JPH10501987A

JPH10501987A - パピローマウイルス用ポリヌクレオチドワクチン

Info

Publication number: JPH10501987A
Application number: JP8503166A
Authority: JP
Inventors: ダンリー，ジヨン・ジエイ; リユ，マーガレツト・エイ; マルチネズ，ダグラス; モンゴメリー，ドナ・エル
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1994-06-30
Filing date: 1995-06-01
Publication date: 1998-02-24
Also published as: CN1156966A; CA2193365A1; AU701973B2; NO965590D0; CZ375296A3; NZ288045A; PL180639B1; HUT76446A; DE69529748T2; FI965224A0; HU220747B1; ATE233101T1; SK164196A3; ES2191052T3; WO1996000583A1; HU9603562D0; EP0768893B1; CA2193365C; FI965224A; IL113817A0

Abstract

(57)【要約】動物組織に直接導入すると発現し得る、パピローマウイルス遺伝子産物をコードするＤＮＡ構築物は、パピローマウイルスによる感染に対する免疫保護をもたらし得る新規な予防製剤である。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称パピローマウイルス用ポリヌクレオチドワクチン他の出願との相互関係本出願は、現在係属中の１９９４年６月３０日出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／２６８，４２４号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、新規な医薬品、即ち、生物の脊椎組織に直接導入するとパピローマウイルスを特異的に認識する免疫応答を誘発させる核酸の製造及び使用に関する。発明の背景パピローマウイルス（ＰＶ）感染症は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ヘビ及びウシを含む種々の動物に発生する。パピローマウイルスは上皮細胞に感染し、一般に感染部位に良性の上皮又は線維上皮腫を誘発する。パピローマウイルスは種特異的感染物質であり、例えばヒトパピローマウイルスは一般に非ヒト動物には感染しない。パピローマウイルスは、感染する宿主に基づいて異なるグループに分類し得る。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、ＤＮＡ配列相同性に基づいてさらに６０以上のタイプに分類される〔考察には、ＰａｐｉｌｌｏｍａＶｉｒｕｓｅｓａｎｄＨｕｍａｎＣａｎｃｅｒ，Ｈ．Ｐｆｉｓｔｅｒ（編），ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９０参照〕。パピローマウイルス感染は、あるタイプのパピローマウイルス感染に対する中和免疫が別タイプのパピローマウイルスに対しては免疫を与え得ないというタイプ特異的免疫原性応答を誘発するようである。ヒトでは、異なるタイプのＨＰＶが異なる疾患を引き起こす。ＨＰＶ１、２、３、４、７、１０及び２６〜２９型は、正常な個体にも免疫抵抗性減弱個体にも良性のいぼをつくる。ＨＰＶ５，８，９，１２，１４，１５，１７，１９〜２５、３６及び４６〜５０型は、免疫抵抗性減弱個体に扁平病変をつくる。ＨＰＶ６，１１，３４，３９，４１〜４４及び５１〜５５型は、生殖路の非悪性コンジローマを引き起こす。ＨＰＶ１６型及び１８型は、生殖路の上皮形成異常を惹起し、頸部、膣、外陰部及び肛門管の大部分のｉｎｓｉｔｕ及び侵襲性癌に係わる。動物系の免疫学的研究により、パピローマウイルス抗原に対する中和抗体が産生されると同種ウイルスによる感染が阻止されることが示された。有効なヒトパピローマウイルスワクチンの開発は、該ウイルスがｉｎｖｉｖｏで培養できないために遅れている。ＨＰＶを直接研究するための適当な動物宿主が存在しないために、有効なＨＰＶワクチンの開発は特に遅滞している。抗体によるパピローマウイルスの中和はタイプ特異的であり且つウイルス表面上の高次構造エピトープに依存するようである。パピローマウイルスは、初期及び後期遺伝子をコードする、エンベロープを有さない小さな（５０〜６０ｎｍ）正２０面体ＤＮＡウイルスである。ウイルスゲノムの読み取りフレーム（ＯＲＦ）は、Ｅ１〜Ｅ７及びＬ１、Ｌ２と称され、「Ｅ」は初期を表し、「Ｌ」は後期を表す。Ｌ１及びＬ２はウイルスのキャプシドタンパク質をコードする。Ｅ１〜Ｅ３及びＥ５〜Ｅ７はウイルスの複製及び形質転換のような機能に係わる。Ｌ１タンパク質は、主要キャプシドタンパク質であり、５５〜６０Ｋの分子量を有している。Ｌ２タンパク質は、約５５Ｋの予測分子量及びポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して７５〜１００Ｋの見かけ分子量を有する微量キャプシドタンパク質である。電子顕微鏡及び免疫学的データは、殆どのＬ２タンパク質がＬ１タンパク質の内側にあることを示唆している。Ｌ２タンパク質は、種々のパピローマウイルス、特にＣ末端の１０個の塩基性アミノ酸間に高度に保存されている。Ｌ１ＯＲＦは、種々のパピローマウイルス間に高度に保存されている。Ｌ１及びＬ２遺伝子は、パピローマウイルス感染症の予防及び治療に使用し得る組換えタンパク質の産生に用いられている。Ｚｈｏｕらは、ＨＰＶ１６型Ｌ１及びＬ２遺伝子をワクシニアウイルスベクターにクローン化し、該組換えベクターをＣＶ−１哺乳動物細胞に感染させて、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生させた。これらの研究は、ＨＰＶ１６型Ｌ１タンパク質とＬ２タンパク質の両方を上皮細胞中で発現させることがＶＬＰアセンブリーを得るのに必要且つ十分であることを実証するものと解釈された。Ｌ１タンパク質のみ若しくはＬ２タンパク質のみを発現させるか又は細胞をＬ１及びＬ２遺伝子を含む単一の組換えワクシニアウイルスベクターで二重感染させても粒子は産生されなかった。細菌由来の組換えウシパピローマウイルスＬ１及びＬ２が合成された。該組換え細菌タンパク質に対する中和血清は自然ウイルスと低レベルで交差反応したが、これは、天然及び細菌由来のタンパク質の高次構造の違いに由来するものと考えられる。