVA载体编码Wuhan-Hu-1参考株或不同关注变体的两个或更多个SARS-CoV-2抗原序列。在一些实施例中，初免-加强过程包括通过两个或更多个sMVA载体的混合物进行的第一次和第二次免疫或额外的加强免疫，该混合物编码选自Wuhan-Hu-1参考株或不同关注变体的两个或更多个不同的SARS-CoV-2抗原序列。在一些实施例中，初免-加强过程包括用编码Wuhan-Hu-1参考株的一个或多个SARS-CoV-2抗原序列的sMVA载体进行的第一次免疫和用编码不同关注变体的一个或多个SARS-CoV-2抗原序列的不同sMVA载体进行的第二次免疫，反之亦然。在一些实施例中，初免-加强过程包括用编码Wuhan-Hu-1参考株的一个或多个SARS-CoV-2抗原序列的sMVA载体进行的多次免疫和用编码不同关注变体的一个或多个SARS-CoV-2抗原序列的不同sMVA载体进行的多次加强免疫，反之亦然。
在本公开中，COH04S1具有如图5和图17所示的sMVA-N/S载体构建。如图57所示，COH04S1是从亲本sMVA-N/S载体C35(也称为sMVA-N/S tv)通过双斑块纯化衍生的临床产物。如本文所用，术语“sMVA-CoV2载体”和“sMVA-SARS-CoV2载体”可互换使用以指表达一个或多个SARS-CoV2抗原的sMVA载体。
以下示例旨在说明本发明的多个实施例。因此，所讨论的具体实施例不应被视为对本发明范围的限制。对本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明范围的情况下可以进行多种等效，改变，和修改，并且应当理解，这些等效实施例将被包括在本文。此外，在本公开中引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文，如同在本文完全阐述。
示例
材料和方法
细胞和病毒：BHK-21(CCL-10)，A549(CCL-185)，HeLa(CCL-2)，293T(CRL-1573)，143B(CRL-8303)，MRC-5(CCL-171)，HEK293/17(CRL11268)，THP-1(TIB-202)，ARPE-19(CRL-2302)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并根据ATCC的建议生长。CEF购自CharlesRiver(10100795)，并在含有10％ FBS的最低必需培养基(MEM)(MEM10)中生长。HEK293T/ACE2是Pamela J.Bjorkman的馈赠46。wtMVA(NIH克隆1)仅用作参考标准。为产生sMVA和wtMVA病毒原种，将CEF接种在30x150mm组织培养皿中，生长至约70–90％的汇合度，以0.02感染复数(MOI)感染sMVA或wtMVA。在感染后两天，通过36％蔗糖密度超速离心和1mM Tris-HCl(pH 9)中的病毒重悬制备纯化的病毒47。病毒储存于-80℃。通过在感染后16–24小时使用多克隆痘苗抗体对病毒斑块进行免疫染色而在CEF上确定病毒滴度。使用Bernard Moss友情提供的FPV株TROVAC(ATCC VR-2553)3或HP1.4414在CEF上繁殖后产生FPV原种。FPV滴度通过病毒斑块测定在CEF上进行评估。SARS-CoV-2株USA-WA1/2020(BEI Resources NR-52281)用于病灶减少中和试验(FRNT)测定53。
sMVA片段的构建：包含Antoine等人报告的完整MVA基因组序列(NCBI登录号#U94848)4的三个约60kbp sMVA片段(F1–F3；图1)构建如下：sMVA F1包含该MVA基因组序列的碱基对191–59743；sMVA F2包含该MVA序列的碱基对56744–119298；和sMVA F3包括该报告的MVA基因组序列的碱基对116299–1778984。由
Figure BDA0004113704310000631
Figure BDA0004113704310000641
Figure BDA0004113704310000642
组成的CR/HL/CR序列排列以相同的方向添加到每个sMVA片段的两端，其中斜体字母表示MVA末端HL序列的双链体拷贝，下划线字母表示CR序列。值得注意的是，在sMVA F1和F3的ITR处并入的该CR/HL/CR序列以相同的排列添加，因为该CR/HL/CR序列出现在假定的MVA复制中间体的基因组连接处的ITR处4。该sMVA片段由Genscript使用化学合成结合酵母重组系统产生和组装。所有sMVA片段均被克隆至称为pCCI-Brick的酵母穿梭载体，其包含mini-F复制子，用于在大肠杆菌中作为低拷贝BAC稳定繁殖大DNA片段。sMVA F1和F3在EPI300大肠杆菌(Epicentre)中克隆和维持，而sMVA F1在DH10B大肠杆菌(Invitrogen)中克隆和维持。
抗原插入：SARS-CoV-2S和N抗原序列在GS1783大肠杆菌细胞中通过En passant诱变插入到sMVA片段中48,49。简而言之，生成了由具有上游mH5启动子序列和下游痘苗转录终止信号(TTTTTAT)的S或N抗原序列组成的转移构建体，并将侧翼为50bp基因复制物的卡那霉素抗性盒引入该抗原序列中。用为同源重组提供约50bp延伸的引物通过PCR扩增该转移构建体，所得PCR产物用于通过第一次Red重组反应将该转移构建体插入sMVA DNA中48,49。引物5’-AAA AAA TAT ATT ATT TTT ATG TTA TTT TGT TAA AAA TAA TCA TCG AAT ACG AACTAG TAT AAA AAG GCG CGC C-3’和5’-GAA GAT ACC AAA ATA GTA AAG ATT TTG CTA TTC AGT GGA CTG GAT GAT TCA AAA ATT GAA AAT AAA TAC AAA GGT TC-3’用于将该N抗原序列插入到Del2位点中。引物5’-ATA TGA ATA TGA TTT CAG ATA CTA TAT TTG TTC CTG TAG ATA ATA ACT AAA AAT TTT TAT CTA GTA TAA AAA GGC GCG CC-3’和5’-GGA AAA TTT TTC ATC TCT AAA AAA AGA TGT GGT CAT TAG AGT TTG ATT TTT ATA AAA ATT GAA AAT AAATAC AAA GGT TC-3’用于将该S抗原序列插入到IGR69/70插入位点引物中。引物5’-TTG GGG AAA TAT GAA CCT GAC ATG ATT AAG ATT GCT CTT TCG GTG GCT GGT AAA AAA TTG AAAATA AAT ACA AAG GTT C-3’和5’-ACA AAA TTA TGT ATT TTG TTC TAT CAA CTA CCT ATA AAA CTT TCC AAA TAC TAG TAT AAA AAG GCG CGC C-3’用于将该S或N抗原序列插入到Del3位点中。下划线字母表示用于为同源重组产生约50bp延伸的序列。该S和N抗原序列基于SARS-CoV-2参考株(NCBI登录#NC_045512)并针对痘苗进行了密码子优化10,38。密码子优化的S和N基因序列由Twist Biosciences合成。使用为同源重组提供～50bp延伸的引物用Phusion聚合酶(Thermo Fisher Scientific)通过PCR扩增该转移构建体以通过Red重组将该转移构建体插入到sMVA片段中。所插入的抗原序列通过PCR，限制性酶消化，和测序验证。使用NucleoSpin Gel和PCR清洁试剂盒(Macherey–Nagel)纯化所扩增的PCR产物，并将100ng PCR产物以15kV/cm，25μF，和200Ω电穿孔到50μL含有该sMVA片段的有重组能力的GS1783细菌中。将细菌重悬在1mL不含抗生素的Luria-Bertani(LB)培养基中并在32℃和220r.p.m下温育2小时。温育2h后，将该细菌划线接种到含有30μg/mL氯霉素和30μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，并于32℃温育2天。通过PCR和限制性模式分析识别在各自的MVA插入位点具有所插入的抗原序列的sMVA片段的细菌克隆。为了通过I-SceI介导的第二次Red重组反应从所插入的抗原序列无缝去除卡那霉素抗性标志物，将100μL所选择的细菌克隆的过夜培养物添加到900μL含有30μg/mL氯霉素的LB培养基中并在32℃和220r.p.m下温育1.5–2小时。随后，添加含有30μg/mL氯霉素和2％ L-阿拉伯糖的1mL LB以诱导I-SceI归巢核酸内切酶的表达并在50bp基因复制物处诱导双链断裂。将细菌于32℃温育1小时，然后转移到水浴中并在220r.p.m和42℃下温育30分钟以诱导Red重组蛋白的表达，并通过50bp基因复制物的重组介导卡那霉素抗性标志物的去除。在32℃和220r.p.m.下将细菌额外温育2小时后，将细菌划线接种到有30μg/mL氯霉素和1％ L-阿拉伯糖的LB琼脂平板上并于32℃温育2天。通过PCR，限制性模式分析，和Sanger测序识别含有从所插入的抗原序列无缝去除卡那霉素标志物的sMVA片段的细菌克隆。
sMVA病毒重构：使用FPV作为辅助病毒从BHK-21细胞中的三个sMVA DNA质粒重构sMVA病毒如下进行8–10。根据制造商的说明，通过碱性裂解从大肠杆菌分离三个sMVA DNA质粒50并使用Fugene HD转染试剂(Roche)共转染到在6孔板组织培养板中生长的60–70％汇合的BHK-21细胞中。在转染后4小时，用大约0.1–1MOI的FPV感染细胞以启动sMVA病毒重构。在8–12天的时间内，被转染/感染的BHK-21细胞生长2天，然后每隔一天转移，重新接种，并在更大的组织培养格式中再生长两天，直到大多数或所有细胞显示出sMVA病毒感染的迹象。使用此过程，表明sMVA病毒重构的特征性MVA病毒斑块形成和细胞病变效应(CPE)通常在转染/感染后4–8天检测到。完全感染的BHK-21细胞单层通常在转染/感染后8–12天可见。来自被感染的BHK-21细胞单层的sMVA病毒通过常规冷冻/解冻方法制备并在BHK-21细胞上传代一次，然后在CEF上产生纯化的病毒原种。sMVA或重组sMVA-CoV-2载体用FPV HP1.441(sMVAhp，sMVA-N/S，sMVA-S/Nhp)或TROVAC(sMVA tv1和tv2，sMVA-S tv，sMVA-N tv，sMVA-N/Stv，sMVA-S/N tv)重构。
宿主细胞范围：使用多个人细胞系(HeLa，293T，MRC-5，A549，和143B)，BHK-21细胞，和CEF的sMVA和wtMVA宿主细胞范围测定如下。将细胞接种在6孔板组织培养格式中并使用MEM2在70–90％的汇合度下一式两份地以0.01MOI感染sMVA或wtMVA。感染后2小时，用PBS洗涤该细胞两次，并在正常生长培养基中温育两天(如细胞和病毒中所述)。温育期后，通过常规冷冻/解冻方法制备病毒并在CEF上一式两份地测定每个一式两份感染的病毒滴度。
复制动力学：为了比较sMVA和wtMVA的复制动力学，将CEF或BHK-21细胞接种在6孔板组织培养格式中并使用MEM2在70–90％的汇合度下一式三份地以0.02MOI感染sMVA或wtMVA。温育2小时后，细胞在MEM10中生长。感染后24和48小时，通过冷冻/解冻方法制备病毒并在CEF上一式两份地测定每个一式三份感染的病毒滴度和接种物。
斑块大小分析：为了比较sMVA病毒和wtMVA的斑块大小，将CEF或BHK-21细胞接种在6孔板组织培养格式中并使用MEM2在70–90％的汇合度下以0.02MOI感染sMVA或wtMVA。温育2小时后，添加MEM10，细胞生长16–24小时。细胞单层用痘苗病毒多克隆抗体染色，使用Leica DMi8倒置显微镜对病毒斑块成像，并使用LAS X软件测量。使用公式Area＝π×a×b计算每个sMVA或wtMVA的25个病毒斑块的大小，其中a和b分别是椭圆的长半径和短半径。
