CN116731192A - 重组刺突蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组刺突蛋白、其编码核酸、其制备方法、包含所述重组刺突蛋白的疫苗组合物及其用途。所述重组刺突蛋白可用于预防由新型冠状病毒或其变异株引起的感染或由该感染导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述变异株是Alpha株、Beta株、Gamma株、Delta株、Omicron株或其组合，或含有这些变异株突变位点组合的新变异株。

Description

重组刺突蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种重组刺突蛋白、其编码核酸、其制备方法、包含所述重组刺突蛋白的疫苗组合物及其用途。

背景技术

新冠肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染引起的呼吸道疾病。SARS-CoV-2属于β属B亚群，是一种有包膜的单股正链RNA病毒。该病毒属还包含SARS-CoV（亦称为SARS-CoV-1）和MERS-CoV，它们都是通过病毒颗粒表面的刺突蛋白（Spike，以下简称S蛋白）与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2（ACE2）结合而感染宿主。S蛋白作为病毒颗粒表面唯一的蛋白，最易受到免疫系统产生的特异性中和性抗体的攻击。目前研究表明，人体感染SARS-CoV-2后，可以诱导出大量的针对S蛋白的中和性抗体，并且体外实验证明这些中和性抗体可以阻止病毒侵染宿主细胞。这也是前期针对SARS-CoV和MERS-CoV的疫苗研发中，选择S蛋白作为抗原的主要原因。

天然状态下，病毒表面的S蛋白呈现三聚体状态，根据蛋白的结构功能，S蛋白可以被分成两个功能单位：S1和S2蛋白亚基，S1亚基的主要功能是介导与宿主细胞表面受体结合，S2亚基的功能是介导病毒与宿主细胞的融合，主要的中和抗原表位集中在S1亚基的受体结合结构域（Receptor binding domain，RBD）上。因此，S蛋白的完整性和结构的正确性确保了疫苗的有效性。但在病毒感染细胞的过程中，处于融合前构象（pre-fusion）的天然S蛋白首先被蛋白酶水解成S1亚基和S2亚基，S1亚基发生解离，S2亚基上的蛋白酶水解位点则暴露出来，导致其进一步被蛋白酶水解，使得位于分子内部的融合肽暴露出来，蛋白构象则转变成融合后构象（post-fusion），进而介导病毒和细胞膜的融合。如果保持S蛋白原有的氨基酸序列进行S蛋白的重组表达，由于表达细胞中蛋白酶的存在，S蛋白很可能被水解而难以保持融合前构象，导致S蛋白表达水平降低，并且不利于其结构的正确性。因此，在以S蛋白作为抗原的SARS-CoV-2病毒疫苗中，需要通过基因工程手段对S蛋白进行改造，一方面保持S蛋白的表达水平，确保疫苗产业化的可行性；另一方面保证S蛋白结构的正确性，确保疫苗的有效性；此外，通过体外重组方式表达和制备的S蛋白不含SARS-CoV-2病毒的遗传物质，保证了疫苗的安全性。

随着新冠疫情的蔓延，病毒在人与人传播过程中不断的适应性进化，其中一些变异株的传播能力和致病性明显提高，还有一些毒株出现抗原逃逸现象，这些变异株引起了公共卫生部门和民众的关注，被世界卫生组织（WHO）列为需要关注的变异株（Variants ofConcern，VOC）。这些VOC附着并感染人类细胞的关键性靶标，即在刺突蛋白（简称S蛋白）上往往发生多个关键氨基酸残基的突变是导致其传染性增强以及免疫逃逸的主要因素，比如K417N、E484K、N501Y和D614G等。代表性的变异株包括Alpha (B.1.1.7, United Kingdom)、Beta (B.1.351, South Africa)、Gamma (P.1, Brazil)、Delta (B.1.617.2, India)和Omicron (B.1.1.529, South Africa）。

通常，单独以蛋白作为疫苗的抗原成分时，其免疫原性较弱，需要辅加佐剂以增强疫苗的效果。本发明人开发的第一代针对SARS-CoV-2病毒的候选重组新型冠状病毒疫苗的I期临床数据显示能够诱导机体产生良好的体液免疫和细胞免疫反应，并且该疫苗被证明在人体中具有良好的安全性。目前，该候选疫苗已顺利进入II期临床研究。因此，在第二代重组新型冠状病毒疫苗的开发过程中，沿用了第一代疫苗的佐剂系统。

铝佐剂是一种安全的传统佐剂，已有的研究结果认为铝佐剂的主要作用为抗原仓储缓释作用、增强抗原的递呈、增强2型辅助性T细胞（T helper cells 2，Th2）介导的适应性免疫应答、增强机体固有免疫应答和激活补体作用等。针对SARS-CoV-2疫苗，诱导机体产生倾向于Th2的免疫应答有引起疫苗诱导的病情加重（Vaccine-associated enhancedrespiratory disease, VAERD）的潜在风险。CpG ODN作为一种Toll样受体9（TLR9）的激动剂，通过激活下游天然免疫反应通路，诱导I型干扰素和炎症因子表达，从而增强体液免疫和细胞免疫反应。研究表明，CpG ODN主要诱导机体产生倾向于Th1的免疫应答，因此在疫苗中联合使用CpG ODN可能有助于降低潜在的VAERD风险。CpG ODN作为疫苗佐剂的安全性已在临床上得到验证。CpG 1018用于Dynavax公司的乙肝疫苗（Heplisav-B），已经于2017年在美国获批上市。

发明内容

在本发明的第一方面，提供了一种经基因工程手段改造的重组S蛋白（以下简称“rS蛋白”）。为了还原自然条件下S蛋白在病毒表面的三聚体结构，同时通过三聚体化增加抗原免疫原性，本发明通过基因工程改造，去除了S蛋白的跨膜区和C端囊膜内段，同时在蛋白C端加入了一个有助于蛋白三聚体化的结构域，获得SΔTM蛋白。

接着，在SΔTM蛋白上引入热点氨基酸突变，增强其针对变异株的中和免疫原性和广谱性；将S1/S2酶切位点进行替换，阻止蛋白酶的切割；在关键位点引入连续两个脯氨酸（Pro，P）突变，阻止分子由融合前构象转变成融合后构象；为了进一步提高S蛋白突变体的稳定性和表达量，将位于S2亚基柔性区域的氨基酸替换成脯氨酸，从而增加其结构刚性。通过体外重组方式表达和制备的rS蛋白不含SARS-CoV-2病毒的遗传物质，保证了疫苗的安全性。

在一个优选的实施方案中，所述rS蛋白具有SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸序列。在一个进一步优选的实施方案中，所述rS蛋白分别由SEQ ID NO：2或4所示的核苷酸序列编码。

在本发明的第二方面，提供了一种编码第一方面的rS蛋白的核酸。在一个优选的实施方案中，所述核酸具有SEQ ID NO：2或4所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种工程化细胞，在一个进一步优选的实施方案中，所述细胞基因组中整合有SEQ ID NO：2或4所示的核苷酸序列。在一个进一步优选的实施方案中，所述细胞能够分泌表达rS蛋白。在一个优选的实施方案中，所述工程化细胞为CHO细胞。在一个优选的实施方案中，所述CHO细胞的培养上清液中rS蛋白的平均表达量达到2000mg/L以上，为第一代疫苗抗原的8-10倍。

在本发明的第四方面，提供了一种通过CHO细胞分泌表达并分离第一方面的rS蛋白的方法，包括以下步骤：

(1) 将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆入表达载体中；

(2) 将步骤(1)所得的表达载体转染至CHO细胞中；

(3) 通过细胞群的筛选和单克隆筛选，获得稳定表达所述rS蛋白的细胞株；

(4) 使用步骤(3)所得的细胞株进行表达，获得含所述rS蛋白的培养上清液；以及

(5) 将步骤(4)所得到的含所述rS蛋白的培养上清液进行纯化，获得纯化的rS蛋白，纯化得率超过第一代疫苗抗原的10倍。

根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤(2)中使用的CHO细胞为CHO-K1Q细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种重组新型冠状病毒疫苗组合物，所述疫苗组合物包含第一方面的rS蛋白以及药学上接受的赋形剂。

