CN114106115B

CN114106115B - 一种腺病毒载体重组新冠病毒b.1.351变异株疫苗及其应用

Info

Publication number: CN114106115B
Application number: CN202111585865.5A
Authority: CN
Inventors: 陈薇; 王步森; 侯利华; 徐婧含; 吴诗坡; 张哲�; 赵拯浩; 张金龙; 宋小红; 王玉东; 付玲; 陈旖
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2041-12-23
Also published as: CN114106115A

Abstract

本发明公开了一种以人5型复制缺陷型腺病毒为载体的新冠变异株疫苗。所述疫苗以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，基因组中整合有经优化设计的新型冠状病毒B.1.351变异株抗原基因（Ad5‑nCoV‑B.1.351）。该疫苗在宿主细胞中可以有效表达保护性抗原蛋白。使用该疫苗单次免疫即可激发针对B.1.351变异株的特异性抗体反应，以及强烈且广谱的新冠病毒变异株中和抗体反应。此外，该疫苗与2019野生型新型冠状病毒疫苗联用，加强免疫两周后迅速提高中和抗体反应。综上，该疫苗具有显著的应用优势，尤其在单剂免疫以及应对新冠B.1.351变异株疫情中优势尤为突出，可作为疫苗候选株，用于应对持续蔓延的新冠变异株疫情。

Description

一种腺病毒载体重组新冠病毒B.1.351变异株疫苗及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体而言，涉及一种重组新型冠状病毒B.1.351变异株疫苗。

背景技术

新冠病毒为RNA病毒，在持续传播过程中极易产生突变，并自然筛选出传播能力增强的优势变异株。B.1.351（Beta型）变异株样本最早于2020年2月采集自亚洲卡塔尔，2020年8月以后在非洲大量出现，2020年11月以后在南非地区开始大规模流行，成为南非地区新冠病毒主要流行株，并有向全球蔓延的趋势。由于B.1.351变异株含有E484K、K417N等突变位点，导致该流行株一定程度上能够逃逸新冠原型株（记为“新冠病毒野生株”，下同）疫苗激发的抗体，导致新冠疫苗失效或保护力降低，为新冠疫情防控工作带来巨大压力。例如，以新冠病毒野生株制备的新冠mRNA疫苗BNT162b2对野生株有效率为95%，而在主要流行株为B.1.351变异株的卡塔尔有效率降为75%；以新冠病毒野生株制备的新冠纳米颗粒疫苗NVX–CoV2373对野生株的保护效力为96.4%，但对B.1.351变异株的有效率仅为51%；同样地，以腺病毒为载体的新冠病毒野生株疫苗ChAdOx1 nCoV-19对野生株有效率为66.7%，而在以B.1.351病毒株流行环境下的南非地区，III期临床试验显示对轻-中症新冠病毒病并无保护效力。目前，B.1.351变异株依然在亚洲、非洲等国家或地区流行。

本申请人前期研发的非复制型5 型腺病毒载体重组新型冠状病毒疫苗（CN111218459A）的I、II 期临床试验显示，该疫苗在受试者中有良好的安全性，99.5%的受试者产生了特异抗体，90%的受试者产生了特异性细胞免疫反应。同时，III期临床结果显示，单剂接种14 天后预防所有症状新冠肺炎的保护效力为68.8%，预防重症新冠肺炎的保护效力为95.5%，显示了优异的保护效果。然而，该疫苗同样为新冠病毒野生株刺突蛋白为主要保护性抗原构建而成，随着B.1.351变异株的持续流行，本发明的目的就是提供一种针对B.1.351变异株疫苗以应对持续蔓延的变异株新冠疫情。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种新型冠状病毒B.1.351变异株的刺突蛋白突变体，所述刺突蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其次，本发明提供了编码上述新型冠状病毒B.1.351变异株的刺突蛋白突变体的多核苷酸，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示。

第三，本发明提供了一种含有上述多核苷酸的重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒，所述重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒表达上述的新型冠状病毒B.1.351变异株刺突蛋白突变体。

第四，本发明提供了上述组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒在制备预防新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。

在一个优选的实施方案中，所述重组腺病毒被制备为注射剂、滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂。

在一个更为优选的实施方案中，所述重组腺病毒被制备为肌肉注射剂。

最后，本发明提供了一种制备上述的表达新型冠状病毒B.1.351变异株刺突蛋白突变体的重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒的方法，所述方法包含以下步骤：