PCR分析：为了通过PCR表征sMVA载体的病毒DNA，将CEF接种在6孔板组织培养格式中，并在70–90％的汇合度下以5MOI感染sMVA或wtMVA。根据制造商的说明，在感染后16–24小时通过DNA Easy Blood和Tissue Kit(Qiagen)提取DNA。所有PCR反应均使用Phusion聚合酶(ThermoFisher Scientific)进行。引物5’-TCG TGG TGT GCC TGA ATC G-3’和5’-AGGTAG CGA CTT CAG GTT TCT T-3’用于检测MVA ITR序列；引物5’-TAT CCA CCA ATC CGAGAC CA-3’和5’-CCT CTG GAC CGC ATA ATC TG-3’用于验证从左ITR到独特区的过渡；引物5’-AGG TTT GAT CGT TGT CAT TTC TCC-3’和5’-AGA GGG ATA TTA AGT CGA TAG CCG-3’用于验证具有或不具有插入的N抗原序列的Del2位点；引物5’-TGG AAT GCG TTC CTT GTGC-3’和5’-CGT TTT TCC CAT TCG ATA CAG-3’具有位于F1/F2同源序列侧翼的结合位点，用于验证F1/F2重组位点；引物5’-TAT AGT CTT TGT GGC ATC CGT TG-3’和5’-ACC CAA ACTTTA GTA AGG CCA TG-3’用于验证具有或不具有插入的S抗原的IGR69/70插入位点；引物5’-ATA AGC GTT GTC AAA GCG GG-3’和5’-AGG AAA TAG AAA TTG TTG GTG CG-3’具有位于F2/F3同源序列侧翼的结合位点，用于验证F2/F3重组位点；引物5’-ACA TTG GCG GACAAT CTA AAA AC-3’和5’-ATC ATC GGT GGT TGA TTT AGT AGT G-3’用于验证具有和不具有插入的S或N抗原序列的Del3插入位点；引物5’-TAT CCA CCA ATC CGA GAC CA-3’和5’-GTC TGT CCG TCT TCT CTA TTG TTT A-3’用于验证从独特区到右ITR的过渡；和引物5’-TTA ACT CAG TTT CAA TAC GGT GCA G-3和5’-TGG GGT TTC TTC TCA GGC TAT C-3’用于检测BAC载体的SopA元件。通过琼脂糖凝胶电泳分析了PCR产物，并使用带有GeneSys(v1.5.4.0)软件的Syngene PXi6成像仪成像。未裁剪的凝胶图像作为源数据文件提供。为了对衍生自sMVA载体的PCR产物进行测序，根据制造商的说明使用NucleoSpin Gel和PCR清洁试剂盒(Macherey–Nagel)纯化所扩增的PCR产物，并通过Sanger测序进行分析。
限制性模式分析：BHK-21细胞接种在20x150mm组织培养皿中，生长至约70–90％的汇合度，并以0.01MOI感染wtMVA，sMVA tv1，或sMVA tv2。如前所述，在感染后两天制备纯化的病毒47。如前所述，用苯酚/氯仿提取病毒DNA(vDNA)，然后进行乙醇沉淀51。简而言之，将分离的病毒颗粒重悬于裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，1.2％ SDS，4mM EDTA pH8.0，4mM CaCl2，和0.4mg/mL蛋白酶K)中并于37℃温育过夜。DNA用苯酚提取两次；每次提取均通过添加等体积的缓冲苯酚并于室温(RT)以300×g离心10分钟进行。小心收集水相以避免DNA剪切。通过向水相添加等体积的1:1苯酚/氯仿进行最终提取，然后如上所述进行离心，并通过苯酚/氯仿提取的病毒DNA的乙醇沉淀完成。使用NanoVue(GE Healthcare Bio-sciences Corp)测定DNA浓度和A260/A280比率。用3个单位的KpnI或XhoI消化10μgvDNA，然后在以2.4v/cm运行过夜的0.5％ EtBr染色的琼脂糖凝胶上进行可视化。使用带有GeneSys(v1.5.4.0)软件的Syngene PXi6成像仪获取图像。
sMVA片段和sMVA载体的测序：PacBio(Pacific Biosciences)长读测序分析用于确定克隆的sMVA片段(F1–F3)和重构的sMVA载体的序列。根据制造商的说明，通过QIAGENLarge-Construct Kit分离用于对sMVA片段进行测序的质粒DNA。如上所公开，通过苯酚/氯仿提取从纯化的病毒颗粒分离的用于对sMVA进行测序的病毒DNA。根据制造商的说明，通过NucleoSpin Blood QuickPure DNA提取试剂盒(Macherey–Nagel)从纯化的病毒颗粒分离用于对sMVA-CoV2载体进行测序的病毒DNA。简而言之，使用SMRTbell Template Prep Kit1.0和Barcoded Adapter Plate-96(PacBio)将5μg片段化DNA转化为条形码SMRTbell库。sMVA片段和sMVA载体的库用BluePippin(Sage Science)进行大小选择(7-kb大小截断)。在用测序引物将聚合酶与该库结合后，使用MagBeads上样将聚合酶复合物上样到RSII SMRT细胞中，并在PacBio RSII上用6小时录影(movie)进行测序。使用扩散模式将sMVA-CoV2载体的聚合酶复合物上样到Sequel SMRT细胞中，并在PacBio Sequel上用10小时录影进行测序。在SMRT Portal(v.2.3.0)或SMRT Link(v6.0.0.47841)或SMRT Link(v8.0.0.80529)中分别通过Demultiplex Barcodes，Resequencing，和CCS模块执行读取解复用，读取映射到参考序列，和循环共识测序(CCS)分析。在使用pbmm2v 1.0.0映射CCS读取后，使用VarScanv2.3.9执行用CCS读数调用的变体。从头(De novo)组装使用canu v1.7.1完成。所组装的重叠群(contig)的5’起始位置通过与参考比较进行编辑。MVA U94848.1用作映射sMVA基因组序列读数的参考。sMVA片段和sMVA-CoV2载体的序列经由与基于由Vector NTI(Invitrogen，v.11.5)构建的MVA U94848.1的相应参考序列比对来绘制。随着从头组装的重叠群与每个参考的比较，该分析确认了克隆的sMVA片段和重构的sMVA载体的序列同一性，包括在sMVA片段F1和所有被测序的重构的sMVA载体(sMVA和sMVA-CoV-2载体)中发现的021L4下游3个碱基对处的非编码决定区中的单点突变。在sMVA片段F3内距ITR末端88bp的串联重复序列处的非编码决定区中发现了一个无法明确排除的额外的变异(点突变)。由于这两个变异存在于克隆的sMVA片段中，因此它们被确认为sMVA片段的化学合成期间产生的错误。包含完整MVA编码内容的ITR的内部独特区和独特区可以可靠地组装用于所有重构的sMVA载体。sMVA载体的序列重叠群几乎(超过99％)覆盖了完整的U94848.1参考序列，只有在高度重复的ITR串联重复序列中有少数例外。sMVA-CoV2载体的ITR串联重复序列的完整区域无法通过与参考序列的比对或从头组装而可靠地映射，因为这些区域的覆盖率低，这可能是序列读数质量的结果。基于PacBio测序的sMVA片段和sMVA-CoV2载体的参考序列已保藏于NCBI。为了确定重构的sMVA载体的原始测序数据中不存在污染BAC载体序列，使用SMRT Link(v8.0.0.80529)中的重测序模块将测序读数与Genscript提供的参考pCCl-Brick载体序列进行比对。
免疫印迹分析：感染后24小时收集以5MOI感染的BHK-21细胞。将蛋白质溶解在含有0.1％ Triton X-100的PBS中，补充蛋白酶抑制剂，然后在含有DTT的Laemmli缓冲液中还原和变性，并于95℃煮沸约10分钟。蛋白质在4–20％ Mini Protean TGX梯度凝胶(BioRad)上分离，并转移到PVDF膜上。用抗SARS-CoV-1S1亚单位兔多克隆抗体(40150-T62-COV2，Sino Biological)探测S蛋白；用抗SARS-CoV1NP兔多克隆抗体(40413-T62，SinoBiological)探测N蛋白。痘苗BR5蛋白被探测为上样对照。将与辣根过氧化物酶(Sigma-Aldrich)缀合的抗兔多克隆抗体用作二抗，并用化学发光底物(ThermoFisher)使蛋白质条带可视化。
流式细胞术：将HeLa细胞接种在6孔板(5x105/孔)中，并在第二天以5MOI感染sMVA疫苗候选物。温育6小时后，使用非酶促细胞解离缓冲液(Cat No.13151014，GIBCO)分离细胞。细胞或直接与一抗温育，或在添加抗体之前固定并渗透化。抗SARS-CoV-1S1小鼠(40150-R007，Sino Biological)和S2兔(GTX632604，GeneTex)单克隆抗体，抗SARS-CoV-1N兔单克隆抗体(40143-R001，Sino Biological)，和抗痘苗兔多克隆抗体(9503–2057，BioRad)以1:2,000的稀释使用。一小时后，将抗小鼠或抗兔Alexa Fluor 488缀合的二抗(A11001，A21206；Invitrogen)以1:4,000的稀释添加到细胞中。活细胞最终用1％多聚甲醛(PFA)固定，并使用带有BD FACSDiva软件(v8.0.1.1)的BD FACSCelesta流式细胞仪采集。使用FlowJo(v10.6.2)进行分析。
免疫荧光：BHK-21或HeLa细胞在玻璃盖玻片上生长，并在加湿培养箱(5％ CO2)中以5MOI感染sMVA或编码S和/或N蛋白的重组sMVA 6小时。感染后，细胞在2％ PFA中固定15分钟，然后通过添加冰冷的1:1丙酮/甲醇在冰上直接渗透化5分钟。细胞在室温下用3％BSA封闭1小时，与针对S2亚单位或N的一抗混合物(1:500)于37℃温育1小时，然后与Alexa缀合的二抗(ThermoFisher)(1:2000)于37℃温育1小时，每步之间洗涤(PBS+0.1％Tween20)。为了检测细胞膜和细胞核，将细胞与Alexa缀合的小麦胚芽凝集素以5μg/mL(ThermoFisher)和DAPI在室温下温育10分钟。洗涤盖玻片并用Fluoromount-G(SouthernBiotech)将其安装到载玻片上。使用激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss，LSM700)进行显微分析。使用Zen软件(Zeiss，黑色版8.1版)获取和处理图像。
小鼠免疫：希望之城(COH)贝克曼研究所的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准了分配给本研究的协议20013。所有研究过程均严格按照《实验动物的护理和使用指南》和《人道护理和实验动物使用公共卫生服务政策》中的建议进行。6周龄C57BL/6(C57BL/6J，000664)或Balb/c(BALB/cJ，000651)购自Jackson实验室。C57BL/6Nramp在希望之城动物设施中繁殖。小鼠(N＝4–5)在三周间隔内通过腹膜内途径用5x107PFU(高剂量)或1x107PFU(低剂量)的sMVA，wtMVA，或sMVA-CoV2载体免疫两次。为了确定使用不同载体时S和N抗原的免疫刺激(图15–16)，小鼠用高剂量(2.5x107PFU)或低剂量(0.5x107PFU)的每个疫苗载体经由相同的免疫方案和途径联合免疫。用于体液免疫分析的血液样本在初免后两周和加强免疫后一周通过眼眶后采血收集。在加强免疫后一周收集用于细胞免疫分析的脾细胞，并在动物被人道安乐死后通过标准过程分离。