在一些优选的实施方案中，所述赋形剂为铝佐剂联合CpG ODN佐剂。在进一步的实施方案中，所述铝佐剂为氢氧化铝。在进一步的实施方案中，所述CpG ODN佐剂为CpG 7909。在进一步的实施方案中，所述赋形剂为氢氧化铝联合CpG 7909。

在一些优选的实施方案中，本发明的疫苗组合物含有10μg-100μg/0.5ml的rS蛋白。在一个优选的实施方案中，rS蛋白的含量为25μg-50μg/0.5ml。

在一些优选的实施方案中，铝佐剂的含量在100μg-1000μg/0.5ml之间。在一个优选的实施方案中，铝佐剂的含量在250μg-500μg/0.5ml之间。在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗组合物含有500μg/0.5ml的氢氧化铝。

在一些优选的实施方案中，CpG ODN佐剂的含量在100μg-1000μg/0.5ml之间。在一个优选的实施方案中，CpG ODN佐剂的含量在250μg-500μg/0.5ml之间。在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗组合物含有500μg/0.5ml的CpG 7909。

在本发明的第六方面，提供了第一方面的rS蛋白在制备疫苗组合物中的用途，所述药物疫苗组合物用于预防由新型冠状病毒或其变异株引起的感染或由该感染导致的疾病。在一个优选的实施方案中，该疫苗组合物具有较强的免疫原性。在一个优选的实施方案中，所述新型冠状病毒为原型株或变异株或其组合。在一个优选的实施方案中，所述变异株是Alpha株、Beta株、Gamma株、Delta株、Omicron株或其组合，或含有这些变异株突变位点组合的新变异株。在一个优选的实施方案中，所述变异株是Beta株、Delta株、Omicron株或其组合。

在一个优选的实施方案中，所述药物疫苗组合物用于预防由原型株、Beta株、Delta株、Omicron株或其组合所导致的感染或由所述感染导致的疾病。

本发明提供的rS蛋白具有融合前构象且呈三聚体状态，其在动物模型上具有良好的免疫原性，可制备疫苗组合物应用于预防新型冠状病毒。此外，本发明还提供了一种可在CHO细胞中高效表达rS蛋白的方法，所述方法表达量高，快速简便，可实现大规模生产。

本发明提供的重组新型冠状病毒疫苗组合物可以在动物模型，例如BALB/c小鼠模型中诱导出高滴度的针对不同变异株假病毒的高水平交叉中和抗体和高水平的细胞免疫反应。包含联合佐剂的疫苗组合物诱导的免疫反应显著优于不加佐剂的rS蛋白以及只加铝佐剂或者只加CpG7909佐剂的疫苗组合物诱导的免疫反应。此外，该疫苗组合物还在恒河猴动物模型中证明了其良好的免疫原性和细胞免疫反应，以及针对广谱VOC和原型株的假病毒和活病毒的高水平交叉中和抗体活性。除此之外，该疫苗组合物可以显著降低攻毒后恒河猴的咽拭子和肛拭子以及肺部和气管-支气管中的病毒载量，并减轻了肺部病理损伤，说明该疫苗组合物对于非人灵长类动物以及人类可具有较好的保护效力。

本发明的其它方面根据本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明：

图1. 表达载体SNT70-S质粒图谱。

图2. 纯化后rS蛋白的变性还原SDS-PAGE分析。

图3. 纯化后rS蛋白的SE-HPLC分析。

图4. rS蛋白25℃条件下活性与稳定性分析。

图5. BALB/c小鼠二免后血清中假病毒中和抗体滴度结果。

图6. 剂量配比实验中BALB/c小鼠二免后血清中结合抗体滴度结果。

图7. 剂量配比实验中BALB/c小鼠二免后血清针对假病毒中和抗体滴度结果。A：原型株；B：Beta株；以及C：Delta株。

图8. 剂量配比实验中BALB/c小鼠二免后ELISPOT (A)和ICS (B)结果。

图9. 恒河猴二免后结合抗体(A)、活病毒中和抗体(B)和假病毒中和抗体(C)滴度结果。

图10. 恒河猴二免后ICS (A和B)和ELISPOT (C)结果。

图11. 恒河猴攻毒后拭子中（A和B）和组织中（C和D）的病毒载量结果。

图12. 恒河猴攻毒后疫苗组和佐剂对照组的肺部病理结果。

具体实施方式

以下实施例仅为举例说明本发明的技术方案的目的，而非限制本发明的要求保护的范围。

实施例1：SARS-CoV-2病毒的S蛋白胞外段的克隆构建、表达与纯化

1. S蛋白序列的选择与基因的合成

基于本发明人对于第一代重组新型冠状病毒疫苗的抗原设计，仍然选择SARS-CoV-2病毒原型株（基因组序列登录号：MN908947）的S蛋白胞外段氨基酸序列（1-1213）作为蛋白优化的基础。与第一代疫苗的抗原设计相同，为了更好地实现S蛋白的分泌表达，以强分泌性信号肽MEFGLSWLFLVAILKGVQC替换S蛋白本身信号肽MFVFLVLLPLVSS；为了维持蛋白的稳定性并将其锁定在融合前（pre-fusion）构象，一方面将S蛋白S1/S2蛋白酶切割位点⁶⁸²RRAR⁶⁸⁵以GGSG取代，同时将关键位点氨基酸⁹⁸⁶KV⁹⁸⁷突变成连续的两个脯氨酸（Proline，P）；在其C末端引入T4 fibritin基序（GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL），以进一步稳定S蛋白的三聚化状态。此外，在该S蛋白上引入K417N、E484K、N501Y和D614G四个热点氨基酸突变，增强其针对变异株的中和免疫原性和广谱性；将位于S2亚基的第817位、第892位、第899位和第942位氨基酸替换成脯氨酸（F817P、A892P、A899P和A942P），从而增加其结构刚性。经过设计后的rS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，含有1248个氨基酸，其中N端的19个氨基酸为信号肽，在分泌表达过程中，会被切除，因此所获得的目的S蛋白抗原为1229个氨基酸（SEQ ID NO：3）。

为了利于rS蛋白在CHO细胞中高效表达，选择CHO细胞偏好的密码子对编码基因进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，并进行人工合成。需要说明的是，优化原则并非简单选择CHO细胞中频率最高的密码子，而是一个较为复杂的优化方案。整体上的优化三个原则：第一，根据密码子的简并性，用CHO细胞中各氨基酸对应的高频密码子替换原有密码子；第二，为避免转录后的mRNA中过高的GC含量对其二级结构造成影响，进而影响翻译效率，在优化过程中尽量将基因的GC%控制在40-60%；第三，避开一些常用的限制性酶切位点。

2. rS蛋白表达载体的克隆构建

上述合成的基因5’和3’端分别含有Hind III和EcoR I限制性内切酶酶切位点，通过双酶切获得片段并将其克隆至表达载体SNT70中（图1）。载体SNT70携带氨苄霉素抗性基因和谷氨酰胺合成酶筛选标记。使用巨细胞病毒（CMV）启动子/增强子序列来进行目的基因的表达。CMV启动子是目前较为常用的启动真核基因表达的强启动子。经克隆构建获得相应的表达载体SNT70-S，并通过酶切和测序鉴定序列无误。