（1）构建包含上述编码新型冠状病毒B.1.351变异株的刺突蛋白突变体的穿梭质粒载体；

（2）将步骤（1）获得的穿梭质粒载体与骨架质粒共转宿主细胞，包装重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒；

（3）培养步骤（2）获得的重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒。

在一个优选的实施方案中，步骤（1）所述载体为pDC316。

在另一个优选的实施方案中，步骤（2）所述骨架质粒为pBHGlox_E1 ,3Cre。

在又一个优选的实施方案中，步骤（2）所述宿主细胞为HEK293细胞。

本发明提供的可表达新型冠状病毒B.1.351变异株刺突蛋白突变体的重组腺病毒作为新型冠状病毒疫苗，其在免疫小鼠后具有良好的免疫原性。与已经上市的5型腺病毒载体新冠野生株疫苗（Ad5-nCoV）相比，单剂免疫4周后，针对新冠B.1.351变异株S蛋白的结合抗体增强约1.7倍，真病毒中和抗体增强约7.9倍，同时可以诱导同等或更高程度的针对野生株的结合或中和抗体反应，并且针对B.1.1.7（Alpha）、P.1（Gamma）、B.1.617.1（Kappa）、B.1.617.2（Delta）等变异株的假病毒中和反应显著增强。在联合免疫研究中，使用Ad5-nCoV初免，4周后以B.1.351变异株疫苗进行加强免疫，加强免疫2周后，针对新冠野生株中和抗体增强约30倍，针对新冠B.1.351变异株的真病毒中和抗体增强约75倍，针对新冠Delta变异株的真病毒中和抗体增强约39倍。结果表明，本发明提供的表达新型冠状病毒B.1.351变异株刺突蛋白突变体的重组腺病毒可以用作单独免疫，也可与Ad5-nCoV联合使用，能够诱导更加高效的免疫反应，为应对新冠疫情提供重要疫苗候选株参考。

附图说明

图1 新冠B.1.351变异株核酸序列优化前、后GC含量分布对比图。

图2. 新冠B.1.351变异株核酸序列优化前、后DNA拟合二级结构信息对比图。

图3. 新冠B.1.351变异株核酸序列优化前、后密码子分布情况对比图。

图4. 质粒pDC316-nCoV-B.1.351图谱，片段nCoV-B.1.351-S制备完成后，连接pDC316穿梭质粒中获得。

图5. 重组新型冠状病毒B.1.351变异株疫苗S蛋白表达水平电泳图。其中，“NC”组和“Ad5-Null”组分别为细胞对照和Ad5空载体对照，Ad5-nCoV为5型腺病毒载体重组新型冠状病毒野生株疫苗对照组，Ad5-nCoV-B.1.351为本申请所述方案实验组。

图6. Ad5-nCoV-B.1.351诱导产生结合抗体和中和抗体水平。A, 针对新冠野生株S蛋白结合抗体水平；B，针对新冠B.1.351变异株S蛋白结合抗体水平；C，针对新冠野生株真病毒中和抗体水平；D，针对新冠B.1.351变异株真病毒中和抗体水平；E针对新冠野生株的抗体质量；F，针对新冠B.1.351变异株的抗体质量。

图7. Ad5-nCoV-B.1.351诱导产生针对多种变异株假病毒中和抗体水平。A~F分别为针对新冠野生株、B.1.351（Beta型）、B.1.1.7（alpha型）、P.1（Gamma型）、B.1.617.1（Kappa型）和B.1.617.2（Delta型）变异株假病毒中和抗体水平。

图8. Ad5-nCoV初免，并使用Ad5-nCoV-B.1.351加强免疫后中和抗体水平对比结果。A~C分别为加强前与加强免疫2周后针对野生株、B.1.351（Beta型）、B.1.617.2（Delta型）变异株中和抗体反应。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