结合抗体：通过ELISA评估了用sMVA，wtMVA，或sMVA-CoV2载体免疫的小鼠中的结合抗体。用1μg/ml表达Venus荧光标志物9，S(S1+S2，40589-V08B1，Sino Biological)，RBD(40592-V08H，Sino Biological)，或N(40588-V08B，Sino Biological)的MVA将ELISA板(3361，Corning)涂覆过夜。板在PBS中用3％ BSA封闭2小时。在PBS中制备小鼠血清的系列稀释并添加到板中两小时。洗涤后，添加1:3,000稀释的HRP缀合的抗小鼠IgG二抗(W402B，Promega)并再温育一小时。使用1-Step Ultra TMB-ELISA(34028，Thermo Scientific)将板显影一至两分钟，然后用1M H2SO4终止反应。使用FilterMax F3酶标仪(MolecularDevices)在450nm波长下读取板。结合抗体终点滴度计算为最后一次血清稀释，以使其吸光度高于0.1吸光度单位(OD)或高于假免疫的小鼠的平均OD加上相同稀释下同一组OD标准偏差的5倍。为了评估IgG2a/IgG1比率，小鼠血清在PBS中按1:10,000稀释。除了二抗(1:2,000。山羊抗小鼠IgG2a交叉吸附的HRP抗体，Southern biotech，1083–05；山羊抗小鼠IgG1交叉吸附的HRP抗体，Thermo Scientific，A10551)外，该试验如上所述进行。IgG2a/IgG1比率的计算方法为用IgG2a二抗温育的孔中的吸光度读数除以用IgG1抗体温育的同一样本的吸光度。
MVA中和试验：将ARPE-19细胞接种在96孔板中(1.5x104细胞/孔)。第二天，将小鼠血清的连续稀释与表达荧光标志物Venus10的MVA(1.5x104PFU/孔)温育2小时。将血清-病毒混合物添加到一式两份的孔的细胞中并温育24小时。24小时温育期后，使用Leica DMi8倒置显微镜对细胞成像。使用Image-Pro Premier(Media Cybernetics)处理来自每个孔的图片并计算与MVA-Venus感染的细胞所覆盖面积对应的荧光面积。
SARS-CoV-2假病毒产生：转染前一天，将HEK293T/17在补充有10％热灭活FBS，非必需氨基酸，HEPES，和谷氨酰胺的DMEM中以5x106个细胞的密度接种在15cm的培养皿中52。根据制造商的协议，第二天使用FuGENE6(Roche)作为转染试剂：DNA比率为3:1，用包装载体(pALDI-Lenti System，Aldevron)，荧光素酶报告载体和编码野生型SARS-CoV2刺突蛋白(Sino Biological)或水泡性口炎病毒G(VSV-G，Aldevron)的质粒的混合物转染细胞。转染后16小时，更换培养基并将细胞再温育24–72小时。在24小时，48小时，和72小时收获培养基，通过1,500RPM离心5分钟进行澄清，并使用无菌0.22μm孔径过滤器过滤。通过于4℃以20,000RPM超速离心2小时浓缩澄清的慢病毒颗粒。将沉淀重悬于含有2％热灭活FBS的DMEM中，并于4℃储存过夜，使沉淀完全溶解。第二天，将样本等分，快速冷冻并储存在-80℃用于下游试验。
SARS-CoV-2假型中和和ADE试验：通过ELISA(Takara)测量了纯化的SARS-CoV-2假型悬浮液中p24抗原的水平。小鼠血清在完全DMEM中以1:100至1:50,000的线性范围进行热灭活，合并，和稀释。对于中和试验，将稀释的血清样本与SARS-CoV-2-刺突假型荧光素酶慢病毒载体于4℃预温育过夜，标准化为100ng/mL的p24抗原。在转导前一天，将过表达ACE-2受体的HEK293T细胞以每孔2x105个细胞的密度接种在完全DMEM的96孔板中。感染前，每孔中添加5μg/mL聚凝胺。然后将中和的血清样本添加到孔中并将细胞于37℃和5％ CO2气氛下再温育48小时。温育后，每孔使用40μL荧光素酶细胞培养裂解5x试剂(Promega)裂解细胞。使用100μL荧光素酶试验试剂(Promega)作为底物对荧光素酶活性进行定量。使用酶标仪(SpectraMax L，Molecular Devices)在570nm波长下测量了相对荧光素酶单位(RLU)。每个稀释的百分比中和滴度计算如下：NT＝[1-(有免疫血清的平均发光/无免疫血清的平均发光)]x 100。给出90％中和的滴度(NT90)通过使用下一个更高和更低的NT而确定绘制NT与血清稀释的图表的线性斜率从而进行计算。在所有实验中，测量了未感染细胞中的RLU并且始终在50和90之间。
对于ADE试验，将THP1细胞以2x106个细胞/mL的汇合度接种在96孔板中，并在存在SARS-CoV-2刺突假型或VSV-G荧光素酶慢病毒载体的情况下与以1:5,000或1:50,000稀释的血清样本共温育48小时，标准化为100ng/mL的p24抗原。温育后，每孔使用100μL ONE-Glo荧光素酶试验系统(Promega)裂解细胞。RLU的测量如上。
SARS-CoV-2病灶减少中和试验(FRNT)：将HeLa-ACE2细胞以每孔2x103个细胞的密度接种在12μL完全DMEM中。在稀释板中，合并的小鼠血清被连续稀释，最终体积为12.5μL。然后将12.5μL SARS-CoV-2病毒以1.2x104pfu/mL的浓度添加到稀释板中。
温育1小时后，去除保留在384孔板上的培养基，并将25μL病毒/血清混合物添加到该384孔板中。将板温育20小时，然后将板固定1小时。然后用100μL 1xPBS 0.05％吐温将每个孔洗涤3次。将在Perm/Wash缓冲液(BD Biosciences 554723)中以1:500稀释的12.5μL人多克隆血清添加到板的每个孔中并在室温(RT)下温育2小时。将该板洗涤三次并将过氧化物酶山羊抗人Fab(Jackson Scientific)在Perm/Wash缓冲液中以1:200稀释，然后添加到该板中并于RT温育2小时。然后将该板洗涤3次并将12.5μL的Perm/Wash缓冲液添加到该板中，然后于RT温育5分钟。去除Perm/Wash缓冲液并立即添加TrueBlue过氧化物酶底物(SeraCare 5510–0030)。在一式三份的孔中测试血清。正常人血浆用作血清筛选的阴性对照。
SARS-CoV-2恢复期血浆样本：COH机构生物安全委员会协议20004批准使用SARS-CoV-2恢复期血浆。SARS-CoV-2恢复期个体(N＝19)的匿名血浆样本获自加州大学圣地亚哥分校。通过PCR和侧流试验确认个体在之前三到十周内被感染。所有个体均出现轻度至中度-重度症状。在SARS-CoV-2大流行之前购买的血清样本(DS-626-G和DS-626-N，Seracare)用作阴性对照。如上所述测量了血浆样本中的SARS-CoV-2特异性结合抗体。交叉吸附的山羊抗人IgG(H+L)二抗(A18811，Invitrogen)以1:3,000的稀释使用。
T细胞分析：采集脾并使用细胞网解离，然后使用RBC裂解缓冲液(BioLegend)去除血细胞。用S或N肽库(GenScript，15mers与11aa重叠，1μg/ml)，0.1％ DMSO，或佛波醇肉豆蔻酸酯(PMA)-离子霉素(BD Biosciences)于37℃刺激2.5x106个脾细胞1.5小时。添加抗小鼠CD28和CD49d抗体(1μg/ml；BioLegend)作为联合刺激。添加布雷非德菌素A(3μg/ml；eBioscience)，并将细胞于37℃再温育16小时。使用Cytofix缓冲液(BD Biosciences)固定细胞并使用荧光素异硫氰酸酯(FITC)缀合的抗小鼠CD3(克隆17A2，555274，BD)，BV650抗小鼠CD8a(克隆53–6.7，563234，BD)进行表面染色。在使用Cytoperm缓冲液(BD Biosciences)使细胞渗透化后，使用别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗小鼠IFN-γ(克隆XMG1.2，554413，BD)，藻红蛋白(PE)缀合的抗小鼠TNF-α(克隆MP6-XT22，554419，BD)，和PE-CF594抗小鼠IL-2(BDBiosciences(克隆JES6-5H4，562483，BD))进行ICS。在测试双重组SARS-CoV2载体的实验中，未包括IL-2抗体并添加了PE-CF594抗小鼠IL-4(克隆11B11，562450，BD)和BV421大鼠抗小鼠IL-10(克隆JES5-16E3，563276，BD)。使用BD FACSCelesta流式细胞仪(2x105个细胞/管)获取事件。使用FlowJo进行分析。通过大小门控(FSC与SSC)，双重阴性(FSC-H与FSC-A)，CD3+，CD8+/CD4+识别抗原特异性T细胞。在减去每个单独小鼠样本的相应未刺激样本(假刺激开始后一小时添加布雷非德菌素A的培养基)中检测到的背景反应后出现细胞因子阳性反应。通过应用FlowJo Boolean组合门控进行多功能T-细胞分析。
细胞因子ELISA：来自被免疫的小鼠的脾细胞(1x106)在2μg/ml S或N肽池存在或无刺激的情况下在体积为200μl的V形底孔中温育。48小时后，将板以2000RPM离心10分钟，收集细胞上清液并储存在-80℃。根据制造商的建议使用小鼠TNF-α(MTA00B)，QuantikineELISA试剂盒(R&Dsystems)。
IFNγELISpot：根据制造商的说明(3321-2A，Mabtech)，通过IFNγELISpot试验进行T-细胞检测。ELISpot PVDF板(MSIPS4W10，Millipore)用乙醇预活化并涂有IFNγ包被抗体。将脾细胞(2X105肽刺激，2X104PMA/离子霉素刺激)添加到一式两份的孔中并与2μg/mL肽温育过夜。刺激物包括S和N肽库；S1亚单位肽池涵盖S库的肽1–86(池1S1)和87–168(池2S1)；S2亚单位肽池包括S库的肽169–316；和N肽库的肽N26(MKDLSPRWYFYYLGT)。24小时后去除细胞，添加IFNγ检测抗体，然后添加链霉抗生物素蛋白-ALP。使用BCIP/NBT-plus(3650–10，Mabtech)使斑点显色，并使用带有AID ELISpot 5.0iSpot软件的AID ELISpot读取仪进行分析。
统计：使用GraphPad Prism(v8.3.0)进行统计学评估。为了评估BHK-21和CEF细胞中sMVA和wtMVA斑块面积的差异以及sMVA和wtMVA宿主细胞范围的差异，分别使用单向ANOVA和Tukey和Dunnet多重比较检验。对于sMVA和wtMVA生长动力学分析，应用了带有Geisser-Greenhouse校正的混合效应模型，然后是Tukey多重比较检验。对于ELISA，单向ANOVA和Tukey多重比较检验用于计算组间终点滴度和组平均值的差异。对于IgG2a/IgG1比率分析，带有Dunnett多重比较检验的单向ANOVA用于比较各组测得的IgG2a/IgG1比率与1的比率。进行皮尔逊相关分析以计算相关系数r及其显著性。对于T细胞反应分析，使用单向ANOVA和带有单合并方差的Dunnett多重比较检验比较每组的平均值。对于ELISpot分析，应用了带有Dunnett多重比较检验的双向ANOVA。
示例1：sMVA的构建