昆虫ＳＦ９細胞に感染させて、組換えＬ１及びＬ２タンパク質を産生させるのに、ＨＰＶ１６Ｌ１又はＨＰＶ１６Ｌ２ＯＲＦを発現する組換えバキュウロウイルスが用いられている。ウエスターンブロット分析により、該バキュウロウイルス由来のＬ１及びＬ２タンパク質はＨＰＶ１６に対する抗体と反応することが示された。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｖｉｓｌａｅの組換え株によりＨＰＶ１６型Ｌ１及びＬ２タンパク質が産生されることも示された。マウス及びヒトのどちらの細胞毒性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）も、保存された内部ウイルスタンパク質由来のエピトープを認識し得、ウイルスに対する免疫応答において重要であると考えられるので、種々のウイルス株に対する異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）保護をもたらし得るＣＴＬワクチンの開発に研究が向けられている。ＣＤ８⁺ＣＴＬは、そのＴ細胞レセプターがＭＨＣクラスＩ分子と結合したウイルスペプチドを認識するとウイルス感染細胞を殺すことは公知である。これらのペプチドは、ウイルス内のタンパク質の位置又は機能に関係なく、内因合成されたウイルスタンパク質から誘導される。従って、ＣＴＬは、保存されたウイルスタンパク質からのエピトープを認識することによって交差株保護（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉｎｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）をもたらし得る。ＣＴＬが認識するＭＨＣクラスＩに結合し得るペプチドは、細胞質又は小胞体中に存在するか又はそこを通過するタンパク質を起源とする。従って、（ＭＨＣクラスII分子により提示される抗原の場合と同様に）エンドソームプロセシング経路に入る異種タンパク質は一般にＣＤ８⁺ＣＴＬ応答の生起には有効でない。ＣＴＬ応答を生起させる方法には、複製ベクターを用いて細胞内でタンパク質抗原を産生させる方法か、又は細胞質ゾルにペプチドを導入することに焦点を合わせた方法が含まれる。これらの方法はどちらも、ワクチンとしての有用性を低減させ得る限界を有している。レトロウイルスベクターは、組換えウイルスの複製能を維持しながら融合タンパク質として発現し得るポリペプチドの大きさ及び構造が限定されており、その後の免疫感作のためのワクシニアのようなベクターの有用性は該ベクター自体に対する免疫応答により低減され得る。また、ウイルスベクター及び修飾病原体はヒトにおけるそれらの使用を妨げ得る固有のリスクを有している。さらに、提示されるべきペプチドエピトープの選択は、個体のＭＨＣ抗原の構造に依存し、従って、ペプチドワクチンは、遠類交配集団におけるＭＨＣハプロタイプの多様性のためにその有用性が限られたものとなり得る。ポリヌクレオチド構築物、即ちタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドを筋肉内接種すると、筋肉細胞中でタンパク質がｉｎｓｉｔｕで産生されることが示された。ウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡプラスミドを用いると、その後のチャレンジに対する同種保護をもたらす抗体応答が生起し得る。抗体の産生にポリヌクレオチドワクチン（ＰＮＶ）を用いることにより、抗体応答期間が延長されると共に、（組換えタンパク質に対する）正しい翻訳後修飾及び天然タンパク質高次構造を有し得る抗原を得ることができる。ＰＮＶ免疫感作後にｉｎｖｉｖｏで産生されるウイルスタンパク質は、その天然高次構造を推定し、それによって、ウイルス中和抗体の産生が誘発され得る。この手段により生起されるＣＴＬ応答により、潜在的に病原性の生ベクター即ち弱毒ウイルスを用いることなしに交差株保護という利点が得られる。Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙらは、マウス中に腹膜組織内、静脈内又は筋肉内導入したＣａＣｌ₂沈降化ＤＮＡが発現され得ると報告した。極く最近になって、マウスにＤＮＡ発現ベクターを筋肉内（ｉ．ｍ．）注入すると、筋肉細胞がＤＮＡを取込み、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質が発現すると報告された（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，１９９０；Ａｓｃａｄｉら，１９９１）。注入されたプラスミドは染色体外に保持されることが示され、複製は行われなかった。次いで、ラット、フィッシュ及び霊長類の骨格筋、並びにラットの心筋に筋肉内注入した後の持続性発現が報告された。免疫原物質として核酸を用いる方法がＷＯ９０／１１０９２号（１９９０年１０月４日）で報告されており、該方法では、脊椎動物の予防接種に裸の（ｎａｋｅｄ）ポリヌクレオチドが用いられた。該方法は筋肉内注入には限定されない。例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡでコートした銀微小発射物（ｇｏｌｄｍｉｃｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）をマウスの皮膚に導入すると、マウス中で抗ＢＧＨ抗体が産生された。生きている動物の皮膚、筋肉、脂肪及び乳房組織のトランスフェクトにはジェットインジェクターが用いられている。種々の核酸導入法が、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｕｌｍｅｒ及びＬｉｕにより検討された(ＴｈｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，２：２０，１９９４)。本発明は、核酸を生体組織に導入してタンパク質の発現を誘発させるための多様な方法を企図している。本発明の方法は、ウイルスタンパク質を抗原プロセシング経路に導入してウイルス特異的ＣＴＬ及び抗体を産生させる方法を提供する。従って、ウイルス病原体に対して所望の予防的免疫応答を誘発させ得る特異的治療剤に対する要望は、本発明によるパピローマウイルスで満たされる。従って、本発明は、特異的ＣＴＬ及び抗体を誘発させるヒトパピローマウイルスのウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を提供する。