除非另外指明，下述实施例中所用的出发质粒、酶、相关试剂均可从市售公司购买得到。

实施例1：以人复制缺陷型5型腺病毒为载体的重组新型冠状病毒B.1.351变异株疫苗的制备

1.1新冠B.1.351变异株抗原蛋白筛选与设计

新冠B.1.351变异株的构建中，选取在南非普遍流行的病毒株（GISAID AccessionID: EPI_ISL_1239301）为模板，获得变异株刺突（Spike, S）蛋白序列。在此基础上，为保证蛋白的稳定性、完整性以及提高表达水平的前提下，对蛋白结构进行了突变。首先，将其原始信号肽替换为组织纤溶酶原激活物信号肽（tPA），同时将986位赖氨酸替换为脯氨酸，将987位缬氨酸替换为脯氨酸，以提高S蛋白稳定性以及表达水平。此外，将第682位、683位和685位精氨酸进行缺失，以此敲除蛋白序列中弗林蛋白酶切位点，防止S蛋白被水解为S1和S2两条肽段，保证抗原表达后的完整性。相应优化设计突变分别位于蛋白S1区N端和C端以及S2区，均属于受体结合区之外，可有效保持S蛋白免疫原性。优化设计后的变异株抗原蛋白序列见SEQ ID NO：1。

1.2新冠B.1.351变异株抗原蛋白基因优化与合成

根据筛选设计后的变异株抗原蛋白序列，依据密码子偏好性，将刺突蛋白基因中的稀有密码子更改为哺乳动物细胞最佳密码子，同时剔除用于克隆的的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，提高GC碱基含量，降低mRNA中AU富集区数量，进一步稳定核酸结构，优化结果如图1-3所示，序列见SEQ ID NO:2。

优化过程通过提高GC含量增强核酸稳定性。优化前序列总长3813bp,碱基A为1122个，占29.43%、C为721个，占18.91%、G为721个，占18.36%、T为1270个，占33.31%（图1 之A），序列优化后序列总长3837 bp，A为904个，占23.56%、C为1195个，占31.14%、G为998个，占26.01%、T为740个，占19.29%（图1之 B），GC碱基含量从37.27%提高到57.15%。由于AT配对形成2个氢键，GC配对形成3个氢键，因此，GC碱基含量的提高显著提高了DNA双链配对以及mRNA二级结构的稳定性。此外，优化后的基因，其GC含量的分布更加均匀，明显减少了高GC含量区和高AT含量区。因此，优化显著改善了刺突蛋白核酸稳定性。

优化过程通过改善二级结构增强核酸稳定性。优化前的DNA拟合二级结构见图2之A，优化后DNA拟合二级结构见图2之B。基因优化过程，进一步降低DNA分子中重复序列和发夹结构数量，核酸分子自由能显著降低。因此，优化显著改善了核酸分子二级结构，稳定性显著增强。

优化过程通过降低稀有密码子使用频率提高基因表达效率。由于优化前序列中含有较多的哺乳动物稀有密码子，很难在哺乳动物细胞中高效表达。优化前、后核酸序列的稀有密码子分析结果见图3之A和图3之B，结果显示，刺突蛋白核酸序列的稀有密码子含量显著降低，高频密码子使用频率显著提高。提高哺乳动物中高频密码子含量，会增进哺乳动物细胞中对应tRNA的利用效率，进而提高蛋白合成中的原料使用效率，提高相应蛋白在哺乳动物细胞中表达水平。优化完成后，在起始密码子前添加Kozak序列（GCCGCCACC），以提高抗原蛋白表达水平。合成或制备优化设计后的变异株抗原蛋白基因序列，用于克隆构建。

1.3重组病毒疫苗包装与体外表达鉴定

在基因合成过程中，将合成后的产物克隆至pDC316载体（加拿大MicrobixBiosystems Inc .）中，所得质粒（pDC316-nCoV-B.1.351）图谱如图4所示。将pDC316-nCoV-B.1.351质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1 ,3Cre（加拿大Microbix Biosystems Inc .）共转染HEK293细胞，使用含5% FBS的DMEM培养基维持培养至细胞病变。在维持培养过程中，pDC316载体中含有腺病毒左侧反向重复序列、包装信号序列及抗原基因的部分片段，依赖Cre/Loxp位点特异性重组与病毒骨架序列拼接，形成病毒完整基因组，启动子代病毒和合成与组装。随着子代病毒的不断合成，细胞病变逐渐加重，待90%以上细胞完全病变并从皿底脱落后，1000g离心10分钟收集病变细胞，加入适量PBS，-80℃/37℃反复冻融3次后，取上清收集重组腺病毒，随后于-80℃冻存。使用该病毒种子，在HEK293细胞中，连续传3代，收集第三代病毒，对病毒进行测序鉴定。

测定验证后的病毒滴度，以MOI=1感染HEK293细胞，24小时后收集细胞进行Western Blot鉴定，结果如图5所示，“NC”组和“Ad5-Null”组分别为细胞对照和Ad5空载体对照，Ad5-nCoV（CN111218459A）为新型冠状病毒野生株疫苗对照，Ad5-nCoV-B.1.351为本申请所述方案B.1.351变异株疫苗感染HEK293细胞后的S蛋白表达情况。对比显示，Ad5-nCoV-B.1.351变异株感染细胞后，S蛋白表达水平与Ad5-nCoV相近。另外，由于变异株疫苗S蛋白敲除了弗林蛋白酶位点，所以S蛋白均以全长形式出现，而Ad5-nCoV的S蛋白会部分水解，出现S1条带。

实施例2：新冠B.1.351变异株疫苗免疫反应评价

使用肌肉注射方式，经大腿内侧注射100 μl含5×10⁸ VP疫苗样品，小鼠于免后4周取血，分离血清，分别用于结合抗体、中和抗体和假病毒中和抗体检测。

2.1 新冠B.1.351变异株疫苗诱导更高水平的结合抗体反应

分别以新冠野生株（Genebank编号：NC_045512.2）和B.1.351变异株S蛋白为抗原，利用ELISA法检测血清中特异性IgG抗体滴度，检测结果如图6之A和图6之B所示（* ,P<0.05；** ,P<0 .01；*** ,P<0 .001）。

腺病毒载体重组疫苗经肌肉注射免疫4周后，抗体滴度接近峰值水平，因此我们将免后4周作为体液免疫评价的主要检测点。与Ad5-nCoV相比，B.1.351变异株疫苗免疫后可以激发同等或略高水平针对野生型S蛋白的结合抗体反应（图6之A），而针对B.1.351变异株S蛋白的结合抗体反应显著高于Ad5-nCoV组（t检验，P<0.01），其几何均值约为Ad5-nCoV组的1.7倍（图6之B）。

2.2 新冠B.1.351变异株疫苗诱导更高水平的中和抗体反应。

使用新冠野生株和B.1.351变异株病毒，利用微孔板病变法分别检测针对两种真病毒的中和抗体滴度，检测结果如图6之C和图6之D所示（* ,P<0 .05；** ,P<0 .01；*** ,P<0 .001）。

使用Ad5-nCoV野生株疫苗与Ad5-nCoV-B.1.351变异株疫苗免疫4周后，小鼠血清中针对新冠野生株的中和抗体基本相当，二者无显著性差异；然而，Ad5-nCoV-B.1.351变异株疫苗诱导的针对变异株的中和抗体几何均值比Ad5-nCoV高约7.9倍（t检验，P<0.001）。首先，该结果印证了以野生型S蛋白为免疫原制备的新冠疫苗，对B.1.351变异株中和抗体水平下降。同时也表明，Ad5-nCoV-B.1.351变异株疫苗单免后，除对B.1.351变异株新冠病毒具有较好的中和抗体反应外，同样兼顾对野生株的中和能力。

此外，我们将中和抗体与对应的结合抗体滴度作比，记作“抗体质量”，以此表征中和抗体在结合抗体中的比重，见图6之E和图6之F。两种疫苗所诱发的抗体对新冠病毒野生株的抗体质量基本相当（图6之E），对新冠B.1.351变异株的抗体质量具有显著差异（t检验，P<0.001），Ad5-nCoV-B.1.351变异株疫苗激发的抗体质量显著较高（图6之F）。

2.3 新冠B.1.351变异株疫苗单免后具有较好的广谱中和作用。

我们分别合成了新冠野生株和B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.1和B.1.617.2 S蛋白基因序列，并将序列嵌入pCAGGS质粒，用于细胞内过表达新冠S蛋白。将pCAGGS质粒与pNL4-3.Luc-R-E−骨架质粒共转染HEK293细胞系，收集48小时和72小时后培养上清，制得HIV骨架新冠变异株假病毒。使用该假病毒与小鼠血清中和，随后感染ACE2稳转细胞系（HEK293-ACE2），检测萤火虫荧光素酶表达水平，用于定量检测假病毒中和抗体，结果见图7。

与真病毒中和抗体结果一致，Ad5-nCoV-B.1.351免疫后的小鼠血清含有同等或略高水平的野生型新冠假病毒中和抗体（图7之A），同时Ad5-nCoV-B.1.351激发的针对B.1.351变异株假病毒中和抗体水平显著高于Ad5-nCoV（t检验，P<0.001），二者几何均值分别为2383和355，前者约为后者的6.7倍（图7之B）。

值得注意的是，Ad5-nCoV-P.1疫苗免疫后，小鼠血清中针对曾在欧洲地区广泛流行的B.1.1.7变异株的中和抗体几何均值增强约2.7倍（图7之C，t检验，P<0.001），针对曾在巴西等南美国家和地区普遍流行的P.1型变异株的中和抗体几何均值增强约5.6倍（图7之D，t检验，P<0.001），针对曾在印度等东南亚地区广泛流行的B.1.617.1变异株中和抗体几何均值增强约2.9倍（图7之E，t检验，P<0.001），针对当前世界范围内广泛流行的Delta型变异株中和抗体几何均值增强约1.7倍（图7之F，t检验，P<0.05）。结果表明，Ad5-nCoV-P.1疫苗单剂免疫后可以诱导更为广谱的针对野生株或多种变异株型的中和抗体反应。

2.3 新冠B.1.351变异株疫苗与Ad5-nCoV联合加强免疫，中和抗体水平显著提高。

我们进一步评价了使用Ad5-nCoV初免4周后，再以Ad5-nCoV-B.1.351变异株疫苗进行加强免疫的效果（图8）。结果显示，变异株疫苗加强免疫2周后，中和抗体反应显著增强，其中，针对野生株中和抗体几何均值约增强30.35倍（图8之A，t检验，P<0.001），针对B.1.351变异株中和抗体均值约增强75.02倍（图8之B，t检验，P<0.001），针对当前普遍流行的B.1.617.2变异株中和抗体均值提高了39.15倍（图8之C，t检验，P<0.001）。该结果表明，使用Ad5-nCoV-B.1.351变异株疫苗与当前上市的Ad5-nCoV野生株疫苗联用，可以有效提高中和抗体水平，预计将起到良好的免疫保护效果，具有一定的应用潜力。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种腺病毒载体重组新冠病毒B.1.351变异株疫苗及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1278

<212> PRT

<213> 人工序列(SARS-CoV-2)

<400> 1

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Asn Ser Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg

20 25 30

Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr

35 40 45

Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp

50 55 60

Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His

65 70 75 80

Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Ala Asn Pro Val Leu Pro

85 90 95

Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile

100 105 110

Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu

115 120 125

Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe

130 135 140

Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn

145 150 155 160

Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn

165 170 175

Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly

180 185 190

Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile

195 200 205

Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val

210 215 220

Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu

225 230 235 240

Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu His Ile Ser Tyr

245 250 255

Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala

260 265 270

Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn

275 280 285

Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu

290 295 300

Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile

305 310 315 320

Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg

325 330 335

Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala

340 345 350

Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn

355 360 365

Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr

370 375 380

Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe

385 390 395 400

Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg

405 410 415

Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys

420 425 430

Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn

435 440 445

Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe

450 455 460

Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile

465 470 475 480

Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys

485 490 495

Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly

500 505 510

Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala

515 520 525

Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn

530 535 540

Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu

545 550 555 560

Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp

565 570 575

Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile

580 585 590

Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro

595 600 605

Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn

610 615 620

Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr

625 630 635 640

Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly

645 650 655

Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile

660 665 670

Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser

675 680 685

Pro Ala Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu

690 695 700

Gly Val Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro

705 710 715 720

Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met

725 730 735

Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr

740 745 750

Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu

755 760 765

Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln

770 775 780

Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys

785 790 795 800

Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys

805 810 815

Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr

820 825 830

Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp

835 840 845

Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr

850 855 860

Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser

865 870 875 880

Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly

885 890 895

Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn

900 905 910

Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile

915 920 925

Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser

930 935 940

Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn

945 950 955 960

Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly

965 970 975

Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro

980 985 990

Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser

995 1000 1005

Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg

1010 1015 1020

Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly

1025 1030 1035 1040

Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser

1045 1050 1055

Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr

1060 1065 1070

Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1075 1080 1085

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly

1090 1095 1100

Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile

1105 1110 1115 1120

Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly

1125 1130 1135

Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser

1140 1145 1150

Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp

1155 1160 1165

Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile

1170 1175 1180

Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu

1185 1190 1195 1200

Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys

1205 1210 1215

Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile

1220 1225 1230

Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys

1235 1240 1245

Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp

1250 1255 1260

Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270 1275

<210> 2

<211> 3837

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggacgcca tgaagcgggg cctctgctgt gttctgctgc tctgcggcgc cgtgttcgtg 60