具体而言，表达质粒SNT70-S的构建可按如下方式进行：

a. 用Hind III和EcoR I分别对SNT70质粒和委托苏州金唯智生物科技有限公司（GENEWIZ）基因合成获得的pUC57-S质粒（包含编码rS蛋白的核苷酸序列）进行双酶切，琼脂糖凝胶分离后采用DNA凝胶回收试剂盒回收，并纯化酶切后的目的片段和酶切后的载体SNT70。

b. 连接反应：纯化后的目的片段（约3.8kb）和载体SNT70（约9.4kb）酶切产物采用T4连接酶进行连接反应，构建成表达质粒SNT70-S。

c. 将连接反应产物转化到Top10感受态细胞，涂布LB培养基平板，获得单克隆转化菌落。

d. 从中挑取10个单克隆菌落进行PCR扩增和测序验证。随后，对测序验证正确的克隆，在LB培养基平板上划线两次，将分离得到的单克隆转接到LB液体培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），37℃，220 rpm过夜振荡培养，大量抽提质粒DNA，最终得到的质粒命名为SNT70-S。

3. SNT70-S质粒的转染、rS蛋白的表达和纯化

通过上述2中的方式，大量制备表达质粒，经PvuI酶切线性化后通过电穿孔方式转染至宿主细胞CHO-K1Q。电穿孔转染方法为：取2.4×10⁷个细胞，1000 rpm离心5 min，弃上清；用20 ml CHO CD培养基重悬细胞，1000 rpm离心5 min，弃上清；将1520 μl CHO CD培养基和80 μl质粒分别置于离心后细胞中，重悬混匀；分别取800 μl混合液于2个电转杯中，将电转杯分别置于电转仪中进行电击（电转程序：300 V，900 μF，指数脉冲，电阻（∞））；电击后，将2个电转杯中细胞合并转移至含有20 ml预热CHO CD04培养基（含终浓度25 mM L-蛋氨酸亚砜亚胺，MSX）的方瓶中，经行加压恢复和筛选。在本实施例中，共进行了4组转染试验。

电转后24 h、第7天及随后每2~4天，检测细胞密度和活率，调整细胞密度为0.5×10⁶个细胞/ml，置于37℃，10% CO2培养箱静置培养。当细胞密度大于1×10⁶个细胞/ml，细胞活率大于90%时，细胞群加压筛选完成。随后采用14天流加培养的方法，对加压筛选得到的细胞群进行表达量评估。表达量的评估方法是采用生物膜层干涉技术（BiolayerInterferometry，以下简称BLI），即先以Protein G sensor结合2G4抗体，再以2G4抗体结合目标蛋白，通过建立标准曲来计算待测样品的蛋白浓度。

接下来利用自动化细胞铺板与成像系统（VIPS）对加压筛选得到的细胞群进行有限稀释法的单克隆化和筛选，并对所挑选的单克隆在分批补料培养过程中扩大培养，将上述克隆细胞的上清收集，取样进行目的蛋白表达量的检测，并综合考虑克隆的生长情况、活细胞密度、活率、终末乳酸含量以及相关产品质量参数，选择出最优的3个克隆，即为优势细胞株。将上述获得的细胞株，经生物反应器培养表达，即可获得含有rS蛋白的细胞培养上清，同样对上述上清液取样进行BLI检测。结果显示，上述细胞株的培养上清液中rS蛋白的平均表达量能够达到200-300 mg/L，满足疫苗生产需求。

为了获得rS蛋白抗原，优势细胞株的培养上清液经常规的处理方式，包括病毒灭活、阴离子交换层析、阳离子交换层析、凝胶过滤层析和除病毒纳滤等步骤后，即可获得SDS-PAGE纯度超过90%（图2）、并且为三聚体的S蛋白（图3）。

进一步，对rS蛋白原液以及疫苗成品稳定性进行分析，ELISA检测结果显示，即使在25℃条件下孵育7天，rS蛋白原液依然能够维持80%以上的活性，并且同样温度下孵育30天的候选疫苗成品，也能够维持80%以上的活性（图4）。

实施例2：疫苗组合物的制备

为了研究本发明所提供的疫苗组合物的技术效果，本发明人制成了以下多种疫苗组合物制剂（0.5ml/剂），每种组合物均含有rS蛋白、氢氧化铝佐剂和／或CpG 7909。具体配制方法为：先将CpG 7909样品吸附到氢氧化铝佐剂上，制备成不同比例的CpG 7909/氢氧化铝佐剂（w/w）吸附样品（此处氢氧化铝佐剂的含量实质上为铝元素的含量）；然后向该CpG7909／氢氧化铝佐剂样品中加入不同浓度的rS蛋白原液。上述制剂充分混合后，如果不立即施用，则储存于2-8°C。具体比例如表1所示。

表1：各疫苗组合物的组成成分

实施例3：在BALB/c小鼠中比较rS蛋白与不同佐剂组合的疫苗组合物的免疫原性

1. 小鼠分组以及动物免疫策略

对50只SPF级雌性BALB/c小鼠（5-6周龄）进行分组。每组10只小鼠，共5组。组别信息具体见表2。根据表2分组情况对小鼠进行免疫，免疫方式为肌肉注射小鼠大腿内侧，注射体积为50μl／剂／只（1/10人拟用剂量）。每只小鼠免疫两次，免疫间隔为三周。

表2：比较rS蛋白与不同佐剂组合的疫苗组合物的免疫原性的动物分组

2. 疫苗组合物诱导的中和抗体反应检测

在第二次免疫后两周分别对各组小鼠进行采血，分离血清。通过针对原型株、Beta株和Delta株假病毒的中和实验检测血清中和抗体滴度（图5）。其中*代表p<0.05；**代表p<0.01；****代表p<0.0001。

与佐剂对照组（AH+CpG7909）相比，各组别小鼠第二次免疫后两周的血清均能检测到一定水平的针对rS蛋白假病毒中和抗体滴度水平，且针对原型株、Beta株和Delta株假病毒株的抗体滴度由高到低均依次为双佐剂组（rS+AH+CpG7909）、单独铝佐剂组（rS+AH）、单独CpG 7909组（rS+CpG7909）、不含佐剂组（rS）。

基于以上结果，rS蛋白联合双佐剂作为本发明的疫苗组合物中的组分显著优于rS蛋白联合单独铝佐剂或者单独CpG 7909或者不联合任何佐剂。

实施例4：在BALB/c小鼠中研究疫苗组合物中的抗原和佐剂的剂量配比

1. 小鼠分组以及动物免疫策略

对100只SPF级雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）进行分组。每组10只，共10组。组别信息具体见表3。根据表3分组情况对小鼠进行免疫，免疫方式为肌肉注射小鼠大腿内侧，注射体积为50μl／剂／只（1/10人拟用剂量）。每只小鼠免疫两次，免疫间隔为三周。

表3：剂量配比实验中BALB/c小鼠的分组

2. 疫苗诱导的抗体反应检测

在第二次免疫后两周分别对各组小鼠进行采血，分离血清。通过ELISA检测血清中针对rS蛋白的IgG抗体滴度；通过基于假病毒的中和实验检测血清中和抗体滴度。

双佐剂对照组几乎未检测出抗原特异性的结合抗体；除5.0μg rS蛋白/50μg氢氧化铝佐剂组别和1.0μl rS蛋白/25μg氢氧化铝佐剂/50μg CpG 7909组别的结合抗体水平相对较低之外，其他组别都诱导出较高水平的结合抗体滴度（≥10⁶）（图6）。

从基于假病毒中和实验检测的各组别小鼠血清中和抗体滴度的结果来看，佐剂对照组针对原型株、Beta株和Delta株假病毒株的抗体滴度均未检出，其他组别都诱导出较高水平的中和抗体滴度。其中，当rS蛋白剂量递增，针对各假病毒株的滴度随抗原剂量的增加而增加。当固定氢氧化铝佐剂剂量为50μg，rS蛋白剂量为5.0μg时，针对各假病毒株的滴度随CpG7909剂量的增加而升高。当固定CpG7909剂量为50μg，rS蛋白剂量为1.0μg、2.5μg和5.0μg时，针对各假病毒株的滴度随着氢氧化铝剂量的增加而升高（图7）。