その後のウイルスチャレンジに対するＤＮＡ予防接種の保護効力は、１種以上の上記ウイルスタンパク質をコードする非複製プラスミドＤＮＡを用いた免疫感作により示される。これは、感染性物質が関与せず、ウイルス粒子のアセンブリーを必要とせず、且つ抗原決定基の選択が可能であるという点で有利である。さらに、いくつかの遺伝子産物の配列は種々のパピローマウイルス型中に保存されるために、クローン化遺伝子が由来する株に対して同種又は異種である種々のパピローマウイルス型によるその後のチャレンジに対する保護が可能になる。発明の要旨動物組織に直接導入されると発現し得る、パピローマウイルス遺伝子産物をコードするＤＮＡ構築物は、パピローマウイルスによる感染に対する免疫保護をもたらし得る新規な予防及び治療製剤である。図面の簡単な説明図１は、ＣＲＰＶＬ１ＤＮＡ又はＬ１及びＬ２ＤＮＡの混合物を注入したウサギ中で誘発されたウイルス中和抗体応答（ｙ軸）、及び該応答を誘発した対応ＥＬＩＳＡタイターを示す。図２．Ｌ１ＤＮＡを注入したウサギの抗体応答。１ｍｇという任意に選択された用量のＬ１ＤＮＡを用いて１回免疫感作したウサギのＬ１ＶＬＰに対するＥＬＩＳＡタイターを示す。対照ＤＮＡを注入したウサギはＬ１ＶＬＰに対して検出可能な抗体を産生しなかった。図３．Ｌ１ＤＮＡを用いた免疫感作により得られた抗血清に及ぼすＬ１ＶＬＰ吸収の効果。Ａでは、正常な血清、及び天然ＶＬＰ又は（１５）におけるような変性ＶＬＰを吸収させた免疫血清をウイルス中和活性についてテストした。チャレンジから７週間後に測定した３カ所のチャレンジ部位上のコンジローマの平均面積を示す。Ｂでは、Ｌ１ＤＮＡを注入したウサギから採取した免疫血清に、組換え酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株中で発現した天然（●）又は変性（■）Ｌ１ＶＬＰを３回段階的に吸収させた。次いで、各段階的吸収の後、血清のアリコートを、バキュウロウイルス由来のＬ１ＶＬＰに対する抗体活性についてＥＬＩＳＡでアッセイした。吸収後の物質のＥＬＩＳＡタイターを、未吸収血清の元のＥＬＩＳＡタイターの百分率としてプロットする。図４．抗ＣＲＰＶＥ２（Ａ）及びＣＲＰＶＥ７（Ｂ）抗体のアッセイにおけるＥＬＩＳＡ応答。個々のウサギそれぞれについてｍＯＤ／分としての正味反応速度（同一希釈度での４回の免疫後速度から免疫前速度を差し引いたもの）を示す。発明の詳細な説明動物組織に直接導入すると発現し得る、パピローマウイルス遺伝子産物をコードするＤＮＡ構築物は、パピローマウイルスによる感染に対する免疫保護を与え得る新規な予防及び治療製剤である。本発明は、ワタオノウサギ及びヒトのような脊椎動物中に直接導入すると、該動物の組織内でコード化ペプチドの発現を誘発するポリヌクレオチドを提供する。該ペプチドが、パピローマウイルス（ＰＶ）に結合したタンパク質のような、感染中を除いては該動物中で産生されないものである場合、該動物の免疫系が活性化されて保護応答が生起される。これらの異種タンパク質は、宿主動物の細胞によって産生されるので、該タンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりプロセッシング及び提示される。この認識は、関連生物に実際に感染したときに生起するものに類似している。その結果、本明細書に示されているように、ビルレント感染に対する保護をもたらし得る免疫応答が誘発される。本明細書に用いられているポリヌクレオチドは、生きている脊椎動物細胞に導入すると、細胞機構にポリヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされる翻訳産物を産生させ得るような必須調節要素を含む核酸である。本発明には当業者が本明細書から理解し得る多くの実施態様が存在する。例えば、種々の転写プロモーター、ターミネーター、担体ベクター又は特異的遺伝子配列を用い得る。本発明は、動物組織に導入すると、ｉｎｖｉｖｏでパピローマウイルス遺伝子産物の発現を誘発する核酸を提供する。従って、例えば本発明のＤＮＡ構築物をウサギの筋肉内に注入すると、コード化遺伝子産物の発現が誘発され、ウイルス中和抗体が産生する。その後で、全ての対照ウサギに病変を起こさせる用量を用い、ワタオノウサギパピローマウイルスでチャレンジしても、ポリヌクレオチドワクチンを注入した動物では病変の発生が極めて少ない。従って、本発明は、ヒトにおけるパピローマウイルス感染症の予防に有用なワクチンを開示する。パピローマウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、動物中で保護的免疫応答を誘発する。以下にさらに詳細に説明するように、動物の免疫応答には、ウイルス中和抗体及び同種のパピローマウイルスを用いたウサギにおけるウイルスチャレンジに対する保護が含まれる。１つの実施態様において、ワクチン産物は、例えば、パピローマウイルスのＬ１、Ｌ２、Ｅ２、Ｅ４タンパク質単独又はその組合わせをコードする個別のＤＮＡプラスミドからなる。他のワクチンより有利であると考えられる点には、ＣＴＬ応答による保護範囲の増大、抗体範囲の増大及び保護期間の増大が含まれるが、それらには限定されない。本発明の一つの実施態様において、臨床分離物から得られたＨＰＶ６ａ、６ｂ、１１、１６又は１８型タンパク質配列からのＬ１若しくはＬ２又はＬ１＋Ｌ２を発現ベクターにクローン化する。該ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼ転写プロモーター、及びＨＰＶコード配列末端の転写ターミネーターを含んでいる。プロモーターの例にはＣＭＶが含まれるがそれには限定されない。転写ターミネーターの例にはＢＧＨが含まれるがそれには限定されない。さらに、製剤の製造を支援するためには、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現した抗生物質耐性標識を発現ベクター中に含めるのも好ましい。ネオマイシン耐性遺伝子又は医薬上許容し得る他の任意の抗生物質耐性標識を用いてもよい。さらに、原核性微生物中で発酵させることによる製剤の高レベルの製造を支援するためには、ベクターが高コピー数であり複製起源を含むのが有利である。種々の市販の原核性クローニングベクターがこれらの利点を提供する。非必須ＤＮＡ配列は除去するのが望ましい。従って、本発明は免疫原としてＰＶタンパク質をコードする発現ベクターを提供する。