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Hintergrund der Erfindung
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Ein Hauptanliegen der biomedizinischen
Forschung ist die Schaffung von Schutz gegen Viruserkrankungen durch
Immunisierung. Ein Ansatz besteht in der Verwendung von Totvakzinen.
Für Totvakzine
sind jedoch große
Materialmengen erforderlich, um eine ausreichende Antigenmasse zu
erhalten. Darüber
hinaus werden Totvakzine bei ihrer Herstellung oft mit unerwünschten
Substanzen kontaminiert. Heterologe Lebendvakzine unter Verwendung
eines entsprechend gentechnisch erzeugten Adenovirus, das selbst
Vakzine ist, erscheinen als hervorragende Immunogene [Chanock R.,
JAMA, 195, 151, (1957)]. Die vorliegende Erfindung betrifft Vakzine,
bei denen ein Adenovirus als Vektor verwendet wird.
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Derzeit erhältliche Adeno-Vakzine umfassen
lebende infektiöse
Adenoviren in einer erst im Darm löslichen Dosisform. Bei Verabreichung
an einen zu impfenden Patienten wird das Virus am oberen Atmungssystem
(wo man annimmt, dass die krankheitsenegende Infektion auftritt)
vorbeigeführt
und im Darm freigesetzt. Im Darm vermehrt sich das Virus in der
Darmwand, wo es zwar keine Adenovirus-Erkrankung verursachen kann,
aber trotzdem die Bildung von Adenovirus-Antikörpern induziert und damit eine
Immunität
gegen die Adenovirus-Erkrankung verleiht. Erfindungsgemäß werden
lebende infektiöse
Adenoviren erzeugt, die Gene enthalten, welche für Antigene codieren, die von
anderen krankheitsenegenden Organismen produziert wurden. Bei der
Freisetzung vermehrt sich das Virus und exprimiert separat sowohl
das Adenovirus-Antigen als auch das Krankheitseneger-Antigen, wodurch
es zur Bildung von Antikörpern
oder einer zellvermittelten Immunität sowohl gegen das Adenovires
als auch gegen den anderen krankheitsenegenden Organismus kommt. Unter "Lebendvirus" wird im Gegensatz
zu einem "toten" Virus ein Virus
verstanden, das in der Lage ist, entweder selbst oder in Verbindung
mit zusätzlichem
genetischem Material eine identische Nachkommenschaft zu produzieren.
Unter "infektiös" wird die Fähigkeit
verstanden, das Virusgenom in Zellen zu senden.
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Roy schlug in der Europäischen Patentveröffentlichung
80806 (1983) ein Verfahren zur Erzeugung von Immunität gegen
mikrobielle Krankheiten durch Verabreichung einer Mikrobe vor, die
ein Fremdgen enthält,
welches ein Antigen einer zweiten Mikrobe exprimiert, der Immunität verliehen
wird. Er führt
aus, dass bevorzugte orale Präparationen
erst im Darm löslich
sind. Dubelcco schlug rekombinante Adenovirus-Vakzine vor, bei denen
das Oberflächenprotein
des Adenovirus derart modifiziert ist, dass es in seiner Struktur
ein Segment eines Fremdproteins enthält, das bei Verabreichung an
Lebewesen eine gewünschte
biologische Reaktion erzeugt. [Internationale PCT-Anmeldung WO 83/02393
(1983)]. Davis offenbart orale Vakzine, die von rekombinanten Adenoviren
abgeleitet sind [GB-2166349B].
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Das menschliche-Immunschwäche-Typ-1-Virus
(HIV-1) wird ätiologisch
mit erworbener Immuninsuffizienz (AIDS) und verwandten Störungen assoziiert.
[Barre-Sinoussi, F., Science 220: 868 (1983); Gallo, R., Science
224: 500 (1984); Popovic, M., Science 224: 497 (1984); Sarngadharan,
M., Science 224: 506 (1984)]. AIDS ist eine mittlerweile weltweite
Epidemie, für
die es derzeit keine Vakzine oder Heilung gibt. Die meisten Bemühungen,
einen Impfstoff zu entwickeln, waren auf das Hüllglycoprotein env als Antigen
gerichtet, das Immunitäts schutz
bieten könnte.
Gegen gereinigtes gp 120 hergestellte Antisera können HIV-1 in vitro neutralisieren.
[Crowl, R., Cell 41: 979 (1985); Puthey, S., Science 234: 1392 (1986);
Ho, D., J. Virol. 61: 2024 (1987); Nara, P., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84: 3797 (1987)]. Das HIV-1-Hüllantigen
wird in verschiedenen Expressionssystem produziert, einschließlich Escherichia
coli [Crowl, R., Cell 41: 979 (1985); Chang, T., Bio/Technology
3: 905 (1985); Dawson, G., J. Infect. Dis. 157: 149 (1988)] sowie
Säugerzellen
[Chakrabard, S., Nature 320: 535 (1986); Dewar, R., J. Virol. 63:
129 (1989); Rekosh, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 334 (1988);
Whealy, M., J. Virol. 62: 4185 (1988)], Hefezellen [Barr, P., Vaccine
5:. 90 (1987)] und Insektenzellen [Hu, S., Nature 328: 721 (1978);
Rusche, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6294 (1987)].
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Lebende rekombinante Vaccinia-Viren,
die das ganze HIV-1-env-Glycoprotein [Hu, S., J. Virol. 61: 3617
(1987)] oder das gereinigte rekombinante gp-120-env-Glycoprotein
[Berman, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5200 (1988)] exprimieren,
wurden bei Schimpansen als Impfkandidaten bewertet. Die aktive Immunisierung
mit diesen Vakzinen induzierte eine gute zellvermittelte Immunreaktion
sowie eine zytotoxische T-Zellen-Aktivität gegen das env-Antigen [Zarling,
J., J. Immunol. 139: 988 (1987)]. Sämtliche Versuchstiere serokonvertierten,
wie mittels ELISA und Western-Blot festgestellt wurde. Immunisierte
Schimpansen entwickelten jedoch keine oder nur geringe Titer des
neutralisierenden Antikörpers
gegen HIV-1. Eine Erregung mit Lebendviren konnte die Schimpansen
nicht gegen diese Vakzinen schützen.