为了开发sMVA疫苗平台的三质粒系统，基于Antoine等人公布的MVA基因组序列4设计了三个独特的合成亚基因组MVA片段(sMVA F1–F3)，长度为约178kbp并包含约9.6kbp反向末端重复(ITR)(图1A)。三个片段设计如下：sMVA F1包含约60kbp的MVA基因组左部分，包括左ITR序列；sMVA F2包含约60kbp的MVA基因组中心部分；sMVA F3包含约60kbp的MVA基因组右部分，包括右ITR序列(图1B)。sMVAF1和F2以及sMVA F2和F3被设计为共享约3kbp的重叠同源序列以促进三个sMVA片段的重组(图1B)。另外地，将侧翼为多联体解析(CR)序列的165个核苷酸长的MVA末端发夹环(HL)的双链体拷贝添加至三个sMVA片段中每一个的两端(图1C)。这种CR/HL/CR序列排列在痘病毒DNA复制中间体的基因组连接处形成并且对基因组解析和包装至关重要27–31。当包含这些CR/HL/CR序列排列的环状DNA质粒被转染到辅助病毒感染的细胞中时，它们会自发分解为具有完整末端HL序列的线性微型染色体28,29,32。如图1B–1C所示设计的三个sMVA片段，当作为环状DNA质粒共转染到辅助病毒感染的细胞中时，可以分解为线性微染色体，经由共享的同源序列彼此重组，并最终包装成全长MVA基因组。所有三个sMVA片段均被克隆至大肠杆菌作为细菌人工染色体(BAC)克隆。
使用先前采用的过程从BAC拯救MVA8,9,33，在将三个DNA质粒共转染到BHK-21细胞中后，sMVA病毒与作为辅助病毒的禽痘(FPV)重构(图1D)，而BHK-21细胞对于FPV是不容许的34。两种不同的FPV株(HP1.441和TROVAC)35,36用于促进sMVA病毒重构(图2A)。纯化的sMVA病毒在CEF中病毒繁殖后产生，通常用于MVA疫苗生产。重构的sMVA病毒获得的病毒滴度与“野生型”MVA(wtMVA)获得的病毒滴度相似(表1)。
Figure BDA0004113704310000781
*感染(MOI 0.02)30x15cm培养皿后在CEF上产生原种。
示例2：sMVA的体外表征
为了表征sMVA的病毒DNA，通过PCR比较了sMVA和wtMVA感染的CEF的DNA提取物的几个MVA基因组位置15。对于所有被评估的基因组位置，sMVA和wtMVA获得了相似的PCR结果(图1E)，包括F1/F2和F2/F3重组位点，这表明三个sMVA片段的有效重组。额外的PCR分析表明sMVA病毒DNA中不存在任何BAC载体序列(图1E)，这表明在sMVA病毒重构时自发和有效地去除细菌载体元件。通过限制性酶消化对来自纯化的sMVA和wtMVA病毒的病毒DNA的比较显示了sMVA和wtMVA之间相似的基因组模式(图1F)。sMVA病毒DNA的测序分析证实了几个位置处的MVA基因组序列，包括F1/F2和F2/F3重组位点。此外，对一种用FPV TROVAC重构的sMVA病毒分离物进行全基因组测序，证实了源自重构的sMVA病毒的病毒DNA中参考MVA基因组序列的组装和不存在载体特异性序列。
为了表征sMVA的复制特性，比较了sMVA和wtMVA在BHK-21和CEF细胞上的生长动力学，已知这两种细胞类型支持生产性MVA复制6。该分析显示了sMVA和wtMVA在BHK-21和CEF细胞上相似的生长动力学(图2B)。另外地，在感染sMVA或wtMVA的BHK-21和CEF细胞单层中测得相似的病毒灶病面积(图2C)，这表明sMVA和wtMVA在MVA容许细胞中相似的传播能力。与sMVA和wtMVA在BHK-21和CEF细胞中的生产性复制相比6，在感染多个人细胞系后仅观察到sMVA或wtMVA有限的病毒产生(图2D)。这些结果与MVA的严格限制性复制特性一致并且示出sMVA病毒可以在BHK-21和CEF细胞中有效繁殖，而不能在人细胞中有效繁殖。示例3：sMVA的体内免疫原性
为了在体内表征sMVA，在两次高剂量或低剂量免疫后比较了C57BL/6小鼠中sMVA和wtMVA的免疫原性。在第一次和第二次免疫后由sMVA和wtMVA刺激的MVA特异性结合抗体是相当的(图3A，4A)。虽然在第一次免疫后高剂量疫苗组的抗体水平超过低剂量疫苗组的抗体水平，但在第二次免疫后观察到高剂量疫苗组和低剂量疫苗组的抗体水平相似。另外地，在第二次免疫后由sMVA和wtMVA诱导的MVA特异性NAb反应的水平没有检测到显著差异(图3B，4B)。在通过使用免疫显性肽35进行离体抗原刺激的加强免疫后所测定的MVA特异性T细胞反应显示了接受sMVA或wtMVA的小鼠中相似的MVA特异性T细胞水平(图3C–3D和4C–4D)。这些结果表明sMVA病毒在小鼠中诱导MVA特异性体液和细胞免疫方面具有与wtMVA相似的能力。
示例4：sMVA SARS-CoV-2疫苗载体的构建
在大肠杆菌中使用高效BAC重组技术，将全长SARS-CoV-2S和N抗原序列插入位于三个sMVA片段内不同位置处的常用MVA插入位点。随后将被修饰和未被修饰的sMVA片段的组合共转染到FPV感染的BHK-21细胞中以重构单独或组合表达S和N抗原序列的sMVA SARS-CoV-2(sMVA-CoV2)载体(图5A和5B)。在单独编码S或N的单重组载体(分别称为sMVA-S和sMVA-N)中，抗原序列被插入缺失(Del3)位点(图1B和5B)5。在编码S和N的双重组载体(称为sMVA-N/S和sMVA-S/N)中，抗原序列被插入Del3和缺失2(Del2)位点(sMVA-N/S)，或者它们被插入Del3和069R和070L之间的基因间区域(IGR69/70)(sMVA-S/N)(图1B和5B)5,38。所有抗原序列与mH5启动子一起插入sMVA-CoV2载体以促进MVA复制早期和晚期的抗原表达39,40。sMVA-CoV-2疫苗载体用FPV株HP1.441或TROVAC重构。使用CEF产生的sMVA-CoV2载体的纯化的病毒达到的滴度与用sMVA或wtMVA获得的滴度相似(表1)。Del2，Del3，和IGR69/70MVA插入位点的PCR和测序分析证实了SARS-CoV-2抗原序列在所有sMVA-CoV2疫苗载体中的完整性和插入(图5C)。此外，所有双重组sMVA-CoV2疫苗载体的全基因组测序—用FPV株TROVAC或HP1.441重构—验证了这些疫苗构建体在NCBI中保藏的参考序列并确认了在插入位点处的SARS-CoV-2抗原序列，MVA基因组的同一性，和BAC载体序列的去除。
示例5：sMVA-CoV2疫苗载体的体外表征
为了表征sMVA-CoV2载体的S和N抗原表达，使用S和N特异性抗体通过免疫印迹评估了感染sMVA-CoV2载体的BHK-21细胞。该分析证实了单重组疫苗载体sMVA-S和sMVA-N单独表达S或N抗原，而证实了双重组载体sMVA-N/S和sMVA-S/N表达S和N抗原(图5D)。
使用细胞表面和细胞内流式细胞术(FC)染色进一步表征sMVA-CoV2载体在HeLa细胞中的抗原表达，证实了单和双重组疫苗载体表达单一和双重S和N抗原。用S特异性抗体的染色显示了所有编码S抗原的载体(sMVA-S，sMVA-N/S，sMVA-S/N)均有丰富的细胞表面和细胞内抗原表达(图5E)。相比之下，用抗N抗体的染色显示了所有编码N抗原的载体(sMVA-N，sMVA-N/S，sMVA-S/N)主要为细胞内抗原表达(图5E)，尽管也在较小程度上观察到细胞表面染色。还通过免疫荧光研究了sMVA-CoV2载体的S和N抗原表达。该分析证实了双重组疫苗载体共表达S和N抗原并且表明了S抗原的有效细胞表面和细胞内表达，而N抗原的表达主要在细胞内观察到(图6A–6C)。此外，除了通过双抗体染色进行的细胞内流式细胞术外，免疫荧光成像还证明了双重组sMVA-CoV2载体在同一细胞内共表达S和N抗原(图6A–6D)。这些结果证明了单和双重组sMVA-CoV2的有效抗原表达。
示例6：sMVA-CoV2载体的体内免疫原性
为了确定单独或组合以sMVA为载体的S和N抗原的免疫原性，评估了用单或双重组疫苗载体免疫两次的Balb/c小鼠中SARS-CoV-2特异性体液和细胞免疫反应。第一次免疫后在所有疫苗组中检测到高滴度抗原特异性结合抗体，并且在加强免疫后观察到这些反应增加(图7A–7B和8A–8B)。虽然单重组载体仅诱导针对S或N抗原的结合抗体，但双重组载体诱导了针对S和N抗原的结合抗体。另外地，所有编码S抗原的sMVA-CoV2载体(sMVA-S，sMVA-S/N，sMVA-N/S)均刺激了针对S受体结合结构域(RBD)的高滴度结合抗体，这被认为是NAb的主要目标22,24。单和双重组疫苗组之间的抗原特异性结合抗体滴度相当。值得注意的是，sMVA-CoV2疫苗载体在小鼠中刺激的SARS-CoV-2抗原特异性结合抗体反应超过了在人恢复期免疫血清中测得的SARS-CoV-2S，RBD，和N特异性结合抗体反应(图7A–7B和9)。疫苗载体在C57BL/6小鼠中引发了与sMVA-CoV2载体在Balb/c小鼠中诱导的相似的结合抗体反应(图10)。对结合抗体的IgG2a/IgG1同型比率的分析表明趋向Th-1的免疫反应倾向于IgG2a，与所研究的疫苗组或抗原无关(图7C和8C)。
在所有接受编码S抗原的载体(sMVA-S，sMVA-S/N，sMVA-N/S)的疫苗组中的第一次免疫后检测到使用假病毒测定的有效SARS-CoV-2特异性NAb反应，并且这些NAb反应在加强免疫后增加(图7D–7E和8D–8E)。在使用感染性SARS-CoV-2病毒的疫苗组中观察到与使用假病毒测量的相似的有效NAb反应(图7F–7G和8F–8G)。使用THP-1单核细胞评估了用于潜在感染的抗体依赖性增强(ADE)的免疫血清。这些细胞不表达ACE2受体，但表达Fcγ受体II，后者被认为是SARS-CoV感染中ADE的主要介质41。即使在亚中和抗体浓度下，任何疫苗组的免疫血清都不促进SARS-CoV-2假病毒对THP-1单核细胞的感染(图11)，这表明疫苗载体诱导的抗体不存在Fc介导的ADE。
在通过离体抗原刺激进行第二次免疫后评估的SARS-CoV-2特异性T细胞显示了在接受双重组载体sMVA-S/N和sMVA-N/S的疫苗组中的S和N特异性T细胞反应。相比之下，接受单重组载体sMVA-N或sMVA-S的小鼠产生了仅针对N或S抗原的T细胞反应(图12A–12D，13，和14)。在用编码S的sMVA-CoV2载体免疫的所有疫苗组中测量到高水平的分泌细胞因子(IFNγ，TNFα，和IL-4)S特异性CD8+T细胞(图12A)。S特异性CD4+T-细胞主要产生Th1细胞因子(IFNγ和TNFα)，而Th2细胞因子(IL-4和IL-10)的产生在抗原刺激后没有增加(图12C，14)，表明趋向Th1的反应。虽然未以显著频率检测到激活的N特异性CD8+T细胞(图12B)，但在所有接种了编码N的单和双重组载体的动物中测量到N特异性IFNγ和某种程度上分泌TNFα的CD4+T细胞(图12D和14)。单和双重组疫苗组的T细胞水平未观察到显著差异。
还评估了通过使用不同剂量的单重组载体sMVA-S和sMVA-N进行联合免疫的小鼠中S和N抗原对SARS-CoV-2特异性免疫反应的刺激。这项研究显示了在单独或组合接受sMVA-S和sMVA-N的疫苗组中相似的SARS-CoV-2抗原特异性体液和细胞免疫反应(图15和16)。总之，这些结果表明以sMVA为载体的S和N抗原在使用单一载体或两个不同载体单独或组合表达时可以在小鼠中刺激有效的SARS-CoV-2特异性体液和细胞免疫反应。示例7：COH04S1在小鼠中的体内免疫原性
用sMVA疫苗COH04S1免疫一次或两次的小鼠表现出高滴度的结合抗体，中和抗体，和T细胞反应性。这些结果表明COH04S1在小鼠中具有高免疫原性。见下表2。NT50/90是仍显示50/90％感染中和的(含抗体)血清的稀释。结合MVA广泛的先前安全性和临床经验以及作为解决未来冠状病毒变体的平台，本文公开的疫苗具有潜在的重要临床用途。
表2.COH04S1引发的小鼠免疫原性总结
Figure BDA0004113704310000831
图18显示了在用表达S和N抗原的C46进行第一次(上图)和第二次(下图)免疫后示出的针对刺突(S)，受体结合结构域(RBD)，和核衣壳(N)抗原的高滴度总结合抗体。抗体滴度与恢复期人血清中的抗体滴度相比具有优势(虚线)。S特异性抗体反应有效结合突变的S(D614G)抗原(数据未显示)。
图19显示了接种双抗原构建体sMVA-N/S(C35)以及单抗原和无抗原及对照的小鼠中的抗原特异性CD4+(左侧)和CD8+(右侧)T细胞反应。IFNγ和TNFα细胞因子的产生表现出稳健的抗刺突Th1细胞因子反应。没有对IL-4(和IL-10，数据未显示)的反应表明缺乏Th2反应。