本発明は、自律複製物質を必要とせずに交差型（ｃｒｏｓｓ−ｔｙｐｅ）保護免疫を誘発させる手段を提供する。さらに、ＤＮＡで免疫感作することにより多くの利点が得られる。先ず、この予防接種法は腫瘍にも感染物質にも適用し得るものである。というのは、ＣＤ８⁺ＣＴＬ応答がどちらの病態生理学的プロセスにおける免疫学的干渉にも重要だからである。従って、形質転換プロセスに極めて重要なタンパク質に対する免疫応答を誘発させることが癌に対する保護又は免疫療法の有効な手段となり得る。次に、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡの注入後に発現したタンパク質に対して抗体が産生されることは、この方法が抗体誘発ワクチン製造の容易且つ有効な手段であることを示唆している。ＤＮＡ構築物の形成及び精製は、慣用的なタンパク質精製より容易であり、それによって組合わせワクチンの製造が容易になる。従って、多重構築物、例えば１種以上の型のＨＰＶのＬ１及びＬ２タンパク質をコードする構築物の形成、混合、同時投与が可能になる。最後に、タンパク質の発現はＤＮＡ注入後一定期間持続し得るので、Ｂ細胞及びＴ細胞メモリーの持続性が高められ、それによって、寿命の長い体液性及び細胞媒介性免疫が生じる。提案されたＨＰＶワクチンに限界があるということは、感染症の予防及び疾患の軽減に対するより効果的な手段の開発が必要であることを強調している。保存タンパク質に対するＣＴＬ応答の生起を改善することにより、極めて長期の交差反応性免疫を得ることができる。本出願人は、ＣＲＰＶ抗原に対して誘発された宿主の免疫応答を検出することにより、ウサギ中でＰＮＶ構築物からタンパク質が発現することを示した。これらの動物実験の結果は、ＤＮＡの直接注入により、ＨＰＶ感染及び疾患に対してヒトを保護する方法が得られることを示している。使用濃度を最適化するために、一連の用量を免疫原性について比較する。ヒトの場合、１０、５０、１００及び２００μｇのＤＮＡ用量が有効であると考えられる。ヒトにおける効力は、ＨＰＶＤＮＡワクチンの接種を受けるボランティアにおいて示される。ワクチン用の組成、用量及び投与方式は前述の研究に基づいている。臨床効力は、感染速度、疾患の評点及び疾患の期間によって示される。保護と相関する代用マーカーを決定するために、これらの臨床知見を宿主の免疫応答及びウイルス検出の実験室評価と比較する。ＤＮＡ構築物を形成／精製するための分子生物学により、本発明のＤＮＡ製剤の製造が可能になる。本発明の製品の製造には標準的な分子生物学法で十分ではあるが、本明細書に開示されている特定の構築物は交差株（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉｎ）保護を生起し得る新規な治療製剤を提供する。ワクチン投与すべき者に導入すべき発現性ＤＮＡの量は、ＤＮＡ構築物に用いられる転写及び翻訳プロモーターの強度、並びに発現される遺伝子産物の免疫原性に依存する。一般に、免疫学的又は予防的に有効な用量である１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは約１０〜３００μｇを筋肉組織に直接投与する。皮下注入、皮内導入、経皮圧入及び他の投与法、例えば、腹腔内、静脈内又は吸入投与も企図される。追加免疫接種を行うことも企図される。ポリヌクレオチドは、裸、即ち、受容者の免疫系に影響を与えるタンパク質、アジュバント又は他の物質と結合していないものであってよい。この場合、該ポリヌクレオチドが、滅菌塩水又は滅菌緩衝塩水のような（但し、それには限定されない）生理的に許容し得る溶液中にあるのが望ましい。あるいは、該ポリヌクレオチドは、レシチンリポソーム又はＤＮＡ−リポソーム混合物のような当業界において公知の他のリポソームと結合しているか、又は、該ＤＮＡは、タンパク質又は他の担体のような、当業界では公知の、免疫応答を強化するアジュバントと結合していてもよい。カルシウムイオン、ウイルスタンパク質及び他のトランスフェクション促進物質のような（但し、それらには限定されない）、細胞のＤＮＡの取込みを支援する物質を用いるのも有利であり得る。これらの物質は一般にトランスフェクション促進物質と称され、医薬上許容し得る担体である。遺伝子による免疫感作の方がその遺伝子産物による免疫感作よりもいくつかの点で有利である。１つの利点は、自然又はほぼ自然の抗原を比較的簡単に免疫系に提示し得ることである。ポリヌクレオチド免疫感作の別の利点は、免疫原がＭＨＣクラスＩ経路に入り、細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発し得ることである。ポリヌクレオチド免疫感作により、体液性及び細胞媒介性応答が共に生起し得るので、別の利点は、ワクチンの潜在能力について大量のウイルス遺伝子及びウイルス型を調べるための比較的簡単な方法が得られる点にある。ポリヌクレオチドの注入による免疫感作は、個々の成分の混合による多成分ワクチンのアセンブリーをも可能にする。本明細書に用いられている遺伝子という用語は、個々のポリペプチドをコードする核酸のセグメントを指す。製剤及びワクチンという用語は、免疫応答の誘発に有用な組成物を示すべく交換可能に用いられる。構築物及びプラスミドという用語は交換可能に用いられる。ベクターという用語は、本発明の方法に従って用いるために、遺伝子がクローン化され得るＤＮＡを示すように用いられる。従って、本発明の１つの実施態様は、ヒトを含む哺乳動物のような脊椎動物中で、ｉｎｖｉｖｏで免疫応答を誘発させるＰＶ遺伝子を用いる方法であり、該方法は、（ａ）少なくとも１つのＰＶ遺伝子を単離する段階、（ｂ）該遺伝子を生物組織に導入すると該遺伝子の転写開始及びその後の翻訳を誘発させる調節配列に作動可能に連結されるように該遺伝子を調節配列に連結する段階、（ｃ）該遺伝子を生物組織に導入する段階、及び（ｄ）任意に、追加ＰＶ遺伝子で追加免疫する段階を含む。本発明の別の実施態様は、異種型ＰＶに対する保護方法であり得る。これは、保存されたＰＶエピトープをコードする免疫学的に有効量の核酸を投与することにより達成される。本発明の別の実施態様において、ポリヌクレオチドワクチンは、Ｌ１若しくはＬ２、Ｅ１〜Ｅ７又はその組合わせのような別のＰＶタンパク質をコードする。本発明の別の実施態様において、ＤＮＡ構築物は、ＨＰＶ６ａ、６ｂ、１１、１６又は１８型タンパク質をコードし、該ＤＮＡ構築物は、動物組織中に導入するとｉｎｖｉｖｏで発現し、コード化ＨＰＶ遺伝子の発現産物に対する免疫応答を誘発し得る。そのような構築物と共にＨＰＶには無関係の他の抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組合わせが本発明により企図される。