Typ-spezifische HIV-1-neutralisierende Antikörper wurden bei Schimpansen
im Frühstadium
der Infektion gegen eine variable Domäne (V3) innerhalb des C-Terminus
in der Hälfte
von gp 120 nachgewiesen [Goudsmit, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85: 4478 (1988)]. Weiters wurde gezeigt, dass in Insektenzellen
hergestelltes rekombinantes gp 120 eine humorale Immunreaktion bei
der Ziege induziert (Rusche J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6294
(1987)]. Zagury [Nature 332; 728 (1988)] haben bei Verwendung einer
Vakzine-Virus-Rekombinate, die gp 160 exprimiert, sowohl eine anamnetische
humorale als auch eine zelluläre
Immunreaktion beim Menschen nachgewiesen. [Chakrabarti, S., Nature
320: 535 (1986); Hahn, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4813 (1985)].
Es wurden auch sowohl eine gruppenspezifisch zellvermittelte Immunität als auch
eine zellvermittelte Zytotoxizität
gegen infizierte T4-Zellen gefunden. Diese Resultate weisen darauf
hin, dass ein Immunzustand gegen HIV-1 beim Menschen erzielt werden
kann, wenn rekombinante Vakzine auf env-Basis eingesetzt werden. Jüngst zeigte
Desrosiers, dass eine Impfung mit ganzem inaktiviertem Affen-Lnmunschwäche-Virus
(SIV) Rhesusaffen gegen eine Erregung mit lebenden SIV schützen kann.
[Proc. NatL Acad. Sci. USA 86: 6353 (1989)]. Diese Daten geben Hoffnung
auf eine mögliche
Schutzimpfung gegen Infektionen durch das menschliche AIDS-Virus
HIV-1.
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Chanda offenbart eine hochgradige
Expression des Hüllglycoproteins
von HIV-1 in Anwesenheit des rev-Gens bei Verwendung von Helfer-unabhängigen Adenovirus
Typ-7-Rekombinanten. [Virology 175: 535 (1990)]. Vernon offenbart
die ultrastrukturelle Charakterisierung von HIV-1-gag-enthaltenden Teilchen, die in einem
rekombinanten Adenovirus-Vektorsystem assembliert sind. [J. Gen.
Virology 72: 1243 (1991)]. Vemon offenbart auch die Herstellung
der rekombinanten HIV-1-Adenoviren Ad7-rev-gag und Ad4-rev-gag.
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Die vorliegende Erfindung sieht die
Verwendung eines lebenden rekombinanten Adenovirus zur Herstellung
eines Medikaments zur Verwendung bei einer Behandlung zur Erzeugung
von Antikörpern
oder einer zellvermittelten Immunität gegen menschliche-Immunität-Typ-1-Viren
vor, worin das Strukturprotein des Virions des lebenden rekombinanten
Adenovirus unverändert
gegenüber
jenem im nativen Adenovirus ist, aus dem das rekombinante Adenovires
erzeugt ist und welches das Gen enthält, das für ein Antigen codiert, das besagten
Antikörpern
entspricht oder besagte zellvermittelte Immunität induziert, wobei das rekombinante Adenovirus
ausgewählt
ist aus einem oder mehr der Gruppe bestehend aus Ad7-tp1env-tp1Hrev, Ad7-tp1gag-tp1Hrev,
Ad7-rev-gag, Ad4-tp1env-tp1Hrev, Ad4-tp1gag-tp1Hrev, Ad4-rev-gag, Ad5-tp1env-tp1Hrev
und Ad5-tp1gag-tp1Hrev, welches Medikament für die intranasale Verabreichung
an einen Säuger
der Ordnung Primaten einschließlich
des Menschen bestimmt ist.
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In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung umfasst das Medikament weiters ein oder mehr menschliche
Immunschwäche
Typ 1-Untereinheit-Protein(e). Vorzugsweise ist das Unter einheit-Protein
env oder gag.
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Auch wenn sich die Beschreibung im
Speziellen auf Adenoviren mit einer frühen Bereich-3-Deletion (E3) bezieht, können abgeschwächte Adenoviren
oder solche mit einer temperaturempfindlichen Läsion oder einer E1-Deletion
ebenfalls als Vektor verwendet werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
beinhaltet die Behandlung die Verabreichung des rekombinanten Adenovirus
sowohl prophylaktisch an einen HIV-1-anfälligen Säuger als auch als Immuntherapie
nach einem HIV-Nachweis in besagtem Säuger. Es wurden Regime mit
den folgenden rekombinanten Adenoviren zur Erzeugung der anti-HIV-Reaktionen
verwendet.
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Unter Bezugnahme auf die obige Tabelle
beziehen sich Ad4, Ad5 und Ad7 auf menschliche Adenoviren Typ 4,
5 bzw. 7, bei denen der E3-Bereich deletiert ist. Env bezieht sich
auf das HIV-Hüllglycoproteingen (gp
160). Gag bezieht sich auf das HIV-gag/pro-Gen. Rev bezieht sich
auf das HIV-Regulationsgen. Hrev bezieht sich auf eine veränderte Version
des rev-Gens, wo die Nucleotidsequenzen verändert wurden ohne Veränderung
der Aminosäuresequenz,
wobei Codons eingesetzt werden, die häufig in menschlichen Genen
verwendet wurden. Tp1 bezieht sich auf die stromaufwärtige dreiteilige
Adenovirus-Leitsequenz mit einer intervenierenden Sequenz zwischen
dem ersten und dem zweiten Leader, die sich vor den rekombinanten
Genen befinden.
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In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung sind lebende rekombinante Viren X-tp1Y-tp1Hrev vorgesehen,
worin X Ad4, Ad5 oder Ad7 ist und Y env oder gag ist.