图20示出了IGg2a与IgG1和IFNγ与IL-4分泌的比率，表明接种sMVA-N/S(C35)主要导致体液和细胞Th1反应(这有助于针对病原体的细胞介导的免疫)，而不是Th2反应。接种掺有明矾佐剂(用于诱导Th2反应的原型佐剂)的刺突抗原显示为每个小图中右边的对照。
图21示出了用双抗原COH04S1，单抗原，和空载体，以及假对照进行一次(“初免后”)或两次(“加强后”)免疫后小鼠血清中的抗体，表明当使用表达刺突抗原的载体时的中和抗体的有效产生。仅表达刺突抗原的sMVA疫苗以蓝色显示(sMVA-S)，仅表达核衣壳抗原的sMVA疫苗以红色显示(sMVA-N)，表达刺突抗原(S)和核衣壳(N)抗原的sMVA疫苗以绿色显示(COH04S1)，没有SARS-CoV-2插入物的sMVA载体以棕色显示(sMVA)，假疫苗接种以藏青显示(假)。使用活SARS-CoV-2感染HeLa-Ace2细胞以测量中和抗体。
图22示出了COH04S1在小鼠中引发的有效的SARS-CoV-2特异性中和抗体(Nab)(使用活SARS-CoV-2病毒)。NAb有效地阻断了SARS-CoV-2感染性病毒的感染。NAb的滴度比被认为对SARS-CoV-2感染具有保护作用的滴度高出1–2个数量级。
图23示出了C46没有表现出与感染的抗体依赖性增强(ADE)的特征紧密联系的证据。左小图示出了表达人ACE2蛋白的HEK细胞。用C46以及单表达S的载体感染小鼠后生成的抗体成功预防了假病毒感染。未观察到来自用任何载体处理的小鼠的血清抗体对对照感染的抑制并且未观察到ADE(这将显示为较上点虚线上方的RLU单位)。该小图是示出疫苗有效的阳性对照。中间小图示出了THP-1单核细胞系，不表达ACE2受体(因此不能被SARS-CoV-2病毒感染)但表达Fc受体(怀疑会导致ADE)。在这个实验中未观察到感染和ADE(点虚线上方无增加)。右小图示出了THP-1细胞，VSV载体感染的阳性对照。在来自被治疗小鼠的抗体存在的情况下，这种感染没有减少，并且在这些抗体存在的情况下也没有观察到ADE效应(RLU在较上点虚线上方没有增加)。RLU表示相对荧光素酶单位，是该系统感染程度的量度。
图24示出了腹膜内(IP)和鼻内(IN)疫苗接种后，COH04S1在小鼠中诱导的强烈的体液和细胞免疫反应。
为了进一步评估以sMVA为载体的N抗原的免疫原性，评估了双重组疫苗载体sMVA-N/S在表达人白细胞抗原(HLA)-B*0702(B7)的转基因C57BL/6小鼠中的抗原特异性T-细胞刺激。这种HLA类型最近被描述为呈现在SARS-CoV-2感染患者中经常被识别的免疫显性N特异性肽。用sMVA-N/S免疫的C57BL/6B7小鼠产生了分泌IFNγ和TNFα的高频N特异性CD8+T细胞，占CD8+T-细胞群的2–3％以上(图25A)。在sMVA-N/S免疫的C57BL/6B7小鼠中也以显著水平检测到分泌IFNγ的S特异性CD8+细胞，尽管与N特异性T-细胞反应相比频率较低(图25B)。在sMVA-N/S免疫的动物中未观察到显著水平的N或S特异性CD8+T细胞分泌IL-4。值得注意的是，C57BL/6B7小鼠中sMVA-N/S刺激的CD8+T细胞对N和S抗原均具有很大的多功能性，超过一半的N特异性CD8+T细胞同时分泌IFNγ和TNFα(图25C和25D)。通过IFNγELISPOT的进一步分析显示了在C57BL/6B7小鼠中由sMVA-N/S诱导的S特异性T-细胞反应主要针对S2结构域的表位(图26)。另外地，在用HLA-B*0702免疫显性N特异性肽表位(SPRWYFYYL)刺激后，测量到sMVA-N/S免疫的B7小鼠的显著反应，最近显示该表位被高比例的被从COVID-19疾病恢复的人识别(图26)。图26示出了对刺突抗原的反应的主要成分是对S2结构域。N库在人中得到了广泛识别。一个重要成分被识别为先前描述的N肽：
Figure BDA0004113704310000861
粗体和下划线是在人中被描述的表位：Peng,Y.,Mentzer,A.J.,Liu,G.等人,SARS-CoV-2在COVID-19后英国康复者中诱导的广泛而强大的记忆CD4+和CD8+T细胞.国家免疫学(2020).https://doi.org/10.1038/s41590-020-0782-6。这些结果表明，以sMVA为载体的N和S抗原在HLA B*0702转基因小鼠中均具有免疫原性，而靶向N的CD8+T-细胞反应看上去是免疫显性。
图27示出了用COH04S1临床分离物免疫的老年小鼠在初免-加强免疫后产生了与年轻小鼠相当的免疫反应。
图28示出了COH04S1临床分离物的免疫原性。COH04S1在Balb/C小鼠中表现出性别间相当的免疫原性，并且与S/N/Alum相比，对所有抗原均表现出Th1免疫力。
示例8：COH04S1在仓鼠中的体内免疫原性
COH04S1免疫原性和保护研究使用6–8周龄的金色叙利亚仓鼠(Mesocricetusauratus)进行。该研究的目的是测试基于希望之城(COH)合成MVA平台的SARS-CoV-2疫苗候选物在金色叙利亚仓鼠中的免疫原性和保护功效。
叙利亚金色仓鼠被选为小动物模型，因为与人疾病和其他小动物模型相比，比较模型的COVID-19疾病症状更相似，从而可以评估包括COH04S1的多种疫苗对预防和降低疾病严重程度的影响。
在表3中描述的15组中评估的总共90只金色叙利亚仓鼠被用于评估经由肌内和鼻内途径的合成SARS-CoV-2sMVA疫苗候选物。除了COH04S1之外，还测试了表达野生型或2P S(刺突)和单独N(核衣壳)或S的sMVA构建体。该分析包括共表达S和N抗原的野生型形式的亲本sMVA-N/S载体C35(图5)，通过双斑块纯化过程衍生自C35(图17和57)的临床分离物COH04S1(C35/F4/B1)，另一种衍生自C35的双斑块纯化分离物(C35/F4/D5)；衍生自sMVA-S/N载体C46(图5)的双斑块纯化分离物(C46/C3/F10)，共表达N以及具有2P改变的预融合稳定形式的S抗原的sMVA载体(C79)，和仅表达野生型S的sMVA-S载体C15。对照组是sMVA空载体和假免疫动物。用1x108pfu的sMVA重组体对动物进行肌内(IM)或鼻内(IN)免疫。
表3.研究组/实验设计
Figure BDA0004113704310000871
Figure BDA0004113704310000881
在第0天以指定剂量经由所示途径向动物施用疫苗构建体，然后在第28天加强施用。在所示时间点评估血清的结合抗体和SARS-CoV-2真病毒中和(图29)。每组6只动物(3只雌性仓鼠和3只雄性仓鼠)经由肌内或鼻内途径用1x108pfu的COH04S1或1x108pfu的sMVA空对照载体以初免-加强方案免疫。
免疫后分析包括对刺突和核衣壳特异性结合抗体的检测以及对活SARS-CoV-2病毒和刺突假病毒的中和抗体进行定量。
加强后两周，用6x104pfu的SARS-CoV-2，分离物USA-WA1/2020(NR-52281，BEIResources)挑战动物。在挑战后10天，将动物安乐死，并收集器官用于确定病毒滴度，大体病理学，和组织病理学评估。随着时间的推移体重减轻，每天进行两次临床观察。
体液反应
在初免后4周(第28天)和加强后两周(第42天)测量仓鼠血清中对S，RBD，和N的总IgG结合抗体。在对照动物中未检测到结合抗体。相比之下，所有sMVA-SARS-CoV-2免疫的动物都在初免后产生了对S，RBD，和N的结合抗体，并且滴度因第二剂而增加(图30)。在IM和IN免疫的仓鼠中测量到相当的滴度。
使用PRNT SARS-CoV-2试验评估了第28天和第42天收集的血清是否存在中和抗体(NAb)。
如表4和图31所示对照动物没有产生NAb(IC50<20)。初免后在少数动物中检测到低滴度NAb并且在IN免疫后看上去更高，尽管结果并非适用于所有动物。加强后NAb滴度增加，范围在60和>4860之间(试验检测上限)。
Figure BDA0004113704310000891
/>
Figure BDA0004113704310000901
/>
Figure BDA0004113704310000911
体重分析
仓鼠在加强后两周用6x104pfu的SARS-CoV-2，分离物USA-WA1/2020挑战，并每天测量体重变化，持续10天。用sMVA-S/N，N/S，S疫苗IM免疫的仓鼠显示出与对照动物相当的初始轻微体重减轻。从挑战后第3天开始，sMVA-S/N，N/S，S免疫的动物开始恢复其体重，而对照动物体重持续下降。对照动物的体重在第7天下降至-15％的平均值，此后开始增加。在挑战后第3天和挑战后第10天的最后时间点之间，sMVA-SARS-S/N，N/S，S，和对照动物之间的体重差异显著(图32和33)。
用sMVA-S/N，N/S，S IN免疫的动物获得了相似的结果。与假免疫和sMVA IN免疫的仓鼠相比，鼻内给予sMVA-S/N，N/S，S防止了受挑战动物的体重减轻。从第2天到研究结束的差异显著(图32和33)。与施用途径无关，在所有测试的重组疫苗中没有观察到差异。另外地，在雌性和雄性仓鼠之间没有观察到体重减轻的差异(图33)。
COH04S1的作用
COH04S1IM和IN免疫的动物在初免后和加强后产生了相当的对S，RBD，和N的结合抗体滴度(图34)。另外地，对抗体同型的分析表明趋向Th1的反应，IgG2–3/IgG1比率强烈移向Th1同型IgG2和IgG3。六只IM免疫的COH04S1仓鼠中有六只具有高滴度NAb，几何平均IC50为540。COH04S1IN免疫的动物的滴度在180到1620之间，中值滴度为540。COH04S1IM或IN保护的动物在使用真SARS-CoV-2病毒进行亚致死性挑战后免于体重减轻(图35)。
通过基因组RNA qPCR分析了挑战后第10天收集的肺，鼻甲，和鼻洗液中是否存在SARS-CoV-2基因组(图36)。在挑战后第10天，假免疫和sMVA免疫的仓鼠在肺，鼻甲，和鼻洗液中仍然具有高病毒载量。COH04S1IM和IN免疫的动物样本示出了肺，鼻甲，和鼻洗液中的gRNA量显著减少，肺中测得的差异最大，表明COH04S1介导的保护作用。
示例9：COH04S1在非洲绿猴中的体内免疫原性和保护功效
非洲绿猴(AGM)支持高水平的SARS-CoV-2复制并发展出比其他NHP物种(包括食蟹猴和恒河猴)更严重的明显呼吸疾病，从而与人表现出的COVID-19症状具有更大的可比性。
在这项研究中，不同性别和体重的远交AGM(表5)肌内(IM)接种COH04S1一剂或两剂，并评估了疫苗的免疫原性和保护功效。
Figure BDA0004113704310000921
Figure BDA0004113704310000931
AGM接受一次(研究2)或两次(研究1)免疫，分别用5x108pfu或2.5x108pfu的sMVA重组体。每项研究中的三只AGM接受假盐水免疫或空sMVA载体作为对照。在初免(研究2)或初免-加强(研究1)设置中用COH04S1对每项研究中的六只AGM进行免疫(图38)。在不同时间点采集血液和血清样本用于分析细胞免疫和体液免疫。初免后六周(研究2)或加强后六周(研究1)，AGM被1x105pfu的SARS-CoV-2的挑战。对动物进行观察，在第一周每天称重和测温，随后两周每隔一天一次。在每个采样日，收集鼻，口腔，和肛门拭子。在挑战后第2，4，7，10，和21天收集支气管肺泡灌洗(BAL)。在挑战后第7天，处死两项研究中的1只假动物，2只sMVA对照动物，和3只COH04S1免疫的动物并收集器官用于病毒定量和组织病理学。在挑战后第21天，处死两项研究中的剩余动物并收集器官用于病毒学和免疫学研究。