3. 疫苗诱导的细胞免疫反应检测

在第二次免疫后两周每组处死5只小鼠，取脾脏，通过ELISpot和ICS检测疫苗诱导的细胞免疫反应。结果显示：1.0μg、2.5μg和5.0μg rS组别的细胞因子分泌水平和抗原剂量存在一定相关性，而相同抗原剂量不同佐剂剂量配比组别之间，细胞因子分泌水平均能够达到较高水平（图8，A）。2.5μg和5.0μg rS蛋白的不同配比的疫苗组合物均可诱导产生较高的CD4+T阳性细胞比，随着抗原剂量的增加，IL-2+、IFN-γ+、TNF-α+ CD4+T细胞比例增加（图8，B）。

基于以上结果，不同抗原剂量和佐剂剂量配比的疫苗组合物在本实验中均表现出很好的结合抗体水平以及假病毒交叉中和抗体水平，并展现了一定的剂量效应。因此，5.0μg rS蛋白/50μg氢氧化铝/50μg CpG7909组将作为候选疫苗组合物将在恒河猴中进一步探索和验证其免疫原性和保护效力。

实施例5：在恒河猴模型中研究疫苗组合物的免疫原性和保护效力

1. 恒河猴分组以及动物免疫策略

恒河猴随机分为2组，每组6只(雌雄各3只)。通过肌肉注射免疫两次，免疫间隔为三周。各组别疫苗信息见表4。

表4：各组别疫苗信息

2. 疫苗诱导的抗体反应检测

分别在第一次免疫前、第一次免疫后1周、第一次免疫后2周、第二次免疫后1周和第二次免疫后2周采血，分离血清。通过ELISA实验方法检测血清的结合抗体滴度，通过假病毒中和实验和基于活病毒中和实验检测血清的中和抗体滴度。结果显示：疫苗组合物表现了较高的结合抗体滴度且第二次免疫后抗体滴度达到最高水平的趋势（图9，A）。在假病毒中和实验中充分显示了疫苗组合物对于原型株假病毒以及4种VOC假病毒的高抗体滴度水平，该结果说明疫苗组合物具有较好的交叉中和活性（图9，C）。而活病毒中和实验进一步验证了疫苗组合物在恒河猴上对于原型株病毒和Beta株、Delta株以及Omicron株病毒具有较强的中和能力（图9，B）。

3. 疫苗诱导的细胞反应检测

第二次免疫后2周采血并分离PBMC，通过ELISpot和ICS检测疫苗诱导的细胞免疫反应。从细胞免疫检测结果上来看，疫苗组相比于佐剂对照组具有更高的细胞免疫水平，疫苗组在恒河猴模型中的细胞免疫原性主要以CD4+ T细胞反应为主（图10，A和B），并且同时表现出较高水平的Th1和Th2途径的T细胞免疫反应（图10，C）。

4. 疫苗的保护效力

所有动物于二免完成后第6周，采用气管插管接种方式进行动物感染，接种病毒液，病毒接种量为1×10⁵ TCID50，每天采集拭子，检测不同样品中病毒载量变化。在攻毒后第7天，对所有实验动物进行解剖观察期肺部病理变化,并检测肺部组织样本中的病毒RNA载量。

拭子病毒载量结果表明，佐剂组2只动物在肛拭子样品中可检出病毒RNA，疫苗组无RNA检出。佐剂组咽拭子病毒载量随感染时间而变化，病毒RNA在咽拭子中一直维持在较高水平，在攻毒后第2天咽拭子的病毒载量到达顶峰。疫苗组大部分动物的咽拭子病毒载量处于检测阈值以下或持续降低阶段，疫苗对上呼吸道有一定的保护作用（图11，A和B）。攻毒后第7天肺与气管病毒载量结果显示：疫苗组气管和支气管病毒载量较佐剂对照组下降了3个log左右（图11D）。疫苗组肺部器官病毒载量范围较佐剂组下降了＞3个log10，表明疫苗可以对肺部和气管产生良好的保护作用（图11，C）。根据对照组肺部组织病理变化程度和范围，由病毒造成的对照组动物的肺部病理损伤为“重度病毒性肺炎并肺纤维化”。对疫苗组的肺部病理损伤为“中度、轻度-中度和轻度病毒性肺炎并肺纤维化”。

基于以上结果，剂量为50μg rS蛋白/500μg氢氧化铝/500μg CpG7909的疫苗组合物在恒河猴中具有良好的免疫原性和细胞免疫反应，以及针对假病毒和活病毒的高水平交叉中和活性。除此之外，本疫苗可以明显降低拭子和组织中的病毒载量，并有效降低了肺部病理损伤，说明本疫苗组合物同时具有较好的保护效力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列信息：

rS蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，含有1248个氨基酸，其中N端的19个氨基酸为信号肽：

MEFGLSWLFLVAILKGVQCQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPGGSGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSPIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGPALQIPFPMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTPSALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL（SEQ ID NO：1）