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Wie nachstehend detailliert beschrieben,
führte
die intranasale Verabreichung von rekombinanten Ad-HIV-Viren an
naive Schimpansen sowohl zu einer Grundimmunisierung als auch zu
einem Booster-Effekt sowohl bei humoralen als auch bei zellvermittelten
Immunreaktionen gegen rekombinante HIV-Antigene. Bei den rekombinanten
Adenoviren, die an Schimpansen verabreicht wurden, zeigte sich,
dass sie Antikörper
gegen env- und gag-Proteine von HIV produzieren. HIV-spezifische
IgG-Antikörper
wurden nach Verabreichung der rekombinanten Adenoviren in Nasen-,
Speichel- und Vaginalsekreten beobachtet, und HIV-spezifische IgA-Antikörper wurden
in Nasen- und Speichelsekreten gefunden. Das erste Set von rekombinanten
Viren (Ad7) schien sich am längsten
zu verbreiten und die beste anti-Ad-Antikörper-Reaktion zu induzieren.
Die Ergebnisse zeigten auch, dass die intranasale Verabreichung
von Ad-HIV-Vakzinen
einer Verabreichung von erst im Darm löslichen rekombinanten Viren
auf oralem Weg überlegen
war.
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Optimale Immunreaktionen gegen HIV-Antigene
erforderten eine Primärinfektion,
eine Booster-Immunisierung mit einem heterotypischen rekombinanten
Ad-HIV, um starke anti-HIV-bindende
Antikörper
hervorzurufen. Die intranasale Verabreichung von Ad-HIV-Viren erstimmunisierte
Schimpansen wirkungsvoll, so dass diese nach einer anschließenden Booster-Immunisierung mit
dem HIV-1-Untereinheit-Protein mit hochtitrigen neutralisierenden
Antikörpern
gegen HIV-1 reagierten.
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Herstellung von repräsentativen
rekombinanten Adenoviren
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Die folgenden Beispiele zeigen die
Konstruktion von repräsentativen
erfindungsgemäßen rekombinanten
Adenoviren. Die rekombinanten Viren wurden auf A549-Zellen vermehrt
und anschließend
auf A549-Zellen titriert.
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Beispiel 1. Ad7-gag-1
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Die Konstruktion von rekombinanten
Adenoviren, die das Gen für
das HIV-Hüllprotein
enthalten, wurde beschrieben [Chanda, P., Virology 175: 535 (1990)];
ein ähnliches
Verfahren wurde zur Inkorporierung von gag und pro verwendet [siehe
Vernon, S., J. Gen. Virology 72: 1243 (1991)]. Kurz gesagt wurde
ein DNA-Fragment, das die ganzen für gag und pro codierenden Bereiche
(bp 335 bis 2165) des HIV-1-Stamms LAV (Wain-Hobson, S., Cell 40:
9, (1985)] enthielt, mit einer nur einmal vorhandenen Sa/I-Stelle
vor dem AUG-Codon des gag-Gens
und einer XbaI-Stelle bei bp 2165 für die Insertion des viralen
rev-Reaktionselements (rre; bp 7178 bis 7698) konstruiert. Ein 2.37-kb-SaI-Fragment,
das die drei HIV-1-Sequenzen enthielt, wurde an einer SaI-Stelle
in eine Expressionskassette inseriert, die den späten Hauptpromotor
(MLP) des Adenovirus Typ 7 (Ad7), den dreiteiligen Leader (TPL)
mit einer intervenierenden Sequenz zwischen dem ersten und dem zweiten
Leader und die Hexon-Polyadenylie rungsstelle (Poly A) enthielt,
wie in Chanda beschrieben [Virology 175: 535 (1990)]. Die Kassette
wurde 159 bp vom rechten Ende eines Ad7-Genoms inseriert [Sussenbach,
The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, S. 34–124 (1984)],
welches das HIY-1-rev-Gen [Feinberg, M., Cell 46: 807 (1986); Sodroski,
J., Nature 321: 412 (1986)] in einem deletierten [79.5 bis 88.4
Genkarteneinheiten (map units – mu)]
E3-Bereich [Chanda, P., Virology 175: 535 (1990)] enthielt.
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Beispiel 2. Ad4-gag-1
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Im Anschluss an das Verfahren zur
Konstruktion des rekombinanten Adenovirus Ad7-gag-1 in Beispiel l wurden eine ähnliche
Expressionskassette, die analoge Ad4-Sequenzen und die drei für HIV codierenden
Sequenzen enthielt, an einer Stelle 139 bp vom rechten Ende eines
Ad4-Genoms inseriert, das HIV-1-rev in einer E3-Deletion zwischen
76 und 86 mu enthielt.
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Beispiel 3. Ad5-env
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Ad5-tp1env-tp1Hrev enthält die gesamt
Codiersequenz von HIV-1 (LAV-Stamm) gp160 und eine modifizierte
Version des rev-Gens, genannt Hrev. Sowohl vor dem env- als auch
vor dem rev-Gen befindet sich eine synthetische Kopie des dreiteiligen
Ad5-Leaders (ad5-tp1). Ad5-tp1 wurde chemisch synthetisiert und
im pTZ-Vektor kloniert. Dann wurde die gp160-DNA-Sequenz hinter Ad5-tp1 inseriert,
um den Ad5-tp1env/PTZ18R-Klon zu erzeugen. Hrev (~360 bp) wurde
auch chemisch synthetisiert, wo die Nucleotidsequenzen ohne Veränderung
der Aminosäuresequenz
mit Hilfe der Codon-Verwendung verändert wurden. Das wurde gemacht,
um eine homologe Rekombination zu vermeiden, da es einige identische
Sequenzen zwischen env und rev gab. Auf analoge Weise wie das Ad5-tp1env-Konstrukt
wurde das Hrev-Gen ebenfalls hinter tp1 im pTZ18R-Vektor inseriert,
um das Plasmid Ad5-tp1Hrev zu erzeugen. Die gesamte Ad5-tp1Hrev enthaltende
Sequenz wurde herausgeschnitten und dann hinter Ad5-tp1env inseriert,
um das Plasmid Ad5-tp1env-tp1Hrev zu erzeugen. Dieses Plasmid wurde
dann im deletierten E3-Bereich des Ad5-Marietta-Stamms (78.8–85.7-mu-Deletion)
bei 78.8 mu inseriert. Dieses Plasmid wurde mit dem BgII-Enzym linearisiert
und dann mit dem 0-87-mu-SnaB1-Fragment vermischt, das vom gereinigten
Wild-Typ-Ad5-Virus abgeleitet wurde. Danach wurden A549-Zellen mit
den DNA-Mischungen transfiziert, rekombinante Virus-Plaques herausgepickt,
dreimal Plaquegereinigt und ihre genomischen Strukturen durch eine
Restriktionsendonucleasestellen-Analyse von aus infizierten Zellen
extrahierter DNA mittels dem Hirt-Verfahren bestätigt. [J. Mol Bio. 26: 365
(1967)].