ＤＮＡ構築物をコードするＨＰＶ遺伝子の例には、が含まれる。本発明の特定の実施態様において、ＤＮＡ構築物はＣＲＰＶＬ１タンパク質をコードし、該ＤＮＡ構築物は、動物組織中に導入すると、ｉｎｖｉｖｏで発現し、コード化ＣＲＰＶ遺伝子の発現産物に対する免疫応答を誘発し得る。そのような構築物と共にＣＲＰＶには無関係の他の抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組合わせが本発明により企図される。ＤＮＡ構築物をコードするＣＲＰＶ遺伝子の例には、が含まれる。該ＤＮＡを含む医薬上有用な組成物は、医薬上許容し得る担体を添加するような公知方法により配合し得る。そのような担体及び配合法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに見られる。有効投与に適した医薬上許容し得る組成物を形成するためには、該組成物は有効量のＨＰＶＤＮＡを含む。本発明の治療及び診断組成物は、ＰＶ感染症の治療又は診断に十分な量で個体に投与される。有効な量は、個体の症状、体重、性別及び年齢のような種々の要素に応じて異なり得る。他の要素には投与方式が含まれる。一般に該組成物は、約１μｇ〜約１ｍｇの範囲の用量で投与される。該医薬組成物は、皮下、局所的、経口及び筋肉内のような多様な経路を介して個体に投与し得る。本発明のワクチンは、ヒト宿主中で中和抗体の形成を誘発する抗原決定基を含むＨＰＶの組換えタンパク質をコードするＨＰＶＤＮＡを含む。そのようなワクチンは、臨床感染の危険なく投与し得るに十分な程安全でもあり、毒性の副作用を有さず、有効な経路で投与し得、安定であり且つワクチン担体との適合性を有する。該ワクチンは、種々の経路を介して、例えば、経口、非経口、皮下又は筋肉内投与し得る。投与量は、個体の症状、性別、体重及び年齢；投与経路；及びワクチンのＰＶタイプに応じて異なり得る。該ワクチンは、カプセル剤、懸濁液、エリキシル剤又は液体溶液のような投与形態で用い得る。該ワクチンは免疫学的に許容し得る担体と共に配合し得る。該ワクチンは、予防上又は治療上有効な量、即ち、免疫学的に保護応答を生起させるに十分な量で投与する。有効な量はＰＶ型に応じて異なり得る。該ワクチンは１回又は複数回用量で投与し得る。本発明の方法により、ＰＶ感染を予防するための一価又は多価ワクチンの配合が可能になる。該方法を用い、一価又は多価ＰＶワクチンを製造し得る。例えば、一価のＨＰＶ１６型ワクチンは、ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質若しくはＬ２タンパク質又はＬ１＋Ｌ２タンパク質をコードするＤＮＡを配合することにより製造し得る。あるいは、多価ＨＰＶワクチンは、種々のＨＰＶ型からのＨＰＶＬＩ若しくはＬ２又はＬ１＋Ｌ２タンパク質をコードするＤＮＡを混合することにより製造し得る。該ＤＮＡは抗体の産生に用い得る。本明細書に用いられている「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びにその断片、例えば、抗原又はハプテンに結合し得るＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２断片が含まれる。本発明のＰＶＤＮＡ及び抗体は、ＨＰＶ又はＣＲＰＶ感染の血清型の検出並びにＨＰＶのスクリーニングに用い得る。該ＨＰＶ及びＣＲＰＶＤＮＡ並びに抗体は、それら自体でＨＰＶ又はＣＲＰＶの検出及び血清型の検出に適したキットの形成にも関与する。そのようなキットは、少なくとも１つの容器を密閉状態に保持するのに適した区画形成化（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ）キャリヤーを含む。該キャリヤーにはさらに、多様なＨＰＶ型の検出に適したＨＰＶＤＮＡ又は抗ＨＰＶ抗体のような試薬も含まれる。該キャリヤーは、標識抗原又は酵素基質などのような検出手段をも含み得る。以下の実施例は本発明をさらに定義するために提供されており、本発明はこれらの実施例の詳細には限定されない。実施例１ワクチン製造用ベクター（Ａ）Ｖ１：ｐＣＭＶＩＥ−ＡＫＩ−ＤＨＦＲ〔Ｙ．Ｗｈａｎｇら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，１７９６（１９８７）〕から発現ベクターＶ１を構築した。該ベクターをＥｃｏＲＩで切断し、自律連結させて、ＡＫＩ及びＤＨＦＲ遺伝子を取り出した。このベクターはＣＭＶプロモーター中にイントロンＡを含んでおらず、従って、内部ＳａｃＩ部位〔Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９，３９７９（１９９１）で番号付けされた１８５５位〕が欠失したＰＣＲフラグメントとして加えられた。ＰＣＲ反応に用いたテンプレートは、ｈＣＭＶ−ＩＥ１エンハンサー／プロモーター及びイントロンＡを含むｐＣＭＶ６ａｌ２０〔Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，前掲参照〕からのＨｉｎｄIII及びＮｈｅＩフラグメントを、ｐＢＬ３のＨｉｎｄIII及びＸｂａＩ部位に連結してｐＣＭＶＩｎｔＢＬを産生させて作製したｐＣＭＶｉｎｔＡ−Ｌｕｘであった。ＲＳＶ−Ｌｕｘ〔Ｊ．Ｒ．ｄｅＷｅｔら，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７，７３５，１９８７〕からの１８８１塩基対ルシフェラーゼ遺伝子フラグメント（ＨｉｎｄIII−ＳｍａＩクレノウ充填）を、ｐＣＭＶＩｎｔＢＬのＳａｌＩ部位にクローン化し、これをクレノウ充填し、ホスファターゼ処理した。イントロンＡにわたるプライマーは、である。ＳａｃＩ部位の除去に用いたプライマーは、である。ＰＣＲフラグメントをＳａｃＩ及びＢｇｌIIで切断し、同じ酵素で切断しておいたベクターに挿入した。（Ｂ）Ｖ１Ｊ発現ベクター、配列番号５：本発明のＶ１Ｊ形成の目的は、プロモーター及び転写終結要素をより限定された前後関係内に置くために、ベクターＶ１から該成分を取り出し、よりコンパクトなベクターを構築してプラスミド精製効率を改良することであった。Ｖ１Ｊは、ベクターＶ１及び市販プラスミドであるｐＵＣ１９から誘導する。Ｖ１をＳｓｐＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、２つのＤＮＡフラグメントを形成した。