SEQ ID NO：1的氨基酸序列对应的核苷酸序列：

ATGGAATTTGGTCTAAGTTGGCTATTTCTAGTGGCTATCCTGAAAGGCGTGCAGTGCCAGTGCGTTAATCTCACCACCAGAACCCAGCTGCCCCCTGCTTACACCAACTCCTTCACCCGCGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGATCTTCTGTGCTGCACTCCACCCAGGATCTGTTTCTGCCTTTCTTCTCCAACGTGACCTGGTTCCACGCAATCCACGTGTCCGGCACAAACGGCACCAAGAGATTCGACAACCCTGTGTTACCATTCAACGACGGCGTGTATTTTGCTTCCACCGAGAAGTCAAACATCATTAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGACTCTAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTCAACAACGCCACAAATGTGGTGATCAAAGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTTCTGGGCGTGTACTACCACAAGAACAACAAGTCCTGGATGGAATCTGAGTTCAGAGTGTACTCCTCTGCCAACAACTGTACCTTCGAGTACGTGTCTCAGCCCTTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAACTTTAAGAACCTGAGAGAGTTCGTCTTCAAAAATATCGACGGCTACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACCCCTATCAACCTAGTGAGAGACCTCCCTCAGGGCTTCTCTGCACTGGAACCTCTGGTGGACCTGCCTATCGGTATCAACATCACCCGGTTCCAAACCCTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACCCCAGGGGACTCTAGCTCTGGCTGGACAGCTGGCGCTGCTGCCTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTCGGACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAAAACGGCACCATCACCGACGCTGTTGATTGCGCCCTGGATCCTCTGTCTGAGACAAAATGCACACTGAAGAGCTTCACCGTGGAAAAGGGCATCTATCAGACAAGCAACTTCAGAGTGCAGCCAACAGAGTCCATCGTGCGGTTCCCTAATATCACTAACCTGTGTCCTTTCGGCGAAGTGTTCAACGCTACCAGATTCGCCTCGGTGTACGCTTGGAATAGAAAGCGGATCTCCAACTGTGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAATTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCAACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGATAGCTTTGTGATCAGAGGCGACGAGGTGAGACAGATCGCTCCTGGCCAGACCGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGTTGCCTGACGACTTTACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAATAACCTGGACTCCAAAGTGGGCGGCAACTACAACTACCTGTACAGACTGTTTCGGAAGTCCAACCTGAAGCCTTTCGAAAGAGATATCAGCACTGAGATCTACCAGGCTGGATCTACACCCTGTAATGGCGTGAAGGGCTTCAACTGCTACTTTCCTCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCTACCTACGGAGTGGGCTACCAGCCTTACCGGGTCGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCCACCGTGTGTGGACCAAAGAAATCGACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGTGTGAACTTCAATTTTAACGGACTGACAGGCACAGGCGTGCTAACGGAGTCCAATAAGAAGTTCTTGCCATTTCAGCAGTTCGGCCGGGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGCGGGATCCTCAAACACTGGAGATCCTGGATATCACACCTTGCTCTTTCGGCGGCGTGTCTGTCATCACCCCTGGCACCAACACCTCCAACCAGGTGGCTGTCCTGTACCAGGGCGTGAATTGCACGGAAGTGCCTGTGGCCATACACGCCGACCAGCTGACCCCCACCTGGCGGGTGTACTCTACGGGCAGCAACGTGTTCCAGACCAGAGCTGGCTGCCTGATCGGCGCTGAACACGTGAACAACTCCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGAGCCGGCATCTGCGCGTCTTACCAAACACAGACCAACTCCCCTGGCGGCTCTGGATCTGTTGCCTCCCAGTCCATCATCGCCTATACCATGTCTCTGGGAGCCGAGAACTCCGTGGCCTACTCCAACAACTCCATCGCCATCCCTACCAACTTCACCATCTCTGTGACCACAGAAATCCTGCCTGTGTCCATGACCAAGACCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGATTCCACAGAATGCTCGAACCTGCTTCTGCAGTACGGCTCCTTCTGCACCCAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAACAGGATAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCTCCCATCAAGGACTTCGGAGGCTTCAACTTCTCCCAGATCCTGCCCGACCCTTCTAAGCCTAGCAAGCGGTCCCCAATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTCACCCTGGCTGATGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGATTGCCTGGGCGATATTGCCGCCCGGGACCTGATCTGCGCCCAGAAGTTCAACGGCCTGACTGTGCTGCCTCCTCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTACACCTCCGCCCTGCTGGCCGGCACCATCACCAGTGGCTGGACCTTTGGCGCCGGCCCTGCTCTACAGATCCCCTTCCCTATGCAGATGGCCTACAGGTTTAATGGAATCGGCGTTACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAGCTGATAGCCAACCAGTTCAACAGTGCCATCGGCAAGATCCAGGATTCTCTGTCCTCAACCCCCTCTGCACTGGGAAAACTGCAGGACGTGGTGAATCAGAACGCCCAGGCCCTGAACACCCTGGTCAAGCAGCTATCCTCTAACTTCGGCGCTATCAGCTCCGTGCTGAACGATATCCTGTCGAGACTGGACCCTCCCGAGGCTGAGGTGCAGATCGACAGACTGATCACTGGCAGACTGCAGTCTCTGCAAACCTACGTCACCCAGCAACTGATCCGCGCTGCCGAAATCCGGGCCTCTGCTAACCTGGCTGCTACCAAGATGTCCGAGTGTGTGTTGGGACAGTCTAAAAGGGTGGATTTCTGCGGCAAGGGATATCACCTGATGTCCTTCCCCCAGAGCGCCCCTCATGGCGTGGTCTTCCTGCATGTGACCTACGTCCCTGCTCAAGAGAAAAACTTTACTACCGCCCCTGCTATCTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCTAGAGAGGGCGTGTTCGTGTCCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTCTACGAGCCTCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTATCCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAACACAGTCTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAAGAAGAGTTAGACAAGTATTTCAAGAACCACACCTCTCCAGATGTGGATTTGGGCGACATCTCTGGCATCAACGCTTCCGTCGTGAACATCCAGAAAGAGATCGACCGGCTGAACGAAGTGGCCAAGAATCTGAACGAGTCCCTGATCGACCTGCAAGAACTGGGCAAGTACGAACAGTACATCAAGTGGCCTGGCTCCGGTTACATCCCAGAAGCCCCCAGGGATGGACAGGCCTATGTGAGAAAGGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGTCTACCTTCCTGTGA（SEQ ID NO：2）

rS蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，含有1229个氨基酸：

QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPGGSGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSPIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGPALQIPFPMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTPSALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPGSGYIPEA PRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL（SEQ ID NO：3）

SEQ ID NO：3的氨基酸序列对应的核苷酸序列：

CAGTGCGTTAATCTCACCACCAGAACCCAGCTGCCCCCTGCTTACACCAACTCCTTCACCCGCGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGATCTTCTGTGCTGCACTCCACCCAGGATCTGTTTCTGCCTTTCTTCTCCAACGTGACCTGGTTCCACGCAATCCACGTGTCCGGCACAAACGGCACCAAGAGATTCGACAACCCTGTGTTACCATTCAACGACGGCGTGTATTTTGCTTCCACCGAGAAGTCAAACATCATTAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGACTCTAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTCAACAACGCCACAAATGTGGTGATCAAAGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTTCTGGGCGTGTACTACCACAAGAACAACAAGTCCTGGATGGAATCTGAGTTCAGAGTGTACTCCTCTGCCAACAACTGTACCTTCGAGTACGTGTCTCAGCCCTTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAACTTTAAGAACCTGAGAGAGTTCGTCTTCAAAAATATCGACGGCTACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACCCCTATCAACCTAGTGAGAGACCTCCCTCAGGGCTTCTCTGCACTGGAACCTCTGGTGGACCTGCCTATCGGTATCAACATCACCCGGTTCCAAACCCTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACCCCAGGGGACTCTAGCTCTGGCTGGACAGCTGGCGCTGCTGCCTACTACGTGGGCTACCTGCAGCCTCGGACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAAAACGGCACCATCACCGACGCTGTTGATTGCGCCCTGGATCCTCTGTCTGAGACAAAATGCACACTGAAGAGCTTCACCGTGGAAAAGGGCATCTATCAGACAAGCAACTTCAGAGTGCAGCCAACAGAGTCCATCGTGCGGTTCCCTAATATCACTAACCTGTGTCCTTTCGGCGAAGTGTTCAACGCTACCAGATTCGCCTCGGTGTACGCTTGGAATAGAAAGCGGATCTCCAACTGTGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAATTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCAACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGATAGCTTTGTGATCAGAGGCGACGAGGTGAGACAGATCGCTCCTGGCCAGACCGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGTTGCCTGACGACTTTACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAATAACCTGGACTCCAAAGTGGGCGGCAACTACAACTACCTGTACAGACTGTTTCGGAAGTCCAACCTGAAGCCTTTCGAAAGAGATATCAGCACTGAGATCTACCAGGCTGGATCTACACCCTGTAATGGCGTGAAGGGCTTCAACTGCTACTTTCCTCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCTACCTACGGAGTGGGCTACCAGCCTTACCGGGTCGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCCACCGTGTGTGGACCAAAGAAATCGACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGTGTGAACTTCAATTTTAACGGACTGACAGGCACAGGCGTGCTAACGGAGTCCAATAAGAAGTTCTTGCCATTTCAGCAGTTCGGCCGGGACATCGCCGACACCACCGACGCCGTGCGGGATCCTCAAACACTGGAGATCCTGGATATCACACCTTGCTCTTTCGGCGGCGTGTCTGTCATCACCCCTGGCACCAACACCTCCAACCAGGTGGCTGTCCTGTACCAGGGCGTGAATTGCACGGAAGTGCCTGTGGCCATACACGCCGACCAGCTGACCCCCACCTGGCGGGTGTACTCTACGGGCAGCAACGTGTTCCAGACCAGAGCTGGCTGCCTGATCGGCGCTGAACACGTGAACAACTCCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGAGCCGGCATCTGCGCGTCTTACCAAACACAGACCAACTCCCCTGGCGGCTCTGGATCTGTTGCCTCCCAGTCCATCATCGCCTATACCATGTCTCTGGGAGCCGAGAACTCCGTGGCCTACTCCAACAACTCCATCGCCATCCCTACCAACTTCACCATCTCTGTGACCACAGAAATCCTGCCTGTGTCCATGACCAAGACCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGATTCCACAGAATGCTCGAACCTGCTTCTGCAGTACGGCTCCTTCTGCACCCAGCTGAACAGAGCCCTGACCGGCATCGCCGTGGAACAGGATAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCTCCCATCAAGGACTTCGGAGGCTTCAACTTCTCCCAGATCCTGCCCGACCCTTCTAAGCCTAGCAAGCGGTCCCCAATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTCACCCTGGCTGATGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGATTGCCTGGGCGATATTGCCGCCCGGGACCTGATCTGCGCCCAGAAGTTCAACGGCCTGACTGTGCTGCCTCCTCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTACACCTCCGCCCTGCTGGCCGGCACCATCACCAGTGGCTGGACCTTTGGCGCCGGCCCTGCTCTACAGATCCCCTTCCCTATGCAGATGGCCTACAGGTTTAATGGAATCGGCGTTACCCAGAACGTGCTGTACGAAAACCAGAAGCTGATAGCCAACCAGTTCAACAGTGCCATCGGCAAGATCCAGGATTCTCTGTCCTCAACCCCCTCTGCACTGGGAAAACTGCAGGACGTGGTGAATCAGAACGCCCAGGCCCTGAACACCCTGGTCAAGCAGCTATCCTCTAACTTCGGCGCTATCAGCTCCGTGCTGAACGATATCCTGTCGAGACTGGACCCTCCCGAGGCTGAGGTGCAGATCGACAGACTGATCACTGGCAGACTGCAGTCTCTGCAAACCTACGTCACCCAGCAACTGATCCGCGCTGCCGAAATCCGGGCCTCTGCTAACCTGGCTGCTACCAAGATGTCCGAGTGTGTGTTGGGACAGTCTAAAAGGGTGGATTTCTGCGGCAAGGGATATCACCTGATGTCCTTCCCCCAGAGCGCCCCTCATGGCGTGGTCTTCCTGCATGTGACCTACGTCCCTGCTCAAGAGAAAAACTTTACTACCGCCCCTGCTATCTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCTAGAGAGGGCGTGTTCGTGTCCAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTCTACGAGCCTCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTATCCGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAACACAGTCTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAAGAAGAGTTAGACAAGTATTTCAAGAACCACACCTCTCCAGATGTGGATTTGGGCGACATCTCTGGCATCAACGCTTCCGTCGTGAACATCCAGAAAGAGATCGACCGGCTGAACGAAGTGGCCAAGAATCTGAACGAGTCCCTGATCGACCTGCAAGAACTGGGCAAGTACGAACAGTACATCAAGTGGCCTGGCTCCGGTTACATCCCAGAAGCCCCCAGGGATGGACAGGCCTATGTGAGAAAGGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGTCTACCTTCCTGTGA（SEQ ID NO：4）

<110> 上海泽润生物科技有限公司

<120> 重组刺突蛋白及其制备方法和用途

<130> CPCH2260031N

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1248

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro

20 25 30

Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val

35 40 45

Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe

50 55 60

Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn

65 70 75 80

Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val

85 90 95

Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn

115 120 125

Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp

130 135 140

Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu

145 150 155 160

Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr

165 170 175

Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe

180 185 190

Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys

195 200 205

Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln

210 215 220

Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn

225 230 235 240

Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr

245 250 255

Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr

260 265 270

Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn

275 280 285

Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu

290 295 300

Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln

305 310 315 320

Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro

325 330 335

Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg

340 345 350

Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val

355 360 365

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys

370 375 380

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn

385 390 395 400

Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile

405 410 415

Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro

420 425 430

Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp

435 440 445

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

450 455 460

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

465 470 475 480

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

485 490 495

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln

500 505 510

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

515 520 525

Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys

530 535 540

Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu

545 550 555 560

Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala

565 570 575

Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp

580 585 590

Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr

595 600 605

Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr

610 615 620

Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg

625 630 635 640

Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu

645 650 655

Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile

660 665 670

Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Gly

675 680 685

Gly Ser Gly Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser

690 695 700

Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile

705 710 715 720

Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser

725 730 735

Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser

740 745 750

Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln

755 760 765

Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr

770 775 780

Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile

785 790 795 800

Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser

805 810 815

Lys Pro Ser Lys Arg Ser Pro Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val

820 825 830

Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly

835 840 845

Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu

850 855 860

Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr

865 870 875 880

Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala

885 890 895

Gly Pro Ala Leu Gln Ile Pro Phe Pro Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe

900 905 910

Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu

915 920 925

Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu

930 935 940

Ser Ser Thr Pro Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln

945 950 955 960

Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe

965 970 975

Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro

980 985 990

Pro Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln

995 1000 1005

Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu

1010 1015 1020

Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys

1025 1030 1035

Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr

1040 1045 1050

His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe

1055 1060 1065

Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr

1070 1075 1080

Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu

1085 1090 1095

Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg

1100 1105 1110

Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val

1115 1120 1125

Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val

1130 1135 1140

Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu

1145 1150 1155

Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly

1160 1165 1170

Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu

1175 1180 1185

Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu

1190 1195 1200

Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp

1205 1210 1215

Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala

1220 1225 1230

Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

1235 1240 1245

<210> 2

<211> 3747

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggaatttg gtctaagttg gctatttcta gtggctatcc tgaaaggcgt gcagtgccag 60