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Beispiel 4. Ad5-gag
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Ad5-tp1gag-tp1Hrev enthält die kompletten
gag- und pro-Bereiche sowie das modifizierte rev-Gen Hrev. Eine
Kopie des synthetischen dreiteiligen Ad5-Leaders wurde vor den gag-
und Hrev-Genen platziert. Ein DNA-Fragment, das die kompletten gag-
und pro-Bereiche enthielt (bp 335 bis 2165 des LAV-Stamms von HIV-1)
wurde mit einer nur einmal vorhandenen SaII-Stelle vor dem AUG-Codon
des gag-Gens und einer xba-Stelle bei bp 2165 für die Insertion des viralen
rev-Reaktionselements (rre; bp 7178–7698) konstruiert. Zwei separate
Plasmide, Ad5-tp1gag sowie Ad5-tp1Hrev, wurden auf ähnliche
Weise wie für Ad5-tp1env-tp1Hrev beschrieben
konstruiert. Dann wurde das Ad5-tp1Hrev-Fragment hinter Ad5-tp1gag inseriert,
um das Plasmid Ad5-tp1gag-tp1Hrev zu erzeugen. Dann wurde das Fragment
Ad5-tp1gag-tp1Hrev
an der nur einmal vorhandenen Stelle XbaI in der Kartenposition
78.8 des Ad5-Marietta-Stamms
mit einer E3-Deletion (78.8–85.7-mu-E3-Deletion)
inseriert. Danach wurde das die Ad5-Sequenz enthaltende Endplasmid
linearisiert und dann mit dem vitalen Fragment 0– 87 mu SnaB1 zwecks Transfektion
gemischt. Rekombinante Plaques wurden herausgepickt, dreimal Plaque-gereinigt
und mittels Hirt-Analyse von aus den infizierten Zellen extrahierter
DNA untersucht.
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Beispiel 5. Kapseln, die
erste im Darm löslich
sind
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Rekombinante Adenoviren wurden in
A549-Zellen gezüchtet
und nach drei Einfrier-Auftau-Zyklen
geerntet. Geklärte
Lysate von infizierten Zellen wurden lyophilisiert und zu 60 bis
100 mg unter Verwendung eines 1-ml-Spritzenkolbens unter entfeuchteten
Bedingungen in #2-Gelatinekapseln gepackt. Die Kapseln wurden mit
10% Celluloseacetatphthalat in Aceton/-100% Ethanol (1 : 1) durch sechsmaliges
händisches
Eintauchen jedes Endes beschichtet, wobei zwischen jedem Eintauchen
luftgetrocknet wurde. Unter diesen Bedingungen bildete sich eine
Beschichtung von 69 bis 77 mg Celluloseacetatphthalat. Probekapseln
wurde auf ihre Beständigkeit
gegen simulierten Magensaft (0,32% Pepsin, 0,2% NaCl, pH 1,2) bei
37°C unter
Verwendung eines VanKel-Disintegration-Testor-Apparats 1 Stunde
lang getestet. Die Kapseln wurden auf Löcher oder Sprünge untersucht
und in ein 15-ml-Röhrchen
mit 10 ml simuliertem Darmsaft (1,0% Pankreatin, 0,05 M monobasisches
Kaliumphosphat, pH 7,5) transferiert und bei 37 °C rotiert. Alle getesteten Kapseln
waren 1 Stunde lang bei 37°C
unter Rühren
gegen simulierten Magensaft beständig
und begannen nach 15 min, sich in simuliertem Darmsaft aufzulösen. Die
Virusmenge wurde auf konfluenten A549-Zell-Monoschichten mit Hilfe
eines Plaque-Tests titriert und die vitale DNA-Stabilität mittels
Hirt-Analyse bestätigt.
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Behandlungsschemen
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Die Immunogenität der rekombinanten Adenoviren
für HIV
wurde bei Schimpansen entsprechend drei Behandlungsschemen bewertet.
Das erste Schema bestand in der Verabreichung des rekombinanten
Adenovirus oral über
eine im Darm lösliche
Kapsel (Beispiel 5) in der Woche 0, 7 und 26 und der anschließenden Nachimpfung
mit den Untereinheit-Proteinen env und gag unter Verwendung von
Alaun als Adjuvans. Das zweite Schema bestand in der weiteren Behandlung
der Schimpansen, die Schema 1 erhalten hatten, mit zusätzlichen
Nachimpfungen mit intranasal verabreichtem rekombinantem Adenovirus
in den Wochen 46 und 58. Das dritte Behandlungsschema bestand in
der Verabreichung von rekombinantem Adenovirus intranasal an naive
Schimpansen in der Woche 0, 24 und 52 und anschließenden Nachimpfung
mit einer Untereinheit env in der Woche 72.
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In der folgenden Tabelle sind die
Behandlungsschemen 1 und 2 zusammengefasst.