从初免后2周(研究2)和加强后2周(研究1)开始，通过IFNγ/IL-2/IL-4ELISPOT在新鲜分离的PBMC中评估了对刺突(S)和核衣壳(N)抗原的T细胞反应(图39–41)。与初免-加强动物相比，仅初免动物往往具有较低的S和N特异性IFNγT细胞水平。然而，仅初免动物的挑战后回忆反应高于初免-加强动物。COH04S1免疫的AGM对S和N产生了稳健的IFNγT-细胞反应，这在对照动物中不存在，并在挑战后第7天增加，表明对挑战病毒的记忆反应(图39)。IL-2反应紧随IFNγ反应，尽管水平较低。表明病理性炎症反应的IL-4T细胞反应在所有COH04S1免疫的动物中非常低或不存在(图40–41)。
通过基因组RNA(gRNA)定量和斑块定量(组织培养感染剂量50，TCID50)评估了BAL样本是否存在SARS-CoV-2挑战病毒。与仅测量复制病毒的亚基因组RNA(sgRNA)和TCID50不同，gRNA是输入挑战病毒和复制病毒的量度，尤其是在挑战后的早期时间点可能被输入病毒高度污染。在挑战后第2天，初免和初免-加强COH04S1动物的BAL样本中均显示gRNA拷贝比对照动物显著减少(图42)。每项研究中有一只接种COH04S1的动物在BAL中检测不到病毒。在挑战后第4天，接种疫苗的动物的gRNA拷贝与对照相比有降低的趋势，但差异不显著。
在挑战后第2，4，和7天采集的BAL样本中的病毒载量通过斑块试验进行定量(图43–44)。在挑战后第2天，来自用COH04S1免疫的动物样本中的病毒载量与对照相比显著减少。研究1中的一只动物和研究2中的三只动物在挑战后第2天的BAL样本中检测不到病毒。到挑战后第7天，除研究1中的AGM外，所有COH04S1免疫的动物的病毒载量均低于试验检测的下限。相比之下，这两项研究中的所有对照动物在挑战后第7天肺中仍有可测量的病毒。这些结果表明，一次或两次注射施用COH04S1可以快速保护AGM下呼吸道免受SARS-CoV-2病毒感染。
示例10：COH04S1预防COVID-19的I期临床试验
在剂量递增临床试验(NCT04639466)中对健康成人的COH04S1进行了评估以确定不良事件和最佳剂量。以三个不同剂量水平(DL)评估了COH04S1疫苗的安全性和耐受性：1.0x107斑块形成单位(PFU)/剂量，1.0x108PFU/剂量，和2.5x108PFU/剂量。对于每个DL，包括4–6个非盲标记。
COH04S1I期临床试验以3个剂量水平(DL1–3)进行，每个DL有4–6个非盲标记，随后35名被注射的健康研究受试者随机对照安慰剂。DL1对应于1x107PFU/剂量，与用于小鼠的低剂量相同。DL2对应于1x108PFU/剂量，DL3对应于2.5x108PFU/剂量。所有剂量均适合大规模生产。安全地对17个标记中的16个(一个DL2标记仅接受初免疫苗接种后退出研究)进行了初免-加强免疫，并且COH04S1在DL1，DL2，和DL3标记中安全且耐受性良好。所测试的所有标记均血清转化为S和N抗原，并产生了Th1T细胞反应。所有被测试的标记均产生了中和抗体。
结合抗体
使用ELISA评估了四个DL1非盲标记直至第120天产生的对刺突(S)，S受体结合结构域(RBD)，和核衣壳(N)的IgG结合抗体(图45A)。在所有时间点的所有DL1标记中，S特异性结合抗体都是可测量的，并且在加强后趋于增加。RBD特异性结合抗体在初免后的3/4DL1标记中不存在。加强后水平与在35名患有轻度至重度COVID-19疾病的SARS-CoV-2恢复期个体池中测得的中值水平相当或略低。N特异性结合抗体水平在DL1标记之间是可变的。加强后的所有DL1标记中都可检测到加强后N特异性结合抗体，其水平与在恢复期个体中测得的水平一样高。
评估了五个DL2标记到第90天产生的对S，RBD，和N的IgG结合抗体(图45B)。与DL1标记相似，在所有五个DL2标记中，在第一次接种COH04S1后不久就产生了对S的结合抗体，并通过第二剂得到加强。引物免疫后在5个DL2标记的4个中测得RBD结合抗体，并且在加强后达到了与恢复期血清中测量的滴度相比更高的滴度。DL2标记产生了不同水平的N特异性结合抗体，5个标记中有5个截至第56天显示出可测量水平的N特异性IgG。
评估了6个DL3标记中直到第56天的S，RBD，和N特异性结合抗体(图45C)。所有DL3标记都易于在初免后产生S特异性结合抗体。6个DL3标记中有2个S特异性IgG滴度未因第二剂而加强。在给定第28天加强后，其余4个DL3标记的S-IgG增加。6个DL3标记中有4个的RBD特异性结合抗体高于基线，包括一个DL3标记在初免后达到了比恢复期血清中测量的滴度更高的滴度。加强后的所有DL3标记均有RBD特异性结合抗体，其滴度与恢复期血清中测量的滴度接近或相当。尽管与DL1和DL2标记相比，DL3标记的N特异性结合抗体往往在初免后达到更高的滴度，但它们之前存在差异。截至第42天，6个DL3标记中有6个具有可测量的N特异性结合抗体。
将DL1/DL2/DL3标记中对S，RBD，和N的IgG滴度与在引物免疫后第60天和第90天接受了两剂EUA疫苗(Pfizer/BioNTech)的希望之城员工组中测得的滴度进行比较。另外地，将COH04S1疫苗的滴度与35名患有轻度至重度COVID-19疾病的SARS-CoV-2恢复期个体池中测得的滴度进行比较(图46)。总体而言，两剂COH04S1后诱导的S，RBD，和N特异性抗体与EUA疫苗接受者和/或从轻度至重度COVID-19疾病恢复的个体的恢复期血浆中的S，RBD，和N特异性抗体相当。加强免疫增加了滴度，尤其是RBD结合抗体。
为了解决最新的SARS-CoV-2变异病毒，评估了DL1/DL2/DL3标记血清样本与P.1巴西SARS-CoV-2变异刺突的结合，并与原始SARS-CoV-2Wuhan株的刺突的结合进行比较(图47)。与Wuhan刺突相比，DL1标记血清样本与P.1刺突的结合效率较低，导致滴度较低。相比之下，在所有时间点，DL2和DL3标记对P.1刺突和Wuhan刺突的滴度相似，大多数DL3标记在第56天对P.1刺突的滴度相当或更高。
中和抗体
使用体外微量中和试验和每个株的基于慢病毒的假病毒，测量了针对祖先Wuhan刺突氨基酸序列的D614G变体和广泛存在的UK(B.1.1.7)，南非共和国(RSA，B.1.351)，和巴西(BRA，P.1)VOC的中和抗体(图48)。所有刺突序列均包含D614G突变，并在C-末端截断了最后19个氨基酸(KFDEDDSEPVLKGVKLHYT)。
与RBD特异性结合抗体的产生时间一致，DL1标记中针对三种株的中和抗体在初免后较低或不可测量，但一个DL1标记除外，该DL1标记在初免后第14天立即对参考株，UK和巴西VOC产生了介于50和100之间的NT50。在其他3个DL1标记中观察到滴度在加强后的显著增加，NT50滴度高达150。所有三种株均以不同的效力被中和，并且滴度截至第56天保持稳定。在第90天和第120天，所有DL1标记均有可测量的对至少一种病毒株(祖先武汉株或VOC)的中和抗体。
在针对参考株和UK，RSA，和BRA VOC进行中和抗体测试的5个DL2标记中，4个在初免后产生的早期中和抗体达到峰值NT50滴度达300。总体而言，与DL1标记相比加强后滴度升高，针对D614G(Wuhan)，UK，RSA，和BRA VOC的d56NT50几何平均滴度(GMT)分别为212，169，64，和119(图49)。
DL3标记的6名志愿者中有2名产生了早期高滴度中和抗体。其他4个DL3标记在初免后具有低滴度中和抗体，在第二剂疫苗后抗体滴度增加。总体而言，DL3标记对D614G(Wuhan)株和UK，RSA，和BRA VOC的中和抗体滴度与DL2标记中测得的滴度和在EUA疫苗接受者队列中使用相同假病毒测得的滴度相当(图49)。
T细胞反应
通过IFNγ/IL-4ELISPOT评估了T细胞反应。用覆盖整个疫苗抗原S和N的肽池以及SARS-CoV-2病毒膜(M)抗原肽池在体外刺激冷冻保存的PBMC过夜。刺突肽被分成四个子池，每个子池中有71–86个肽，并且添加对每个池的Elispot反应以给出对S抗原的总反应。所有覆盖N抗原的肽都包含在单个N抗原池中。从每个样本中减去假刺激样本(DMSO)中的Elispot反应(图50和51)。
如图51和52所示，所有4个DL1标记都在初免后产生了S和N特异性IFN-γT细胞反应。通过第二次免疫加强了T细胞并稳定至第120天，具有更高的S-和N-IFNγ反应趋势。在S和N刺激后，分泌IL-4的T细胞的水平非常低或不存在。所有DL1志愿者均没有M特异性反应。与DL1标记相比，DL2标记对S和N的IFN-γT-细胞反应更高。一些受试者加强后的IFN-γT细胞反应高于初免后，而其他受试者则更低。IL-4对S和N的反应表示T辅助细胞的Th2表型在所有受试者中都很低。M特异性T细胞反应低或不存在。DL3标记IFN-γT-细胞反应在初免后达到峰值，大多数标记的加强后水平低于初免后。
将COH04S1标记中的IFN-γ和IL-4T细胞反应与Pfizer/BioNTech疫苗接受者池在引物免疫后第56–60天和第90天测量的水平进行比较(图53)。在第56–60天和第90天，COH04S1标记显示出与EUA疫苗接受者相当水平的S特异性IFN-γ和IL-4T细胞。由于N抗原包含在COH04S1而不是mRNA疫苗中，因此N特异性IFN-γT细胞反应显著高于EUA疫苗接受者。
这些结果表明用COH04S1的免疫成功诱导了对S和N的强Th1T细胞反应和想要的的低Th2反应。由本文公开的疫苗组合物引发的T细胞反应与其他EUA和研究疫苗相当。
示例11：基于SARS-CoV-2变体构建的额外的sMVA疫苗
使用合成疫苗平台生成了基于首先在南非识别的SARS-CoV-2变异谱系B.1.351的共表达全长S和N抗原序列的sMVA载体。这些sMVA构建体衍生自两个独立的病毒重构体，在本文中称为C163和C164。如上面所公开构建了C163和C164sMVA载体，与形成临床产物COH04S1基础的C35sMVA疫苗载体相似，其不同之处在于基于插入C163和C164中的Del3和Del2位点的Wuhan参考株的密码子优化的基因序列被进一步修饰以编码具有几个B.1.351谱系特异性突变的S和N抗原(参见图86和87以及111和112的特异性序列)。重组sMVA载体包括S抗原中的N501Y，E484K，K417N，L18F，D80A，D215G，Del242–244，R246I，D614G，和A701I突变，和N抗原中的T205I突变。蛋白质印迹分析证实了C163/C164变异载体对S蛋白和N蛋白的S1和S2结构域的表达与原始C35疫苗构建体相比具有相似的表达水平(图54)。
使用合成疫苗平台生成了基于首先在巴西识别的SARS-CoV-2变异谱系P.1的共表达全长S和N抗原序列的sMVA载体。该sMVA构建体在本文中称为C170。如上面所公开构建了C170sMVA载体，与形成临床产物COH04S1基础的C35sMVA疫苗载体相似，其不同之处在于基于插入C170中的Del3和Del2位点的Wuhan参考株的密码子优化的基因序列被进一步修饰以编码具有几个P.1谱系特异性突变的S和N抗原(参见图92和93以及113和114的特异性序列)。重组sMVA载体包括S抗原中的N501Y，E484K，K417T，L18F，T20N，P26S，D138Y，R190S，H655Y，T1027I，和V1176F突变，和N抗原中的P80R，R203K，和G204R突变。蛋白质印迹证实了C170变异载体对S蛋白和N蛋白的S1和S2结构域的表达与原始C35疫苗构建体相比具有相似的表达水平(图55)。
参考文献
下面列出的参考文献，专利和公开的专利申请，以及上面说明书中引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文，如同在本文完全阐述。
1.Volz,A.&Sutter,G.Modified Vaccinia Virus Ankara:History,Value inBasic Research,and Current Perspectives for Vaccine Development.Advances invirus research97,187-243(2017).