agtaactcga gccagtgcgt gaacctgacc accagaacac agctgcctcc agcctacacc 120

aacagcttca ccagaggcgt gtactacccc gacaaggtgt tcagatccag cgtgctgcac 180

tctacccagg acctgttcct gcctttcttc agcaacgtga cctggttcca cgccatccac 240

gtgagcggca ccaatggcac caagagattc gccaaccccg tgctgccctt caacgacggg 300

gtgtactttg ccagcaccga gaagtccaac atcatcagag gctggatctt cggcaccaca 360

ctggacagca agacccagag cctgctgatc gtgaacaacg ccaccaacgt ggtcatcaaa 420

gtgtgcgagt tccagttctg caacgacccc ttcctgggcg tgtactacca caagaacaac 480

aagagctgga tggaaagcga gttccgggtg tacagcagcg ccaacaactg caccttcgag 540

tacgtgtccc agcctttcct gatggacctg gaaggcaagc agggcaactt caagaacctg 600

cgcgagttcg tgttcaagaa catcgacggc tacttcaaga tctacagcaa gcacacccct 660

atcaacctcg tgcgggatct gcctcagggc ttctctgctc tggaacccct ggtggatctg 720

cccatcggca tcaacatcac ccggtttcag acactgcaca tcagctacct gacacctggc 780

gatagcagct ctggatggac agctggcgcc gctgcctact atgtgggata cctgcagcct 840

cggaccttcc tgctgaagta caacgagaac ggcaccatca ccgacgccgt ggattgtgct 900

ctggatcctc tgagcgagac aaagtgcacc ctgaagtcct tcaccgtgga aaagggcatc 960

taccagacca gcaacttccg ggtgcagccc accgaatcca tcgtgcggtt ccccaatatc 1020

accaatctgt gccccttcgg cgaggtgttc aatgccacca gattcgcctc tgtgtacgcc 1080

tggaaccgga agcggatcag caattgcgtg gccgactact ccgtgctgta caactccgcc 1140

agcttcagca ccttcaagtg ctacggcgtg tcccctacca agctgaacga cctgtgcttc 1200

acaaacgtgt acgccgacag cttcgtgatc cggggagatg aagtgcggca gattgcccct 1260

ggacagacag gcaacatcgc cgactacaac tacaagctgc ccgacgactt caccggctgt 1320

gtgattgcct ggaacagcaa caacctggac tccaaagtcg gcggcaacta caattacctg 1380

taccggctgt tccggaagtc caatctgaag cccttcgagc gggacatctc caccgagatc 1440

tatcaggccg gcagcacccc ttgtaacggc gtgaagggct tcaactgcta cttcccactg 1500

cagtcctacg gcttccagcc aacatacggc gtgggctacc agccttacag agtggtggtg 1560

ctgagcttcg agctgctgca tgctcctgcc acagtgtgcg gccctaagaa aagcaccaat 1620

ctcgtgaaga acaaatgcgt gaacttcaac ttcaacggcc tgaccggcac cggcgtgctg 1680

acagagagca acaagaagtt cctgccattc cagcagttcg gccgggacat cgccgatacc 1740

acagatgccg tcagagatcc ccagacactg gaaatcctgg acatcacccc ttgcagcttc 1800

ggcggagtgt ctgtgatcac ccctggcacc aacaccagca atcaggtggc agtgctgtac 1860

cagggcgtga actgtacaga ggtgccagtg gccattcacg ccgatcagct gacccctact 1920

tggcgggtgt actccacagg cagcaatgtg tttcagacca gagccggctg tctgatcgga 1980

gccgagcacg tgaacaatag ctacgagtgc gacatcccca tcggcgctgg catctgcgcc 2040

tcttaccaga cacagaccaa tagccctgcc agcgtggcca gccagagcat cattgcctac 2100

acaatgtctc tgggcgtgga gaactctgtg gcctactcca acaactctat cgctatcccc 2160

accaacttca ccatcagcgt gaccacagag atcctgcctg tgtccatgac caagaccagc 2220

gtggactgca ccatgtacat ctgcggcgat tccaccgagt gctccaacct gctgctgcag 2280

tacggcagct tctgcaccca gctgaataga gccctgacag ggatcgccgt ggaacaggac 2340

aagaacaccc aagaggtgtt cgcccaagtg aagcagatct acaagacccc tcctatcaag 2400

gacttcggcg gcttcaattt cagccagatt ctgcccgatc ctagcaagcc cagcaagcgg 2460

agcttcatcg aggacctgct gttcaacaaa gtgacactgg ccgacgccgg cttcatcaag 2520

cagtatggcg attgtctggg cgacattgcc gccagggatc tgatttgcgc ccagaagttt 2580

aacggactga cagtgctgcc tcctctgctg accgatgaga tgatcgccca gtacacatct 2640

gccctgctgg ccggcacaat cacaagcggc tggacatttg gagctggcgc tgccctgcag 2700

atcccctttg ctatgcagat ggcctaccgg ttcaacggca tcggagtgac ccagaatgtg 2760

ctgtacgaga accagaagct gatcgccaac cagttcaaca gcgccatcgg caagatccag 2820

gacagcctga gcagcacagc aagcgccctg ggaaagctgc aggacgtggt caaccagaat 2880

gcccaggcac tgaacaccct ggtcaagcag ctgtctagca acttcggcgc catctctagc 2940

gtgctgaacg atatcctgag cagactggac cctcctgaag ccgaggtgca gatcgacaga 3000

ctgatcaccg gaaggctgca gtccctgcag acctacgtta cccagcagct gatcagagcc 3060

gccgagatta gagcctctgc caatctggcc gccaccaaga tgtctgagtg tgtgctgggc 3120

cagagcaaga gagtggactt ttgcggcaag ggctaccacc tgatgagctt ccctcagtct 3180

gctcctcacg gcgtggtgtt tctgcacgtg acatacgtgc ccgctcaaga gaagaatttc 3240

accaccgctc cagccatctg ccacgacggc aaagcccact ttcctagaga aggcgtgttc 3300

gtgtccaacg gcacccattg gttcgtgacc cagcggaact tctacgagcc ccagatcatc 3360

accacagaca acaccttcgt gtccggcaac tgcgacgtcg tgatcggcat tgtgaacaat 3420

accgtgtacg accctctgca gcccgagctg gacagcttca aagaggaact ggataagtac 3480

tttaagaacc acacaagccc cgacgtggac ctgggcgata tcagcggaat caatgcctcc 3540

gtcgtgaaca tccagaaaga gatcgaccgg ctgaacgagg tggccaagaa tctgaacgag 3600

agcctgatcg acctgcaaga actggggaag tacgagcagt acatcaagtg gccttggtac 3660

atctggctgg gctttatcgc cggactgatt gccatcgtga tggtcacaat catgctgtgt 3720

tgcatgacca gctgctgtag ctgcctgaag ggctgttgta gctgtggctc ctgctgcaag 3780

ttcgacgagg acgattctga gcccgtgctg aaaggcgtga agctgcacta cacctga 3837

Claims

1.一种编码新型冠状病毒B.1.351变异株刺突蛋白突变体的多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种含有权利要求1所述多核苷酸分子的重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒，其特征在于，所述重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒表达权利要求1所述的多核苷酸分子编码的新型冠状病毒B.1.351变异株刺突蛋白突变体。

3.根据权利要求2所述的重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒在制备预防新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒被制备为注射剂、滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒被制备为肌肉注射剂。

6.一种制备权利要求2所述重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒的方法，所述方法包含以下步骤：

（1）构建包含权利要求1所述多核苷酸分子的穿梭质粒载体；

（2）将步骤（1）获得的所述穿梭质粒载体与骨架质粒共转宿主细胞，包装重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒；

（3）培养步骤（2）获得的所述重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤（1）所述穿梭质粒载体为pDC316。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤（2）所述骨架质粒为pBHGlox_E1 ,3Cre。

9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤（2）所述宿主细胞为HEK293细胞。