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BEHANDLUNGSSCHEMA
1 UND 2
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In der folgenden Tabelle ist das
Behandlungsschemen 3 zusammengefasst.
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Messung der Immunogenität: Behandlungsschema
1
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Inokulationen von Schimpansen
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Drei Schimpansen (2 männliche
und 1 weiblicher), die auf die Anwesenheit von neutralisierenden
Antikörpern
gegen menschliche Adenoviren Typ 4 und 7 negativ gescreent worden
waren, wurden unter Anwendung von Behandlungsschema 1 bewertet.
Im Darm lösliche
Kapseln mit rekombinanten Adenoviren wurden unter Verwendung eines
Magenröhrchens
an drei aufeinander folgenden Tagen unter Narkose verabreicht. Zwei
Schimpansen (1 und 2) erhielten beide die rekombinanten Viren env
und gag, während
der dritte (3) nur rekombinante env-Viren erhielt.
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Von Adenovirus abgeleitete Untereinheit-Präparationen,
die env- oder gag-Genprodukte enthielten, wurden aus infizierten
A549-Zellkulturen gereinigt [siehe Vernon, S., J. Gen. Virology
72: 1243 (1991) und Natuk, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7777
(1992)]. Rekombinante Antigene wurden mit Alaun als Adjuvans formuliert
und intramuskulär
verabreicht, 200 ug/Dosis env-Teilchen und 500 μg/Dosis gag-Teilchen.
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Im Verlauf des Versuchs wurden Vollblut-,
Serum- und Stuhlproben zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen. Vollblut
wurde zur Gewinnung von weißen
Blutzellpopulationen für
FACS, HIV-CTL (unter Verwendung von rekombinanten Vaccinia-Viren,
die HIV-env, HIV-gag
oder lac-Genprodukte exprimieren) und Lymphozytenproliferationsversuche
zu gereinigtem rekombinantem HIV gp160, gp120 und p24 verarbeitet.
Die Serum- und Stuhlproben wurden bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
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Nachweis von
rekombinanten Adenoviren in Stuhlproben
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Stuhlproben von Schimpansen wurden
aufgetaut und 10%ige Suspensionen (v/v) in Antibiotika enthaltendem
DMEM hergestellt. Geklärte
Stuhlsuspension wurde zur Infektion von konfluenten A549-Zell-Monoschichten
in 60 mm Gewebekulturschalen verwendet. Nach 1 Stunde Adsorptionsdauer
wurde das nicht gebundene Material weggewaschen und die Monoschichten
mit einem 0,5% Agar-Überzugsmedium
beschichtet. Plaques wurden 7 bis 10 Tage entwickeln gelassen und
durch neutrales Rotfärben
sichtbar gemacht, gezählt und
der Agar-Überzug vorsichtig
entfernt, wobei darauf geachtet wurde, dass die Zell-Monoschicht
nicht durcheinander gebracht wurde. Die Zellschicht wurde auf Nitrocellulose-Filtermembranen
(Millipore Typ HA, 0,45 μm)
transferiert, in 20X SSC vorgetränkt
und auf die Zellschicht aufgetragen und mit der Zell-Monoschicht
2 bis 4 Minuten lang in Kontakt gelassen. Die Filter wurden abgeschert,
luftgetrocknet und 2 Stunden lang im Vakuumofen bei 80°C gebacken.
Die Nitrocellulose-Filter wurden bei Raumtemperatur zweimal in 3X SSc/0,1%
SDS gewaschen und nach Standard-Verfahren [Poncet, D., J. Virol.
Methods 26: 27 (1989)] vorhybridisiert und hybridisiert. 32P-markierte Oligosonden wurden dem Hybridisierungspuffer
(1 × 106 CPM) zugesetzt und über Nacht bei 42°C inkubiert.
DNA-Sonden wurden hergestellt, mit denen entweder Ad4-Faser-, Ad5-Faser-,
Ad7-Faser-, HIV-env- oder HIV-gag-spezifische Sequenzen detektiert
werden konnten. [Wain-Hobson, Cell 40: 9 (1985)]. Die Filter wurden
gewaschen, autoradiographiert und Hybridisierungssignale gezählt.
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Testverfahren
zur Adenovirs-Neutralisierung
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Serielle Zweifachverdünnungen
(beginnend mit 1 : 4) von hitzeinaktiviertem (56°C, 30 min) Hundeserum wurde
in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gegeben (0,05 ml/Vertiefung)
und mit 0,05 ml Medium enthaltend 30–100 TCID50 Virus
1 Stunde lang bei 37°C
gemischt. In jede Vertiefung wurden 0,05 ml Medium enthaltend 2 × 104 A549-Zellen gegeben, und die Platten wurden
bei 37°C
5% CO2 7 bis 10 Tage lang inkubiert. Sämtliche
Proben wurden doppelt angefertigt. In jeden Test wurden Virus- und
nicht infizierte Zellkontrollen zur Bestimmung des Endpunkts in
den Testseren eingeschlossen. Die Titer wurden als reziproker Wert
der niedrigsten Verdünnung
ausgedrückt,
bei der 50% zytopathischer Effekt beobachtet wurde.
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Nachweis von
Anti-HIV-Antikörpern
mittels ELISA und Wester-Blot
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Nachweis von anti-HIV-Antikörpern: Die
Antikörper-Reaktionen
von Schimpansen auf HIV-1-Antigene wurden durch Testen verschiedener
Verdünnungen
mittels handelsüblicher
ELISA- und Western-Blot-Sets nach den Anweisungen der Hersteller
(DuPont, Wilmington, DE) gemessen.
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Ergebnisse
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Von jedem Schimpansen wurde der Kot
vor und nach der Virus-Inokulation, gesammelt und bei –70°C aufbewahrt.
Von jeder Probe wurden 10%ige Suspensionen hergestellt und zur Infektion
von konfluenten A549-Zell-Monoschichten verwendet. Nach 7 bis 10
Tagen wurden Virus-Plaques durch neutrales Rotfärben identifiziert und die
Zell-Monoschichten auf Nitrocellulose-Membrane transferiert. Repräsentative
Proben wurden mit verschiedenen markierten Oligo-Sonden hybridisiert,
um für
Ad4-, Ad5-, Ad7-, HIV-env- oder HIV-gag-Gene spezifische Sequenzen
zu detektieren. Mit dieser Plaque-Hybridisierungstechnik konnte
die Identifikation von spezifischen rekombinanten Ad-HIV-Viren ermittelt
werden. Keine der rekombinanten Viren verbreiteten sich im Kot länger als
7 Tage p. i. Peak-Titer wurden immer mit 1-3-Tagesproben assoziiert
und stellten aller Wahrscheinlichkeit nach das nicht adsorbierte
Virus-Inokulum dar. Frühere
Studien mit Schimpansen unter Verwendung von Ad-HBsAg-Rekombinanten
hatten aufgezeigt, dass Ad-HBsAg-Rekombinante 30–40 Tage p. i. nachgewiesen
werden konnten. Beim Verabreichungsweg mit der erst im Darm löslichen
Kapsel schien es, dass diese rekombinanten Viren in vivo nicht gut
replizierten.
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Die Serokonversion zum Serotyp des
verwendeten Adenovirus-Vektor wurde mittels Neutralisationstestverfahren
bestimmt. Es wurden gegenüber
allen drei Adenovirus-Serotypen, die bei jedem Schimpansen verwendet
wurden, sehr niedrige bis mäßige anti-Adenovirus-Serumtiter
gemessen.
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Die Serokonversion zu rekombinanten
HIV-Genprodukten wurde entweder mittels der ELISA- oder mittels
der Western-Blot-Technik bestimmt. Keine ELISA-Reaktion wurde bei
sämtlichen
Schimpansen vor der zweiten Booster-Inokulation mit der Ad5-env-Rekombinante
detektiert. Zwei Wochen nach der Ad5-env-Inokulation konnten anti-env-Reaktionen
bei 2 von 3 Tieren gemessen werden. Die intramuskuläre Injektion
von gag- und/oder env-Präparationen
zeigte einen geringen Booster-Effekt bei einem von drei Tieren.
Die Western-Blot-Analyse schien viel empfindlicher als ELISA zu
sein und hatte den weiteren Vorteil, dass herausgefunden wurde,
welche env- und/oder gag-Genprodukte als immunogen erkannt wurden.
Niedrige Serum-Antikörper-Titer
wurden sowohl nach der Erstimmunisierung mit der Ad7-Rekombinante
als auch nach der ersten Auffrischung mit rekombinanten Ad4-Viren
gemessen. Ein signifikanter Anstieg im Serumtiter gegen env-Genprodukte
wurde nach der zweiten Booster-Immunisierung mit der Ad5-env-Rekombinante
beobachtet. Signifikante Anstiege bei den zwei Tieren, die gag-Genprodukte erhalten
hatten, waren nach der Injektion von Untereinheit-Präparationen
zu sehen. Trotz relativ guter Western-Blot-Titer für HIV-Antigene
reagierte nur eines von drei Tieren mit neutralisierenden Serum-Antikörpern. Diese
Reaktion war beim Schimpansen 2 sehr gering (Titer zwischen 10 und
20).
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Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle zusammengefasst.
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ERGEBNISSE
BEI ANWENDUNG VON BEHANDLUNGSSCHEMA 1
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Die zellvermittelte Immunität wurde
in einer von Schimpansen gewonnenen monoklonaren Zellpopulation
aus peripherem Blut gemessen. Die HIV-spezifisches CTL-Aktivität wurde
durch Bestimmung der Lyse von syngenen Zielzellen gemessen, die
mit Vaccinia-Virus-Re kombinanten infiziert wurden, welche entweder die
HIV-env-Genprodukte oder die HIV-gag-Genprodukte oder das lac-Genprodukt
(Kontrolle für
unspezifische Toxizität)
exprimieren. Auf diese Weise wurde eine Spur von HIV-spezifischer
CTL-ähnlicher
Aktivität
gemessen.
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Lymphozytenproliferationsversuche
wurden durchgeführt,
um zu ermitteln, ob gereinigte env-(gp 160, gp 120)- oder gag-(p24)-Präparationen
in der Lage sind, Blastogenese zu stimulieren. Nach der Erstinokulation
wurde keine starke Vermehrung gemessen, und nur eines von drei Tieren
zeigte nach Verabreichung der ersten Booster-Impfung mit Ad4-rekombinanten
Viren eine lymphoproliferative Reaktion. Nach der zweiten Booster-Impfung
(Ad5-env) und der dritten Booster-Impfung (Untereinheit-Präparationen)
reagierten alle drei Tiere mit proliferativen Reaktionen.
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Messung der Immunogenität: Behandlungsschema
2
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Inokulationen von Schimpansen
und Sammeln von Daten
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Drei Schimpansen (2 männliche
und 1 weiblicher), die zuvor mit rekombinanten Ad-HIV-Viren in erst im
Darm löslichen
Kapseln inokuliert und mit Adenovirus-abgeleiteten gag- und/oder env-Untereinheiten
nachgeimpft worden waren (Behandlungsschema 1), wurden intranasal
mit Ad7-HIV-Viren (Woche 46) und 12 Wochen später (Woche 58) mit Ad4-HIV-Viren
infiziert. Rekombinante Adenoviren wurden in mit Phosphat-Kochsalz-Puffer
verdünntem
Gewebezellkulturmedium, narkotisierten Schimpansen durch Eintropfen
in die Nase verabreicht. Zwei Schimpansen (No. 1 und 2) erhielten
rekombinante env- und gag-Viren, während der dritte Schimpanse
(No. 3) nur rekombinante env-Viren erhielt.
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Im Verlauf des Versuchs wurden Vollblut-,
Serum- und Stuhlproben zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und
wie in Schema 1 beschrieben verarbeitet. Der Adenovirus-Nachweis
in Stuhlproben oder Nasenabstichen, die Testverfahren zur Neutralisierung
von Adenoviren und der Nachweis von anti-HIV-Antikörpern erfolgten
analog zu den in Schema 1 beschriebenen Verfahren.
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Ergebnisse
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Die erste intranasale Booster-Impfung
mit Ad7-Rekombinanten erfolgte in einer Dosis von 1 × 108 pfu/Schimpanse. Zu Zeit der Virus-Verabreichung
hatten die Schimpansen 3, 1 und 2 Serum-anti-Ad7-Neutralisierungstiter
von <4, 8 bzw.
64 von früheren
oralen Immunisierungen. Nasenabstriche und Stuhlproben wurden mit
einer Plaque-Hybridisierungstechnik auf die Anwesenheit von verbreiteten
Viren untersucht. Rekombinantes Ad7-env wurde in Nasenabstrichen
bis zu 7 Tagen p. i. bei zwei der Tiere nachgewiesen. Rekombinantes
Ad7-env und Ad7-gag wurden in Stuhlproben 5 bis 12 Tage p. i. gefunden.
Es bestand ein Zusammenhang zwischen dem Serumtiter gegen Ad7 und
der Möglichkeit,
rekombinante Viren in Nasenabstrichen und Stuhlproben nachzuweisen.
Die beiden Tiere, die eine marginale anti-HIV-Antikörper-Reaktion
zeigten, wurden durch die intranasale Booster-Impfung erheblich
gestärkt.
Der Booster-Effekt beim dritten Tier war geringer. Gegen HIV gerichtete
neutralisierende Antikörper
mit niedrigem Titer konnten nunmehr bei allen drei Tieren nachgewiesen
werden. Sekret-Antikörper
wurden in Nasenabstrichproben detektiert, die anti-gag- und/oder
env-bindende Antikörper
enthielten.
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Aufgrund der intranasalen Verabreichung
von rekombinanten Ad7-Viren wurden keinerlei Anzeichen oder Symptome
einer Atemwegserkrankung bei diesen Tieren beobachtet.
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Drei Monate später wurden diese Schimpansen
mit Ad4-Rekombinanten in einer Einmaldosis von 1 × 108 pfu/Schimpanse/Virus immunisiert. Diese
Tiere hatten Serum-anti-Ad4-Neutralisierungstiter
zwischen 128 und 256 von früheren
oralen Immunisierungen zum Zeitpunkt der intranasalen Erregung.
3 Tage nach der Infektion hatten zwei der Tiere (2 und 3) leichten
Husten. Das dritte Tier (No. 1) starb am Tag 5 an bakterieller Lungenentzündung (Streptococcus
pneumonia wurde isoliert). Die beiden anderen Tiere machten beim
Abhorchen bellende Geräusche,
und aus beiden Schimpansen wurde S. pneumonia isoliert. Es wurden
Behandlungen mit Antibiotika begonnen und beide Schimpansen erholten
sich.
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Bei der retrospektiven Untersuchung
dieser Situation konnten mehrere Beobachtungen gemacht werden. Zur
Zeit der intranasalen Verabreichung hatte Schimpanse No. 1 bereits
Fieber und abnormale Blutwerte. Es gab eine unverhältnismäßig große Menge
von polymorphkernigen Zellen und einen 5%igen Gehalt an Bandzellen
(unreifen polyrnorphkernigen Zellen) insgesamt, wobei diese Informationen
darauf hinwiesen, dass eine signifikante bakterielle Infektion vor
der Virus-Inokulation stattgefunden hatte. Autopsieproben aus Lunge, Leber,
Milz und Serum erwiesen sich alle als negative hinsichtlich der
Anwesenheit von infektiösem
Adenovirus durch Gewebekultur unter Verwendung von drei Blinddurchgängen an
anfälligen
A549-Zell-Monoschichten. Ähnliche
Erkenntnisse erbrachten Plaque-Hybridisierungstechniken. In Paraffin
eingelegte Proben von Lunge und Leber erwiesen sich als negativ
beim Test über
die Anwesenheit von Adenovirus-Antigenen unter Verwendung eines
handelsüblichen
Immunfluoreszenz-Sets für
Adenovirus-Antigene. Inklusionskörper
wurden in H&E-gefärbten Lungensektionen
beobachtet. Unter den Fachleuten herrschte keine Einigkeit darüber, ob
diese Inklusionen durch den Adenovirus verursacht worden waren oder
nicht. Mehrere Wochen später
erlitt ein anderer Schimpanse ein ähnliches Schicksal im selben
Primaten-Zentrum und starb. Während
es wahrscheinlich war, dass die Verabreichung von rekombinanten
Adenoviren, wenn überhaupt,
nur eine geringfügige
Rolle bei der Todesursache von Schimpanse No. 1 spielte, wurde es
als sinnvoll erachtet, Antibiotika prophylaktisch vor und nach jeder
weiteren intranasalen Verabreichung von Adenovirus-Rekombinanten
an Schimpansen zu verabreichen.
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Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse,
die unter Anwendung von Behandlungsschema 1 und den Ad7-Rekombinanten
in Schema 2 erzielt wurden.
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ERGEBNISSE
BEI ANWENDUNG VON BEHANDLUNGSSCHEMA 1 UND 2
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Messung der Immunogenität: Behandlungsschema
3
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Inokulationen von Schimpansen
und Sammlung von Daten
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Drei Schimpansen (2 männliche
und 1 weiblicher), die auf die Anwesenheit von neutralisierenden
Antikörpern
gegen menschliche Adenoviren Typ 4, 5 und 7 negativ gescreent worden
waren, wurden unter Anwendung von Behandlungsschema 3 bewertet.
Zwei Schimpansen (No. 4 und 5) erhielten rekombinante env- und gag-Viren,
während
der dritte Schimpanse (No. 6) nur rekombinante env-Viren bekam.
Prophylaktisch wurden Antibiotika an die Schimpansen verabreicht,
und es wurden keine Atembeschwerden beobachtet.
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Im Verlauf des Versuchs wurden Vollblut-,
Serum- und Stuhlproben zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und
wie in Schema 1 beschrieben verarbeitet. Der Adenovirus-Nachweis
in Stuhlproben oder Nasenabstichen, die Tests zur Neutralisierung
von Adenoviren und der Nachweis von anti-HIV-Antikörpern erfolgten nach
den in Schema 1 beschriebenen Verfahren.
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Ergebnisse
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- 1. Immunisierung mit Ad7-Rekombinanten: Rekombinante
Viren verbreiteten sich im Kot 22 bis 34 Tage nach der Infektion.
Keine rekombinanten Viren wurden in Nasensekreten gefunden, die
zwei Wochen nach der Infektion entnommen wurden. Die Serokonversion
zum Serotyp der verwendeten Adenovirus-Vektoren wurde mittels Neutralisierungstests
bestimmt. Es wurden bei allen drei Schimpansen hervonagende anti-Adenovirus-Serumtiter
gegen die bei jedem Schimpansen verwendeten Ad7-Serotypen gemessen.
Die Serokonversion zu rekombinanten HIV-Genprodukten wurden mittels
Western-Blot bestimmt. Vier Wochen nach der Erstimmunisierung mit
Ad7-Rekombinanten konnten anti-env- und anti-gag-Reaktionen bei
zwei der drei Schimpansen gemessen werden. Spätestens in der 20. Woche nach
der Infektion hatten alle drei Tiere messbare Antikörper gegen
HIV-Antigene. Es wurden keine Sekret-Antikörper in Nasenabstrichen gefunden,
die in den ersten vier Wochen nach der Erstimmunisierung entnommen
wurden. Alle drei Schimpansen hatten keine nachweisbaren anti-HIV-neutralisierenden
Antikörper-Reaktionen
aufgebaut.
- 1. Booster-Immunisierung mit Ad4-Rekombinanten: Rekombinante
Ad4-Viren verbreiteten sich im Kot 14 bis 28 Tage nach der Infektion.
Eine Untersuchung von Nasenabstrichen zeigte, dass rekombinante
Ad4-Viren bei allen drei Schimpansen zumindest sieben Tage nach
der Infektion nachweisbar waren. Nach der intranasalen Verabreichung
hatten sich signifikante anti-Ad4-Reaktionen gegen den Ad4-Serotyp
aufgebaut. Die Stärke
war etwas geringer als jene, die gegen die rekombinanten Ad7-Viren
gemessen wurde. Bei allen drei Tieren wurden hervorragende Booster-Reaktionen
gegen gag- und/oder env-Antigene gemessen. In den Nasenabstrichen
der Schimpansen 4 und 5 wurden niedrigtitrige (1 : 2) anti-gag-
und/oder anti-env-Reaktionen gemessen. Noch immer wurden keine anti-HIV-neutralisierenden
Antikörper
in einem der Tiere gemessen.
- 2. Booster-Immunisierung mit Ad5-Rekombinanten: Rekombinante
Viren verbreiteten sich im Kot 8 Tage nach der Infektion. Keine
rekombinanten Viren konnten in Nasenabstrichen 0, 1 oder 2 Wochen
nach der Infektion nachgewiesen werden. Sekret-IgG und -IgA konnte
in Nasenabstrichen aus allen drei Tieren gemessen werden. Sekret-Antikörper wurden
im Speichel aller drei Tiere und im Vaginalabstrich des einen weiblichen
Schimpansen detektiert. Anti-HIV-typspezifische
neutralisierende Antikörper
wurden bei allen drei Schimpansen nachgewiesen.
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Zusammenfassung Tabellen: Die folgende
Tabelle zeigt die unter Anwendung von Behandlungsschema 3 erzielten
Ergebnisse.
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ERGEBNISSE
BEI ANWENDUNG VON BEHANDLUNGSSCHEMA 3
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In der folgenden Tabelle sind anti-HIV-Reaktionen
zusammengefasst, die in Sekreten von Schimpansen nach intranasaler
Booster-Immunisierung mit Ad5-HIV-Rekombinanten nachgewiesen wurden.
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IN
SEKRETEN NACHGEWIESENE ANTI-HIV-REAKTIONEN
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Das erfindungsgemäß zur Herstellung von Vakzinen
zu verwendende lebende rekombinante Adenovirus kann durch Inserieren
eines Gens in ein Adenovirus konstruiert werden, welches Gen für ein Antigen
codiert, das einem Antikörper
gegen einen infektiösen
Organismus bei Warmblütlern
entspricht oder zellvermittelte Immunität gegen einen infektiösen Organismus
bei Warmblütlern
induziert. Die Insertion kann durchgeführt werden, wie in P. K. Chanda
et al., Virology 175: 535–547
(1990), insbesondere auf Seite 539, beschrieben.
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Das erfindungsgemäß zu verwendende lebende rekombinante
Adenovirus kann durch Plaque-Reinigung gereinigt werden. Zur Herstellung
von Vakzinen können
die Virusmengen durch Replikation in einem geeigneten Wirt erhöht werden.
Die Replikation kann in Zellkultur erfolgen. Die Zellen der Zellkultur
sind vorzugsweise BK-(Rindernieren)-Zellen oder menschliche Karzinomzellen,
insbesondere Zervixkarzinomzellen, beispielsweise die Zelllinie
Hela, oder menschliche Lungenkarzinomzellen, beispielsweise die
Zelllinie A549. Das Virus kann bei –70°C in Medien wie DMEM mit 5%
fötalem
Kälberserum
aufbewahrt werden.
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Für
die intranasale Verabreichung kann die Vakzine das Virus mit einem
Stabilisiermittel, beispielsweise SPGA (Saccharose, Phosphat, Glutarat
und Albumin) und gewünschtenfalls
einem oder mehr Zucker(n) umfassen.
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Die Erfindung wird vorzugsweise zur
Behandlung von Säugern
der Ordnung Primaten (einschließlich des
Menschen) verwendet.