該フラグメントのうち、異種遺伝子の発現を調節するＣＭＶｉｎｔＡプロモーター及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）転写終結要素を含む小さい方のフラグメントをアガロース電気泳動ゲルから精製した。次いで、このＤＮＡフラグメントの末端を、別の「平滑末端化」ＤＮＡフラグメントに連結し易くするためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて「平滑化」した。発現ベクターの「バックボーン」を得るためにｐＵＣ１９を選択した。ｐＵＣ１９は、高収率のプラスミドを産生することが知られており、配列及び機能が十分に特性決定され、最小の大きさを有するものである。本出願人は、ＨａｅII制限酵素を用いて部分消化することにより、このベクターから、本発明の目的には不要であり、プラスミドの収率及び異種遺伝子の発現に悪影響を与え得る全ｌａｃオペロンを除去した。残りのプラスミドをアガロース電気泳動ゲルから精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理して、上記のＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨ要素に連結した。ｐＵＣバックボーン内のプロモーター要素の２つの可能な配向のいずれかを示すプラスミドを得た。これらのプラスミドの１つからＥ．ｃｏｌｉ中で高収率のＤＮＡが得られ、これをＶ１Ｊと称した。このベクターの構造を結合領域の配列分析により調べた結果、異種遺伝子の発現がＶ１以上であることが示された。（Ｃ）Ｖ１Ｊｎｅｏ発現ベクター、配列番号６アンピシリンはヒトの臨床産物を産生させるための大規模な発酵には用い得ないので、Ｖ１Ｊを有する細菌の抗生物質選択に用いられるａｍｐ^r遺伝子を除去する必要があった。ＳｓｐＩ及びＥａｍ１１０５１制限酵素で消化して、Ｖ１ＪのｐＵＣバックボーンからａｍｐ^r遺伝子を除去した。残りのプラスミドをアガロースケル電気泳動により精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いで、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。トランスポゾン９０３由来であり、ｐＵＣ４Ｋプラスミド内に含まれる市販のｋａｎ^r遺伝子をＰｓｔＩ制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。このフラグメントをＶ１Ｊバックボーンと連結し、各々の配向でｋａｎ^r遺伝子を含むプラスミドを誘導し、これをＶ１Ｊｎｅｏ＃１及び＃３と称した。これらのプラスミドはそれぞれ制限酵素消化分析及び結合領域のＤＮＡ配列決定により確認され、Ｖ１Ｊと類似の量のプラスミドを産生することが示された。これらのＶ１Ｊｎｅｏベクターは、異種遺伝子産物の発現についてもＶ１Ｊと同等であった。本出願人は、Ｖ１Ｊｎｅｏ＃３を任意に選択し、以後Ｖ１Ｊｎｅｏと称したが、該ベクターは、発現構築物としてＶ１Ｊ中のａｍｐ^r遺伝子と同配向のｋａｎ^r遺伝子を含んでいる。（Ｄ）ＶＩＪｎｓ発現ベクター：組込み実験を容易にするために、Ｖ１ＪｎｅｏにＳｆｉＩ部位を加えた。市販の１３塩基対ＳｆｉＩリンカー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）をベクターのＢＧＨ配列内のＫｐｎＩ部位で加えた。Ｖ１ＪｎｅｏをＫｐｎＩで直鎖状にし、ゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化して平滑末端ＳｆｉＩリンカーに連結した。制限マッピングによりクローナル分離体を選択し、リンカーにわたって配列決定をして確認した。この新規なベクターをＶ１Ｊｎｓと称した。Ｖ１Ｊｎｓ（ＳｆｉＩを含む）における異種遺伝子の発現は、Ｖ１Ｊｎｅｏ（ＫｐｎＩを含む）における同一遺伝子の発現と同等であった。実施例２ワタオノウサギパピローマウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ構築物の作製全てのクローン化遺伝子のＣＲＰＶＤＮＡ源はＣＲＰＶ−ｐＬＡIIである。これは、ＳａｌＩ部位でｐＢＲ３２２にクローン化された全ＣＲＰＶゲノムである〔Ｎａｓｓｅｒｉ，Ｍ．，Ｍｅｙｅｒｓ，Ｃ．及びＷｅｔｔｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｏ．（１９８９）ＧｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＲＰＶｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ：該Ｌ１読み取りフレームは細胞の形質転換には必須ではないが、パピローマの形成には必要である。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０，３２１−３２５〕。１．Ｖ１Ｊｎｓ−Ｌ１：テンプレートとしてＣＲＰＶ−ｐＬＡII ＤＮＡを用いＰＣＲによりＬ１コード配列を作製した。ＰＣＲフラグメントをゲル精製した後で切断するためのＢａｍＨＩ部位を含むようにＰＣＲプライマーを設計した。Ｌ１コード領域の作製に用いたプライマーは、であった。該ＰＣＲフラグメントをゲル精製し、ＢａｍＨＩで切断し、ＢｇｌIIで切断したＶ１Ｊｎｓに連結した。２．Ｖ１Ｊｎｓ−Ｌ２：ＰＣＲによりＬ２コード領域を作製した。ベクターＣＲＰＶ−ｐＬＡIIは、ＣＲＰＶのｐＢＲ３２２への挿入に用いたＳａｌＩ部位で分割されたＬ２遺伝子を有する。従って、ＣＲＰＶ−ｐＬＡIIをＳａｌＩで切断し、ＣＲＰＶＤＮＡをＳａｌＩ部位で環状形態に連結してＰＣＲ用のテンプレートを作製した。この連結ＣＲＰＶＤＮＡをＰＣＲ用のテンプレートとして用いた。ＰＣＲフラグメントをゲル精製した後で切断するためのＢａｍＨＩ部位を含むようにＰＣＲプライマーを設計した。Ｌ２コード領域の作製に用いたプライマーは、３．Ｖ１Ｊｎｓ−Ｅ２：テンプレートとしてＣＲＰＶ−ｐＬＡII ＤＮＡを用いＰＣＲによりＥ２コード領域を作製した。ＰＣＲフラグメントをゲル精製した後で切断するためのＢｇｌII部位を含むようにＰＣＲプライマーを設計する。Ｅ２コード領域の作製に用いたプライマーは、である。４．Ｖ１Ｊｎｓ−Ｅ４：テンプレートとしてＣＲＰＶ−ｐＬＡII ＤＮＡを用いＰＣＲによりＥ４コード領域を作製する。ＰＣＲフラグメントをゲル精製した後で切断するためのＢｇｌII部位を含むようにＰＣＲプライマーを設計する。Ｅ４コード領域の作製に用いたプライマーは、である。５．Ｖ１Ｊｎｓ−Ｅ７：テンプレートとして、一方にはＣＲＰＶ−ｐＬＡIIを用い、他方にはＫｒｅｉｄｅｒのＣＲＰＶ株からの精製ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＥ７コード領域を作製した。どちらのテンプレートにも同じＰＣＲプライマーを用いた。ＰＣＲフラグメントをゲル精製した後で切断するためのＢｇｌII部位を含むようにＰＣＲプライマーを設計する。Ｅ７コード領域の作製に用いたプライマーは、であった。６．ｐＧＥＸ−２Ｔ−Ｅ２：Ｖ１Ｊｎｓ−Ｅ２について記載のようにＰＣＲによりＥ２コード領域を作製した。該フラグメントをＢａｍＨＩ部位でｐＧＥＸ−２Ｔにクローン化して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とのフレーム内融合体を作製した。この構築物を用いてＥ．ｃｏｌｉ中でタンパク質を産生させる。７．ｐＧＥＸ−２ｔ−Ｅ４：Ｖ１Ｊｎｓ−Ｅ４について記載のようにＰＣＲによりＥ４コード領域を作製した。該フラグメントをＢａｍＨＩ部位でｐＧＥＸ−２Ｔにクローン化して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とのフレーム内融合体を作製した。この構築物を用いてＥ．ｃｏｌｉ中でタンパク質を産生させる。８．ｐＧＥＸ−２Ｔ−Ｅ７：Ｖ１Ｊｎｓ−Ｅ７について記載のようにＰＣＲによりＥ７コード領域を作製した。該フラグメントをＢａｍＨＩ部位でｐＧＥＸ−２Ｔにクローン化して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とのフレーム内融合体を作製した。この構築物を用いてＥ．ｃｏｌｉ中でタンパク質を産生させる。実施例３Ｅ．ｃｏｌｉ由来のプラスミドの精製Ｖ１Ｊ構築物を一晩飽和状態まで増殖させた。細胞を収穫し、アルカリＳＤＳ法〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，，Ｅ．Ｆ．，及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，第２版（１９８９）〕を改変したものを用いて溶菌した。改変は、細胞の溶菌及びＤＮＡ抽出の容量を３倍に増大させることであった。ＣｓＣ１−ＥｔＢｒ勾配の二重バンド法によりＤＮＡを精製した。１−ブタノールで抽出して臭化エチジウムを除去した。得られたＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈降させた。ＤＮＡを、トランスフェクションのためにはＴＥ（１０ｍＭトリス、１ｍＭＢＤＴＡ）、ｐＨ８に再懸濁し、マウスに注入するためには０．９％ＮａＣｌに再懸濁した。各ＤＮＡ調製物の濃度及び純度をＯＤ_260/280読み取りにより測定した。２６０／２８０比は≧１．８であった。実施例４ｉｎｖｉｖｏでのＣＲＰＶ特異的抗体の産生１グループ当たり５匹のウサギから出血させ、次いで、１ｍｇのＶ１Ｊｎｓ− Ｌ１、Ｖ１Ｊｎｓ−Ｌ２、Ｖ１ＪｎｓＬ２とＶ１Ｊｎｓ−Ｌ１との混合物（合計２ｍｇ）を含む１．２ｍｌのサリン又はＶ１Ｊｎｓ（コードされるタンパク質を含まない対照ベクター）のみを注入した。接種原を両後脚と両前脚及び背中後部の都合６カ所の筋肉内部位に等分に分けた。最初のＤＮＡ注入から３週間後にウサギから出血させ、同じ方法で同じＤＮＡの２回目の注入を行った。２回目の注入から４週間後に動物から再度出血させた。免疫血清の１０倍段階希釈液をＣＲＰＶストックウイルス（Ｋｒｅｉｄｅｒ株）の１：３希釈液と混合して、血清をウイルス中和抗体についてテストした。該希釈液は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で調製した。ＣＲＰＶストックウイルス（Ｄｒ．Ｊ．Ｋｒｅｉｄｅｒ、Ｈｅｒｓｈｅｙ，ＰＡから購入）は、野生のワタオノウサギから得た皮膚の断片から調製し、これにＣＲＰＶを感染させ、無胸腺症（ａｔｈｙｍｉｃ）マウスの腎皮膜下に移植した。得られたコンジローマをホモジナイズし、遠心して清浄化し、ストックウイルス調製物を得た。免疫血清とウイルスストックとの混合物を氷上で少なくとも６０分間インキュベートし、次いで、各混合物から５０μｌずつを、３匹のニュージーランド白ウサギの背中の面積１ｃｍ²の剃毛／乱切した皮膚に塗布した。７週間後に、動物をいぼの存在について観察し、楕円形のいぼの前後方向及び両側面方向の寸法（ｍｍ）を測定した。Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ補間法により種々の希釈度でのいぼの頻度から終点タイターを測定した。Ｌ１ＤＮＡ、又はＬ１及びＬ２ＤＮＡの両方を注入したウサギの中和抗体タイターを図１のｙ軸上にプロットする。Ｌ１ＤＮＡを注入したウサギからの血清も抗体についてＥＬＩＳＡでテストした。ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ウエルの半精製組換え酵母由来ＣＲＰＶＬ１タンパク質で一晩４℃でコートした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で組換えＬ１を作製し、Ｋｉｒｕｎｂａｕｅｒらにより記載（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１２１８０−４，１９９２）のものをわずかに改変した方法で精製した。希釈血清を加え、室温で１時間（オービタル振盪機上で振盪しながら）インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を加えた。振盪しながら１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、基質を加えた。動力学的ＥＬＩＳＡ読み取り装置（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＣｏｒｐ．）を用い４５０ｎｍでプレートの読み取りを行い、得られた値を、同一希釈度での免疫後感作血清の反応速度から免疫前血清の反応速度を差し引いて、バックグラウンドに対して補正した。得られた補正反応速度対希釈度曲線を１０ｍＯＤ／分の速度値に補間してタイターを測定した。Ｌ１ＤＮＡ又はＬ１＋Ｌ２ＤＮＡを注入したウサギのＥＬＩＳＡタイターを図１のｘ軸にプロットする。図１は、中和活性について陽性（ｌｏｇタイター≧１、即ち、非希釈血清に関して陽性）であった１２／１３の血清がＥＬＩＳＡ抗体についても陽性（ＥＬＩＳＡタイター≧１００）であったことを示している。