2.Gilbert,S.C.Clinical development of Modified Vaccinia virus Ankaravaccines.Vaccine 31,4241-4246(2013).
3.Sutter,G.&Moss,B.Nonreplicating vaccinia vector efficientlyexpresses recombinant genes.Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America89,10847-10851(1992).
4.Antoine,G.,Scheiflinger,F.,Dorner,F.&Falkner,F.G.The completegenomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain:comparison with otherorthopoxviruses.Virology 244,365-396(1998).
5.Meisinger-Henschel,C.et al.Genomic sequence of chorioallantoisvaccinia virus Ankara,the ancestor of modified vaccinia virus Ankara.TheJournal of general virology 88,3249-3259(2007).
6.Carroll,M.W.&Moss,B.Host range and cytopathogenicity of the highlyattenuated MVA strain of vaccinia virus:propagation and generation ofrecombinant viruses in a nonhuman mammalian cell line.Virology 238,198-211(1997).
7.Cottingham,M.G.&Carroll,M.W.Recombinant MVA vaccines:dispelling themyths.Vaccine 31,4247-4251(2013).
8.Wussow,F.et al.A vaccine based on the rhesus cytomegalovirusUL128complex induces broadly neutralizing antibodies in rhesusmacaques.Journal of virology 87,1322-1332(2013).
9.Wussow,F.et al.Human cytomegalovirus vaccine based on the envelopegH/gL pentamer complex.PLoS pathogens 10,e1004524(2014).
10.Chiuppesi,F.et al.Multiantigenic Modified Vaccinia Virus AnkaraVaccine Vectors To Elicit Potent Humoral and Cellular Immune Reponses againstHuman Cytomegalovirus in Mice.Journal of virology 92(2018).
11.La Rosa,C.et al.MVA vaccine encoding CMV antigens safely inducesdurable expansion of CMV-specific T cells in healthy adults.Blood 129,114-125(2017).
12.Aldoss,I.et al.Poxvirus Vectored Cytomegalovirus Vaccine toPrevent Cytomegalovirus Viremia in Transplant Recipients:A Phase 2,RandomizedClinical Trial.Annals of internal medicine 172,306-316(2020).
13.Yuan,Y.et al.Complete regression of cutaneous metastases withsystemic immune response in a patient with triple negative breast cancerreceiving p53MVA vaccine with pembrolizumab.Oncoimmunology 6,e1363138(2017).
14.Zhou,P.et al.A pneumonia outbreak associated with a newcoronavirus of probable bat origin.Nature 579,270-273(2020).
15.Zhu,N.et al.A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia inChina,2019.The New England journal of medicine 382,727-733(2020).
16.Lurie,N.,Saville,M.,Hatchett,R.&Halton,J.Developing Covid-19Vaccines at Pandemic Speed.The New England journal of medicine(2020).
17.Smith,T.R.F.et al.Immunogenicity of a DNA vaccine candidate forCOVID-19.Nature communications 11,2601(2020).
18.Yu,J.et al.DNA vaccine protection against SARS-CoV-2 in rhesusmacaques.Science (2020).
19.Zhu,F.C.et al.Safety,tolerability,and immunogenicity of arecombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine:a dose-escalation,open-label,non-randomised,first-in-human trial.Lancet(2020).
20.Ni,L.et al.Detection of SARS-CoV-2-Specific Humoral and CellularImmunity in COVID-19 Convalescent Individuals.Immunity(2020).
21.Long,Q.X.et al.Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients withCOVID-19.Nature medicine(2020).
22.Premkumar,L.et al.The receptor binding domain of the viral spikeprotein is an immunodominant and highly specific target of antibodies inSARS-CoV-2 patients.Science immunology 5(2020).
23.Hoffmann,M.et al.SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor.Cell 181,271-280e278(2020).
24.Walls,A.C.et al.Structure,Function,and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein.Cell 181,281-292 e286(2020).
25.Wrapp,D.et al.Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in theprefusion conformation.Science 367,1260-1263(2020).
26.Grifoni,A.et al.Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals.Cell(2020).
27.Merchlinsky,M.Mutational analysis of the resolution sequence ofvaccinia virus DNA:essential sequence consists of two separate AT-richregions highly conserved among poxviruses.Journal of virology 64,5029-5035(1990).
28.Baroudy,B.M.,Venkatesan,S.&Moss,B.Structure and replication ofvaccinia virus telomeres.Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology47 Pt 2,723-729(1983).29.DeLange,A.M.,Reddy,M.,Scraba,D.,Upton,C.&McFadden,G.Replication and resolution of cloned poxvirus telomeres in vivo generateslinear minichromosomes with intact viral hairpin termini.Journal of virology59,249-259(1986).
30.DeLange,A.M.&McFadden,G.Efficient resolution of replicatedpoxvirus telomeres to native hairpin structures requires two invertedsymmetrical copies of a core target DNA sequence.Journal of virology 61,1957-1963(1987).
31.Merchlinsky,M.,Garon,C.F.&Moss,B.Molecular cloning and sequence ofthe concatemer junction from vaccinia virus replicative DNA.Viral nucleasecleavage sites in cruciform structures.Journal of molecular biology 199,399-413(1988).
32.Merchlinsky,M.&Moss,B.Resolution of linear minichromosomes withhairpin ends from circular plasmids containing vaccinia virus concatemerjunctions.Cell 45,879-884(1986).
33.Wussow,F.et al.Exploiting 2A peptides to elicit potentneutralizing antibodies by a multi-subunit herpesvirus glycoproteincomplex.Journal of virological methods 251,30-37(2018).
34.Scheiflinger,F.,Dorner,F.&Falkner,F.G.Construction of chimericvaccinia viruses by molecular cloning and packaging.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 89,9977-9981(1992).
35.Taylor,J.,Weinberg,R.,Kawaoka,Y.,Webster,R.G.&Paoletti,E.Protective immunity against avian influenza induced by a fowlpox virusrecombinant.Vaccine 6,504-508(1988).
36.Mayr,A.&Malicki,K.[Attenuation of virulent fowl pox virus intissue culture and characteristics of the attenuated virus].Zentralblatt furVeterinarmedizin.Reihe B.Journal of veterinary medicine.Series B 13,1-13(1966).
37.Tscharke,D.C.et al.Identification of poxvirus CD8+T celldeterminants to enable rational design and characterization of smallpoxvaccines.The Journal of experimental medicine 201,95-104(2005).
38.Wyatt,L.S.et al.Elucidating and minimizing the loss by recombinantvaccinia virus of human immunodeficiency virus gene expression resulting fromspontaneous mutations and positive selection.Journal of virology 83,7176-7184(2009).
39.Wyatt,L.S.,Shors,S.T.,Murphy,B.R.&Moss,B.Development of areplication-deficient recombinant vaccinia virus vaccine effective againstparainfluenza virus 3 infection in an animal model.Vaccine 14,1451-1458(1996).
40.Wang,Z.et al.Modified H5 promoter improves stability of insertgenes while maintaining immunogenicity during extended passage of geneticallyengineered MVA vaccines.Vaccine 28,1547-1557(2010).
41.Jaume,M.et al.Anti-severe acute respiratory syndrome coronavirusspike antibodies trigger infection of human immune cells via a pH-andcysteine protease-independent FcgammaR pathway.J.Virol.85,10582-10597(2011).
42.Noyce,R.S.,Lederman,S.&Evans,D.H.Construction of an infectioushorsepox virus vaccine from chemically synthesized DNA fragments.PloS one 13,e0188453(2018).43.Wyatt,L.S.,Earl,P.L.&Moss,B.Generation of RecombinantVaccinia Viruses.Current protocols in protein science 89,5 13 11-15 13 18(2017).
44.Iwasaki,A.&Yang,Y.The potential danger of suboptimal antibodyresponses in COVID-19.Nature reviews.Immunology 20,339-341(2020).
45.Graham,B.S.Rapid COVID-19 vaccine development.Science 368,945-946(2020).46.Crawford,K.H.D.et al.Protocol and Reagents for PseudotypingLentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for NeutralizationAssays.Viruses 12(2020).
47.Wang,Z.et al.Recombinant modified vaccinia virus Ankara expressinga soluble form of glycoprotein B causes durable immunity and neutralizingantibodies against multiple strains of human cytomegalovirus.J.Virol.78,3965-3976(2004).
48.Tischer,B.K.,von Einem,J.,Kaufer,B.&Osterrieder,N.Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNAmanipulation in Escherichia coli.Biotechniques 40,191-197(2006).
49.Tischer,B.K.,Smith,G.A.&Osterrieder,N.En passant mutagenesis:a twostep markerless red recombination system.Methods Mol.Biol.634,421-430(2010).
50.Birnboim,H.C.&Doly,J.A rapid alkaline extraction procedure forscreening recombinant plasmid DNA.Nucleic acids research 7,1513-1523(1979).
51.Earl,P.L.,Moss,B.,Wyatt,L.S.&Carroll,M.W.Generation of RecombinantVaccinia Viruses.Current Protocols in Molecular Biology 43,16.17.11-16.17.19(1998).
52.Millet,J.K.et al.Production of Pseudotyped Particles to StudyHighly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.J Vis Exp(2019).
53.Rogers,T.F.et al.Isolation of potent SARS-CoV-2 neutralizingantibodies and protection from disease in a small animal model.Science 369,956–963(2020).