tgcgttaatc tcaccaccag aacccagctg ccccctgctt acaccaactc cttcacccgc 120

ggcgtgtact accccgacaa ggtgttcaga tcttctgtgc tgcactccac ccaggatctg 180

tttctgcctt tcttctccaa cgtgacctgg ttccacgcaa tccacgtgtc cggcacaaac 240

ggcaccaaga gattcgacaa ccctgtgtta ccattcaacg acggcgtgta ttttgcttcc 300

accgagaagt caaacatcat tagaggctgg atcttcggca ccaccctgga ctctaagacc 360

cagtctctgc tgatcgtcaa caacgccaca aatgtggtga tcaaagtgtg cgagttccag 420

ttctgcaacg acccctttct gggcgtgtac taccacaaga acaacaagtc ctggatggaa 480

tctgagttca gagtgtactc ctctgccaac aactgtacct tcgagtacgt gtctcagccc 540

ttcctgatgg acctggaggg caagcagggc aactttaaga acctgagaga gttcgtcttc 600

aaaaatatcg acggctactt caagatctac tccaagcaca cccctatcaa cctagtgaga 660

gacctccctc agggcttctc tgcactggaa cctctggtgg acctgcctat cggtatcaac 720

atcacccggt tccaaaccct gctggccctg cacagaagct acctgacccc aggggactct 780

agctctggct ggacagctgg cgctgctgcc tactacgtgg gctacctgca gcctcggacc 840

tttctgctga agtacaacga aaacggcacc atcaccgacg ctgttgattg cgccctggat 900

cctctgtctg agacaaaatg cacactgaag agcttcaccg tggaaaaggg catctatcag 960

acaagcaact tcagagtgca gccaacagag tccatcgtgc ggttccctaa tatcactaac 1020

ctgtgtcctt tcggcgaagt gttcaacgct accagattcg cctcggtgta cgcttggaat 1080

agaaagcgga tctccaactg tgtggccgac tactccgtgc tgtacaattc cgcctccttc 1140

tccaccttca agtgctacgg cgtgagccca accaagctga acgacctgtg cttcaccaac 1200

gtgtacgccg atagctttgt gatcagaggc gacgaggtga gacagatcgc tcctggccag 1260

accggcaaca tcgccgacta caactacaag ttgcctgacg actttaccgg ctgcgtgatc 1320

gcctggaact ccaataacct ggactccaaa gtgggcggca actacaacta cctgtacaga 1380

ctgtttcgga agtccaacct gaagcctttc gaaagagata tcagcactga gatctaccag 1440

gctggatcta caccctgtaa tggcgtgaag ggcttcaact gctactttcc tctgcagtcc 1500

tacggcttcc agcctaccta cggagtgggc taccagcctt accgggtcgt ggtgctgagc 1560

ttcgagctgc tgcatgctcc tgccaccgtg tgtggaccaa agaaatcgac caacctggtg 1620

aagaacaagt gtgtgaactt caattttaac ggactgacag gcacaggcgt gctaacggag 1680

tccaataaga agttcttgcc atttcagcag ttcggccggg acatcgccga caccaccgac 1740

gccgtgcggg atcctcaaac actggagatc ctggatatca caccttgctc tttcggcggc 1800

gtgtctgtca tcacccctgg caccaacacc tccaaccagg tggctgtcct gtaccagggc 1860

gtgaattgca cggaagtgcc tgtggccata cacgccgacc agctgacccc cacctggcgg 1920

gtgtactcta cgggcagcaa cgtgttccag accagagctg gctgcctgat cggcgctgaa 1980

cacgtgaaca actcctacga gtgcgacatc cccatcggag ccggcatctg cgcgtcttac 2040

caaacacaga ccaactcccc tggcggctct ggatctgttg cctcccagtc catcatcgcc 2100

tataccatgt ctctgggagc cgagaactcc gtggcctact ccaacaactc catcgccatc 2160

cctaccaact tcaccatctc tgtgaccaca gaaatcctgc ctgtgtccat gaccaagacc 2220

agcgtggact gcaccatgta catctgcggc gattccacag aatgctcgaa cctgcttctg 2280

cagtacggct ccttctgcac ccagctgaac agagccctga ccggcatcgc cgtggaacag 2340

gataagaaca cccaagaggt gttcgcccaa gtgaagcaga tctacaagac ccctcccatc 2400

aaggacttcg gaggcttcaa cttctcccag atcctgcccg acccttctaa gcctagcaag 2460

cggtccccaa tcgaggacct gctgttcaac aaggtcaccc tggctgatgc cggcttcatc 2520

aagcagtacg gcgattgcct gggcgatatt gccgcccggg acctgatctg cgcccagaag 2580

ttcaacggcc tgactgtgct gcctcctctg ctgaccgacg agatgatcgc tcagtacacc 2640

tccgccctgc tggccggcac catcaccagt ggctggacct ttggcgccgg ccctgctcta 2700

cagatcccct tccctatgca gatggcctac aggtttaatg gaatcggcgt tacccagaac 2760

gtgctgtacg aaaaccagaa gctgatagcc aaccagttca acagtgccat cggcaagatc 2820

caggattctc tgtcctcaac cccctctgca ctgggaaaac tgcaggacgt ggtgaatcag 2880

aacgcccagg ccctgaacac cctggtcaag cagctatcct ctaacttcgg cgctatcagc 2940

tccgtgctga acgatatcct gtcgagactg gaccctcccg aggctgaggt gcagatcgac 3000

agactgatca ctggcagact gcagtctctg caaacctacg tcacccagca actgatccgc 3060

gctgccgaaa tccgggcctc tgctaacctg gctgctacca agatgtccga gtgtgtgttg 3120

ggacagtcta aaagggtgga tttctgcggc aagggatatc acctgatgtc cttcccccag 3180

agcgcccctc atggcgtggt cttcctgcat gtgacctacg tccctgctca agagaaaaac 3240

tttactaccg cccctgctat ctgtcacgac ggcaaggccc acttccctag agagggcgtg 3300

ttcgtgtcca acggcaccca ctggttcgtg acacagcgga acttctacga gcctcagatc 3360

atcaccaccg acaacacctt cgtatccggc aactgcgacg tggtgatcgg catcgtgaac 3420

aacacagtct acgaccctct gcagcccgag ctggacagct tcaaagaaga gttagacaag 3480

tatttcaaga accacacctc tccagatgtg gatttgggcg acatctctgg catcaacgct 3540

tccgtcgtga acatccagaa agagatcgac cggctgaacg aagtggccaa gaatctgaac 3600

gagtccctga tcgacctgca agaactgggc aagtacgaac agtacatcaa gtggcctggc 3660

tccggttaca tcccagaagc ccccagggat ggacaggcct atgtgagaaa ggacggcgag 3720

tgggtgctgc tgtctacctt cctgtga 3747

<210> 3

<211> 1229

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr

1 5 10 15

Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser

20 25 30

Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn

35 40 45

Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys

50 55 60

Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala

65 70 75 80

Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr

85 90 95

Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn

100 105 110

Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu

115 120 125

Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe

130 135 140

Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln

145 150 155 160

Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu

165 170 175

Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser

180 185 190

Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser

195 200 205

Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg

210 215 220

Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp

225 230 235 240

Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr

245 250 255

Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile

260 265 270

Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys

275 280 285

Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn

290 295 300

Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr

305 310 315 320

Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser

325 330 335

Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr

340 345 350

Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly

355 360 365

Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala

370 375 380

Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly

385 390 395 400

Gln Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe

405 410 415

Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val

420 425 430

Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu

435 440 445

Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser

450 455 460

Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln

465 470 475 480

Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg

485 490 495

Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys

500 505 510

Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

515 520 525

Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys

530 535 540

Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr

545 550 555 560

Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro

565 570 575

Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser

580 585 590

Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro

595 600 605

Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser

610 615 620

Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala

625 630 635 640

Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly

645 650 655

Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Gly Gly Ser Gly

660 665 670

Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala

675 680 685

Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn

690 695 700

Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys

705 710 715 720

Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys

725 730 735

Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg

740 745 750

Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val

755 760 765

Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe

770 775 780

Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser

785 790 795 800

Lys Arg Ser Pro Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala

805 810 815

Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala

820 825 830

Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu

835 840 845

Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu

850 855 860

Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Pro Ala

865 870 875 880

Leu Gln Ile Pro Phe Pro Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile

885 890 895

Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn

900 905 910

Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr

915 920 925

Pro Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln

930 935 940

Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile

945 950 955 960

Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala

965 970 975

Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln

980 985 990

Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser

995 1000 1005

Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln

1010 1015 1020

Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser

1025 1030 1035

Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr

1040 1045 1050

Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile

1055 1060 1065

Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val

1070 1075 1080

Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu

1085 1090 1095

Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys

1100 1105 1110

Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu

1115 1120 1125

Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe

1130 1135 1140

Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly

1145 1150 1155

Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu

1160 1165 1170

Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln

1175 1180 1185

Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Gly Ser Gly

1190 1195 1200

Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys

1205 1210 1215

Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

1220 1225

<210> 4

<211> 3690

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagtgcgtta atctcaccac cagaacccag ctgccccctg cttacaccaa ctccttcacc 60

cgcggcgtgt actaccccga caaggtgttc agatcttctg tgctgcactc cacccaggat 120

ctgtttctgc ctttcttctc caacgtgacc tggttccacg caatccacgt gtccggcaca 180

aacggcacca agagattcga caaccctgtg ttaccattca acgacggcgt gtattttgct 240

tccaccgaga agtcaaacat cattagaggc tggatcttcg gcaccaccct ggactctaag 300

acccagtctc tgctgatcgt caacaacgcc acaaatgtgg tgatcaaagt gtgcgagttc 360

cagttctgca acgacccctt tctgggcgtg tactaccaca agaacaacaa gtcctggatg 420

gaatctgagt tcagagtgta ctcctctgcc aacaactgta ccttcgagta cgtgtctcag 480

cccttcctga tggacctgga gggcaagcag ggcaacttta agaacctgag agagttcgtc 540

ttcaaaaata tcgacggcta cttcaagatc tactccaagc acacccctat caacctagtg 600

agagacctcc ctcagggctt ctctgcactg gaacctctgg tggacctgcc tatcggtatc 660

aacatcaccc ggttccaaac cctgctggcc ctgcacagaa gctacctgac cccaggggac 720

tctagctctg gctggacagc tggcgctgct gcctactacg tgggctacct gcagcctcgg 780

acctttctgc tgaagtacaa cgaaaacggc accatcaccg acgctgttga ttgcgccctg 840

gatcctctgt ctgagacaaa atgcacactg aagagcttca ccgtggaaaa gggcatctat 900

cagacaagca acttcagagt gcagccaaca gagtccatcg tgcggttccc taatatcact 960

aacctgtgtc ctttcggcga agtgttcaac gctaccagat tcgcctcggt gtacgcttgg 1020

aatagaaagc ggatctccaa ctgtgtggcc gactactccg tgctgtacaa ttccgcctcc 1080

ttctccacct tcaagtgcta cggcgtgagc ccaaccaagc tgaacgacct gtgcttcacc 1140

aacgtgtacg ccgatagctt tgtgatcaga ggcgacgagg tgagacagat cgctcctggc 1200

cagaccggca acatcgccga ctacaactac aagttgcctg acgactttac cggctgcgtg 1260

atcgcctgga actccaataa cctggactcc aaagtgggcg gcaactacaa ctacctgtac 1320

agactgtttc ggaagtccaa cctgaagcct ttcgaaagag atatcagcac tgagatctac 1380

caggctggat ctacaccctg taatggcgtg aagggcttca actgctactt tcctctgcag 1440

tcctacggct tccagcctac ctacggagtg ggctaccagc cttaccgggt cgtggtgctg 1500

agcttcgagc tgctgcatgc tcctgccacc gtgtgtggac caaagaaatc gaccaacctg 1560

gtgaagaaca agtgtgtgaa cttcaatttt aacggactga caggcacagg cgtgctaacg 1620

gagtccaata agaagttctt gccatttcag cagttcggcc gggacatcgc cgacaccacc 1680

gacgccgtgc gggatcctca aacactggag atcctggata tcacaccttg ctctttcggc 1740

ggcgtgtctg tcatcacccc tggcaccaac acctccaacc aggtggctgt cctgtaccag 1800

ggcgtgaatt gcacggaagt gcctgtggcc atacacgccg accagctgac ccccacctgg 1860

cgggtgtact ctacgggcag caacgtgttc cagaccagag ctggctgcct gatcggcgct 1920

gaacacgtga acaactccta cgagtgcgac atccccatcg gagccggcat ctgcgcgtct 1980

taccaaacac agaccaactc ccctggcggc tctggatctg ttgcctccca gtccatcatc 2040

gcctatacca tgtctctggg agccgagaac tccgtggcct actccaacaa ctccatcgcc 2100

atccctacca acttcaccat ctctgtgacc acagaaatcc tgcctgtgtc catgaccaag 2160

accagcgtgg actgcaccat gtacatctgc ggcgattcca cagaatgctc gaacctgctt 2220

ctgcagtacg gctccttctg cacccagctg aacagagccc tgaccggcat cgccgtggaa 2280

caggataaga acacccaaga ggtgttcgcc caagtgaagc agatctacaa gacccctccc 2340

atcaaggact tcggaggctt caacttctcc cagatcctgc ccgacccttc taagcctagc 2400

aagcggtccc caatcgagga cctgctgttc aacaaggtca ccctggctga tgccggcttc 2460

atcaagcagt acggcgattg cctgggcgat attgccgccc gggacctgat ctgcgcccag 2520

aagttcaacg gcctgactgt gctgcctcct ctgctgaccg acgagatgat cgctcagtac 2580

acctccgccc tgctggccgg caccatcacc agtggctgga cctttggcgc cggccctgct 2640

ctacagatcc ccttccctat gcagatggcc tacaggttta atggaatcgg cgttacccag 2700

aacgtgctgt acgaaaacca gaagctgata gccaaccagt tcaacagtgc catcggcaag 2760

atccaggatt ctctgtcctc aaccccctct gcactgggaa aactgcagga cgtggtgaat 2820

cagaacgccc aggccctgaa caccctggtc aagcagctat cctctaactt cggcgctatc 2880

agctccgtgc tgaacgatat cctgtcgaga ctggaccctc ccgaggctga ggtgcagatc 2940

gacagactga tcactggcag actgcagtct ctgcaaacct acgtcaccca gcaactgatc 3000

cgcgctgccg aaatccgggc ctctgctaac ctggctgcta ccaagatgtc cgagtgtgtg 3060

ttgggacagt ctaaaagggt ggatttctgc ggcaagggat atcacctgat gtccttcccc 3120

cagagcgccc ctcatggcgt ggtcttcctg catgtgacct acgtccctgc tcaagagaaa 3180

aactttacta ccgcccctgc tatctgtcac gacggcaagg cccacttccc tagagagggc 3240

gtgttcgtgt ccaacggcac ccactggttc gtgacacagc ggaacttcta cgagcctcag 3300

atcatcacca ccgacaacac cttcgtatcc ggcaactgcg acgtggtgat cggcatcgtg 3360

aacaacacag tctacgaccc tctgcagccc gagctggaca gcttcaaaga agagttagac 3420

aagtatttca agaaccacac ctctccagat gtggatttgg gcgacatctc tggcatcaac 3480

gcttccgtcg tgaacatcca gaaagagatc gaccggctga acgaagtggc caagaatctg 3540

aacgagtccc tgatcgacct gcaagaactg ggcaagtacg aacagtacat caagtggcct 3600

ggctccggtt acatcccaga agcccccagg gatggacagg cctatgtgag aaaggacggc 3660

gagtgggtgc tgctgtctac cttcctgtga 3690

Claims (18)

1.一种重组刺突蛋白，其特征在于，所述重组刺突蛋白具有SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸序列。

2.一种编码重组刺突蛋白的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQ ID NO：2或4所示的核苷酸序列。

3.一种工程化的细胞，其特征在于，所述细胞基因组整合有SEQ ID NO：2或4所示的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述细胞可以分泌表达重组刺突蛋白。

5.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述细胞为CHO细胞。

6.一种通过CHO细胞分泌表达并制备具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重组刺突蛋白的方法，包括下述步骤：

(1) 将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆入表达载体中；

(2) 将步骤(1)所得的表达载体转染至CHO细胞中；

(3) 通过细胞群的筛选和单克隆筛选，获得稳定表达所述重组刺突蛋白的细胞株；

(4) 使用步骤(3)所得的细胞株进行表达，获得含所述重组刺突蛋白的培养上清液；以及

(5) 将步骤(4)所得到的含所述重组刺突蛋白的培养上清液进行纯化，获得纯化的重组刺突蛋白。

7.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重组刺突蛋白以及药学上接受的赋形剂。

8.如权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物含有10μg-100μg/0.5ml，优选地25μg-50μg/0.5ml的重组刺突蛋白。

9.如权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述赋形剂为佐剂。

10.如权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂为铝佐剂联合CpG ODN佐剂。

11.如权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，所述铝佐剂为氢氧化铝。

12.如权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物含有100μg-1000μg/0.5ml，优选地250μg-500μg/0.5ml的铝佐剂。

13.如权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物含有500μg/0.5ml的氢氧化铝。

14.如权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，所述CpG ODN佐剂为CpG 7909。

15.如权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物含有100μg-1000μg/0.5ml，优选地250μg-500μg/0.5ml的CpG ODN佐剂。

16.如权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物含有500μg/0.5ml的CpG 7909。

17.权利要求1所述的重组刺突蛋白在制备疫苗组合物中的用途，所述疫苗组合物用于预防由新型冠状病毒或其变异株引起的感染或由所述感染导致的疾病。

18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述变异株为Alpha株、Beta株、Gamma株、Delta株、Omicron株或其组合，或含有这些变异株突变位点组合的新变异株。