中和抗体について陰性であった４種の血清中４種がＥＬＩＳＡタイター≦３５０を有していた。Ｌ２ＤＮＡのみ又はＶ１Ｊ対照ベクターを受容したウサギの血清は全てＥＬＩＳＡタイターが１００未満であった。これらのデータを総合すると、Ｌ１ＤＮＡ注入後に、ＣＲＰＶ特異的で且つＣＲＰＶを中和し得る抗体が得られたことがわかる。ウサギのＥＬＩＳＡタイターは免疫感作後少なくとも３２週にわたって減少せずに持続された（図２）。実施例５ビルレントＣＲＰＶでのチャレンジに対するウサギの保護上記のように、１グループ当たり５匹のウサギに、１ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−Ｌ１、Ｖ１Ｊｎｓ−Ｌ２、Ｖ１Ｊｎｓ−Ｌ１とＶ１Ｊｎｓ−Ｌ２との混合物（合計２ｍｇ）又はＶ１Ｊｎｓ（コード化タンパク質を含まない対照ベクター）のみを筋肉内注入した。最初のＤＮＡ注入から３週間後に、ウサギに同じＤＮＡの２回目の注入を行った。２回目の注入から４週間後、ウサギをＣＲＰＶでチャレンジした。ＣＲＰＶチャレンジは、各ウサギの背中の各１ｃｍ²の剃毛／乱切した皮膚３カ所に、ウイルスストックの２種の希釈液（ＤＭＥＭ＋１％ＢＳＡで１：２又は１：１２希釈）５０μｌを塗布して行った。Ｌ１ＤＮＡ又はＬ１＋Ｌ２ＤＮＡを注入した動物からチャレンジ時に採取した血清は、上記のようなＥＬＩＳＡによるＬ１に対する抗体及びウイルス中和抗体を含んでいた。該動物には、チャレンジから３、６及び１０週後にいぼの形成が見られた。Ｌ１ＤＮＡを注入しなかったウサギでは、ＣＲＰＶでチャレンジした５４部位中５１部位にいぼができたが、Ｌ１ＤＮＡを注入した動物では、６０部位中２部位にしかいぼができなかった。Ｌ１ＤＮＡで免疫感作したウサギに認められた２つのいぼの中の１つは、発生後３週間以内に退行した。表１は、ＣＲＰＶチャレンジ後のウサギのいぼの分布を示している。Ｌ１ＤＮＡによる予防的免疫感作により、ウサギは、ビルレントＣＲＰＶ感染によるいぼの発生から保護された。実施例６Ｌ１ＤＮＡにより誘発された抗体の高次構造特異性保護的中和抗体がＶＬＰ上で高次構造エピトープを認識することを示すために、吸収実験を行った。免疫血清にＬ１ＶＬＰ（１５）を吸収させて、全ての中和抗体及びＥＬＩＳＡ活性を除去した（図３Ａ、図３Ｂ）。乱切した皮膚に免疫前ウサギ血清を混合したＣＲＰＶを塗布すると、チャレンジした全ての部位にコンジローマが生じたが、ＣＲＰＶを免疫血清と混合し、同じように塗布した場合には、中和抗体活性のためにコンジローマは見られなかった。ＣＲＰＶとＬ１ＶＬＰを吸収させた免疫血清とを混合し、該混合物から中和抗体を除去すると、全て（３／３）の部位はコンジローマ陽性となった。反対に、変性非粒状Ｌ１タンパク質（８Ｍ尿素中で還元／アルキル化して変性させた）を免疫血清に吸収させても、血清は、まだＣＲＰＶを中和し得（図３Ａ）、ＥＬＩＳＡにおいてその活性が保持されていた（図３Ｂ）。従って、Ｌ１ＤＮＡ免疫感作により誘発されたウイルス中和抗体は、天然立体構造においてはＬ１ＶＬＰによってのみ除去し得るが、変性Ｌ１では除去できなかった。吸収によるＥＬＩＳＡ活性の喪失が中和抗体の除去に対応するので、ＥＬＴＳＡアッセイは主として、完全なＬ１ＶＬＰと反応する高次構造特異的抗体を検出するようである（図３Ｂ）。実施例７Ｅ４及びＥ７ＤＮＡにより誘発された抗体応答１グループ当たり４匹のＮＺＷウサギ群に、免疫感作１回当たり１ｍｇのＶ１Ｊ−Ｅ２又はＶ１ＪＥ７ＤＮＡを筋肉内注入した。４回の免疫感作を０、４、８及び２０週目に実施し、２２週目に出血させた。コード化タンパク質を発現させるための代用（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）標識として抗体を用いた。ＣＲＰＶＥ２又はＥ７をコードするｐＧＥＸ発現ベクターで形質転換し、ＩＰＴＧで誘発させ、Ｅ．ｃｏｌｉから精製した１ウエル当たり１μｇのＧＳＴ−Ｅ２又はＧＳＴ−Ｅ７融合タンパク質でコートしたＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣＭａｘｉｓｏｒｐ）を用いて血清抗体をアッセイした。ＥＬＩＳＡアッセイは実施例３に記載のように実施した。ｍＯＤ／分としての正味反応速度（４回の免疫後速度から免疫前速度を差し引いたもの）を図４に示す。正味速度＞１０ｍＯＤ／分であれば陽性と見なす。高抗体タイターを有する検体は、検出系の過飽和のために最低希釈度では低い正味反応速度を有し得る。従って、コード化Ｅ２及びＥ７タンパク質が発現し、受容免疫系によって認識された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者リユ，マーガレツト・エイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者マルチネズ，ダグラスアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者モンゴメリー，ドナ・エルアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１つのパピローマウイルス遺伝子の全体又は一部をコードする核酸を含み、動物組織に導入するとｉｎｖｉｖｏでパピローマウイルス特異的免疫応答を誘発し得るポリヌクレオチド。２．遺伝子が、ＨＰＶＬ１、ＨＰＶＬ２、ＨＰＶＥ１、ＨＰＶＥ２、ＨＰＶＥ３、ＨＰＶＥ４、ＨＰＶＥ５、ＨＰＶＥ６、ＨＰＶＥ７、ＣＲＰＶＬ１、ＣＲＰＶＬ２、ＣＲＰＶＥ１、ＣＲＰＶＥ２、ＣＲＰＶＥ３、ＣＲＰＶＥ４、ＣＲＰＶＥ５、ＣＲＰＶＥ６、ＣＲＰＶＥ７及びその組合わせからなる群から選択されるパピローマウイルスタンパク質をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．少なくとも１ｎｇの、請求項１に記載のポリヌクレオチドを脊椎動物に導入することを含む、脊椎動物中でパピローマウイルスエピトープに対する免疫応答を誘発させる方法。４．請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むパピローマウイルス用ワクチン。５．請求項１に記載のポリヌクレオチド及び医薬上許容し得る担体を含む医薬組成物。６．ヒトパピローマウイルス遺伝子を用いてｉｎｖｉｖｏで免疫応答を誘発させる方法であって、（ａ）該遺伝子を単離する段階、（ｂ）該遺伝子を生物組織に導入すると該遺伝子の転写開始及びその後の翻訳を誘導させる調節配列に作動可能に連結されるように該遺伝子を調節配列に連結する段階、及び（ｃ）該遺伝子を生物組織に導入する段階を含む前記方法。