Claims (41)

1.一种用于预防或治疗受试者冠状病毒感染的疫苗组合物，包括：
(i)包含MVA的整个基因组的单个合成DNA片段，或各自包含所述MVA的基因组的部分序列的两个或更多个合成DNA片段，使得所述两个或更多个DNA片段在共转染后转移到宿主细胞中时顺序组装并包含所述MVA基因组的全长序列，和
(ii)编码一个或多个冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的一个或多个DNA序列，插入到所述MVA的一个或多个插入位点中，其中所述抗原在所述一个或多个MVA DNA片段转染后于所述宿主细胞中表达。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述抗原，亚单位，或其片段的DNA序列经密码子优化以在所述宿主细胞或痘苗病毒中表达。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述一个或多个DNA片段进一步包含编码所述冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的DNA序列上游的病毒启动子，编码所述冠状病毒抗原，亚单位，或其片段的DNA序列下游的转录终止信号，或两者。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述启动子包含mH5启动子，p7.5启动子，或任何其他合适的天然或合成的痘苗或痘病毒启动子。
5.根据权利要求1–4中任一项所述的疫苗组合物，其中，编码所述抗原，亚单位，或其片段的所述DNA序列被插入到一个或多个MVA插入位点中，如基因间区域，非必需基因和区域，和缺失位点。
6.根据权利要求1–5中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述一个或多个冠状病毒抗原包括刺突(S)蛋白，核衣壳(N)蛋白，膜(M)蛋白，和包膜(E)蛋白，木瓜样蛋白酶，ORF1A，3CL蛋白酶，ORF1B，内切核糖核酸酶，基质，解旋酶，蛋白质1a，蛋白质1b，或其免疫原性片段。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述一个或多个冠状病毒抗原包含SARS-CoV-2刺突(S)蛋白，SARS-CoV-2核衣壳(N)蛋白，或两者。
8.根据权利要求6或7所述的疫苗组合物，其中，所述S蛋白或所述N蛋白是完全成熟的或完全糖基化的。
9.根据权利要求6–8中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述被表达的S蛋白被修饰以包含选自F817P，A892P，A899P，A942P，K986P，V987P，和RRAR682–685GSAS的一个或多个突变。
10.根据权利要求7–9中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述S蛋白包含在N-末端处的信号肽，或在C-末端处的跨膜结构域或细胞质结构域。
11.根据权利要求7–10中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述S蛋白的C-末端处的19个氨基酸残基缺失。
12.根据权利要求7–11中任一项所述的疫苗组合物，其中，编码所述S蛋白或所述N蛋白的序列通过沉默密码子改变进行密码子优化以避免连续顺序的4个或更多个相同核苷酸。
13.根据权利要求7–12中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述S蛋白包含选自由以下组成的组的一个或多个突变：S13I，L18F，T19R，T20N，R21T，P26S，69和70位处组氨酸和缬氨酸缺失，K77T，D80A，T95I，D138Y，G142D，144位处酪氨酸缺失，W152C，E154K，氨基酸156和157位处谷氨酸和苯丙氨酸缺失，R158G，R190S，D215G，Q218H，242–244位处亮氨酸，丙氨酸，和亮氨酸缺失，R246I，K417N，K417T，N439K，L452R，Y453F，S477N，T478K，E484K，E484Q，S494P，N501Y，S520S，A570D，D614G，H655Y，P681H，P681R，RRAR682–685GSAS，A701V，T716I，D950N，S982A，K986P，V987P，T1027I，Q1071H，H1101D，D1118H，和V1176F。
14.根据权利要求1–13中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述一个或多个抗原包含该S蛋白的S1结构域，S2结构域，或受体结合结构域(RBD)。
15.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其中，所述S1结构域，所述S2结构域，或所述RBD包含在N-末端处的信号肽，或在C-末端处的跨膜结构域或细胞质结构域。
16.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其中，所述S1结构域包含所述S蛋白N-末端的698，685，680，或更少的氨基酸残基。
17.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其中，所述RBD包含所述S蛋白的氨基酸残基331至524或319至541。
18.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其中，所述一个或多个抗原包含至少两个来自不同SARS-CoV-2株的RBD。
19.根据权利要求17所述的疫苗组合物，其中，所述至少两个RBD通过一个或多个GS接头连接。
20.根据权利要求7–19中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述N蛋白包含选自D3L，P80R，S235F，R203K，R203M，G204R，T205I，和D377Y的一个或多个突变。
21.根据权利要求1–20中任一项所述的疫苗组合物，还包含药学上可接受的载体，佐剂，添加剂，或其组合。
22.一种预防受试者的冠状病毒感染的方法，包括向所述受试者施用预防或治疗有效量的权利要求1–21中任一项所述的疫苗组合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述受试者处于感染冠状病毒的风险。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述冠状病毒包括β冠状病毒。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述β冠状病毒包括MERS-CoV，SARS-CoV和SARS-CoV2，229E，NL63，OC43，和HKU1。
26.根据权利要求22–25中任一项所述的方法，其中，所述受试者处于感染SARS-CoV-2或其变体的风险。
27.一种在受试者中引发免疫反应的方法，包括向所述受试者施用预防或治疗有效量的权利要求1–21中任一项所述的疫苗组合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述受试者处于感染冠状病毒的风险。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述冠状病毒包括β冠状病毒。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述β冠状病毒包括MERS-CoV，SARS-CoV和SARS-CoV2，229E，NL63，OC43，和HKU1。
31.根据权利要求27–30中任一项所述的方法，其中，所述受试者处于感染SARS-CoV-2或其变体的风险。
32.一种产生重组MVA载体的方法，包括将一个或多个DNA片段转染到宿主细胞中，其中，所述一个或多个DNA片段包含MVA物种的整个基因组DNA序列，使得所述MVA病毒在所述宿主细胞中重构，并且其中，所述一个或多个DNA片段还包含编码一个或多个抗原，亚单位，或其片段的一个或多个DNA序列。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述编码一个或多个抗原，亚单位，或其片段的一个或多个DNA序列被插入到MVA序列的一个或多个插入位点中。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法，还包括在转染所述一个或多个DNA片段之前，期间，或之后用辅助病毒感染所述宿主细胞以启动所述一个或多个DNA片段的转录。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述辅助病毒是禽痘病毒(FPV)。
36.根据权利要求32–35中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个DNA片段在转染之前被环化或以环状形式转染到所述宿主细胞中。
37.根据权利要求32–36中任一项所述的方法，其中，将所述一个或多个DNA片段克隆到质粒或细菌人工染色体(BAC)载体中。
38.根据权利要求32–37中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个抗原包括刺突(S)蛋白，核衣壳(N)蛋白，膜(M)蛋白，包膜(E)蛋白，木瓜样蛋白酶，ORF1A，3CL蛋白酶，ORF1B，内切核糖核酸酶，基质，解旋酶，或其免疫原性片段。
39.根据权利要求32–38中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个抗原包括S蛋白，其变体，其亚单位，或其片段，N蛋白，其变体，其亚单位，或其片段，或两者。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述S蛋白或所述N蛋白为预融合形式，稳定的，或突变的。
41.根据权利要求38–40中任一项所述的方法，其中，所述S蛋白或所述N蛋白是完全成熟的或完全糖基化的。
CN202180059838.6A 2020-05-17 2021-05-17 基于合成的被修饰的痘苗安卡拉（smva）的冠状病毒疫苗 Pending CN116348132A (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063026127P 2020-05-17 2020-05-17
US63/026,127 2020-05-17
US202063044033P 2020-06-25 2020-06-25
US63/044,033 2020-06-25
US202063113810P 2020-11-13 2020-11-13
US63/113,810 2020-11-13
US202163161371P 2021-03-15 2021-03-15
US63/161,371 2021-03-15
PCT/US2021/032821 WO2021236550A1 (en) 2020-05-17 2021-05-17 Synthetic modified vaccinia ankara (smva) based coronavirus vaccines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116348132A true CN116348132A (zh) 2023-06-27

Family

ID=78708032

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180059838.6A Pending CN116348132A (zh) 2020-05-17 2021-05-17 基于合成的被修饰的痘苗安卡拉（smva）的冠状病毒疫苗

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230323389A1 (zh)
EP (1) EP4153228A1 (zh)
JP (1) JP2023526073A (zh)
KR (1) KR20230012583A (zh)
CN (1) CN116348132A (zh)
AU (1) AU2021276265A1 (zh)
BR (1) BR112022023173A2 (zh)
CA (1) CA3183016A1 (zh)
IL (1) IL298210A (zh)
MX (1) MX2022014387A (zh)
WO (1) WO2021236550A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023056284A1 (en) * 2021-09-29 2023-04-06 Svenska Vaccinfabriken Produktion Ab Compositions and methods for treating and preventing coronavirus infection
WO2023092021A1 (en) * 2021-11-17 2023-05-25 City Of Hope Synthetic modified vaccinia ankara (smva) based coronavirus vaccines
WO2024020545A1 (en) * 2022-07-22 2024-01-25 City Of Hope Synthetic modified vaccinia ankara vaccines to stimulate orthopox and monkeypox virus immunity
EP4316514A1 (en) * 2022-08-03 2024-02-07 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Mva-based vectors and their use as vaccine against sars-cov-2
WO2024077288A1 (en) * 2022-10-07 2024-04-11 Medigen Vaccine Biologics Corporation Immunogenic compositions against the omicron variant of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005028634A2 (en) * 2003-09-18 2005-03-31 Emory University Improved mva vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
US20230323389A1 (en) 2023-10-12
AU2021276265A1 (en) 2022-12-08
MX2022014387A (es) 2023-04-11
IL298210A (en) 2023-01-01
KR20230012583A (ko) 2023-01-26
JP2023526073A (ja) 2023-06-20
CA3183016A1 (en) 2021-11-25
BR112022023173A2 (pt) 2022-12-27
EP4153228A1 (en) 2023-03-29
WO2021236550A1 (en) 2021-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chiuppesi et al. Development of a multi-antigenic SARS-CoV-2 vaccine candidate using a synthetic poxvirus platform
US20230323389A1 (en) Synthetic modified vaccinia ankara (smva) based coronavirus vaccines
Small et al. Viruses—From pathogens to vaccine carriers
Li et al. Hantavirus-like particles generated in CHO cells induce specific immune responses in C57BL/6 mice
JP2023513913A (ja) 麻疹ベクターを用いたｃｏｖｉｄ－１９免疫原性組成物及びワクチン
CN103458922B (zh) 诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的重组病毒载体和方法
WO2012053646A1 (ja) ワクシニアウイルスベクターおよびセンダイウイルスベクターからなるプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター
Guerbois et al. Live attenuated measles vaccine expressing HIV-1 Gag virus like particles covered with gp160ΔV1V2 is strongly immunogenic
Liniger et al. Recombinant measles viruses expressing single or multiple antigens of human immunodeficiency virus (HIV-1) induce cellular and humoral immune responses
Chiuppesi et al. Development of a synthetic poxvirus-based SARS-CoV-2 vaccine
Khattar et al. Comparative immunogenicity of HIV-1 gp160, gp140 and gp120 expressed by live attenuated newcastle disease virus vector
US11844833B2 (en) Expression system for expressing herpesvirus glycoprotein complexes
Wang et al. CTLA4 mediated targeting enhances immunogenicity against PRRSV in a DNA prime/killed virus boost strategy
US11253587B2 (en) Vaccine compositions for the treatment of coronavirus
US20230233670A1 (en) A Recombinant Modified Vaccinia Virus (MVA) Vaccine Against Coronavirus Disease
US20220143174A1 (en) Multivalent kaposi sarcoma-associated herpesvirus-like particles and uses thereof
EP4100514A2 (en) Poxvirus-based vectors produced by natural or synthetic dna and uses thereof
JPWO2021236550A5 (zh)
Bissa et al. Systemically administered DNA and fowlpox recombinants expressing four vaccinia virus genes although immunogenic do not protect mice against the highly pathogenic IHD-J vaccinia strain
US20230097513A1 (en) Poxvirus-based vectors produced by natural or synthetic dna and uses thereof
Xie et al. Advances in vaccinia virus-based vaccine vectors, with applications in flavivirus vaccine development
EP4316514A1 (en) Mva-based vectors and their use as vaccine against sars-cov-2
Khan Development of immunogenic, distributable, and equitable SARS-CoV-2 vaccines
WO2022269003A1 (en) MVA-BASED VACCINE EXPRESSING A PREFUSION-STABILIZED SARS-CoV-2 S PROTEIN
WO2024003238A1 (en) Epstein-barr-virus vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination